skrining kandungan senyawa aktif madu dan uji …
TRANSCRIPT
Skripsi
SKRINING KANDUNGAN SENYAWA AKTIF MADU DAN UJI
POTENSINYA SEBAGAI ANTIOKSIDAN
ENDAH HANDAYANI
H 311 14 515
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2018
SKRINING KANDUNGAN SENYAWA AKTIF MADU DAN UJI
POTENSINYA SEBAGAI ANTIOKSIDAN
Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar sarjana sains
Oleh :
ENDAH HANDAYANI
H 311 14 515
MAKASSAR
2018
SKRIPSI
SKRINING KANDUNGAN SENYAWA AKTIF MADU DAN UJI
POTENSINYA SEBAGAI ANTIOKSIDAN
Disusun dan diajukan oleh
ENDAH HANDAYANI
H 311 14 515
Skripsi ini telah diperiksa dan disetujui oleh :
Pembimbing Utama Pembimbing Pertama
Prof. Dr. Alfian Noor, M.Sc Drs. F. W. Mandey, M.Sc
NIP. 195105151 97412 1 001 NIP. 19650118 199002 1 001
When I step into the unknown
I know I’ll never be alone
You have won me the victory
Before I even believed
You’ve loved me through the years
So whom shall I fear?
You’re all I need
My Lord
My Heavenly Father
My Redeemer, My Jesus “Now Faith is being sure of what we Hope for, being convinced of what we do not see”
Hebrews 11:1
v
PRAKATA
Segala puji dan syukur hanya bagi Tuhan Yesus, oleh karena penyertaan
dan kasih setia-Nya yang melimpah akhirnya penulis dapat menyelesaikan
penulisan laporan hasil penelitian dengan judul “SKRINING KANDUNGAN
SENYAWA AKTIF MADU DAN UJI POTENSINYA SEBAGAI
ANTIOKSIDAN”. Penyelesaian tugas ini sebagai syarat guna memperoleh gelar
Sarjana Sains Depertemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam Universitas Hasanuddin. Penulis menyadari bahwa betapa banyaknya
hambatan yang terjadi dalam menyelesaikan tugas ini. Tugas ini tidak akan selesai
tanpa dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, oleh karena itu penulis
menyampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih yang setinggi kepada :
1. Kedua Orang Tua, Yohanis Kendek dan Damaris Karisa atas segala kasih
sayang, pengertian, dukungan serta segala wejangan hikmat yang tidak henti
disampaikan pada penulis. Juga buat dukungan dari kakak penulis, Arie,
Imanuel, Mesri, Nopriani, Kak Roberth dan Mba Ola, serta keponakan
tersayang Shelter dan Josh.
2. Bapak Prof. Dr. Alfian Noor, M.Sc selaku pembimbing utama serta
Drs. F. W. Mandey, M.Sc selaku pembimbing pertama, yang telah
meluangkan waktu, tenaga dan dalam mengarahkan penulis mulai dari
penyusunan proposal hingga tersusunnya laporan hasil penelitian ini.
3. Tim Penguji Sarjana, Bapak Prof. Dr. Ahyar Ahmad (ketua), Bapak
Dr. Maming, M.Si (Sekretaris), Ibu Dr. St. Fauziah, M.Si (anggota). Terima
kasih atas saran dan masukannya.
vi
4. Ketua dan sekretaris departemen kimia serta seluruh dosen yang telah
membagi ilmunya kepada penulis selama 4 tahun menempuh pendidikan,
terkhusus Bapak Dr. Yusafir Hala, M.Si selaku pembimbing akademik yang
telah membimbing selama masa perkuliahan.
5. Staf dan seluruh analis departemen kimia fakultas MIPA Universitas
Hasanuddin, terima kasih atas bantuan dan kerjsamanya.
6. Honeybee geng Uni, Ainun, Rani dan Vitra, terima kasih atas kerjasamanya
dari awal pengambilan sampel (sampai dikejar lebah) hingga akhirnya
penyusunan tugas akhir .
7. Teman-teman seangkatan 2014, terkhusus Widya, Ainun, Salmiyah dan
Deca buat segala bantuan dan semangatnya.
8. Big thanks to Latiana, Desri dan Lola, my beloved bestfriends, buat
dukungan doa, saran dan sharingnya yang membangun dan menguatkan dan
segala semangat yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis sadar akan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran
dan kritik yang bersifat membangun dalam penulisan selanjutnya. Akhirnya
penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat kepada para
pembaca dan peneliti berikutnya.
Penulis
2018
vii
ABSTRAK
Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa aktif
pada madu serta menguji aktivitas antioksidan senyawa aktif dari madu hutan.
Hasil penelitian menunjukkan ekstrak metanol memberikan hasil positif pada
flavonoid, tanin, saponin, steroid dan alkaloid dengan nilai IC50 metode DPPH
sebesar 683,153 µg/mL. Ekstrak DCM memberikan hasil positif tanin, steroid dan
alkaloid dengan nilai IC50 701,743 µg/mL. Ekstrak n-heksan positif mengandung
tanin dan alkaloid dengan nilai IC50 1709,536 µg/mL, ekstrak air positif tanin,
saponin, steroid, alkaloid dengan nilai IC50 1698,345 µg/mL. Sampel madu positif
mengandung semua aspek yang diujikan dengan nilai IC50 2826,471 µg/mL. Hal
ini menunjukkan ekstrak dan sampel memiliki aktivitas antioksidan yang sangat
lemah.
Kata Kunci : ekstrak, IC50, madu, senyawa aktif,
viii
ABSTRACT
The aim of this research to isolate and identify and to test the antioxidant activity
of active compounds in honey. The result showed that methanol gave results in
flavonoid, tannin, saponin, steroid and alkaloid with IC50 value of DPPH method
of 683,153 µg/mL. DCM extract gave positive results for tannin, steroid and
alkaloid with IC50 values of 701,743 µg/mL. N-hexane extract positively contains
tannin and alkaloid with IC50 1709,536 µg/mL, water extract positively contains
of tannin, saponin, steroid, alkaloid with IC50 value 1698,345 µg/mL. Pure honey
contain all aspects tested with IC50 values 2826,471 µg/mL. This showed extracts
and samples have very weak antioxidant activity.
Keywords : active compound, extract, honey, IC50
ix
DAFTAR ISI Halaman
PRAKATA ................................................................................................... v
ABSTRAK ................................................................................................... vii
ABSTRACT ................................................................................................. viii
DAFTAR ISI ................................................................................................ ix
DAFTAR TABEL ........................................................................................ xii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xiv
DAFTAR SIMBOL DAN SINGKATAN .................................................... xv
BAB I PENDAHULUAN ........................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ........................................................................ 1
1.2 Rumusan Masalah .................................................................... 4
1.3 Maksud dan Tujuan Penelitian ................................................. 4
1.3.1 Maksud Penelitian ................................................................. 4
1.3.2 Tujuan Penelitian ................................................................... 4
1.4 Manfaat Penelitian .................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................. 5
2.1 Gambaran Umum Madu .......................................................... 5
2.2 Komposisi Madu ...................................................................... 8
2.3 Radikal Bebas ........................................................................... 11
2.4 Antioksidan .............................................................................. 13
2.5 Metode DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazil) ...................... 15
2.6 Apis dorsata .............................................................................. 16
x
BAB III METODE PENELITIAN............................................................... 18
3.1 Bahan Penelitian ....................................................................... 18
3.2 Alat Penelitian .......................................................................... 18
3.3 Waktu Dan Tempat Penelitian ................................................. 18
3.4 Prosedur Penelitian ................................................................... 18
3.4.1 Pengolahan Sampel ............................................................... 18
3.4.2 Ekstraksi Madu dengan Metanol ........................................... 19
3.4.3 Ekstraksi Madu dengan Pelarut Air ...................................... 19
3.4.4 Ekstraksi Madu dengan Pelarut DCM………....………….. 19
3.4.5 Ekstraksi Madu dengan Pelarut n-Heksan ............................. 20
3.4.6 Uji Fitokimia .......................................................................... 20
3.4.6.1 Uji Alkaloid ......................................................................... 20
3.4.6.2 Uji Flavonoid ....................................................................... 21
3.4.6.3 Uji Tanin ............................................................................. 21
3.4.6.4 Uji Steroid ........................................................................... 21
3.4.6.5 Uji Saponin ........................................................................... 21
3.4.7 Uji Bioaktivitas ....................................................................... 22
3.4.7.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM ...................................... 22
3.4.7.2 Pembuatan Larutan Induk Asam Askorbat 500 ppm ........... 22
3.4.7.3 Pembuatan Larutan Induk Ekstrak n-Heksan 500 ppm ....... 22
3.4.7.4 Pembuatan Larutan Induk Ekstrak DCM 500 ppm .............. 22
3.4.7.5 Pembuatan Larutan Induk Ekstrak Metanol 500 ppm .......... 22
3.4.7.6 Pembuatan Larutan Induk Ekstrak Air 500 ppm .................. 23
3.4.7.7 Pembuatan Larutan Induk Sampel Madu 500 ppm .............. 23
xi
3.4.7.8 Penentuan Aktivitas Antioksidan Asam Askorbat
dengan Metode DPPH .......................................................... 23
3.4.7.9 Penentuan Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Sampel
dengan Metode DPPH .......................................................... 24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 25
4.1 Maserasi Sampel ........................................................................ 25
4.2 Uji Fitokimia ............................................................................. 26
4.3 Uji Bioaktivitas .......................................................................... 31
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 39
5.1 Kesimpulan ................................................................................. 39
5.2 Saran ........................................................................................... 39
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 40
LAMPIRAN ................................................................................................. 45
xii
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Komposisi Madu .................................................................................. 9
2. Hasil Uji Fitokimia Ekstak Sarang Madu dan Madu ........................... 10
3. Data Pengujian Kandungan Metabolit Sekunder
Ekstrak Metanol, DCM, Heksan, Air dan Sampel Madu …………… 26
4. Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Sampel Madu…………………… 33
5. Data Hasil Uji IC50 Ekstrak dan Sampel…………………………….. 35
6. Data Hasil Uji IC50 Asam Askorbat………………………………….. 37
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Madu Hutan .......................................................................................... 6
2. Struktur Struktur 1,1-Diphenyl-2-picrylhidrazyl……………………... 12
3. Struktur Dasar Flavonoid……………………………………………... 14
4. Reaksi antara DPPH dengan Senyawa Antioksidan...………………... 15
5. Mekanisme Pembentukan Garam Flavilium…...……………………... 27
6. Reaksi Uji Fitokimia Tanin…………………….……………………... 28
7. Reaksi Uji Fitokimia Steroid…………………...……………………... 29
8. Reaksi Uji Fitokimia Alkaloid………………………………………... 30
9. Reaksi Uji Fitokimia Saponin………………….……………………... 31
10. Reaksi Flavonon dengan DPPH……………………………………... 32
11. Diagram Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Madu..………………... 34
12. Grafik Nilai IC50 Ekstrak dan Sampel Madu………………….…….. 36
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
13. Skema Prosedur Kerja ........................................................................ 45
14. Kurva Pengukuran Aktivitas Antioksidan .......................................... 53
15. Perhitungan Pembuatan Larutan Induk .............................................. 62
16. Perhitungan Pembuatan Deret Standar............................................... 65
17. Dokumentasi Penelitian ..................................................................... 71
xv
DAFTAR SIMBOL DAN SINGKATAN
DPPH : 1,1-Diphenyl-2-picrylhidrazyl
IC : Inhibitor Concentration
DNA : deoxyribonucleic acid
UV : Ultra Violet
DCM : dicholormethane
nm : nanometer
ppm : part per million
Vis : Visible
kg : kilogram
µg/mL : mikro gram per mililiter
°C : derajat celcius
g : gram
p.a : pro analis
mL : mililiter
mg/mL : miligram per mililiter
mg : miligram
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Perkembangan zaman yang semakin maju setiap harinya menyebabkan
terjadinya perubahan dari pola hidup manusia menjadi kurang sehat misalnya
dalam hal makanan. Makanan instan cepat saji dipilih sebagai alternatif utama
tanpa memikirkan efek yang ditimbulkannya. Bahaya makanan dan minuman,
bahaya lingkungan yang berasal dari radiasi, polusi, asap rokok serta pola hidup
yang tidak sehat dapat memicu terbentuknya radikal bebas (Idris, 2017).
