) r Borelioza z Lyme, laboratoryjne metody

'-~ ...;r...;o..;;z;!;;poznania zakażenia)

Borelioza z Lyme, laboratoryjne metody rozpoznania zakażeniaTomasz Chmielewski, Stanisława Tylewska- Wierzbanowska,Samodzielna Pracownia Riketsji, Chlamydii i Krętków OdzwierzęcychPaństwowy Zakład Higieny, Warszawa

Borelioza z Lyme jest najczęściej występującą na świecie chorobązakaźną, przenoszoną przez kleszcze. Zakażenie to ma charakterwieloukładowy, w którym można wyodrębnić kolejne stadia. Wpoczątkowym okresie, we wczesnej fazie (I stadium), po kilku dniach lubtygodniach od chwili zakażenia, pojawia się rumień wędrujący, któremumogą towarzyszyć objawy grypopodobne.Następnie dochodzi do zakażenia wielu narządów i układów (II stadium);pojawiają się dolegliwości ze strony ośrodkowego lub obwodowegoukładu nerwowego, układu kostno-stawowego lub układu krążenia.Późna borelioza z Lyme charakteryzuje się nieodwracalnymi zmianamistawowymi, uszkodzeniem układu nerwowego w postaci encefalopatiilub uszkodzeniem nerwów czaszkowych, obwodowych, a takżeprzewlekłym zanikowym zapaleniem skóry. Wielopostaciowośćchoroby wymaga diagnostyki różnicowej i często sprawia trudności wprawidłowym rozpoznaniu.Dla ułatwienia identyfikacji zakażeń jak i dla celów epidemiologicznychwprowadzono definicję przypadku boreliozy z Lyme. Pierwszą definicjęsformułowano w 1991 roku w USA. Obejmowała ona chorych zrumieniem wędrującym oraz chorych z co najmniej jednym objawemboreliozy późnej i potwierdzeniem rozpoznania klinicznego badaniemlaboratoryj nym [l). Europej ska definicj a wprowadzona w 1996 roku jestszersza niż amerykańska ze względu na występowanie w Europie, conajmniej trzech chorobotwórczych dla człowieka genogatunków B.burgdorferi sensu lato, tj. B. burgdorferi sensu stricto, B. garini oraz B.afzeli i związane z tym większe zróżnicowanie objawów choroby [18).W Europie najczęściej występują B. garini i B. afzeli, podczas gdy B.burgdorferi sensu stricto znacznie rzadziej i zwykle w Europiewschodniej. Zróżnicowanie szczepów wywołujących zakażenia nanaszym kontynencie muszą być brane pod uwagę przy opracowywaniunowych testów diagnostycznych, jak PCR oraz antygenówdiagnostycznych do badań serologicznych. Jest to bardzo ważneponieważ w ostatnim czasie wykryto w Europie kolejne, nowechorobotwórcze genogatunki, B. valaisiana iB. spielmanii.

Antygeny Borrelia burgdorferi sensu lato w diagnostyce zakażeniaSwoiste dla B. burgdorferi białka, które mogą być wykorzystane jakoantygeny diagnostyczne charakteryzują się znaczną heterogennością.Występujące w Europie trzy chorobotwórcze dla człowieka genogatunkii jeden w Ameryce Płn można podzielić na przynajmniej siedemserotypów, biorąc pod uwagę jedynie zróżnicowanie występujących napowierzchni komórki swoistych białek OspA. Odpowiadają onepodziałowi na genogatunki: B. burgdorferi sensu stricto - serotyp 1, B.afzeli - serotyp 2, B. garini - serotypy od 3 do 7 [23].W przypadku białka OspC, na podstawie różnic w sekwencjiaminokwasów, wyodrębniono dotychczas 4 serotypy krętków [24). Jestto białko wysoce immunogenne, odpowiedzialne przede wszystkim zawczesną odpowiedź humoralną.Jednym z najbardziej immunogennych białek w komórce B. burgdorferijest flagelina, białko wchodzące w skład wici. Wywołuje ono silną iwczesną odpowiedź humoralną. Białko to w początkowym i końcowymodcinku łańcucha, wykazuje wysoki stopień homologii z sekwencjąaminokwasów flageliny Bacillus subtilis (65%) i SalmonellaTyphimurium (56%) [20]. Epitopy charakterystyczne dla gatunku B.burgdorferi zlokalizowane są tylko między 129 a 251 aminokwasem.Końcowa sekwencja tego polipeptydu wykazuje aż 80% homologii zbiałkiem flagelinyT. pallidum [5).Obecnie w diagnostyce wykorzystywane są także wysocekonserwatywne, a jednocześnie immunogenne epitopy w heterogennychbiałkach wytwarzanych in vivo, jak np. peptyd C6 w białku VlsE czyanalog białka DbpA(p17).Podstawą rozpoznania boreliozy z Lyme jest obecność określonychobjawów klinicznych, potwierdzonych badaniem laboratoryjnym,wykrywającym swoiste przeciwciała klasy IgM i/lub IgG dla antygenówB. burgdorferi.

