Martina Volfová

Biofyzika

2009

Úvod

Experimentální část

Konfokální mikroskopie

Mikrospektrofluorimetrie

Výsledky a diskuze

Závěr

Použitá literatura

mikrospory výtrusy se rozmnožujících rostlin (přesličky,

mechy a kapradiny) patří díky velmi dobře pozorovatelnému

vývoji a citlivosti k různým vnějším faktorům mezi vhodné

modely buněčných biologů

hlavní výhodou je jejich autofluorescence excitovaná UV-

zářením

jednoduché buňky obalené mnohovrstevnou celulózní stěnou

– ochrana před nepříznivými faktory vnějšího prostředí

dříve bylo pro studium vývoje mikrospor používáno

histochemické barvení nebo elektronová mikroskopie

jejich fluorescenci lze sledovat pod luminiscenčním

mikroskopem (mikrospektrofluorimetry)

konstrukce konfokálního mikroskopu umožňuje sledovat

buněčné struktury režimem hloubky

touto metodou lze studovat i buňky

řas a některé nesekretující buňky

vyšších rostlin

vegetativní mikrospory přesličky rolní

(Equisetum arvense)

sběr v přírodních lokalitách v dubnu–květnu

1996-2001

klíčení mikrospor bylo studováno kultivací

na podložním sklíčku položeném na vlhkém

papíru na Petriho misce

pro analýzy konfokálním mikroskopem s olejovou imerzí –

mikrospory vlhčeny a poté sušeny horkým vzduchem (50-70 C)

5-7 minut (studium suchých i vlhkých vzorků)

při měření s vodní imerzí nebyly používány krycí sklíčka

LSM 510 NLO „Carl Zeiss“

program LSM 510 and Lucida

Analyse 5

vodní i olejová imerze

buzení emise:

argon laser (458, 488, 514 nm)

He-Ne laser (543 nm)

He-Ne laser (633 nm)

tři fotonasobiče zachytávaly autofluorescenci samostatně

nebo současně užíváním pseudobarevných efektů

excitace 488 nm – registrace autofluorescence 505-630 nm

excitace 543 nm – registrace autofluorescence 565-615 nm

excitace 633 nm – registrace autofluorescence 650-750 nm

výsledný

obrázek je

superpozicí

pseudobarev

vzorky excitovány UV-zářením 360-380 nm

analýzy mikrospektrofluorimetry – registrace

fluorescenčních spekter a měření fluorescenčních intenzit pro

dvě oddělené vlnové délky

program „Microfluor“ – histogramy intenzit fluorescence a

statistické řešení dat použitím t-testu

autofluorescence intaktních buněčných povrchů pozorována

luminiscenčním mikroskopem Fluoval „Carl Zeiss“

fluorescenční spektra intaktních buněk měřena

mikrospektrofluorimetrem

průměry optických sond: 100 μm, 20 μm, 2 μm

zvětšení objektivu 10x

zvětšení okuláru 7x

registrační čas fluorescenčních spekter v oblasti 400-700 nm

byl 22 s

chyba fluorescenčního měření byla 1-2 r. j.

fluorescenční intenzity mikrospor byly měřeny také duálně –

vlnovým mikrospektrofluorimetrem

konfokální mikroskopie - demonstrován rozdíl mezi modře

fluoreskujícím obalem a červeně fluoreskujícími

chloroplasty mikrospor (pigmenty, azuleny)

ostatní organely – žlutá fluorescence

mikrospektrofluorimetrie – střední část mikrospory má 3

maxima – 460, 550 a 680 nm (typické pro chlorofyl)

obal a elatery (haptery) maximum při 680 nm nemají

během vývoje mikrospor docházelo ke změnám

fluorescenčních spekter i barev – vlhčení mikrospor

po 15 min zesílila fluorescence

chloroplastů, buňky zmohutněly a

objevily se haptery

chloroplasty se začaly difúzně

pohybovat k buněčnému obalu

po 60 min se chloroplasty pohybovaly zpět do středu buňky

indikace začátku buněčného dělení

po 120 min buňka odložila obal

obal - maximum 460nm a rameno 500 nm

uvolněná buňka - maxima 460, 550 a 680 nm, rozdělení na:

mnohobuněčnou stélku (thallus)

rhizoid (redukovaný počet chloroplastů)

data byla korelována s histochemickým barvením při

použití 6-9 syntetických barviv a biochemickými

analýzami obsahu chlorofylu a azulenů

během studia nedošlo k žádnému poškození mikrospor,

byly schopné dále pokračovat ve svém vývoji

Autofluorescence vegetativních mikrospor,

produkovaných přesličkou jarní, je vhodná pro studium

buněčného vývoje od jednobuněčné struktury po

mnohobuněčný organismus metodami konfokální

mikroskopie a mikrospektrofluorimetrie.

Během studia nedochází k žádnému poškození

mikrospor.

Mikrospory jsou schopné dále pokračovat ve svém

vývoji.

ROSHCHINA, V. V., YASHIN, V. A., KONONOV, A. V., 2004:

Autofluorescence of Developing Plant Vegetative Microspores Studied by

Confocal Microscopy and Microspectrofluorimetry, In Journal of Fluorescence: s.

745 – 750.

http://lecive-rostliny.krasne.cz/byliny/preslicka-rolni

http://fotoblog.in/clanek/591

http://academicdepartments.musc.edu/ccdir/center_microscopes/center_microsco

pes.htm

http://cgi.benl.ebay.be/Carl-Zeiss-Jena-Fluoval-Fluoreszenz-Mikroskop_W0QQitemZ190344580729QQcmdZViewItemQQptZDE_Computer_Elektronik_Foto_Camcorder_Optik?hash=item2c516bce79