Radikal bebas adalah spesi yang reaktif karena adanya elektron yang tidak
berpasangan. Pembentukan spesi ini di dalam tubuh dipicu oleh berbagai faktor
antara lain ketika komponen makanan diubah menjadi bentuk energi melalui
proses metabolisme. Proses metabolisme seringkali terjadi keadaan yang
memungkinkan elektron berada pada kondisi tidak stabil sehingga terbentuk
radikal bebas seperti superoksida, hidroksil dan lain-lain (Winarsi, 2007). Dalam
upaya radikal bebas menstabilkan diri, radikal bebas ini akan bereaksi dengan
molekul disekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron. Reaksi ini
berlangsung terus-menerus dalam tubuh dan bila tidak dihentikan akan
menimbulkan gangguan kesehatan berupa penyakit seperti kanker, jantung,
katarak, penuaan dini serta penyakit degeneratif lainnya. Oleh karena itu, tubuh
memerlukan bahan yang penting yaitu antioksidan untuk menangkap radikal
bebas tersebut dan menstabilkannya sehingga tidak mengganggu kesehatan tubuh
(Kikuzaki dkk., 2002; Sibuea, 2003).
2
Antioksidan adalah senyawa pemberi elektron atau reduktor yang mampu
menginhibisi reaksi oksidasi dengan cara mencegah pembentukan radikal.
Antioksidan juga dapat menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal
bebas dan molekul yang sangat reaktif (Winarsi, 2007). Antioksidan di dalam
tubuh dapat menetralkan radikal bebas seperti enzim superoksida dismutase,
glutationin dan katalase. Antioksidan ini dapat diperoleh dari asupan makanan
yang mengandung vitamin C, vitamin E, betakaroten serta senyawa fenolik
(Prakash, 2001; Trevor, 1995).
Salah satu jenis bahan alam yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber
antioksidan adalah madu. Madu cairan manis yang berasal dari nektar tanaman
yang diproses oleh lebah dan disimpan dalam sel-sel sarang lebah (Adriani, 2011).
Jenis madu berdasarkan sumber nektarnya dapat dibagi menjadi dua, yaitu
monoflora dan poliflora. Madu monoflora merupakan madu yang diperoleh dari
satu tumbuhan utama. Madu monoflora juga disebut madu ternak. Madu poliflora
merupakan madu yang berasal dari nektar beberapa jenis tumbuhan bunga.
Contoh dari madu jenis ini adalah madu hutan (Suranto, 2007). Tiap jenis madu
memiliki efek radikal bebas yang berbeda-beda dimana jumlah dan kandungan
antioksidannya sangat bergantung dari sumber nektarnya (Ratnayani dkk., 2012).
Kandungan nutrisi dalam madu yang berfungsi sebagai antioksidan adalah
vitamin C, asam organik, enzim, asam fenolat, flavonoid dan beta karoten yang
bermanfaat sebagai antioksidan tinggi (Gheldof, 2002). Flavonoid dan asam
fenolat mampu menangkap radikal bebas sehingga membentuk radikal baru yang
relatif lebih stabil dan tidak berbahaya bagi tubuh (Widyaningsih, 2010). Banyak
flavonoid (apigenin, pinosembrin, pinobanksin, kaemferol, kuarsetin, galangin,
3
krisin, dan luteolin) dan asam fenolat (kafein, galat, sinamat, protocatechuic,
p-kumarik dan asam klorogenik) telah diidentifikasi dalam madu. Beberapa hasil
penelitian menunjukkan bahwa madu berfungsi sebagai sumber antioksidan alami
yang efektif mengurangi resiko penyakit jantung, kanker, penurunan sistem
kekebalan tubuh, katarak, proses inflamasi yang berbeda dan sebagainya
(Vulic dkk., 2015).
Pengukuran aktivitas antioksidan dalam menangkal radikal bebas dapat
dilakukan dalam beberapa cara seperti 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH),
Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC), Cupric Ion Reducing Antioxidant
(CUPRAC) dan Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) (Putri, 2014). Metode
yang digunakan dalam penentuan antioksidan madu adalah metode DPPH
(1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Metode ini dipilih karena memiliki beberapa
kelebihan seperti aktivitas penangkapan radikal bebas yang tinggi dalam pelarut
organik seperti metanol atau etanol pada suhu kamar, metodenya sederhana,
menggunakan sampel dalam jumlah sedikit dalam waktu yang singkat dan hanya
membutuhkan spektofotometer UV-Vis (Salamah dan Widyasari, 2015).
Penelitian ini dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut
metanol, n-heksan, DCM dan air. Pelarut yang digunakan bertujuan menarik
senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam madu berdasarkan perbedaan
kepolaran dari pelarut. Penggunaan pelarut ini mengacu pada penelitian Cahyati
dan Miladiyah (2014) yang menggunakan pelarut metanol untuk menarik
komponen fenolat yang terdapat dalam madu kopi, madu sawit, madu randu dan
rambutan yang sumber nektarnya berasal dari pohon kopi, pohon sawit, pohon
randu serta pohon rambutan. Berdasarkan uraian tersebut sehingga mendorong
4
peneliti untuk mengetahui lebih jauh efek antioksidan dari madu dengan
menggunakan pelarut yang berbeda.
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan masalah penelitian ini, antara lain:
1. kandungan senyawa aktif apa yang terdapat dalam madu poliflora?
2. apakah senyawa tersebut berpotensi sebagai antioksidan?
1.3 Maksud dan Tujuan Penelitian
1.3.1 Maksud Penelitian
Penelitian ini dimaksudkan untuk melakukan skrining senyawa aktif yang
terdapat dalam madu dan menguji potensinya sebagai antioksidan.
1.3.2 Tujuan Penelitian
Tujuan dalam penelitian ini adalah:
1. mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa aktif pada madu poliflora.
2. menguji aktivitas senyawa aktif dari madu sebagai antioksidan.
1.4 Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang potensi
madu sebagai salah satu sumber daya alam hutan penghasil senyawa aktif sebagai
antioksidan dan memberikan kontribusi terhadap ilmu pengetahuan dan penelitian
mengenai madu.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Gambaran Umum Madu
Madu merupakan cairan kental, berwarna kuning, manis dan memberi rasa
pada bahan makanan, dengan nilai biologis dan kalori (mengandung gula, vitamin
dan enzim), dikumpulkan dan diproduksi oleh lebah dari nektar atau jus manis
yang dapat ditemukan di berbagai bagian tanaman dan pohon, yang memiliki
banyak kegunaan tergantung dari jenisnya madu (Maria dkk., 1918). Madu alami
merupakan produk yang dihasilkan dari nektar dan simpanan manis yang
dikumpulkan dari berbagi sumber bunga yang diubah dan disimpan oleh lebah
madu di dalam sarangnya (Umarani dkk, 2015). Ada dua faktor yang diperlukan
untuk menghasilkan madu yaitu bunga yang nektarnya merupakan bahan baku
pembuatan madu dan sserangga yaitu lebah yang merupakan tenaga ahlinya
(Sarwono, 2011).
Madu adalah makanan alami yang diakui seluruh dunia memiliki nilai gizi
yang tinggi dan memiliki banyak efek kesehatan yang menguntungkan. Madu
umumnya terdiri dari karbohidrat (minimal 60% dengan perbandingan massa) dan
memiliki kemampuan khusus untuk mengurangi gula seperti fruktosa dan glukosa
sebagai sumber energi yang cepat setelah dikonsumsi. Komponen minor dalam
madu termasuk asam amino, vitamin, asam organik, mineral dan berbagai
fitokimia (Chua dan Adnan, 2014)
Sejak ribuan tahun yang lalu sampai sekarang ini, madu telah dikenal
sebagai salah satu bahan makanan atau minuman alami yang mempunyai peranan
6
penting dalam kehidupan. Madu memiliki manfaat dalam berbagai aspek, antara
lain dari segi pangan, kesehatan dan kecantikan. Madu merupakan salah satu obat
tradisional tertua yang dianggap penting untuk pengobatan penyakit pernafasan,
infeksi saluran pencernaan dan bermacam macam penyakit lainnya.
(Mulu dkk., 2004). Gambar 1 merupakan sarang lebah sumber madu hutan yang
diambil di hutan Desa Sadar, Dusun Kajuara, Kabupaten Bone, Sulawesi Selatan.
Gambar 1. Sarang Lebah Sumber Madu Hutan
Madu yang digunakan pada zaman dulu umumnya merupakan madu yang
dapat diambil dari pohon yang terdapat dalam hutan yaitu madu hutan. Madu
hutan dipanen langsung dari pohon di hutan tanpa proses penangkaran lebah.
Madu hutan dihasilkan oleh lebah Apis dorsata yaitu jenis lebah yang belum dapat
dibudidayakan karena sifatnya yang agresif dan liar (Muslim, 2014). Sumber
pakan dari lebah ini adalah tumbuh- tumbuhan obat yang banyak tumbuh di dalam
hutan hujan tropis di Indonesia. Madu hutan juga sangat baik untuk kesehatan
karena mengandung antibiotik alami (Suranto, 2007).
7
Madu berdasarkan sumbernya dapat dibedakan menjadi madu monoflora,
madu polifora dan madu ekstraflora. Madu monoflora merupakan madu yang
diperoleh dari satu tumbuhan utama. Madu monoflora disebut madu ternak,
karena lebah yang menghasilkan madu jenis ini pada umumnya diternakkan.
Sedangkan madu poliflora merupakan madu yang berasal dari nektar beberapa
jenis tumbuhan bunga. Contoh dari madu jenis ini adalah madu hutan
(Sarwono, 2001). Madu ekstraflora atau madu embun adalah madu yang
dihasilkan dari nektar di luar bunga, seperti daun, cabang dan batang tanaman.
Madu embun dihasilkan dari cairan hasil sekresi serangga, yang kemudian
eksudatnya diletakkan dibagian tanaman. Selanjutnya cairan itu dihisap dan
dikumpulkan oleh lebah madu. Madu ini berwarna gelap dengan aroma
merangsang (Sarwono, 2001).
Produksi lebah madu hutan memiliki kelebihan dibandingkan dengan
lebah madu lain diantaranya yaitu hasil dari nektar yang dikumpulkan lebah terasa
manis dan aromanya tajam serta menyengat. Selain itu, lebah hanya mengambil
makanan langsung dari alam sehingga hasil madunya tidak bercampur racun dari
pestisida (Muslim, 2014). Madu hutan juga memiliki kandungan antioksidan yang
lebih tinggi karena mengandung vitamin, beta karoten, flavonoid, asam fenolat,
polifenol, asam urat dan asam nikotinat (Soleha, 2015).
Kualitas madu ditentukan oleh beberapa hal diantaranya waktu pemanenan
madu, kadar air, warna madu, rasa dan aroma madu. Waktu pemanenan madu
harus dilakukan pada saat yang tepat, yaitu ketika madu telah matang dan rongga
rongga madu mulai ditutup oleh lebah. Madu bersifat menyerap air sehingga akan
bertambah encer dan akan menyerap kelembaban udara sekitarnya. Madu yang
8
normal dengan kadar air 18,8% atau kurang akan menyerap kelembaban dari
udara lebih dari 60%. Pemprosesan atau penyimpanan akan berpengaruh pada
higroskopisitas sehingga menyebabkan kandungan air yang akan bertambah
(Olaitan dkk., 2007).
2.2 Komposisi Kimiawi Madu
Madu dilaporkan mengandung sekitar 200 zat (campuran gula kompleks
dan juga sejumlah kecil unsur penyusun lainnya seperti mineral, protein, vitamin,
asam organik, flavonoid, asam fenolat, enzim dan fitokimia lainnya)
(White, 1978). Pada umumnya madu memiliki komposisi sebagai berikut: air
17%, fruktosa 38,19%, glukosa 31,29%, sukrosa 1,31%, gula lainnya 8,8%, total
asam 0,57%, abu 0,169%, nitrogen 0,041%, dan lain-lain 2,43%
(Bogdanov dkk., 1997). Asam organik banyak ditemukan dalam madu
diantaranya laktat, format, butirat, tartarat, piruvat, asetat, sitrat, oksalat sukinat,
malat, meleat, piroglutamat dan lainnya. Asam-asam organik ini dihasilkan dari
enzim glukosa oksidase pada dekstrosa (Mato dkk., 2003).