Metody diagnostycznePrawidłowe rozpoznanie boreliozy z Lyme zależy od odpowiednio

dobranych metod i antygenów diagnostycznych, następnie odprawidłowej interpretacji wyników.

Powszechnie stosowane testy ELISA są czułe, proste w wykonaniu,gwarantują szybkie uzyskanie wyniku nie podlegającego subiektywnymocenom badacza. Niestety ich niska swoistość, wynosząca 29-71 % wzależności od zastosowanego antygenu [11], może prowadzić dobłędnych rozpoznań.

Stosowane testy diagnostyczne do wykrywania boreliozy z Lymeróżnią się między sobą antygenem diagnostycznym. W testach pierwszejgeneracji była to cała komórka bakteryjna, stosowana w metodachirnrnunoenzymatycznych w formie sonikatu lub cała, nienaruszonakomórka w odczynie immunofluorescencji. Ze względu na bardzo małąswoistość, praktycznie testy tej grupy nie sąjuż stosowane.

Zestawy diagnostyczne ELISA stosowane w badaniachprzesiewowych powinny należeć przynajmniej do drugiej generacji,ponieważ w grupie tej została udoskonalona swoistość i w dużym stopniuzostały ograniczone krzyżowe reakcje. Do tej grupy należą testy, wktórych albo antygenem diagnostycznym są izolowane frakcje białekalbo stosowana jest wstępna absorbcja krętkami Reitera. Szczepyużywane do produkcji antygenu muszą wytwarzać białko OspCumożliwiające wykrycie swoistej odpowiedzi w klasie IgM oraz DbpA(decorin binding protein A, dawniej p17), będące dominującymantygenem w odpowiedzi IgG.

W najnowszej, trzeciej generacji testów, jako antygenydiagnostyczne stosowane są rekombinowane białka. Dotychczasotrzymano i sprawdzono pod względem przydatności w diagnostycebore1iozy z Lyme, białka p831100 (wskaźnik późnej fazy choroby), p41(flagelina, p4l int (wewnętrzna część cząsteczki flageliny o masie 14 000,nie reagująca krzyżowo z flageliną innych gatunków bakteryjnych),białka błony zewnętrznej OspA i OspC i p39. Ostatnie badania wskazują,że dzięki uzupełnieniu antygenu diagnostycznego o rekombinowanebiałka DbpA (P17) i p58, a także p14, p30, p43 można uzyskać większączułość testu. Ostatnio z powodzeniem w Stanach Zjednoczonychwprowadzono rekombinowany swoisty antygen VlsE i pochodzący zniego syntetyczny peptyd C6. Przydatność tych antygenów zdają siępotwierdzać badania surowic pochodzących od europejskich chorych zrumieniem wędrującym, ACA i zapaleniem stawów. Jednocześniejednak zwraca się uwagę na konieczność ostrożnego przenoszeniawyników badań z USA do Europy ze względu na występujące tuzróżnicowanie genogatunków i heterogenność immunodominującychepitopów antygenu VlsE [6).

W każdym przypadku, powinny być oznaczone przeciwciałaobu klas. Uzyskanie ujemnego wyniku badania serologicznego wewczesnej fazie zakażenia nie przesądza o rozpoznaniu. Zalecane jestpowtórzenie badania z nową próbką surowicy po upływie 4 tygodni odwystąpienia pierwszych objawów choroby.

