DEMOSTRACION DEL PROCESO DE UREOGENESIS: ACCIÓN DE LA ARGINASA

I. INTRODUCCIÓN :

Cuando la llegada de aminoácidos al hígado es alto. Como sucede después de la ingesta de de uno como una dieta rica en proteínas.Parte del exceso de aminoácidos gracias al aumento de la síntesis proteica así como por el incremento de su degradación a urea y sustrato glucogénico o cetogenico dependiendo de cada aminoácido y su vía oxidativa. Junto con el catabolismo del esqueleto de cada aminoácido, es necesario disponer de un medio eficaz de eliminación del nitrógeno de los grupos aminos para evitar la acumulación hasta niveles tóxicos de amoniaco y para que el hígado proceda a la síntesis de urea, requiere de cantidad estequiometrias de amoniaco (en forma de carbamil-P) y de aspartato.

El hombre y mamíferos la síntesis de urea (ureogénesis) se realiza a partir del amoniaco (NH3) resultante de la desanimación de los aminoácidos y el C02 proveniente de las descarboxilaciones (ciclo de Krebs). La hidrolisis de la arginina es la fuente de la urea aunque este aminoácido se encuentra en todas las células. La formación de urea está particularmente limita al hígado; ya que es el único tejido que posee arginasa.La arginasa (PM: 120.000) está constituida por cuatro subunidades, cada de las cuales está unido un átomo de Mn2+.

1. La ortina producto del desdoblamiento de la arginina, puede ser utilizada de manera cíclica al reaccionar con otra, molécula de carbamil – P y así formar citrulina a nivel mitocondrial en la primera reacción de la secuencia que conduce finalmente a la síntesis de urea.

2. Citrulina (citoplasma)3. Hidrólisis de Arginina – ornitina + urea

Se ha estudiado que las enzimas del ciclo de la urea muestran también respuestas adaptativas a los cambios en la ingesta proteica guardando relación con la excreción urinaria de urea y a hormonas como el glucagon y los glucocorticoides.El objeto de esta práctica es de mostrar la acción de la arginasa sobre la arginina para la síntesis de urea.

II. MATERIAL :

A) Material BiológicoHomogenizado hepático de rata al 20% en sacarosa 0.25 M.

B) Reactivos:- Buffer fosfato 0.05 M, Ph 7.2- Solución de arginina 0.3 M

- Ureasa en polvo- Acido sulfúrico 2/3 N- Tungstato de sodio al 10%- Reactivo de Nessler

III. PROCEDIMIENTO :

La preparación del homogenizado hepático de rata al 25% en sacarosa 0.25 M, se realiza tomando 10ml de homogenizado en un tubo de ensayo y dejar en baño de agua a 60°C durante 15 minutos (tener cuidado en que no se eleve la temperatura a 60°C). La arginasa es estable bajo este tratamiento mientras que las demás enzimas del hígado son precipitadas. Cumplidos los 15 minutos, enfriar el tubo bajo un chorro de agua. Enseguida desechar, el precipitados y quedara una solución de color rojo ligeramente turbia en donde se encuentra la enzima.

Armar los siguientes sistemas:

A.- Producción de urea utilizando arginina (sustrato)

COMPONENTES TUBO I TUBO II

Buffer fosfato 0.05 M pH702 1.0ml 1.0ml

Sol. Arginina 0.3 M 0.5ml ---

Agua destilada --- 0.5ml

Pre-incubar a 37 C por 5 minutos --- ---

Homogenizado hepático(arginasa) 0.5ml 0.5ml

Ureasa en polvo Una pizca Una pizca

Incubar a 37 C por 30 minutos --- ---

H2SO4 2/3 N 1.0ml 1.0ml

Tungstato de sodio 10 % 1.0ml 1.0ml

agua destilada 6.0ml 6.0ml

Mezclar y filtrar; el filtrado debe ser transparente; de lo contrario volver a filtrar

B.- Determinación de la urea mediante reactivos de Nessler

COMPONENTES TUBO B TUBO I TUBO II

Filtrado I --- 0,1ml ---

Filtrado II --- --- 0,1ml

agua destilada 9,0ml 8,9ml 8,9ml

Reactivo de Nessler 1,0ml 1,0ml 1,0ml

En esta etapa se utiliza nuevos tubos de ensayo, a los cuales les agrega el filtrado de la anterior. Los que no deberán presentar opalescencia ni turbidez.

IV. RESULTADOS :

Figura nº 1: Tubos sistema B: de izquierda a derecha; TUBO B; TUBO I; TUBO II

V. DISCUSIÓN :

El ciclo de la urea está dirigido por enzimas tal como la Arginasa; en los tubos de los sistemas:Tubo I: se agrego sustrato (Arginina), enzima (homogenizado hepático-Arginasa) por lo que se obtuvo ornitina y urea la que se degrado por acción de la ureasa liberando amoniaco siendo reconocido por el reactivo de Nessler dando la coloración que se observa en la figura nº 1Tubo II: al no agregarle sustrato no se vio acción de la Arginasa, por lo tanto no se obtuvo urea; ni coloración.

VI. CONCLUSIONES :

La Arginasa cumple una función crucial en el ciclo de la Urea, convirtiendo la Arginina en Ornitina y Urea, a través de una hidrólisis. La urea (conteniendo dos grupos amino; siendo perjudicial su acumulación en iones amonio NH4+) resultante se excreta mientas la ornitina vuelve nuevamente al ciclo.

VII. BIBLIOGRAFIA :

Stryer, L.; Bioquímica; 2002; Edit. Reverte. España