Komposisi kimia madu dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain:
komposisi nektar asal madu, keadaan iklim, topografi, jenis lebah, cara
pengolahan dan penyimpanan (Sihombing, 1997). Asam amino, karbohidrat,
protein, beberapa jenis vitamin serta mineral adalah zat gizi dalam madu yang
mudah diserap oleh sel-sel tubuh. Sifat antioksidan dari madu telah banyak
dikenal karena diketahui terdiri dari senyawa dengan sifat antioksidan seperti
flavonoid, asam fenolat, protein, asam amino, asam askorbat, HMF dan beberapa
enzim (Gheldof dan Engseth, 2002). Polifenol antioksidan yang terpenting adalah
9
flavonoid dan asam fenolat (Makawi dkk., 2009). Tabel 1 menunjukkan rata-rata
komposisi madu untuk masing-masing komponen.
Tabel 1. Komposisi Madu (Bogdanov dkk., 2008)
Komponen Madu Hutan
Nilai rata-rata (g/100 g) Rentang nilai (g/100g)
Kadar air 16,3 15-20
Fruktosa 31,8 28-40
Glukosa 26,1 19-32
Sukrosa 0,5 0,1-4,7
Disakarida lainnya 4,0 1-6
Melezitose 4,0 0,3-22,0
Erlose 1,0 0,1-6
Oligosakarida lainnya 3,0 0,1-6
Gula total 80,5 -
Mineral 0,9 0,6-2,0
Asam amino,protein 0,6 0,4-0,7
Asam 1,1 0,8-1,5
pH 5,2 4,5-6,5
Kandungan nutrisi dalam madu yang berfungsi sebagai antioksidan adalah
vitamin C, asam organik, enzim, asam fenolat, flavonoid dan beta karoten yang
bermanfaat sebagai antioksidan tinggi (Gheldof dan Engseth, 2002). Senyawa
dengan aktivitas antioksidan yang diteliti adalah senyawa fenolat. Senyawa
fenolat dalam tumbuhan dapat berupa fenol, antraquinon, asam fenolat, kumarin,
10
flavonoid, lignin dan tanin (Harborne, 1987). Senyawa fenolat telah diketahui
memiliki berbagai efek biologis seperti aktivitas antioksidan melalui mekanisme
sebagai pereduksi, penangkap radikal bebas, pengkhelat logam, peredam
terbentuknya oksigen singlet serta pendonor elektron
(Gheldof dan Engeseth, 2002). Pada tabel 2 menunjukkan hasil uji fitokimia
terhadap ekstrak sarang madu dan madu.
Tabel 2. Hasil Uji Fitokimia Ekstak Sarang Madu dan Madu (Idris, 2017).
Sampel Uji Pendahuluan
Flavonoid Asam Fenolik Tanin
Kanton Madu + + +
Kantong Polen + + +
Propolis + + +
Kantong Telur + + +
Madu + + -
Unsur mineral merupakan salah satu komponen yang sangat diperlukan
oleh makhluk hidup selain karbohidrat, lemak, protein dan vitamin
(Davis dan Mertz, 1987). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, diketahui
kandungan total mineral dalam madu sekitar 0,04 - 0,02 %. Banyak faktor yang
dapat mempengaruhi komposisi mineral yang terdapat pada madu, termasuk jenis
tanah, sumber bunga, kondisi iklim, pemupukan dan variabilitas yang besar
(White, 1978; Anklam, 1998).
Madu mengandung beberapa enzim yang diantaranya katalase, glukosa
oksidase dan peroksidase serta kandungan non enzimatik seperti karatenoid, asam
11
amino, protein, asam organik, produk reaksi Maillard dan lebih dari 150 senyawa
polifenol termasuk flavonols, asam fenolik, katekin dan turunan asam sinamat
yang dapat mendukung sifat antioksidan dari madu (Ferreira dkk., 2009).
2.3 Radikal Bebas
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil dan sangat
reaktif karena mengandung satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada
orbital terluarnya. Reaksi dari radikal bebas akan berlangsung secara terus
menerus dalam tubuh dan bila tidak dihentikan akan menimbulkan berbagai
penyakit seperti kanker, jantung, katarak, penuaan dini dan lain-lain. Oleh karena
itu, tubuh memerlukan substansi penting yaitu antioksidan yang mampu
menangkap radikal bebas tersebut sehingga tidak dapat menginduksi suatu
penyakit (Anonim, 2006).
Senyawa ini terbentuk dalam tubuh karena dipicu oleh banyak faktor
misalnya komponen makanan diubah menjadi energi melalui metabolisme. Pada
proses metabolisme ini seringkali terjadi kebocoran elektron sehingga sangat
mudah terbentuk radikal bebas seperti anion superoksida, hidroksil dan lainnya.
Radikal bebas juga dapat terbentuk dari senyawa lain yang pada awalnya bukan
radikal bebas tetapi mudah menjadi radikal bebas seperti hidrogen peroksida,
ozon dan lainnya. Kelompok senyawa itu sering disebut senyaw oksigen reaktif
(SOR) atau Reactive Oxygen Species (ROS) (Winarsi, 2007).
Reaksi oksidasi merupakan salah satu reaksi yang menyebabkan
terbentuknya radikal bebas yang sangat aktif yang dapat merusak struktur serta
fungsi sel. Namun reaktivitas radikal bebas itu dapat dihambat oleh sistem
12
antioksidan yang melengkapi sistem kekebalan tubuh. Radikal bebas juga bisa
terbentuk ketika komponen makanan diubah menjadi bentuk energi melalui proses
metabolisme yang memungkinkan terbentuknya radikal bebas seperti anion
superoksida, hidroksil dan lainnya (Winarsi, 2007).
Radikal bebas bersifat tidak stabil, sangat reaktif dan dapat mengambil
elektron dari molekul lain untuk mendapatkan pasangan elektronnya. Molekul
yang kehilangan elektron akan bersifat reaktif, terutama asam lemak tidak jenuh
yang kemudian ditransformasikan menjadi radikal bebas yang sangat reaktif
(Simon dkk., 2000). Radikal bebas yang terbentuk secara cepat akan menarik
elektron makromolekul biologis yang berada di sekitarnya seperti protein dan
asam nukleat (DNA) (Halliwell and Gutteridge, 1999). Gambar 2 merupakan
struktur dari senyawa 1,1-Diphenyl-2-picrylhidrazyl salah satu radikal bebas yang
bersifat tidak stabil.
Gambar 2. Struktur 1,1-Diphenyl-2-picrylhidrazyl (Yuhernita, 2011).
13
Jika makromolekul yang teroksidasi dan terdegradasi merupakan bagian
dari sel atau organel, maka dapat mengakibatkan kerusakan pada sel tersebut.
Target utama radikal bebas adalah protein, karbohidrat, asam lemak tak jenuh,
lipoprotein serta unsur-unsur DNA. Molekul-molekul target tersebut yang paling
rentan terhadap radikal bebas adalam asam lemak tak jenuh
(Halliwell and Gutteridge, 1999). Jika radikal bebas tidak diinaktivasi, reaktivitas
radikal bebas dapat menimbulkan perubahan kimiawi dan merusak seluruh tipe
makromolekul seluler seperti karbohidrat, protein, lipid dan asam nukleat
(Langseth, 2000). Salah satu uji untuk menentukan aktivitas antioksidan
menangkap radikal bebas adalah dengan metode DPPH
(1,1-Diphenyl-2-picrylhidrazyl) (Molyneux, 2004).
2.4 Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau
reduktan. Antioksidan memiliki berat molekul kecil tetapi mampu menginaktivasi
berkembangnya reaksi oksidasi dengan cara mencegah terbentuknya radikal.
Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi
dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif (Winarsi, 2007).
Tubuh manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas
radikal bebas yang secara kontinu dibentuk sendiri oleh tubuh. Bila jumlah
senyawa oksigen reaktif melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh, kelebihannya
akan menyerang komponen lipid, protein maupun DNA sehingga mengakibatkan
kerusakan-kerusakan yang disebut stress oksidatif (Winarsi, 2007). Antioksidan
dalam bahan makanan dapat berasal dari kelompok yang terdiri atas satu atau
14
lebih komponen pangan, substansi yang dibentuk dari reaksi selama pengolahan
atau dari bahan tambahan pangan yang khusus diisolasi dari sumber-sumber alami
dan ditambahkan ke dalam bahan makanan. Adanya antioksidan alami maupun
sintesis dapat menghambat oksidasi lipid, mencegah kerusakan, perubahan dan
degradasi komponen organik dalam bahan makanan sehingga dapat
memperpanjang umur simpanan (Rohdiana, 2001). Pada Gambar 3 merupakan
struktur flavonoid salah satu sumber antioksidan.
Gambar 3. Struktur Dasar Flavonoid (Redha, 2010)
Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase,
katalase dan glutation peroksidase), vitamin (misalnya vitamin E, C, A dan
β-karoten) dan senyawa lain (misalnya flavonoid, albumin, bilirubin,
seruloplasmin dan lainnya). Antioksidan enzimatis merupakan sistem pertahanan
utama terhadap kondisi stress oksidatif yang bekerja dengan cara mencegah
terbentuknya senyawa radikal baru. Selain antioksidan yang bersifat enzimatis ada
juga yang berupa senyaw nutrisi maupun non-nutrisi yang dapat diperoleh dari
asupan bahan makanan (Winarsi, 2007).
15
Flavonoid merupakan salah satu senyawa yang banyak digunakan sebagai
antioksidan. Flavonoid termasuk dalam golongan senyawa fenolik dengan strukur
kimia C6-C3-C6 yang memiliki satu cincin aromatic A, satu cincin aromatic B
serta cincin tengah heterosiklik yang mengandung oksigen (Hess, 1975).
Flavonoid berperan sebagai antioksidan dengan mendonasikan atom hidrogennya
atau melalui kemampuannya mengkhelat logam, berada dalam bentuk glikosida
(mengandung rantai samping glukosa) atau dalam bentuk bebas yang disebut
aglikon (Cupppett, 1954).
2.5 Metode DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazil)
Gambar 4. Reaksi antara DPPH dengan senyawa antioksidan (Frindryani, 2016)
Metode DPPH adalah suatu metode kolorimetri yang efektif dan cepat
untuk memperkirakan aktivitas antiradical atau antioksidan. Uji kimia ini secara
luas digunakan dalam penelitian produk alami untuk isolasi antioksidan fitokimia
dan untuk mengkaji seberapa besar kapasitas ekstrak dan senyawa murni dalam
16
menyerap radikal bebas. Metode DPPH berfungsi untuk mengatur elektron
tunggal seperti aktivitas transfer hidrogen sekaligus untuk mengukur aktivitas
penghambatan radikal bebas (Pratimasari, 2009). Metode ini merupakan metode
yang cepat, sederhana dan tidak membutuhkan biaya yang tinggi dalam
menentukan kemeampan antioksidan menggunakan radikal bebas
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil (Prakash, 2001).
Metode DPPH memberikan warna yang kuat pada panjang gelombang
517 nm dengan warna ungu gelap (Molyneux, 2004). Warna DPPH akan berubah
dari ungu menjadi kuning seiring penambahan antioksidan yaitu elektron tunggal
DPPH berpasangan dengn hidrogen dari antioksidan (Dehpour dkk., 2009).
Metode ini dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun cairan
(Prakash, 2001).
2.6 Apis Dorsata
Apis dorsata merupakan lebah madu yang dapat ditemukan hampir di
seluruh kepulauan di Indonesia kecuali Maluku dan Irian Jaya (Ruttner, 1988).
Secara morfologis, A. dorsata merupakan spesies lebah madu asli Indonesia
dengan ukuran tubuh paling besar. Selain itu spesies ini juga terkenal sangat
agresif di bandingkan dengan spesies lebah madu lain yang terdapat di Indonesia
(Hadiseosilo, 2001). Dua dari tiga subspesies A. dorsata yaitu A. dorsata dorsata
dan A.d. binghami terdapat di Indonesia dan subspecies ketiga A.d. breviligula
terdapat di Filipina (Sakagami dkk., 1980). Menurut Maa (1953), subspecies
A. dorsata binghami yang terdapat di pulau Sulawesi dan pulau sekitarnya
dianggap merupakan spesies tersendiri, yaitu A. binghami Cockerell.
17
Lebah madu Apis dorsata dalam bahasa Indonesia disebut lebah hutan atau
lebah raksasa. Lebah ini hidup di hutan lebat sebagai lebah madu liar. Sampai
sekarang belum pernah diternakkan dalam stup. Madu dan lilin yang
dihasilkannya merupakan produk terbaik dan madunya lebih encer daripada madu
lebah biasa. Panjang lebah madu pekerja sekitar 1,9 cm. Satu koloni terdiri dari
sisiran sarang yang sangat besar yang dihuni sampai berjuta-juta ekor lebah.