Należy także pamiętać, że swoiste przeciwciała wykrywane są takżeu osób zdrowych, co może świadczyć o bezobjawowym przebieguchoroby. W zależności od stopnia narażenia na kontakt z kleszczamiodsetek osób z przeciwciałami wynosi od 12% w normalnej populacji(krwiodawcy) do około 40% w grupach ryzyka np. wśród leśników [3,4].Obecność samych przeciwciał, bez objawów zakażenia, nie może byćwskazaniem do leczenia.

W 2000 roku opublikowano, opracowane przez międzynarodowągrupę ekspertów, zalecenia dotyczące prawidłowej diagnostykilaboratoryjnej boreliozy z Lyme (angielska wersja ,,MiQ 12 LymeBorreliose" dostępna w internecie na stronie:http://www.dghm.org/red/index).

Ze względu na liczne nie swoiste reakcje krzyżowe i fałszywiedodatnie wyniki, których nie można było wyeliminować w powszechniestosowanych testach ELISA, mimo wprowadzania róźnych antygenówdiagnostycznych (sonikat całej komórki, izolowane białka, antygenyrekombinowane), zalecana jest obecnie dwustopniowa diagnostykaserologiczna.

Str. 6 Borelioza z Lyme, laboratoryjne metody

rozpoznania zakażenia

. Polega ona na oznaczeniu w pierwszym etapie poziomuprzeciwciał półilościowymi testami ELISA o wysokiej czułości.Następnie, próbki surowic, z którymi uzyskano wynik dodatni lubwątpliwie dodatni są badane jakościową metodą Western-blot o wysokiejswoistości, w celu weryfikacji wcześniejszych rezultatów. Interpretacjawyników badań ELISA i Western-blot odbywa się według ściśleustalonych kryteriów.

Western-błotJako test potwierdzający Western blot powinien charakteryzować sięwysoką, nie mniejszą niż 95% swoistością.Pierwsze kryteria oceny wyniku badania metodą Western-błot ustalonezostały przez Center for Disease Controi and Prevention (CDq wAtlancie, USA. Interpretacja uzyskanych wyników zgodnie z tymikryteriami jest często zalecana przez producentów testów i nie rzadkoautomatycznie stosowana na kontynencie europejskim. Może toprowadzić do błędów w rozpoznaniu.Opracowanie kryteriów oceny wyników badań metodą Westęm-blotprzeprowadzonych u chorych z terenu Europy jest bardziej złożone zewzględu na występowanie kilku genogatunków chorobotwórczych naobszarze tego kontynentu.Analiza występowania przeciwciał przeprowadzona w ramach programuEUCALB, wykazała przydatność następujących 8 antygenów wdiagnostyce zakażeń B. burgdorferi sensu lato: OspC i p41 dla IgM orazp83/100, p58, p41, p39, OspC, ObpA (P17) dla IgG, jakkolwiekwykazano zróżnicowane ich znaczenie. Stwierdzono, bowiem że czułośći swoistość metody zależna jest od genogatunku szczepu użytego jakoantygen diagnostyczny. Ważnym elementem jest zastosowanie kryteriówuwzględniających odpowiedź immunologiczną na antygeny szczepównajczęściej występujących na danym terenie. Ponadto, przyjętainterpretacja wyników powinna być również powiązana zcharakterystyką objawów klinicznych stwierdzanych na danym terenie[13].Aby poprawnie zinterpretować wynik badania, potrzebnajest informacjana temat czasu trwania choroby, z którym ściśle związane jest pojawieniesię przeciwciał dla określonych antygenów. We wczesnej boreliozieznaczenie ma intensywność przynajmniej dwóch frakcji białkowych(p41 i OspC) i w związku z tym konieczne jest stosowanie odpowiednichkontroli wewnętrznych, aby ocenić badanie półi lościowo.Dostępne są testy, w których rozdziałowi poddano albo lizat całejkomórki albo wyselekcjonowane białka B. burgdoferi produkowaneprzez komórki E. col i w wyniku manipulacj i genetycznych.Zaletą lizatu całej komórki jest możliwość wykrycia większej liczbyimmunogennych frakcji. Wadą natomiast to, że w niektórychprzypadkach trudno jest rozróżnić frakcje swoiste od krzyżoworeagujących. Zastosowanie jako antygen diagnostyczny w metodzieimmunoblot, szczepu, który wytwarza swoiste, immunogenne białkawymaga dokładnej standaryzacji i bardzo precyzyjnej indentyfikacjifrakcji białkowych przy pomocy przeciwciał monoklonalnych.Na terenie Europy zalecany jest w diagnostyce Western-blat zantygenami B. afzelii (szczep PKo) ponieważ charakteryzuje sięnajwiększą czułością.Przyjmuje się, że jeżeli antygenem jest szczep B. afzelii to wynikimmunoblotjest dodatni jeżeli przeciwciała IgM reagują przynajmniej zjedną frakcją z pośród: p41 (silna reakcja), p39, OspC, DbpA (OspI7).Wraz ze zmianą antygenu diagnostycznego zmieniają się równieżkryteria interpretacji (patrz Tabela I).Zastosowanie antygenów rekombinowanych ma wiele zalet. Użycie ichdaje pewność, że uzyskane reakcje dotyczą wyłącznie swoistych białek.Ponadto, możliwe jest zastosowanie w jednym teście swoistych białekpochodzących z różnych genogatunków, np. ObpA Osp C i BmpA, atakże swoistych peptydów będących fragmentami białek, które w całościwywołują reakcje krzyżowe, jak np. białko p41 i peptyd p41 int., a takżeantygenów wytwarzanych przez bakterie tylko w warunkach in vivo,jakDbpA i VlsE. Ponadto, testy z antygenami rekombinowanymi są obecnielepiej wystandaryzowane niż z lizatem komórkowym [15].

