compuestos citotoxicos y citogenética molecular

Mutaciones y Mutaciones y Citogenética Citogenética

molecularmolecular

Taller de Citogenética y Taller de Citogenética y EvoluciónEvolución

IES T-004 “Gral. T. de Luzuriaga” IES T-004 “Gral. T. de Luzuriaga” Normal Superior Tunuyán Normal Superior Tunuyán

MendozaMendozaDr. Jorge ValdezDr. Jorge Valdez

Mutaciones y Citogenética Molecular. Taller de Citog. y Evolución. IES T-004 Gral T. de Luzuriaga. Prof: J.G. ValdMutaciones y Citogenética Molecular. Taller de Citog. y Evolución. IES T-004 Gral T. de Luzuriaga. Prof: J.G. Valdez 2012ez 2012

TemarioTemario Mutaciones y Sustancias Mutaciones y Sustancias

genotóxicas. Tests para genotóxicas. Tests para identificación de compuestos identificación de compuestos genotóxicos. Citogenética molecular. genotóxicos. Citogenética molecular. Microscopia de Fluorescencia. Microscopia de Fluorescencia. Pintado de cromosomas. Sondas. Pintado de cromosomas. Sondas. Bandeo. Automatización en Bandeo. Automatización en citogenética humana. citogenética humana.


Mutaciones génicasMutaciones génicas Sustituciones de bases: cambio o sustitución de una Sustituciones de bases: cambio o sustitución de una

base por otra en el ADN.base por otra en el ADN.– Transiciones: cambio de una purina (Pu) por otra purina, o Transiciones: cambio de una purina (Pu) por otra purina, o

bien cambio de una pirimidina (Pi) por otra pirimida.bien cambio de una pirimidina (Pi) por otra pirimida.– Transversiones: cambio de una purina (Pu) por una Transversiones: cambio de una purina (Pu) por una

pirimidina (Pi) o cambio de una pirimidina (Pi) por una pirimidina (Pi) o cambio de una pirimidina (Pi) por una purina (Pu).purina (Pu).

Inserciones o adiciones y deleciones de nucleótidos: Inserciones o adiciones y deleciones de nucleótidos: – Son ganancias de uno o más nucleótidos (inserciones o Son ganancias de uno o más nucleótidos (inserciones o

adiciones) y de pérdidas de uno o más nucleótidos adiciones) y de pérdidas de uno o más nucleótidos (deleciones). Tienen como consecuencia cambios en el (deleciones). Tienen como consecuencia cambios en el cuadro o pauta de lectura cuando el número de nucleótidos cuadro o pauta de lectura cuando el número de nucleótidos ganado o perdido no es múltiplo de tres.ganado o perdido no es múltiplo de tres.


Mutaciones génicasMutaciones génicas Duplicaciones: consiste en la repetición de un Duplicaciones: consiste en la repetición de un

segmento de ADN del interior de un gen.segmento de ADN del interior de un gen.

Inversiones: un segmento de ADN del interior Inversiones: un segmento de ADN del interior de un gen se invierte, para ello es necesario de un gen se invierte, para ello es necesario que se produzcan dos giros de 180º , uno que se produzcan dos giros de 180º , uno para invertir la secuencia y otro para para invertir la secuencia y otro para mantener la polaridad del ADN.mantener la polaridad del ADN.

Transposiciones: un segmento de un gen Transposiciones: un segmento de un gen cambia de posición para estar en otro lugar cambia de posición para estar en otro lugar distinto del mismo gen o en otro lugar del distinto del mismo gen o en otro lugar del genoma.genoma.


Sustancias genotóxicasSustancias genotóxicas Sustancia dañina para el ADN. Sustancia dañina para el ADN.

– Pueden unirse directamente al ADN o Pueden unirse directamente al ADN o actuar indirectamente mediante la actuar indirectamente mediante la afectación de las enzimas involucradas afectación de las enzimas involucradas en la replicación del ADN y causando, en en la replicación del ADN y causando, en consecuencia, mutaciones que pueden o consecuencia, mutaciones que pueden o no desembocar en un cáncer. no desembocar en un cáncer.