Sarang bagian atas digunakan untuk menyimpan madu dimana tebalnya sekitar
10 cm dan sarang bagian bawah dengan tebal 4 cm sebagai tempat mengerami
telur. Lebah raksasa Apis dorsata merupakan lebah paling produktif dimana satu
sisir sarang dapat menyimpan madu sebanyak 10-20 kg (Sarwono, 2001).
18
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah madu hutan, kertas
saring Whatman No 42, pelarut diklorometan p.a, pelarut n-heksan p.a, asam
askorbat, serbuk DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazil), metanol p.a, aluminium
foil, wrapping plastic dan tissue roll.
3.2 Alat Penelitian
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah wadah selai, batang
pengaduk, neraca analitik, kuas, rotary evaporator,corong, botol vial, falcon tube,
oven, pipet tetes, pipet volum, tabung reaksi, rak tabung, bulb, dan
spektrofotometer UV-Vis.
3.3 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dimulai pada bulan April sampai Oktober 2018 dengan
pengambilan sampel pada lokasi, selanjutnya dilakukan preparasi sampel dan
isolasi di Laboratorium Kimia Radiasi serta identifikasi kandungan senyawa
aktifnya di Laboratorium Biokimia Departemen Kimia Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin.
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pengolahan Sampel
Bahan yang digunakan adalah madu hutan dari Desa Sadar, Dusun
Kajuara, Kabupaten Bone yang selanjutnya di freeze dry selama 48 jam untuk
mengurangi jumlah air dalam madu.
19
3.4.2 Ekstraksi Madu dengan Metanol
Madu kering yang telah difreeze dry sebanyak 78 g selanjutnya dimaserasi
dengan metanol selama 2 x 24 jam sebanyak 3 kali. Setelah itu larutan dipisahkan
antara maserat dan residu dengan cara didekantasi. Maserat yang diperoleh
dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 55 ˚C maka akan diperoleh
ekstrak kental metanol sebesar 53,5234 g. Setelah itu dilakukan remaserasi
dengan melarutkan kembali residu dengan menggunakan metanol sebanyak
30 mL lalu diaduk dan didiamkan. Setelah larutan itu disaring dengan
menggunakan kertas saring Whatmann no. 42 dimana residu akan tertahan pada
kertas saring sedangkan maserat ditampung kedalam botol vial yang telah
diketahui bobotnya. Maka didapatkan maserat yang kemudian didievaporasi
menggunakan rotary evaporator pada suhu 55 ˚C sehingga didapatkan ekstrak
metanol sebesar 1,016 g.
3.4.3 Ekstraksi Madu dengan Pelarut Air
Ekstraksi dilakukan dengan menimbang sebanyak 2 gram madu kedalam
botol vial yang telah diketahui bobotnya. Kemudian madu dimaserasi dengan
menggunakan pelarut akuabides sebanyak 30 mL sambil disonikasi menggunakan
alat sonikator selama 2 x 30 menit. Setelah itu larutan didekantasi hingga
didapatkan maserat dan residu. Maserat yang didapatkan dievaporasi
menggunakan rotary evaporator pada suhu 55 ˚C, maka didapatkan ekstrak air
sebesar 0,3329 g.
3.4.4 Ekstraksi Madu dengan Pelarut DCM
Ekstraksi dilakukan dengan menimbang sebanyak 2 gram madu kedalam
falcon tube yang telah diketahui bobotnya. Kemudian larutan dimaserasi dengan
20
menggunakan pelarut DCM sebanyak 30 mL sambil disonikasi menggunakan alat
sonikator selama 2 x 30 menit. Setelah itu larutan didekantasi hingga didapatkan
maserat dan residu. Maserat yang didapatkan dievaporasi dengan cara maserat
dimasukkan kedalam botol vial yang telah diketahui bobotnya lalu ditutupi
dengan aluminium foil yang telah diberikan sedikit lubang kecil. Maserat itu
kemudian dibiarkan hingga pelarut DCM yang digunakan menguap dan
menyisakan ekstrak DCM madu. Setelah itu ditimbang dan didapatkan ekstrak
DCM sebesar 0,06829 g.
3.4.5 Ekstraksi Madu dengan Pelarut n-Heksan
Ekstraksi dilakukan dengan menimbang sebanyak 2 gram madu kedalam
falcon tube yang telah diketahui bobotnya. Lalu dimaserasi dengan menggunakan
pelarut n-heksan sebanyak 30 mL sambil disonikasi menggunakan alat sonikator
selama 2 x 30 menit. Setelah itu didekantasi hingga didapatkan maserat dan
residu. Maserat yang didapatkan dievaporasi dengan cara maserat dimasukkan
kedalam botol vial yang telah diketahui bobotnya lalu ditutupi dengan aluminium
foil yang telah diberikan sedikit lubang kecil. Maserat itu kemudian dibiarkan
hingga pelarut n-heksan yang digunakan menguap dan menyisakan ekstrak
n-heksan madu. Setelah itu ditimbang dan didapatkan ekstrak n-heksan sebesar
0,0058 g.
3.4.6 Uji Fitokimia
3.4.6.1 Uji Alkaloid
Sampel madu dan masing-masing ekstrak dimasukkan sebanyak 2 mL
kedalam 5 tabung reaksi yang berbeda, lalu ditambahkan 3 tetes reagen Mayer.
21
Terbentuknya endapan berwarna kuning menunjukkan adanya alkaloid. Pada Tes
Dragendorff, 2 mL sampel dan ekstrak masing-masing dimasukkan dalam tabung
reaksi, lalu ditambahkan H2SO4 2%. Endapan berwarna oranye kemerahan
menandakan positif alkaloid.
3.4.6.2 Uji Flavonoid
Sampel madu dan masing-masing ekstrak diteteskan pada plat tetes, lalu
ditambahkan logam Mg, setelah itu ditambahkan 5 mL metanol 95 %.
Terbentuknya warna merah tua menandakan merah tua menandakan positif
flavonoid.
3.4.6.3 Uji Tanin
Sampel madu dan masing-masing ekstrak dipipet 0,5 mL kedalam tabung
reaksi dan ditambahkan 1 mL akuades. Lalu ekstrak dan madu masing-masing
ditambahkan 3 tetes FeCl3. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna
hijau atau hitam kebiruan.
3.4.6.4 Uji Steroid
Sampel madu dan masing-masing ekstrak diteteskan sebanyak 2 tetes pada
plat tetes, lalu ditambahkan 2 tetes asetat anhidrat. Setelah itu ekstrak dan madu
masing-masing ditambahkan 2 tetes kloroform kemudian di teteskan H2SO4.
Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya cincin kecoklatan atau violet pada
perbatasan larutan.
3.4.6.5 Uji Saponin
Sampel madu dan masing-masing ekstrak dimasukkan 2 mL kedalam
tabung reaksi. Setelah ekstrak dan madu masing-masing ditambahkan akuades
lalu dikocok. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil.
22
3.4.7 Uji Bioaktivitas
3.4.7.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM
Pembuatan larut DPPH dilakukan dengan cara serbuk DPPH ditimbang
sebanyak 0,015 g kemudian dilarutkan dengan metanol p.a dalam labu ukur
hingga volume 100 mL lalu dihomogenkan.
3.4.7.2 Pembuatan Larutan Induk Asam Askorbat 500 ppm
Asam askorbat ditimbang sebanyak 0,005 g, lalu dilarutkan dengan 10 mL
metanol p.a, dihomogenkan sehingga didapatkan larutan asam askorbat
konsentrasi 500 ppm. Setelah itu larutan asam askorbat 500 ppm dipipet 0,1 mL
kemudian ditambahkan metanol p.a sebanyak 9,9 mL sehingga didapatkan larutan
asam askorbat konsentrasi 5 ppm dengan volume total 10 mL.
3.4.7.3 Pembuatan Larutan Induk Ekstrak n-Heksan 500 ppm
Ekstrak n-Heksan madu sebesar 0,0058 g yang diperoleh dilarutkan
dengan 11,6 mL metanol p.a sehingga didapatkan konsentrasi larutan 500 ppm.
3.4.7.4. Pembuatan Larutan Induk Ekstrak DCM 500 ppm
Ekstrak DCM madu sebesar 0,0682 g yang diperoleh dilarutkan dengan
11,4 mL metanol pa sehingga didapatkan konsentrasi larutan 6000 ppm. Setelah
itu larutan uji 500 ppm dengan mempipet larutan uji DCM 6000 ppm sebanyak
0,83 mL lalu ditambahkan metanol 9,17 mL hingga didapatkan volume 10 mL .
3.4.7.5 Pembuatan Larutan Induk Ekstrak Metanol 500 ppm
Ekstrak metanol madu sebesar 1,016 g yang diperoleh dilarutkan dengan
10,2 mL metanol pa sehingga didapatkan konsentrasi larutan 100.000 ppm.
23
Setelah itu larutan 500 ppm dibuat dengan mempipet larutan uji metanol
100.000 ppm sebanyak 0,05 mL lalu ditambahkan metanol 9,95 mL hingga
didapatkan volume 10 mL.
3.4.7.6 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Air
Ekstrak air madu sebesar 0,3329 g yang diperoleh dilarutkan dengan
10,1 mL metanol p.a sehingga didapatkan konsentrasi larutan 33.000 ppm.
Setelah itu larutan uji 500 ppm dibuat dengan mempipet larutan ekstrak air
33.000 ppm sebanyak 0,15 mL lalu ditambahkan metanol 9,85 mL hingga
didapatkan volume 10 mL .
3.4.7.7 Pembuatan Larutan Induk Sampel Madu 500 ppm
Sampel madu ditimbang sebanyak 0,005 g. Kemudian madu dilarutkan
dengan metanol p.a sebanyak 10 mL kedalam botol vial kosong setelah itu
dihomogenkan.
3.4.7.8 Penentuan Aktivitas Antioksidan Asam Askorbat dengan Metode
DPPH
Uji aktivitas antioksidan asam askorbat dilakukan dengan membuat deret
standar asam askorbat terlebih dahulu dengan cara memipet asam askorbat
konsentrasi 5 ppm masing-masing 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL, 2 mL dan 4 mL
kedalam tabung reaksi yang berbeda untuk membuat deret standar 0,25 ppm,
0,5 ppm, 1 ppm, 2 ppm dan 4 ppm. Setelah larutan asam askorbat ditambahkan
masing-masing 1 mL larutan DPPH 0,4 mM. Setelah itu larutan asam askorbat
ditambahkan metanol p.a masing-masing 3,75 mL, 3,5 mL, 3 mL, 2 mL dan 0 mL
sehigga didapatkan volume total 5 mL untuk masing-masing deret standar.
24
Setelah deret standar diinkubasi dengan cara ditempatkan pada ruangan yang
gelap pada suhu ruang selama 30 menit. Kemudan diukur serapannya pada
panjang gelombang maksimum 515 nm.
3.4.7.9 Penentuan Aktivitas Antioksidan Ekstrak dengan Metode DPPH
Ekstrak air, metanol, n-heksan, DCM dan sampel madu dengan
konsentrasi 500 ppm masing-masing dipipet sebanyak 0,1 mL, 0,2 mL, 0,4 mL,
0,8 mL dan 1,6 mL untuk membuat deret ukur 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm
dan 160 ppm dari masing-masing ekstrak. Setelah itu larutan deret ukur
ditambahkan masing-masing 1 mL larutan DPPH 0,4 mM dan ditambahkan
metanol p.a hingga didapatkan volume total 5 mL.
Setelah itu dibuat larutan kontrol dengan mempipet larutan DPPH 0,4 mM
sebanyak 1 mL kedalam tabung reaksi. Setelah itu volume dicukupkan sampai
5 mL dengan menggunakan metanol p.a. Setelah itu deret ukur dari
smasing-masing ekstrak dan larutan kontrol diinkubasikan pada suhu ruang
selama 30 menit diruang yang gelap. Kemudian diukur pada panjang gelombang
maksimum 515 nm.