Dodanie do zestawu antygenów białek DbpA i VlsE znacznie zwiększaczułość testu. We wczesnym stadium choroby, często przeciwciała IgGdla VlsE pojawiają się przed przeciwciałami IgM dla innychantygenów[21,22].

Inne badaniaPodstawą rozpoznania laboratoryjnego boreliozy z Lyme są badaniaserologiczne. Opisywane są jednak serologicznie ujemne przypadkichoroby. Przyczyna tego zjawiska nie jest wyjaśniona, między innymitłumaczy się to możliwością powstawania kompleksówimmunologicznych [16]. W związku z tym, jeżeli mimo ujemnegowyniku nadal klinicznie podejrzewane jest zaawansowane stadiumboreliozy, można zastosować inne dodatkowe metody diagnostyczne,jaknp. PCR lub hodowlę itp. Mają one także zastosowanie u chorych znietypowym rumieniem wędrującym, przy podejrzeniu wczesnejneuroboreliozy, w której nie zostały jeszcze wytworzone przeciwciałaoraz u chorych z obniżoną odpornością.

renŁańcuchowa reakcja polimerazy umożliwia wielokrotne powielanieokreślonych, charakterystycznych dla danego drobnoustrojufragmentów genomu. W przypadku B. burgdorferi sensu lato, najczęściejwykrywane są sekwencje genów kodujących flagelinę, białka błonyzewnętrznej (Osp), l6S-RNA i 5S-23S-RNA [14]. PCR jest metodąbardzo czułą, a dolna granica wykrywalności wynosi około 10-1000komórek w badanej próbce. Pomimo swych niewątpliwych zalet posiadajednak szereg ograniczeń. Do najważniejszych należy rodzaj materiałudo badania i stadium choroby, w którym został pobrany. Materia!genetyczny krętków częściej można wykryć w ostrej fazie choroby niż wjej okresie przewlekłym. DNA krętków wykrywa się wokoło 60-70%wycinków skóry pobranych z rumienia wędrującego i wokoło 60%wycinków ze zmian typu ACA [14,17,19]. U chorych z rumieniemwędrującym ONAB. burgdorferi we krwi stwierdza się nie częściej niż uokoło 18% chorych, w płynie mózgowo-rdzeniowym DNA wykrywa sięw 38% przypadków w neuroboreliozie wczesnej i w 25% wneuroboreliozie póżnej [8,9]. W zależności od stosowanych starterówczułość metody PCR w płynie stawowym wynosi od 48% dla starterówkomplementarnych do sekwencji genu 16S rRNA do 96% dla starterówdla OspA [10]. Na wynik badania może mieć wpływ obecność wbadanym materiale DNA pochodzącego z komórek gospodarza, jak ihamujący wpływ innych składników tkankowych takich jakhemoglobina, heparyna, porfrryny. Ograniczenia te mogą prowadzić douzyskiwania wyników fałszywie dodatnich jak i fałszywie ujemnych.Poważny wpływ na otrzymany wynik mają też metody ekstrakcji DNA,gdyż ze względu na niewielką liczbę bakterii w badanym materiale możedochodzić do strat prowadzących do fałszywie ujemnego wyniku [14].Ponadto startery zastosowane do reakcji muszą umożliwiać amplifikacjęfragmentów DNA charakterystycznych dla wszystkichchorobotwórczych i potencjalnie chorobotwórczych genogatunków B.burgdorferi sensu lato z tą samą czułością.