– Las sustancias genotóxicas no son Las sustancias genotóxicas no son necesariamente cancerígenas, pero la necesariamente cancerígenas, pero la mayor parte de los cancerígenos son mayor parte de los cancerígenos son genotóxicos.genotóxicos.


Klug, capítulo 15, punto 4.Klug, capítulo 15, punto 4.15.415.4 Las mutaciones inducidas se Las mutaciones inducidas se

producen por daños del DNA producen por daños del DNA causados por agentes químicos y causados por agentes químicos y radiaciones.radiaciones.


MutágenosMutágenos son agentes naturales o son agentes naturales o artificiales que inducen mutaciones.artificiales que inducen mutaciones.– Toxinas de hongosToxinas de hongos– Luz ultravioletaLuz ultravioleta

– Contaminantes industrialesContaminantes industriales– Rayos XRayos X


Análogos de Base Análogos de Base pueden sustituir pueden sustituir a las purinas o a las pirimidinas a las purinas o a las pirimidinas durante la síntesis de los ácidos durante la síntesis de los ácidos nucleicos (nucleicos (Figure 15.5Figure 15.5).).

Mutaciones y Citogenética Molecular. Taller de Citog. y Evolución. IES T-004 Gral T. de Luzuriaga. Prof: J.G. ValdMutaciones y Citogenética Molecular. Taller de Citog. y Evolución. IES T-004 Gral T. de Luzuriaga. Prof: J.G. Valdez 2012ez 2012 Figure 16.5

Derivado del uracilo


Agentes alquilantes (Gases Agentes alquilantes (Gases mostaza)mostaza) Fue uno de los primeros Fue uno de los primeros grupos mutagénicos descubiertos. grupos mutagénicos descubiertos. Estos agentes químicos ceden un Estos agentes químicos ceden un grupo alquilo como CH3 o CH3-CH2 grupo alquilo como CH3 o CH3-CH2 a grupos amino o ceto de los a grupos amino o ceto de los nucleótidos, alterando las afinidades nucleótidos, alterando las afinidades de apareamiento .(de apareamiento .(Figure 16.6Figure 16.6).).


El gas mostaza se usó en la 1er El gas mostaza se usó en la 1er GMGM

La exposición al gas mostaza no es fatal. Mató a menos del 5% de las personas que estuvieron expuestas. Se presentan quemaduras de segundo y tercer grado, infecciones respiratorias, enfisema y cancer de pulmón y respiratorio.


Causan mutaciones por cambio de Causan mutaciones por cambio de marco de lectura, intercalando entre marco de lectura, intercalando entre purinas y pirimidinas.purinas y pirimidinas.

Colorantes de acridina Colorantes de acridina


http://web.educastur.princast.es/proyectos/biogeo_ov/2BCH/B4_INFORMACION/T411_MUTACIONES/informacion.htm


Crea Crea dímeros de pirimidinadímeros de pirimidina entre entre dos residuos de timina que dos residuos de timina que distorsionan la conformación del DNA distorsionan la conformación del DNA y se tiende a crear errores durante la y se tiende a crear errores durante la replicación (replicación (Figure 16.8Figure 16.8).).

Radiación UVRadiación UV


Ionizing radiationIonizing radiation in la forma de in la forma de rayos X , gamma rays, y cosmicos rayos X , gamma rays, y cosmicos son mutagénicos (son mutagénicos (Figure 16.9Figure 16.9).).


Importancia de los estudios Importancia de los estudios genotóxicosgenotóxicos

El incremento en el grado de mutación de las células germinales (óvulos, espermatozoides y sus precursores) lo cual puede provocar el aumento de la incidencia de las enfermedades genéticas en futuras generaciones.


Importancia de los estudios Importancia de los estudios genotóxicosgenotóxicos

La existencia de una estrecha relación entre la inestabilidad genómica de células somáticas con el cáncer y las enfermedades degenerativas crónicas.

El origen ambiental del cáncer.


Tests para identificación de Tests para identificación de compuestos genotóxicoscompuestos genotóxicos

Se conocen dos grupos de Se conocen dos grupos de carcinógenos:carcinógenos:– Inducción de daño genético Inducción de daño genético

Genotóxicos.Genotóxicos.– Otros que no parecen producir Otros que no parecen producir

mutaciones.mutaciones. Se detectan con bioensayos animales Se detectan con bioensayos animales

y pruebas de genotoxicidad.y pruebas de genotoxicidad.