25
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Maserasi Sampel
Maserasi adalah proses ekstraksi suatu sampel menggunakan pelarut
dengan melakukan pengadukan pada temperatur ruangan. Tujuan dari maserasi
yaitu untuk menarik senyawa aktif dalam suatu sampel yang tahan dalam
pemanasan maupun tidak tahan pemanasan (Istiqomah, 2013). Proses maserasi
penelitian ini menggunakan empat pelarut yang berbeda yaitu metanol, DCM,
n-Heksan dan air. Maserasi dengan pelarut yang berbeda-beda bertujuan untuk
membandingkan kemampuan pelarut dalam menarik senyawa dari dalam sampel
madu berdasarkan kepolaran dari tiap pelarut dan mengetahui kemampuan
antioksidan dari masing-masing ekstrak dari setiap pelarut.
Sampel madu kering sebanyak 78 g yang dimaserasi menggunakan pelarut
metanol p.a selama 2 x 24 jam dan diremaserasi medapatkan ekstrak kental
metanol sebanyak 54,5394 g. Ekstrak yang didapatkan dari proses maserasi
dengan pelarut metanol sangat banyak. Hal ini disebabkan karena pelarut metanol
merupakan pelarut yang universal yang mampu mengikat semua komponen kimia
yang terdapat pada bahan alam baik yang bersifat non polar, semi polar dan polar.
Metanol juga mudah masuk kedalam sel melewati dinding sel bahan alam
sehingga metabolit sekunder yang terdapat dalam sitoplasma akan terlarut dalam
pelarut dan senyawa akan terekstraksi sempurna (Lenny, 2016).
Pada proses ekstraksi dengan n-heksan, air dan dcm menggunakan sampel
sebanyak 2 g, didapatkan ekstrak sampel masing-masing pelarut yaitu ekstrak
26
n-heksan 0,0058 g, ekstrak air 0,3329 g dan ekstrak dcm sebesar 0,0682 g.
Kemampuan pelarut n-heksan, air dan DCM tidak sebaik pelarut metanol yang
dapat menarik senyawa aktif. Pelarut n-heksan, air dan DCM hanya mampu
menarik senyawa aktif dari dalam sampel madu yang memiliki kepolaran sama
dengan pelarut n-heksan, air dan DCM sedangkan DCM mampu menarik senyawa
aktif dengan sangat baik sehingga mendapatkan ekstrak yang relatif banyak.
4.2 Uji Fitokimia
Uji fitokimia merupakan tahap awal penting yang dilakukan untuk
mengetahui jenis senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak sampel sebelum
dilakukan proses isolasi lebih lanjut. Pada penelitian ini ekstrak metanol, ekstrak
DCM, ekstrak n-heksan, ekstrak air dari madu, serta sampel madu itu sendiri
dilakukan uji fitokimia berupa uji flavonoid, tanin, terpenoid, steroid dan alkaloid.
Adapun data yang diperoleh dapat dilihat pada Table 3.
Tabel 3. Data Pengujian Kandungan Metabolit Sekunder Ekstrak Metanol, DCM,
n-Heksan, Air dan Sampel Madu
Jenis Sampel
Pengamatan Sampel
Flavonoid Tanin Saponin Steroid Alkaloid
Madu + + + + +
Ekstrak Air - + + + +
Ekstrak Metanol + + + + +
Ekstrak DCM - + - + +
Ekstrak n-Heksan - + - - +
27
Berdasarkan hasil pengujian fitokimia diketahui bahwa ekstrak metanol
dan sampel madu positif mengandung senyawa flavonoid, sedangkan ekstrak
DCM, n-heksan dan air tidak mengandung senyawa flavonoid. Hasil positif
mengandung senyawa flavonoid dibuktikan dengan terbentuk warna merah
(ekstrak dan sampel madu + logam Mg + HCl + etanol).
Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus
hidroksil, karena itu flavonoid umunya larut dalam pelarut polar
(Harborne, 1987). Pada uji ini logam Mg dan HCl akan mereduksi inti benzopiron
yang terdapat pada struktur flavonoid sehingga membentuk perubahan warna
menjadi merah atau jingga. Jadi jika dalam suatu ekstrak terdapat senyawa
flavonoid maka akan terbentuk garam flavilium yang berwarna merah atau jingga
saat penambahan logam Mg dan HCl (Prashant dkk., 2011). Pada gambar 5
menunjukkan pembentukan garam flavilium pada uji fitokimia flavonoid.
Gambar 5. Mekanisme Pembentukan Garam Flavilium (Setyowati dkk., 2014).
28
Pada uji tanin, semua ekstrak dan sampel madu memberikan hasil positif
dengan warna hijau. Penambahan ekstrak dengan FeCl3 dalam air menimbulkan
warna hijau yang disebabkan karena tanin bereaksi dengan ion Fe3+ membentuk
senyawa kompleks (Setyowati dkk., 2014). Gambar 6 merupakan reaksi uji
fitokimia tanin.
Gambar 6. Reaksi Uji Fitokimia Tanin (Setyowati dkk., 2014).
29
Uji steroid memberikan hasil postif pada ekstrak metanol, DCM, air dan
sampel madu sedangkan pada ekstrak n-heksan memberikan hasil negatif. Hasil
positif ditandai dengan terbentuknya cincin coklat pada batas larutan saat
ditambah dengan H2SO4. Prinsip mekanisme reaksi dalam uji steroid ialah
kondensasi atau pelepasan H2O dan penggabungan karbokation
(Setyowati dkk., 2014). Gambar 7 merupakan reaksi uji fitokimia steroid.
Gambar 7. Reaksi Uji Fitokimia Steroid (Setyowati dkk., 2014).
30
Berdasarkan hasil pengujian diketahui semua ekstrak dan sampel
mengandung alkaloid. Hasil positif alkaloid pada uji Dragendorff ditandai dengan
terbentuknya endapan coklat muda sampai kuning. Endapan tersebut adalah
kalium-alkaloid. Pada pembuatan pereaksi Dragendorff, bismuth nitrat dilarutkan
dalam HCl agar tidak terjadi reaksi hidrolisis karena garam-garam bismuth mudah
terhidrolisis membentuk ion bismutil (BiO+). Gambar 8 merupakan reaksi uji
fitokimia alkaloid.
Gambar 8. Reaksi Uji Fitokimia Alkaloid (Marliana dkk., 2005)
Ion Bi3+ dibiarkan tetap berada dalam larutan maka larutan itu
ditambahkan asam sehingga keseimbangan akan bergeser kearah kiri. Selanjutnya
ion Bi3+ dari bismut nitrat akan bereaksi dengan kalium iodida membentuk
endapan hitam bismuth(III) iodida yang kemudian melarut dalam kalium iodida
berlebih membentuk kalium tetraiodobismutat. Pada uji dengan pereaksi
Dragendorff, nitrogen digunakan membentuk ikatan kovalen koordinat dengan K+
yang merupakan ion logam sehingga terbentuk endapan kalium-alkaloid berwarna
coklat hingga kuning (Setyowati dkk., 2014).
31
Hasil pengujian saponin pada sampel madu, menunjukkan hasil positif
pada ekstrak air, ekstrak metanol dan sampel madu yang ditandai dengan
terbentuknya busa. Timbulnya busa menunjukkan adanya glikosida yang
mempunyai kemampuan membentuk buih dalam air yang terhidrolisis menjadi
glukosa dan senyawa lainnya (Setyowati dkk., 2014). Gambar 9 merupakan reaksi
uji fitokimia saponin.
Gambar 9. Reaksi Uji Fitokimia Saponin (Marliana dkk., 2005)
4.3 Uji Bioaktivitas
Ekstrak metanol, ekstrak dcm, ekstrak n-heksan dan ekstrak air dari madu
diuji daya hambatnya terhadap radikal bebas menggunakan radikal DPPH. DPPH
akan bereaksi dengan suatu senyawa antioksidan yang dapat mendonorkan radikal
hidrogen. Radikal DPPH ini akan terus tereduksi membentuk DPPH-H dan
32
warnanya akan berubah dari ungu pudar menjadi kuning ketika elektron radikal
bebas DPPH berpasangan dengan sebuah hidrogen penangkap radikal bebas dari
suatu antioksidan. Perubahan warna yang terjadi tersebut akan memberikan nilai
absorbansi yang akan dibaca pada panjang gelombang maksimum menggunakan
spektrofotometer UV-Vis (Idris, 2017). Berikut reaksi antara senyawa antioksidan
(flavonoid) dengan radikal DPPH pada gambar 10.
Gambar 10 . Reaksi Flavonon dengan DPPH (Idris, 2017).
33
Pengujian juga dilakukan pada sampel madu yang belum diekstrak untuk
dijadikan pembanding dalam menentukan sampel yang memiliki aktivitas
antioksidan yang tertinggi. Hasil uji aktivitas antioksidan dari madu dapat
dianalisa dari pengukuran absorbansi pada panjang gelombang maksimum
515 nm sehingga dapat diketahui nilai aktivitas antioksidan dari senyawa terhadap
radikal bebas DPPH yang dapat diketahui berdasarkan perhitungan pengurangan
antara absorban kontrol yang dikurangi absorban sampel yang kemudian dibagi
dengan absorban kontrol sehingga didapatkan aktivitas antioksidan (%). Pada
tabel 4 merupakan aktivitas antioksidan (%) dari ekstrak dan sampel.
Tabel 4. Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Sampel Madu
No Konsentrasi
(µg/mL)
Aktivitas Antioksidan (%)
Ekstrak Sampel
Madu MeOH DCM n-Heksan Air
1 10 0,24 1,41 2,42 1,14 2,03
2 20 0,47 2,34 2,64 1,36 2,33
3 40 1,88 3,98 3,30 1,82 2,62
4 80 4,94 6,32 4,40 2,95 3,49
5 160 10,82 12,18 6,59 5,45 4,65
Berdasarkan Tabel 4 menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan terbesar
terdapat pada ekstrak DCM dengan konsentrasi 160 µg/mL sebesar 12,18 % dan
ekstrak metanol pada konsentrasi 160 µg/mL sebesar 10,82 %. Aktivitas
antioksidan terkecil terdapat pada ekstrak metanol dengan konsentrasi 10 µg/mL
serta 20 µg/mL masing-masing sebesar 0,24 % dan 0,47 %. Pada Tabel 4 dapat
34
diketahui persen inhibisi (aktivitas antioksidan) berbanding lurus dengan
konsentrasi, yang artinya semakin meningkat konsentrasi maka aktivitas
antioksidan juga akan meningkat. Konsentrasi tertinggi dari ekstrak dan sampel
semua berada pada konsentrasi 160 µg/mL. Data ini sesuai dengan penelitian yang
telah dilakukan oleh Hernani dan Rahardjo (2005) yang menyatakan bahwa
presentasi penghambatan (persen inhibisi terhadap aktivitas radikal bebas akan
meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi. Perbandingan aktivitas
antioksidan terhadap ekstrak dan sampel dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11. Diagram Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Madu
Berdasarkan data aktivitas antioksidan yang diperoleh, maka dibuat
persamaan regresi linear untuk menyatakan hubungan antara konsentrasi larutan
uji (x) dengan aktivitas antioksidan (y) untuk memperoleh nilai IC50. Semakin
besar aktivitas antioksidan maka nilai IC50 akan semakin kecil, dimana nilai IC50
berbanding terbalik dengan aktivitas antioksidan suatu senyawa yang terkandung
35
di dalam ekstrak maupun asam askorbat. Tabel 3 merupakan data hasil uji IC50
ekstrak dan sampel madu.
Tabel 5. Data Hasil Uji IC50 Ekstrak dan Sampel.
No Larutan Uji IC50(μg/mL) Metabolit Sekunder
1 Madu 2826,471 Flavonoid, tanin, alkaloid, steroid,
saponin
2 Ekstrak Air 1698,345 Tanin, saponin, steroid, alkaloid
3 Ekstrak Metanol 683,153 Flavonoid, tannin, alkaloid, steroid,
saponin
4 Ekstrak DCM 701,743 Tanin, steroid, alkaloid
5 Ekstrak n-Heksan 1709,536 Tanin, alkaloid
Suatu senyawa dikatakan sebagai senyawa dengan kemampuan
antioksidan yang sangat kuat apabila memiliki nilai IC50 kurang dari 50 μg/mL.
Senyawa dengan antioksidan kuat apabila memiliki IC50 antara 50-100 μg/mL,
antioksidan sedang dengan nilai IC50 100-150 μg/mL dan lemah apabila memiliki
nilai IC50 antara 150-200 μg/mL (Molyneux, 2004). Pada Tabel 5 menunjukkan
sampel madu dengan hasil uji fitokimia positif mengandung flavonoid, tanin,
alkaloid, steroid serta tanin memberikan hasil IC50 sebesar 2826,471 μg/mL.