HodowlaKlasyczne postępowanie w diagnostyce mikrobiologicznej, hodowla iizolacja czynnika etiologicznego nie spełnia warunków wymaganych wrutynowej diagnostyce. Aby wydać wynik hodowlę krętków prowadzisię do 3 miesięcy. Uzyskany po tym czasie ujemny wynik nie wykluczazakażenia. Krętki B. burgdorferii można izolować ze zmian skórnych(bioptaty), płynu mózgowo-rdzeniowego, płynu stawowego i krwi.Czułość tej metody w II stadium choroby waha się od około 10 do 30%.Najczęściej dodatnie posiewy uzyskuje się z bioptatów skóry pobranychz rumienia (ok. 50-85%), rzadziej z płynu mózgowo-rdzeniowego (ok.10%), z chrząstki stawowej; najmniej izolacji uzyskuje się z płynustawowego i krwi.

Do hodowli krętków B. burgdorferii stosowane jest bardzobogate podłoże BSK (Barbour'a, Stoenner'a, Kelly'ego) i jego różnemodyfikacje, najczęściej podłoże BSK w skład którego wchodzi ponad60 składników, takich jak aminokwasy, witaminy, elektrolity; dodatkowojest wzbogacane surowicą króliczą (6%) [12]. Inokulum nie może byćmniejsze niż 10 komórek bakteryjnych. Gęstość zawiesiny bakteryjnej wpodłożu BSK-H po inkubacji 14 dni nie przekracza WIO komórek w Iml, a-czas między podziałami komórkowymi wynosi około 12godzin. Na

podłożach stałych bakterie te rosnąjeszcze wolniej [7j.B. burgdorferi są bakteriami powoli rosnącymi na dostępnych

obecnie sztucznych Qodłożach bakteciologicznvch. OQt'imatnatemperatura wzrostu krętków przy obniżonym poziomie tlenu wynosi32-370C.

(Borelioza z Lyme, laboratoryjne metody )

_____________ r_o_z~p_o_z_n_a_n_i_a_z_a_k~a_z-·e--n-ia---------l Str. 7-~-I

HodowlaiPCRW porównaniu z zakażeniami innymi drobnoustrojami, liczba krętków wdostępnych do badania próbkach materiału klinicznego jest bardzo mała,na granicy wykrywalności metodą PCR. Ocenia się, że w płyniemózgowo-rdzeniowym liczba tych drobnoustrojów nie przekracza 50komórek w 1 mL [8], i uzyskanie wystarczającej ilości DNA krętków doamplifikacji metodą PCR jest często niemożliwe. Można najpierwwykonać posiew, a następnie po hodowli przez 1-2 tygodnie, poszukiwaćDNA B. burgdorferi sensu lato metodą PCR. Ma to szczególnieznaczenie w przypadkach klinicznego rozpoznania neuroboreliozy przysłabej odpowiedzi immunologicznej lub jej braku. Taki sposóbpostępowania z materiałem klinicznym, podnosi znacznie czułośćbadania diagnostycznego w kierunku boreliozy [2].

Tabela. Interpretacja wyniku badania metodą Western-blot z antygenamiwystępujących w Europie genogatunków

r.<;en:-:-:-:oga-:=tuc-:-n"".I<"::--.-----"'F'"".t"'cjc-. a-=n"'tygM=-:Cowe=:wyk=rywa:-:-:cn::-:-.:-:-prze=z""prz::C",,"·i1V=d':-"I':-;kł:::'=SY; .----,.--:--.-~.-