RegulaciónRegulación ICH (Conferencia Internacional sobre la

Armonización), OECD (Organización para la Cooperación y el Desarrollo) y EPA (Agencia para la Protección del Ambiente en Estados Unidos), exigen ensayos – in vitro que determine daño a nivel de

genes, de elección el ensayo de Ames, – in vivo que determine daño a nivel de los

cromosomas.


Test de AmesTest de Ames El test de Ames se usa para asignar la El test de Ames se usa para asignar la

mutagenicidad de un compuesto.mutagenicidad de un compuesto. El test de El test de Ames Ames usa cerca de una docena usa cerca de una docena

de cepas de de cepas de Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium seleccionadas por su incremento a la seleccionadas por su incremento a la sensitividad a mutágenos y su habilidad sensitividad a mutágenos y su habilidad de revelar la presencia de tipos de revelar la presencia de tipos específicos de mutacionesespecíficos de mutaciones..


Muchos carcinógenos conocidos se Muchos carcinógenos conocidos se clasificaron como mutágenos fuertes clasificaron como mutágenos fuertes por el test de Ames.por el test de Ames.


Tests in vitro para Tests in vitro para identificación de compuestos identificación de compuestos

genotóxicosgenotóxicos Ensayo de aberraciones cromosómicas en

cultivo de linfocitos de sangre periférica humana.– Estudio in vitro que determina daño a nivel de

cromosomas. – Las aberraciones estructurales pueden ser

cromosómicas o cromatídicas. La mayoría de los mutágenos químicos dan lugar a aberraciones cromatídicas, aunque también pueden producirse aberraciones cromosómicas.

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Estudios genotóxicos in vivoEstudios genotóxicos in vivo Ensayo cometa en leucocitosEnsayo cometa en leucocitos

de ratón.de ratón. Micronúcleos de célula ósea.Micronúcleos de célula ósea. Morfología de la cabeza del Morfología de la cabeza del

espermatozoide.espermatozoide.


Ensayo cometa en ratónEnsayo cometa en ratón Las rupturas de simple cadena y la formación de sitios

lábiles al álcali en el ADN han sido parámetros ampliamente utilizados para la detección de genotoxicidad y han sido demostrados sus implicaciones en enfermedades degenerativas y el cáncer.

En 1988 Singh y col. desarrollaron la variante alcalina de la electroforesis de células individuales (ensayo cometa), para la detección de este tipo de daño proporcionando por primera vez datos a nivel de célula individual siendo más rápido, sensible y económico con respecto a otros estudios genotoxicológicos como, intercambio de cromáticas hermanas, elusión alcalina y el ensayo de micronúcleos.


Ensayo cometa en ratónEnsayo cometa en ratón Supuesto Supuesto

efecto efecto citotóxico del citotóxico del glifosato en glifosato en linfocitos de linfocitos de ratón. La ratón. La primer figura primer figura corresponde al corresponde al control.control.


Micronúcleos de médula Micronúcleos de médula óseaósea

Permite detectar lesiones provocadas por la sustancia de ensayo en los cromosomas o el aparato mitótico de eritroblastos mediante el análisis de eritrocitos tomados de la médula ósea y/o la sangre periférica de animales (por lo general roedores).

Determina daño en los cromosomas en un sistema vivo.

Los animales se someten a la sustancia y se extrae la médula a las cuatro semanas.


Estudios in vivo. Morfología de Estudios in vivo. Morfología de la cabeza del espermatozoidela cabeza del espermatozoide

Permite determinarPermite determinarla inducción de la inducción de daño a nivel de las daño a nivel de las células germinales células germinales masculinas.masculinas.

La espermatogénesis manifiesta gran resistencia al daño.