Ekstrak air dengan hasil uji fitokimia yang positif mengandung tanin,
saponin, steroid dan alkaloid memiliki nilai IC50 1698,345 μg/mL. Ekstrak
metanol yang mengandung flavonoid, tanin, alkaloid, steroid dan saponin
memiliki nilai IC50 683,153 μg/mL. Ekstrak DCM yang positif mengandung tanin,
steroid dan alkaloid pada uji fitokimia memiliki nilai IC50 701,743 μg/mL dan
ekstrak n-heksan yang mengandung tanin serta alkaloid memiliki nilai IC50
sebesar 1709,536 μg/mL.
36
Perbedaan jenis pelarut akan mempengaruhi kemampuan aktivitas dari
ekstrak (Suryani dkk., 2016). Pelarut n-heksan hanya mampu menarik senyawa
bersifat non polar dan pelarut DCM hanya mampu menarik senyawa bersifat semi
polar. Ekstrak yang menggunakan pelarut metanol memiliki aktivitas antioksidan
lebih baik dari yang lain karena pelarut metanol bersifat universal sehingga
mampu mengikat semua jenis komponen kimia yang terdapat pada madu baik
yang bersifat non polar, semi polar dan polar (Suryani dkk., 2016). Grafik
peningkatan nilai IC50 dari sampel dan ekstrak sampel madu dapat dilihat pada
Gambar 12.
Gambar 12. Grafik nilai IC50 Ekstrak dan Sampel Madu
Pada Gambar 12 menunjukkan kemampuan antioksidan meningkat dengan
semakin meningkatnya kepolaran pelarut. Nilai IC50 dari madu yang merupakan
sampel madu murni yaitu 2826,471 μg/mL, kemudian meningkat pada sampel
madu yang diekstrak dengan air IC50 1698,345 μg/mL. Madu yang ekstrak
dengan pelarut polar yaitu metanol memiliki nilai IC50 tertinggi yaitu
683,153 μg/mL. Setelah itu nilai IC50 berturut-turut menurun pada ekstrak DCM
37
yang merupakan pelarut semi polar yaitu 701,743 μg/mL dan ekstrak n-heksan
yang merupakan pelarut non polar yaitu 1709,536 μg/mL.
Ekstrak metanol memiliki kemampuan antioksidannya yang lebih baik dari
ekstrak lain bahkan sampel madu murni, walaupun berdasarkan nilai IC50 yang
diperoleh ekstrak metanol sangat lemah walaupun pada uji fitokimia positif
mengandung flavonoid, salah satu senyawa aktif yang berperan dalam aktivitas
antioksidan. Hasil ini menunjukkan bahwa semua ekstrak dan sampel memiliki
kemampuan antioksidan yang sangat lemah karena tidak satupun mendekati
ketentuan nilai kuat lemahnya kemampuan antioksidan dari suatu senyawa yang
telah ditetapkan.
Uji DPPH pada flavonoid murni memiliki hasil yang berbeda tergantung
dari jenis flavonoidnya. Flavonoid kuersetin memiliki nilai IC50 sangat efektif
yaitu 8,5 μg/mL yang dapat menghambat 50% radikal DPPH. IC50 dari flavonoid
kuersetin ini bahkan lebih kuat dibanding dengan larutan standar vitamin C yaitu
19,6 μg/mL dan Trolox (36,9 μg/mL). Flavonoid luteolin dan rhamnetin memiliki
IC50 yang hampir sama yaitu 53 μg/mL dan 59 μg/mL (Majewska dkk., 2011).
Tabel 6. Data Hasil Uji IC50 Asam Askorbat
No Konsentrasi
(μg/mL)
Aktivitas
Antioksidan (%)
Nilai IC50 (μg/mL)
1 0,25 27,10 2,597
2 0,5 30,70
3 1 35,25
4 2 42,69
5 4 64,03
Data IC50 dari asam askorbat pada table 6 digunakan untuk
membandingkan hasil IC50 dari ekstrak dan sampel. Nilai IC50 dari asam askorbat
38
yaitu 2,97 μg/mL yang menyatakan bahwa kemampuan antioksidan dari asam
askorbat sangat kuat.
Gugus hidroksil dan ikatan rangkap terkonjugasi menjadi aspek penting
yang sangat mempengaruhi kuatnya aktivitas antioksidan dari suatu senyawa.
Asam askorbat memiliki aktivitas antioksidan kuat karena memiliki beberapa
gugus hidroksil yang memiliki kemampuan menangkap radikal bebas dan
membentuk radikal baru. Radikal yang terbentuk tersebut mampu distabilkan
lebih lanjut dengan adanya delokalisasi kedalam cincin sehingga membentuk
radikal yang lebih stabil.
39
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan maka dapat diketahui
bahwa ekstrak metanol memberikan hasil positif pada flavonoid, tanin, saponin,
steroid dan alkaloid dengan nilai IC50 metode DPPH sebesar 683,153 µg/mL.
Ekstrak DCM memberikan hasil positif tanin, steroid dan alkaloid dengan nilai
IC50 701,743 µg/mL. Ekstrak n-heksan positif mengandung tanin dan alkaloid
dengan nilai IC50 1709,536 µg/mL, ekstrak air positif tanin, saponin, steroid,
alkaloid dengan nilai IC50 1698,345 µg/mL. Sampel madu positif mengandung
semua aspek yang diujikan dengan nilai IC50 2826,471 µg/mL. Maka dapat
disimpukan bahwa sampel madu dan masing-masing ekstraknya memiliki
kemampuan antioksidan yang sangat lemah.
5.2 Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai uji antioksidan dari madu
menggunakan metode selain metode DPPH.
40
DAFTAR PUSTAKA
Adriani, R., 2011, Identifikasi dan Karakterisasi Sifat Kimia dan Sifat Fisik dari
Madu Asli dengan Madu yang Dijual di Pasaran Medan, Skripsi,
Departemen Kimia,FMIPA Universitas Sumatera Utara, Medan.
Anklam, E., 1998, A Review of the Analytical Methods to Determine the
Geographical and Botanical Origin of Honey, Food Chem, 63; 549-562.
Anonim, 2006, Antioksidan Makanan Terbaik, Oktober 14,
(http://www.lampungspot. com/cetak/berita.php) 2 Oktober 2011.
Bogdanov, S., Jurendic, T., Sieber, R. dan Gallman, P., 2008, Honey for Nutrient
and Health: a Review, American Journal of the College of Nutrition, 27:
677-689.
Cahyati, I. dan Miladiyah, I., 2014, Kandungan Komponen Fenolat, Kadar
Fenolat Total dan Aktivitas Antioksidan Madu dari Beberapa Daerah di
Jawa dan Sumatera, MGMI, 6(1): 11-24.
Chua, L.S. dan Adnan, N.A, 2014, Biochemical and Nutritional Components of
Selected Honey Samples, Acta Scientiarum Polonorum 13(2): 169-179.
Cuppett, S., M, Schrepf dan C, Hall., 1954, Natural Antioxidant – Are They
Reality, Foreidoon Shahidi : Natural Antioxidants, Chemistry, Health
Effect and Applications, AOC Press, Illinois.
Davis, G.K. dan Mertz, W., 1987, Trace Elements in Human and Animal
Nutrition, Academic Press, 301-364.
Dephour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S. dan Mohammad, N.S., 2009,
Anioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafeotida and Its
Essential Oil Composition, Grass Aceties, 60(4): 405-412.
Ferreira, I.C.F.R., Aires, E., Barreira, J.C.M. dan Estevinho, L.M., 2009,
Antioxidant of Portuguese Honey Sample: Different Contributions of The
Entire Honey and Phenolic Extract, Food Chemistry, 93: 857-863.
Frindryani, L.F., 2016, Isolasi d Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa dalam Ekstrak
Etanol Temu Kunci (Boesenbergia pandurata) dengan Metode DPPH,
Skripsi tidak diterbitkan, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Universitas Negeri Yogyakarta, Yogyakarta.
Gheldof, N dan Engeseth, N.J., 2002, Antioxidant Capacity of Honeys from
Various Floral Sources based on Determination of Oxygen Radical
Absorbance Capacity and Inhibition of in vitro Lipoprotein Oxidant in
41
Human Serum Samples, Journal of Agricultural and Food Chemistry,
50(10): 3050-3055.
Hadiseosilo, S., 2001, Review: Keanekaragaman Spesies Lebah Madu Asli
Indonesia, Biodiversitas, 2(1): 123-128.
Halliwell, B. dan Gutteridge, J.M.C., 1999, Free radical in Biology and Medicine, 3rd, Oxford.
Harbone, J.B., 1987, Metode Fitokimia, Edisi kedua, ITB, Bandung.
Hernani dan Rahardjo, M., 2005, Tanaman Berkhasiat Antioksidan, Penebar
Swadaya, Depok.
Hess, D., 1975, Plant Physiology, Molecular, Biochemical and Physiological
Fundamentals of Metabolism and Development, Toppan Company,
Singapura.
Idris, N.A., 2017, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Sarang Lebah dan Madu
Hutan daru Luwu Utara dengan Metode DPPH (1,1-Difenil-2-
Pikrilhidrazil),Skripsi tidak diterbitkan, Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan
Teknologi, UIN Alauddin, Makassar.
Istiqomah, 2013, Perbandingan Metode Ekstraksi Maserasi dan Soxhletasi
terhadap Kadar Piperin Buah Cabe Jawa (Piperis retrofracti fructus),
Skripsi tidak diterbitkan, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan,
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta.
Kikuzaki, H., Hisamoto, M., Hirose,K., Akiyama, K. dan Taniguchi, H., 2002,
Antioxidants Properties of Ferulic Acid and Its Related Compound,
Journal Agricultural Food Chemistry, 50: 2161-2168.
Langseth, L., 2000, Antioxidant and Their Effect on Health, di dalam : Schmild, M. K., dan Labuza, T. P., Essentials of Fungtional Foods, Aspen Publisher Inc. Gaethersburg, Maryland.
Lenny, S., 2006, Senyawa Flavonoid, Feni Propanoida dan Alkaloida (Online),
(http://library.usu.ac.id/download/fmipa/06003489.pdf, diakses 30 November 2018).
Maa, T.C., 1953, An Inquiry inti the Systematics of the Tribus Apidini or
Honeybees (Hymenoptera), Treubia, 21: 525-640. Majewska, M., Skrzycki, M., Podsiad, M. dan Czeczot, H., 2011, Evaluation of
Antoxidant Potential of Flavonoids: An in Vitro Study, Acta Poloniae Pharmaceutica-Drug Research, 68(4): 611-615.
42
Makawi, S.Z.A., Gadkariem, E.A. dan Ayoub, S.M.H., 2009, Determination of Antioksidan Flavonoid in Sudanese Honey Samples by Solid Phase Extraction and Hgh Performance Liquid Chromatography, E-Journal of Chemistry, 6: 429-437.
Maria, P., Roxana, A dan Simona, V., 1918, Study Concerning Microbiological
and Physical-Chemical Characteristics of Transylvania Honey, 1-13.
Marliana, S.D., Suryanti, V. dan Suyono., 2005, Skrining Fitokimia dan Analisis
Kromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechium
edule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol, Biofarmasi, 3(1):26-31.
Mato, I., Huidobro, J.F., Lozano, J.S. dan Sancho, M.T., 2003, Significance of
Non-aromatic Organic Acid in Honey, J.Food Prot, 66(12): 2371-2376.
Molyneux, P., 2004, The use of thr Stable Free Radical Dyphenylpicrylhydrazil
(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Journal Science and
Technology, 26: 211-219.
Mulu, A., Tessema, B. dan Derby, F., 2004, In vitro Assesment of The
Antimicrobial
Potential of Honey on Common Human Pathogens, Ethiop.J. Health Dev,
18 (2).
Muslim, T., 2014, Sebaran dan Karakteristik Persarangan Apis dorsata Binghami,
Prosiding Seminar KSDA : 67-78.
Olaitan, P.B., Adeleke, O.E. and Ola, I.O., 2007, Honey: A reservoir for
microorganisms and an inhibitory agent for microbes, African Health Sci,
7(3): 159–165.