IgM IgG

B. atz9fił Co najmniej jedna frakcja r. ICo najmniej doNie frakcje z:

p39, Osp(:. p17 lub silna reakcja l p83/100, p58, p43, p39, p30. OspC, p21, DbpA

ar.\ygene.m p4\ (p17). p'4

• genogawnek, l kt6reilo PCZ"{Qotowano antygen dla~nostvczny

8.g.artnl ConaJmnie'jjednafrakojaZ: COnajmniejjedna1rakcjaz:

p39, OSP<; lub silna reakcja Z p831100,p39,p30,OspC,p21, ObpA(p17}

antygenem p4\

B.burgdor1erl

sensu stricto

CClnajmniej jedna fra.kcj:9 z: Co r.aimniej jedna fraj(cja z:

p39. OspC, p17 lub silna reakcja z p831100,psa, p56, osec, p21, ObpA(pili

antygenem p4 t

CO' najmniej ,dwie frakcje" z: Co najmniej ~łJje frakcje z:Ant}Veny

rekom btnowane p39, OspC, p'l in", p17 lub sin. p83/1 00, psa, p39, OspC, pą t lnt.. ObpA (pI7}

leakcja z antygenem OspC

Piśmiennictwo• Centers for Disease Control and Prevention. Case definitions for public health

surveillance, Morbid. Morta!' Weekly Rep. 39 (RR-13):19-21 (1990)• Chmielewski T., Fiett J., Gniadkowski M., Tylewska-Wierzbanowska S.

Improvement to laboratory recognition of Lyme borreliosis with thecombination ofculture and PCR methods. Mol. Diagn. 7 (3/4):155-162(2003)

• Chmielewski T., Tylewska-WierzbanowskaS, Występowanie przeciwciałswoistych dla Borrelia burgdorferi u ludzi zdrowych na terenie Polski.Przeg .Epidemiol. 56,33-38 (2002)

.Chmielewski T., Tylewska-Wierzbanowska S, Prevalence of Borreliaburgdorferi and HGE antibodies in forest workers in Poland. IXInternational Conference on Lyme Borreliosis and other tick-bornediseases. 18-22.08.2002,New York, USA.

.Coleman J.L,. Benach J.L Identification and characterization of anendoflagellar antigen of Borrelia burgdorferi.J. Clin. Invest. 84, 322-330 (1989)

.Goetner G., SchuJte-SpechtelU., Hillermann K, Liegl G., Wilske B., FingerleV Improvement ofLyme borreliosis serodiagnosis by a newly developedrecombinant immunoglobulin G (IgG) and IgM line immunoblot assay andaddition of VIsE andDbpA homologues. J. C/in. Microbiol. 43, 3602-3609.

.Kurti TJ., Munderloch U.G., Johnson R.C, Ahlstrand G,G. Colony formationand morphology in Borrelia burgdorferi. J. Clin. Microbiol. 25, 2054-2058 (1987)

.Lebech A.-M., Hansen K. Detection of Borrelia burgdorferi DNA in urinesampIes and cerebrospinal fluid sampIes from patienls with early andlate Lyme neuroborreliosis by polymerase chain reaction. 1. Clin.Microbiol. 30, 1646-1653(1992)

.Nocton U., Bloom BJ., Rutledge BJ" Persing D.H., Logigian EL, SchmidCH., Steere A,C Detection of Borrelia burgdorferi DNA by polymerasechain reaction in cerebrospinal fluid in Lyme neuroborreliosis. J. Infect.Dis. 174,623-627 (199.6)

.Nocton J.I., Dressler F., Rutledge BJ, Rys P.N.,Persing D.H., Steere A.C,Detection of Borrelia burgdorferi DNA by polymerase chain reactionin synovial fluid from patients with Lyme arthritis. N Engl. J. Med. 330,229-234 (1994)

.Nohlmans M.K.E" Blaauw A.A.M., van den BogaardA.E.J., van BovenCP.A. Evaluation ofnine serological tests for diagnosis ofLymeborreliosis, Eur. J Clin. Microbiol. Infect. Dis, 13,394-400 (1994)

.Pollack KI., Teleford III S.R" Spielman A. Standarization ofmedium forculturing Lyme disease spirochetes. 1. Clin. Microbiol. 31, 1251-1255(1993)

.Robertson 1., Guy E., Andrews N., Wilske B., Anda P., Grandstrom M.,Hauser U., Moosmann Y, Sambri V, Schellekens J., Stanek G., Gray J. AEuropean multicenter study of immunobloting in serodiagnosis of Lymeborreliosis.i/ cu« Microbiol. 38,2097-2102 (2000)