Tomado de http://www.sertox.com.ar/img/item_full/23003.pdf


Ejemplo de ensayo de Ejemplo de ensayo de compuestos citotóxicoscompuestos citotóxicos

Estudios de genotoxicidad de Estudios de genotoxicidad de antibióticos antitumorales en células antibióticos antitumorales en células eucariotas eucariotas – Alejandro D. Bolzán, Martha S. Bianchi, Alejandro D. Bolzán, Martha S. Bianchi,

Julieta SánchezJulieta Sánchez BAG. Journal of Basic and Applied Genetics BAG. Journal of Basic and Applied Genetics

versión ISSN 1852-6233. 22 (1) 2011versión ISSN 1852-6233. 22 (1) 2011

Bandeo de Bandeo de cromosomas y cromosomas y citogenética citogenética molecularmolecular


Bandeo de cromosomasBandeo de cromosomas Se pueden detectar los cromosomas Se pueden detectar los cromosomas

según un patrón que está dado por según un patrón que está dado por bandas alternantes.bandas alternantes.

http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/cariotipo/


Cariotipo por bandeo GCariotipo por bandeo G


Significado del patrón de Significado del patrón de bandeobandeo

Bandeo QBandeo Q– Patrón muy informativo, necesita de Patrón muy informativo, necesita de

fluorescencia (Quinacrina)fluorescencia (Quinacrina) Bandeo GBandeo G

– Presenta el mismo patrón que el bandeo Presenta el mismo patrón que el bandeo Q, con algunas diferencias.Q, con algunas diferencias. Se realiza una digestión con tripsina y una Se realiza una digestión con tripsina y una

tinción con Giemsatinción con Giemsa


Tipos de bandasTipos de bandas El bandeo G y Q son bandas que están El bandeo G y Q son bandas que están

relacionadas con la composición del relacionadas con la composición del ADN.ADN.– Bandas G oscuras son ricas en ATBandas G oscuras son ricas en AT– Se considera que las bandas G y Q Se considera que las bandas G y Q

contienen pocos genes y que son regiones contienen pocos genes y que son regiones que tienden a la represión génica.que tienden a la represión génica.

– Las bandas G claras contienen la mayoría Las bandas G claras contienen la mayoría de los genes de mantenimiento, son de los genes de mantenimiento, son activas y se replican precozmente.activas y se replican precozmente.


Otros bandeosOtros bandeos Bandeo CBandeo C

– Tiñe la heterocromatina constitutiva.Tiñe la heterocromatina constitutiva. Sólo tiñe regiones centroméricas y los bloques de Sólo tiñe regiones centroméricas y los bloques de

heterocromatina C de los cromosomas 1, 9 y 16 y del heterocromatina C de los cromosomas 1, 9 y 16 y del brazo largo del Ybrazo largo del Y

Bandeo RBandeo R– Es el inverso del G (o Q) Es el inverso del G (o Q)

Bandeo NBandeo N– Tiñe los organizadores nucleolares (13, 15, 21 Tiñe los organizadores nucleolares (13, 15, 21

y 22)y 22)


Hibridación in situHibridación in situ Si un gen está clonado, se puede usar Si un gen está clonado, se puede usar

como una prueba para hibridar como una prueba para hibridar cromosomas.cromosomas.– Son radioactivas o fluorescentes.Son radioactivas o fluorescentes.

Si hay grupos clonados de diferentes Si hay grupos clonados de diferentes cromosomas, o de diferentes regiones, cromosomas, o de diferentes regiones, se pueden marcar con diferentes se pueden marcar con diferentes tinciones fluorescentes y “pintar” el tinciones fluorescentes y “pintar” el cromosoma.cromosoma.


Tinciones de Tinciones de cromosomas cromosomas in situ in situ con con una prueba específica una prueba específica para un gen presente para un gen presente en simple copia en cada en simple copia en cada set de cromosomas, en set de cromosomas, en este caso una proteína este caso una proteína muscular en el muscular en el cromosoma 11. Sólo un cromosoma 11. Sólo un locus muestra un punto locus muestra un punto fluorescente fluorescente correspondiente a la correspondiente a la prueba asociada al gen prueba asociada al gen de la proteína muscular.de la proteína muscular.

Hibridización in situHibridización in situ


Principios del FISHPrincipios del FISH


Cariotipo humanoCariotipo humano


Combinación de técnicasCombinación de técnicas

Bandeo

Multiplex FISHSe observan translocaciones

Hibridación Genómica Comparativa


ComparaciónComparaciónHibridación Genómica Comparativa


Automatización en citogenética Automatización en citogenética humanahumana


http://www.metasystems-international.com/ikaros

compuestos citotoxicos y citogenética molecular

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