Parwata, O.A., Ratnayani, K. dan Listya, A., 2010, Aktivitas Antiradikal Bebas
serta Kadar Beta Karoten pada Madu Randu (Ceiba pentandra) dan Madu
Kelengkeng (Nephelium longata L.), Jurnal Kimia, 4(1): 56-42.
Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity, Medallion Laboratories : Analytical
Progres, 19(2): 1-4.
Prashant, T., Bimlesh, K., Mandeep, K., Gurpreet, K. dan Harleen, K., 2011,
Phytochemical Screening and Extraction : A Review, International
Pharmaceutica Sciencia, 2(1): 100-106.
Pratimasari, R., 2009, Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Buah Carica Papaya L.
dengan Metode DPPH dan Penetapan Kadar Fenolik serta Flavonoid
Totalnya, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta,
Surakarta.
43
Ratnayani, K., Dwi Adhi, N.M.A dan Gitadewi, I.G.A.M.A.S., 2012, Penentuan
Kadar Glukosa dan Fruktosa pada Madu Randu dan Madu Kelengkeng
dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Jurnal Kimia, 2(2): 77-
86.
Redha, A., 2010, Flavonoid : Struktur, Sifat Antioksidan dan Perannya dalam
Sistem
Biologis,(Online),(http://mobile.repository.polnep.ac.id/xmlui/bitstream/ha
ndle/123456789/144/13-Abdi.pdf?sequence=1, diakses 1 Desember 2018).
Rohdiana, D., 2001, Aktivitas Daya Tangkap Radikal Polifenol dalam Daun Teh,
Jurnal Indonesia, 12(1): 53-58.
Ruttner, F., 1988, Biogeography and Taxonomy of Honeybees, Springer-Verlag
Berlin Heidelberg, New York.
Sakagami, F.S., Matsumura, T. dan Ito, K., 1980, Apis Laboriosa in Himalaya, the
Little Known World Largest Honeybee (Hymnoptera, Apidae), Insect
Matsumurana, 19: 47-77.
Salamah, N. dan Widyasari, E., 2015, Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol
Daun Kelengkeng (Euphoria (L) Steud) dengan Metode Penangkalan
Radikal 2,2’-difenil-1-pikrilhidrazil, Pharmaciana, 5(1): 25-34.
Sarwono, B., 2001, Kiat Mengatasi Permasalahan Praktis Lebah Madu, Cetakan
Pertama, Agro Media Pustaka, Jakarta.
Setyowati, W.A., Ariani, S.R.D., Mulyani, B. dan Rahmawati, C.P., 2014,
Skrining Fitokimia dan Identifikasi Komponen Utama Ekstrak Metanol
Kulit Durian (Durio zibethinus Murr.) Varietas Petruk, Makalah disajikan
dalam Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia di Surakarta
Angkatan VI, Program Studi Pendidikan Kimia Jurusan PMIPA FKIP
UNS, Surakarta, 21 Juni.
Sibuea, P., 2003, Antioksidan Senyawa Ajaib Penangkal Penuaan Dini, Sinar
Harapan, Yogyakarta
Sihombing, D., 1997, Ilmu Ternak Lebah Madu, Gadjah Mada Press, Yogyakarta.
Simon, H.U., Yehia, A.H. dan Schaffer, F.L., 2000, Role of Reactive Oxygen
Species (ROS) in Apoptosis Induction, Apoptosis Journal, 5(5): 415-418.
Soleha, R.M., 2015, Pengaruh Suhu Pemanasan dan Lama Penyimpanan
terhadap Kualitas Madu asal Desa Terasa berdasarkan Kandungan 5-
(Hidroksimetil) Furan-2-Karbaldehida(HMF), Skripsi tidak diterbitkan,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Hasanuddin, Makassar.
44
Sumarlin, L.O., Muawanah, A. dan Masitoh, P.W., 20014, Aktivitas Antikanker
dan Antioksidan Madu di Pasaran Lokal Indonesia, Jurnal Ilmu Pertanian
Indonesia (JIPI), 19(3): 136.
Suranto, A., 2007, Terapi Madu, Penebar Plus, Jakarta.
Suryani, N.C., Permana, D.G. dan Jambe, A.A.G.N.A., 2016, Pengaruh Jenis
Pelarut terhadap Kandungan Total Flavonoid dan Aktivitas Antioksidan
Ekstrak Daun Matoa (Pometia pinnata),(Online),
(https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_penelitian_1_dir/8717ce9f43ee82b
d10e8dfee6a8770c1.pdf, diakses 1 Desember 2018).
Trevor, R., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih,
Padmawinata, Edisi 6, ITB, Bandung.
Ulfah, S., 2015, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Rambutan (Nephelium
lappaceum Linn) dengan Metode DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil,
Skripsi diterbitkan, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif
Hidayatullah, Jakarta.
Umarani, S., Eswaran, V.U., Keerthika, E., Mathumitha, K., Elakiyya, S. dan
Bhargava, H.R., 2015, A Relative Study on the Chemical Composition
Amongthe Pure and Branded Honey Types Collected from Diverse
Sources of Tamilnadu India, World Applied Science Journal, 33(3): 401-
408
Vulic, J., Brunet, J., Cetkovic, G., Djilas, S. dan Saponjac, T., 2015, Antioxidant
and Sensorial Properties of Polyfloral Honey with Dried Apricots after
One Year of Storege, Journal of Chemistry, 2015: 7
White, J.W., 1978, Honey, J. Apicultural Sci, 17; 234-238.
Widyaningsih, W., 2010, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun Dewa
(Gynura procumbens) dengan Metode DPPH (1,1-Diphenyl-2-
picrilhidrazil), Prosiding Seminar Nasional Kosmetika Alami, Fakults
Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta.
Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas: Potensi dan
Aplikasinya dalam Kesehatan, Kanisius, Yogyakarta.
Yuhernita dan Juniarti., 2011, Analisis Senyawa Metabolit Sekunder dari Ekstrak
Metanol Daun Surian yang Berpotensi sebagai Antioksidan, MARAKA SAINS, 15(1): 48-52.
45
Lampiran 1. Skema Prosedur Kerja
A. Preparasi dan Ekstraksi
1. Pengolahan Sampel
2. Ekstraksi Madu dengan pelarut Metanol
Madu
Madu Kering
Sebanyak 78 g dimaserasi dengan metanol p.a
selama 2 x 24 jam sebanyak 3 kali
menggunakan metanol p.a.
didekantasi.
Maserat
Residu
Di freeze dry selama 48 jam.
Madu Kering
Dievaporasi pada suhu 55 ˚C
Ekstrak Kental
Metanol
Diremaserasi menggunakan 30 mL
metanol p.a.
Diaduk dan didiamkan.
Disaring menggunakan kertas.
saring whatman no.42 .
Maserat
Residu
Dievaporasi menggunakan rotary evaporator
suhu 55 ˚C.
Ekstrak Metanol
46
3. Ekstraksi Madu dengan Pelarut Air
4. Ekstraksi Madu dengan Pelarut DCM
2 gram Madu
Ditimbang kedalam botol vial kosong
yang telah diketahui bobotnya.
Dimaserasi menggunakan pelarut
akuabides sebanyak 30 mL
Disonikasi menggunakan alat sonikator.
didekantasi
Maserat Residu
Dievaporasi menggunakan rotary
evaporator pada suhu 55 ˚C.
Ekstrak Air
2 gram Madu
Ditimbang kedalam falcon tube.
Dimaserasi menggunakan pelarut DCM
sebanyak 30 mL.
Disonikasi menggunakan alat sonikator.
Didekantasi.
47
5. Ekstraksi Madu dengan Pelarut n-Heksan
Maserat Residu
Dimasukkan kedalam botol vial kosong yang telah diketahui
bobotnya.
Ditutup dengan aluminium foil yang telah diberi lubang kecil
Didiamkan hingga seluru pelarut DCM menguap dan
menyisakan ekstrak DCM
Ekstrak DCM
2 gram Madu
Ditimbang kedalam falcon tube.
Dimaserasi menggunakan pelarut n-Heksan
sebanyak 30 mL.
Disonikasi menggunakan alat sonikator.
Didekantasi.
Maserat Residu
Dimasukkan kedalam botol vial kosong yang telah diketahui
bobotnya.
Ditutup dengan aluminium foil yang telah diberi lubang kecil.
Didiamkan hingga seluru pelarut n-Hek.san menguap dan
menyisakan ekstrak n-Heksan
Ekstrak n-Heksan
48
B. Uji Bioaktivitas
1. Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM
2. Pembuatan Larutan Induk Asam Askorbat 500 ppm
3. Pembuatan Larutan Induk Ekstrak n-Heksan 500 ppm
Ditimbang sebanyak 0,0058 gram
Dilarutkan dengan metanol banyak 11,6 mL.
Ditimbang sebanyak 0,005 g.
Dilarutkan dengan 10 mL metanol p.a
Serbuk DPPH
Ditimbang sebanyak 0,015 g
Dilarutkan dalam 100 mL metanol p.a
dihomogenkan
Larutan DPPH 0,4 mM
Asam Askorbat
Konsentrasi
500 ppm
Ekstrak n-Heksan
Konsentrasi 500 ppm
Dipipet 0,1 mL
Ditambahkan metanol p.a 9,9 mL sehingga didapatkan
volume 10 mL.
Konsentrasi 5 ppm
49
4. Pembuatan Larutan Induk Ekstrak DCM 500 ppm
Ditimbang sebanyak 0,0682 g.
Dilarutkan dengan metanol banyak 11,4 mL.
Dipipet sebanyak 0,83 mL
Ditambahkan metanol p.a sebanyak 9,17 mL sehingga
didapatkan volume 10 mL
5. Pembuatan Larutan Induk Ekstrak Metanol 500 ppm
Ditimbang sebanyak 1,016 gram
Dilarutkan dengan metanol p.a banyak 10,2 mL
Dipipet sebanyak 0,05 mL
Ditambahkan metanol p.a sebanyak 9,95 mL sehingga
didapatkan volume 10 mL
Ekstrak DCM
Konsentrasi 6000 ppm
Konsentrasi 500 ppm
Ekstrak Metanol
Konsentrasi 100.000 ppm
Konsentrasi 500 ppm
50
6. Pembuatan Larutan Induk Ekstrak Air 500 ppm
Ditimbang sebanyak 0,3329 gram
Dilarutkan dengan metanol banyak 10,1 mL
Dipipet sebanyak 0,15 mL
Ditambahkan metanol p.a sebanyak 9,85 mL sehingga
didapatkan volume 10 mL
7. Pembuatan Larutan Induk Sampel Madu 500 ppm
Ditimbang sebanyak 0,005 g.
Dilarutkan dengan metanol banyak 10 mL.
8. Penentuan Aktivitas Antioksidan Asam Askorbat dengan Metode DPPH
Ekstrak Air
Konsentrasi 33.000
ppm
Konsentrasi 500 ppm
Sampel Madu
Konsentrasi 50 ppm
Dipipet masing-masing 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL, 2 mL dan
4 mL untuk membuat deret standar 0,25 ppm, 0,5 ppm, 1
ppm, 2 ppm dan 4 ppm.
Ditambahkan masing-masing 1 mL larutan DPPH 0,4 mM
Ditambahkan metanol p.a masing-masing 3,75 mL, 3,5 mL,
3 mL, 2 mL dan 0 mL sehigga didapatkan volume total
5 mL untuk masing-masing deret standar
Ditutup dengan aluminium foil
Diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ˚C.
Diukur serapan absorbansi dengan menggunakan
Asam Askorbat
Konsentrasi 5 ppm
Deret Standar
51
9 Penentuan Aktivitas Antioksidan Ekstrak dengan Metode DPPH
Dipipet 0,1 mL, 0,2 mL, 0,4 mL, 0,8 mL dan
1,6 mL untuk membuat deret ukur 10 ppm, 20 ppm,
40 ppm, 80 ppm dan 160 ppm dari masing-masing
ekstrak
Ditambahkan masing-masing larutan DPPH
sebanyak 1 mL
Ditambahkan masing-masing metanol hingga
volume 5 mL
Dipipet sebanyak 1 mL
Volume dicukupkan sampai 5 mL dengan menggunakan
metanol.