.Schmidt B.L. PCR in laboratory diagnosis of human Borrelia burgdorferiinfections, Clin. Microbiol. Rev. 10, 185-201 (1997)

.SchuJte-Spechtel U., Lehnert G., Liegl G., Fingerle V, Heimerl C, JohnsonB.J.B., Wilske B. Significant improvement of the recombinant Borrelia-specific immunoglobulin G immunoblot test by addition ofVlsE and aDbpA homologue derived from Borrelia garini for diagnosis of earlyneuroborreliosis.Z Clin. Microbiol. 4( 1299-1303 (2003).

.Schutzer S.E., Coyle P.K.,Belman AL, Golightly M.G., Drulle I.Seqestration of antibody to Borrelia burgdorferi in immune complexes inseronegative Lyme disease. Lancet 335:312-315 (1990)

.Schwartz L, Wormser G.P., Schwartz J.I., Cooper D., Weissensee P.,GazumyanA, Zimmermann E., Goldberg N.S., Bittker S., Campbell G.L.,Pavia CS. Diagnosis of early Lyme disease by polymerase chain reactionamplification and culture of skin biopses from erythema migrans lesions. Jcu« Microbiol. 30,3082-3088 (1992)

.Stanek G., O'Connel S., Cimmino M" Aberer E., Kristofertsch W.,Grandstrom M., Guy E., Gray I. European Union concerted action on riskassesment in Lyme borreliosis: clinical case definitions for Lymeborreliosis. Wien. Klin, Wochenschr. 108,741-747 (1996)

.von Stedingk L.V, Olsson 1, Hanson H.S" Asbrink E., Hovmark A.Polymerase chain reaction for detection of Borrelia burgdorferi DNAin skin lesions of early and late Lyme borreliosis. Ew: 1. Clin. Microbiol.Infect. Dis. 14, 1-5 (1995)

.Wallich R., Moter S.E., Simon M.M., Ebnet K., Heiberger A., Kramer M.D.The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigen(flagellin): molecular c1oning,expression, and amplification ofthe gene.Infect. Immun. 58, 1711-1719 (1990).

.Wilske B, Diagnosis ofLyme borreliosis in Europe. Vector-Borne Zoon. Dis .3(4),215-227 (2003)

.Wilske B., Fingerle v., Sculte-Spechtel U. Microbiological and serologica1diagnosis ofLyme borreliosis. FEMS Immunol Med. Microbiol 49, 13-21(2007).

.Wilske B., Preac-Mursic V, Gobel U.B., GrafE., Jauris S., Soutschek E.,Schwab E., Zumstein G. An OspA serotyping system for Borreliaburgdorferi based on reactivity with monoclonal antibodies and OspAsequence analysis. 1. Ciin. Microbiol. 31,340-350 (1993)

.Wilske B., Preac-Mursic v., Jauris S" Hofinann A., Pradel L, soutschek E.,Schwab E., Will G., wanner G. Immunological and molecularpolimorphisms of OspC, an immunodominant major outer surfaceprotein of Borrelia burgdorferi. Infect. Immun. 61,2182-2191 (1993)

Adres autorówPaństwowy Zakład HigienySamodzielna Pracownia Riketsji, Chlamydii i KrętkówOdzwierzęcychul. Chocimska 24, 00-791 Warszawatel. 022-5421261, e-mail: tchmielewski@pzh.gov.pl

KOMUNIKAT RZECZNIKA DYSCYPLINARNEGO KIDLRzecznik Dyscyplinarny KIDL nie odpowiada na telefony

i anonimowe pisma.

Uprzejmie informuję, że zainteresowane osoby i strony kierujące do RzecznikaDyscyplinarnego KlDL (ul. Konopacka4, 03-428 W-wa) skargi ipisma powinnyprzesyłaćje pisemnie (!! !) zpodaniem adresu do korespondencji, zaśw przypadkuPT Diagnostów Laboratoryjnych, oprócz adresu, należy podać numer wpisu nalistę diagnostów lab,DANETE POZOSTAJĄWYŁĄCZNIEWDYSPozycn

I DO INFORMACJI RZECZNIKA DYSCYPLINARNEGO KlDLRzecznik Dyscyplinarny KlDLEwa Tuszewska