Larutan konsentrasi 500 ppm ekstrak
n-Heksan, DCM, Metanol, Air dan
Sampel Madu
Deret Ukur
Larutan DPPH 0,4 mM
Kontrol
Diinkubasi pada suhu ruang ditempat gelap selama 30 menit
Diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum 515 nm
Data
Deret Standar
52
diinkubasikan pada suhu ruang selama 30 menit di
ruang gelap
Serapannya diukur pada panjang gelombang
maksimum 515 (λmax)
Catatan: Larutan blanko yang digunakan 5 mL metanol dan perlakuan yang sama
dengan ekstrak
Deret Ukur Kontrol
Data
53
Lampiran 2. Kurva Pengukuran Aktivitas Antioksidan
1. Pengukuran Ekstrak n-Heksan
No Konsentrasi (μg/mL) Aktivitas Antioksidan (%)
1 10 2,42
2 20 2,64
3 40 3,30
4 80 4,40
5 160 6,59
Perhitungan aktivitas antioksidan pada ekstrak n-heksan
% aktivitas antioksidan = absorbansi control – absorbansi sampel x 100 %
absorbansi control
54
a. Konsentrasi 10 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,455 – 0,444 x 100 %
0,455
= 2,42 %
b. Konsentrasi 20 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,455 – 0,443 x 100 %
0,455
= 2,64 %
c.Konsentrasi 40 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,455 – 0,44 x 100 %
0,455
= 3,30 %
d. Konsentrasi 80 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,455 – 0,435 x 100 %
0,455
= 4,40 %
e. Konsentrasi 160 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,455 – 0,425 x 100 %
0,455
= 6,59 %
Perhitungan nilai IC50 :
y = 0,028x – 2,1337
IC50 = y – b = 50 – 2,133
a 0,028
= 1709,535
55
2. Pengukuran Ekstrak DCM
No Konsentrasi (μg/mL) Aktivitas Antioksidan (%)
1 10 1,41
2 20 2,34
3 40 3,98
4 80 6,32
5 160 12,18
Perhitungan aktivitas antioksidan pada ekstrak DCM
% aktivitas antioksidan = absorbansi control – absorbansi sampel x 100 %
absorbansi kontrol
a. Konsentrasi 10 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,427 – 0,421 x 100 %
0,427
= 1,41 %
56
b. Konsentrasi 20 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,427 – 0,417 x 100 %
0,427
= 2,34 %
c.Konsentrasi 40 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,427 – 0,41 x 100 %
0,427
= 3,98 %
d. Konsentrasi 80 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,427 – 0,4 x 100 %
0,427
= 6,32 %
e. Konsentrasi 160 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,427 – 0,375 x 100 %
0,427
= 12,18 %
Perhitungan nilai IC50 :
y = 0,0704x + 0,8782
IC50 = y – b = 50 – 0,878
a 0,070
= 701,743
57
3. Pengukuran Ekstrak Metanol
No Konsentrasi (μg/mL) Aktivitas Antioksidan (%)
1 10 0,24
2 20 0,47
3 40 1,88
4 80 4,94
5 160 10,82
Perhitungan aktivitas antioksidan pada ekstrak metanol
% aktivitas antioksidan = absorbansi control – absorbansi sampel x 100 %
absorbansi kontrol
a. Konsentrasi 10 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,425 – 0,424 x 100 %
0,425
= 0,24 %
b. Konsentrasi 20 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,425 – 0,423 x 100 %
0,425
= 0,47 %
58
c.Konsentrasi 40 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,425 – 0,417 x 100 %
0,425
= 1,88 %
d. Konsentrasi 80 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,425 – 0,404 x 100 %
0,425
= 4,94 %
e. Konsentrasi 160 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,425 – 0,379 x 100 %
0,425
= 10,82 %
Perhitungan nilai IC50 :
y = 0,0723x - 0,8137
IC50 = y – b = 50 – 0,813
a 0,072
= 683,153
4. Pengukuran Ektrak Air
No Konsentrasi (μg/mL) Aktivitas Antioksidan (%)
1 10 1,14
2 20 1,36
3 40 1,82
4 80 2,95
5 160 5,45
59
Perhitungan aktivitas antioksidan pada ekstrak air
% aktivitas antioksidan = absorbansi control – absorbansi sampel x 100 %
absorbansi kontrol
a. Konsentrasi 10 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,44 – 0,435 x 100 %
0,44
= 1,14 %
b. Konsentrasi 20 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,44 – 0,434 x 100 %
0,44
= 1,36 %
c.Konsentrasi 40 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,44 – 0,432 x 100 %
0,44
= 1,82 %
d. Konsentrasi 80 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,44 – 0,427 x 100 %
0,44
= 2,95 %
60
e. Konsentrasi 160 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,44 – 0,416 x 100 %
0,44
= 5,42 %
Perhitungan nilai IC50 :
y = 0,029x + 0,7481
IC50 = y – b = 50 – 0,748
a 0,029
= 1698,345
5. Pengukuran Sampel Madu
No Konsentrasi (μg/mL) Aktivitas Antioksidan (%)
1 10 2,03
2 20 2,33
3 40 2,62
4 80 3,49
5 160 4,65
61
Perhitungan aktivitas antioksidan pada sampel madu
% aktivitas antioksidan = absorbansi control – absorbansi sampel x 100 %
absorbansi kontrol
a. Konsentrasi 10 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,344 – 0,337 x 100 %
0,344
= 2,03
b. Konsentrasi 20 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,344 – 0,336 x 100 %
0,344
= 2,33 %
c.Konsentrasi 40 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,344 – 0,335 x 100 %
0,344
= 2,62 %
d. Konsentrasi 80 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,344 – 0,332 x 100 %
0,344
= 3,49 %
e. Konsentrasi 160 ppm
% aktivitas antioksidan = 0,344 – 0,328 x 100 %
0,344
= 4,65 %
Perhitungan nilai IC50 :
y = 0,0173x + 1,9501
IC50 = y – b = 50 – 1,950
a 0,017
= 2826,471
62
Lampiran 3. Perhitungan Pembuatan Larutan Induk
1. Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM
g = M . V . Mr
= 0,4 x 10-3 . 0,1 . 394,32
= 15,7728 x 10-3 g
= 0,015 g
2. Pembuatan Larutan Induk Asam Askorbat 500 ppm
ppm = mg
L
500 = mg
0,01 L
mg = 5 mg = 0,005 g
diencerkan hingga 5 ppm :
M1 . V1 = M2 . V2
500 . V1 = 5 . 10
V1 = 0,1 mL
Volume metanol p.a yang dibutuhkan = 10 mL – 0,1mL = 9,9 mL
3. Pembuatan Larutan Induk Ekstrak n-Heksan 500 ppm
ppm = mg
mL
500 = mg
0,01
mg = 5 mg = 0,005 g
63
4. Pembuatan Larutan Induk Ekstrak DCM 500 ppm
ppm = mg
mL
= 0,0682 g
11,4 mL
ppm = 6000 ppm
Untuk membuat konsentrasi 500 ppm 10 mL dari konsentrasi 6000 ppm
V = 500 ppm. 10 mL
6000 ppm
= 0,83 mL
Volume metanol p.a yang dibutuhkan = 10 mL – 0,83 mL = 9,17 mL
5. Pembuatan Larutan Induk Ekstrak Metanol 500 ppm
ppm = mg
mL
= 1,016 g
10,2 mL
ppm = 100000 ppm
Untuk membuat konsentrasi 500 ppm 10 mL dari konsentrasi 100000 ppm
V = 500 ppm. 10 mL
100000 ppm
= 0,05 mL
Volume metanol p.a yang dibutuhkan = 10 mL – 0,05 mL = 9,95 mL
6. Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Air
ppm = mg
mL
= 0,3329 g
10,1 mL
ppm = 33000 ppm
Untuk membuat konsentrasi 500 ppm 10 mL dari konsentrasi 33000 ppm
64
V = 500 ppm. 10 mL
33000 ppm
= 0,15 mL
Volume metanol p.a yang dibutuhkan = 10 mL – 0,15 mL = 9,85 mL
7. Pembuatan Larutan Induk Sampel Madu 500 ppm
ppm = mg
L
500 = mg
0,01 L
mg = 5 mg = 0,005 g
65
Lampiran 4. Perhitungan Pembuatan Deret Standar
1. Ekstrak Metanol 500 ppm
1.1 Konsentrasi 10 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 10 ppm . 5 mL
V1 = 0,1 mL
1.2 Konsentrasi 20 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 20 ppm . 5 mL
V1 = 0,2 mL
1.3 Konsentrasi 40 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 40 ppm . 5 mL
V1 = 0,4 mL
1.4 Konsentrasi 80 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 80 ppm . 5 mL
V1 = 0,8 mL
1.5 Konsentrasi 160 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 160 ppm . 5 mL
V1 = 1,6 mL
66
2. Ekstrak DCM 500 ppm
1.1 Konsentrasi 10 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 10 ppm . 5 mL
V1 = 0,1 mL
1.2 Konsentrasi 20 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 20 ppm . 5 mL
V1 = 0,2 mL
1.3 Konsentrasi 40 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 40 ppm . 5 mL
V1 = 0,4 mL
1.4 Konsentrasi 80 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 80 ppm . 5 mL
V1 = 0,8 mL
1.5 Konsentrasi 160 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 160 ppm . 5 mL
V1 = 1,6 mL
67
3. Ekstrak n-Heksan 500 ppm
1.1 Konsentrasi 10 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 10 ppm . 5 mL
V1 = 0,1 mL
1.2 Konsentrasi 20 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 20 ppm . 5 mL
V1 = 0,2 mL
1.3 Konsentrasi 40 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 40 ppm . 5 mL
V1 = 0,4 mL
1.4 Konsentrasi 80 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 80 ppm . 5 mL
V1 = 0,8 mL
1.5 Konsentrasi 160 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 160 ppm . 5 mL
V1 = 1,6 mL
68
4. Ekstrak Air 500 ppm
1.1 Konsentrasi 10 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 10 ppm . 5 mL
V1 = 0,1 mL
1.2 Konsentrasi 20 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 20 ppm . 5 mL
V1 = 0,2 mL
1.3 Konsentrasi 40 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 40 ppm . 5 mL
V1 = 0,4 mL
1.4 Konsentrasi 80 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 80 ppm . 5 mL
V1 = 0,8 mL
1.5 Konsentrasi 160 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 160 ppm . 5 mL
V1 = 1,6 mL
69
5. Sampel Madu 500 ppm
1.1 Konsentrasi 10 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 10 ppm . 5 mL
V1 = 0,1 mL
1.2 Konsentrasi 20 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 20 ppm . 5 mL
V1 = 0,2 mL
1.3 Konsentrasi 40 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 40 ppm . 5 mL
V1 = 0,4 mL
1.4 Konsentrasi 80 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 80 ppm . 5 mL
V1 = 0,8 mL
1.5 Konsentrasi 160 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
500 ppm . V1 = 160 ppm . 5 mL
V1 = 1,6 mL
70
6. Deret Standar Asam Askorbat dari 5 ppm
1.1 Konsentrasi 0,75 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
5 ppm . V1 = 0,75 ppm . 5 mL
V1 = 0,75 mL
1.2 Konsentrasi 0,5 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
5 ppm . V1 = 0,5 ppm . 5 mL
V1 = 0,5 mL
1.3 Konsentrasi 1 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
5 ppm . V1 = 1 ppm . 5 mL
V1 = 1 mL
1.4 Konsentrasi 2 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
5 ppm . V1 = 2 ppm . 5 mL
V1 = 2 mL
1.5 Konsentrasi 4 ppm
M1 . V1 = M2 . V2
5 ppm . V1 = 4 ppm . 5 mL
V1 = 4 mL
71
Lampiran 5. Dokumentasi Penelitian
Sampel madu yang diambil di Desa Sadar, Bone
Madu setelah difreeze dry Maserasi dengan pelarut metanol
Proses evaporasi dengan Rotary Eveporator
72
Ekstrak Metanol Madu Maserasi madu dengan
pelarut dcm, n-heksan dan air
Madu dengan pelarut yang akan dievaporasi
Ekstrak metanol, n-heksan, dcm dan air dari madu
73
Pengujian IC50 dengan DPPH ekstrak n-heksan
Pengujian IC50 dengan DPPH ekstrak metanol
Pengujian IC50 dengan DPPH ekstrak dcm
Pengujian IC50 dengan DPPH ekstrak air
74
Pengujian IC50 dengan DPPH madu
Uji fitokimia ekstrak metanol
Uji fitokimia ekstrak dcm
Uji fitokimia ekstrak air
75
Uji fitokimia ekstrak n-heksan
Uji fitokimia madu
Uji Saponin
76
Uji Alkaloid
Uji Tanin