reporte fermentaciones

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato

INGENIERA FARMACUTICA

Ingeniera en fermentaciones

Proyecto

Produccin de cerveza artesanal tipo Pale Ale

PRESENTA:

Equipo de fermentaciones:

Arriaga Moreno Janai

Ortiz Hernndez Vctor Hugo

Roco Alcntar Alma Itzel

Snchez Felipe Cynthia Guadalupe

Equipo de biorreactores:

Araujo Acosta Anabella

Escalera Martnez Erika Karina

Lpez Alfaro Eduardo

Aceves Mata Mara Carolina

Ramrez Laguna Patricia

Barrientos Garca Enrique

Granados Jos Guadalupe

Equipo #1

6FM1

Profesor (a):

Diana Ramrez Saenz

PRODUCCIN DE CERVEZA ARTESANAL TIPO PALE ALE

2 | Ingeniera Farmacutica

Arriaga, Ortiz, Roco y Snchez

INTRODUCCIN

AISLAMIENTO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Los responsables de la fermentacin sumergida para la produccin de cerveza tipo Pale

Ale, no son bacterias sino levaduras, los cuales son hongos unicelulares que pertenecen a

los eucariotas. (Koolman, 2004)

Saccharomyces cerevisiae

Las levaduras de la cerveza (Saccharomyces Cerevisiae) son organismos haploides y estos

se reproducen asexualmente por gemacin. Este tipo de levaduras logran existir en

condiciones aerobias y anaerobias. (Koolman, 2004).

La cerveza tiene como subproducto levaduras las cuales utiliza como medios para la

fermentacin de la cebada, malta u otros cereales. As mismo consumen los azcares y los

convierten en alcohol y anhdrido carbnico (CO2). (Hough, 1990).

Entre los usos ms habituales de esta levadura, es la produccin de cerveza, pan y vino. El

dixido de carbono (CO2) y etanol (C2H6O) producidos durante el proceso de fermentacin,

son productos de desecho para las clulas de la levadura. Este mtodo se efecta cuando la

levadura se encuentra en un medio muy rico en azcares. (Tortora, 2007)

Aislamiento de Saccharomyces Cerevisiae

Una de las formas ms importantes para la caracterizacin de microorganismos es observar

su crecimiento a en medios de cultivo como Agar Papa Dextrosa (PDA) til para cultivar

levaduras ya que la base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulacin y la

produccin de pigmentos en algunos dermatofitos, algunos procedimientos sealan bajar el

pH del medio a 3.5 con cido tartrico al 10% para inhibir el crecimiento bacteriano; la

infusin de papa promueve un crecimiento abundante de los hongos y levaduras y el agar es

adicionado como agente solidificante.




En la microbiologa, un medio de cultivo es un elemento bsico e indispensable en cuanto

al estudio (aislamiento e identificacin) de los microorganismos se refiere, ya que un

cultivo es un gel o sustancia que proporciona todo nutrimento esencial necesario para el

desarrollo del mismo (Rodrguez et al., 2005).

Requerimientos nutricionales para el crecimiento de S. Cerevisiae (Cceres, 2002):

Fuente de carbono:

Los azucares son de vital importancia, ya que son considerados la fuente de carbono y

energa, por lo cual la clula fermentara la sacarosa, galactosa, manosa y en general

hexosas. Aunque esta, no fermenta la lactosa, maltosa y pentosa

Fuente de nitrgeno:

Tales como sales de amonio inorgnicas, el acetato de amonio, carbonato, etc.

Fuente de fsforo:

Normalmente se utiliza en H2PO4

Fuente de azufre

Sales y elementos traza

Pruebas bioqumicas para Saccharomyces cerevisiae

Las pruebas bioqumicas se utilizan con frecuencia para identificar bacterias y levaduras

(Tortora, 2007). Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz

de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de compuestos, la

produccin de compuestos coloreados, etc. (Edwards, et al, 1986)

Las pruebas son:

Fermentacin de carbohidratos: Esta prueba nos indica la presencia de levaduras al

obtener un cambio de color en una solucin de rojo fenol. Ya que se puede observar un

cambio de pH, este debido a la fermentacin de los azcares que llevan a cabo las

levaduras.




Prueba de ureasa: Esta prueba es utilizada para detectar la presencia de la enzima

ureasa, mostrando as el medio un cambio de color de rojo a rosa fucsia indicando como tal

la liberacin de amoniaco y dixido de carbono al hidrolizar la urea (Edwards, et al., 1986).

Pruebas macroscpicas y microscpicas de identificacin de Sacharomyces cerevisiae

Para poder identificar un microorganismo (en este caso una levadura) es importante tomar

en cuenta las caractersticas clave de la morfologa colonial (figura 1) para ello se utiliza

frecuentemente criterios que caracterizan el crecimiento como tamao, pigmentacin,

forma y aspecto de la colonia.

El aislamiento de las colonias al cultivar es importante ya que con ello se puede examinar la

morfologa y realizar un frotis que junto con la evaluacin microscpica de los cultivos y la

morfologa de la colonia son lo ms importante para la identificacin del microorganismo.

(Prescott, 1999). Para caracterizar la morfologa celular de microorganismos se debe

analizar el tamao celular, forma celular y distribucin de las clulas unas con respecto a

otras. Tambin puede observarse la movilidad de los microorganismos bajo microscopio

con condiciones de preparacin hmeda o por inoculacin en medios semislidos. (Tortora

et al., 2007)

Antecedentes de aislamiento de Saccharomyces Cerevisiae para la produccin de cerveza

Paz y Pellegrini (2003) aislaron diferentes tipos de levadura principalmente Saccharomyces

uvarum con el propsito de observar los efectos de incorporar a la dieta de equinos

levadura de cerveza, comparando sus efectos sobre el estallido respiratorio de neutrfilos

sanguneos.

Legras y colaboradores (2007), aislaron Saccharomyces cerevisiae para demostrar la

importancia de estas bacterias en la fermentacin de algunos alimentos que juegan un rol

importante en la sociedad, evaluando la evolucin de los procesos de produccin y su

adaptacin que va desde la domesticacin local a la industria.




Khle y Jesperen, as como otros colaboradores (2001) caracterizaron y aislaron levaduras

provenientes de cerveza de sorgo producida en Ghana y Burkina Faso en frica Occidental.

Las levaduras involucradas en la fermentacin que fueron encontradas consisten en

Saccharomyces spp, de los cuales los cultivos aislados investigados, el 45% fueron

identificados como Saccharomyces cerevisiae y un poco ms del 53% tenan propiedades

fisiolgicas atpicas de S. cerevisiae o cualquier otro miembro del complejo strictu sensu,

ya que fueron capaces de asimilar solo glucosa, maltosa y etanol como fuentes de carbono.

Cocolin, Campolongo, Gorra, Rolle y Ratsion (2012) a travs de un estudio investigaron la

biodiversidad de Saccharomyces cerevisiae durante la elaboracin de la cerveza de una

cerveza artesanal, as como su estudio durante su almacenamiento en la botella durante 107

das a 20C. Despus de la inoculacin con una levadura seca activa, los recuentos de

levadura fueron seguidos durante la fermentacin, as como despus del embotellado. Las

cargas de levadura se mantuvieron estables en las unidades formadoras de colonia. Casi

todas las levaduras aisladas fueron identificadas como Saccharomyces cerevisiae.

PRODUCCIN DE CERVEZA

Un ejemplo de biotecnologa tradicional es el proceso rudimentario de cerveza, cerveza

artesanal, ya que puede presentar variaciones en su elaboracin que dependern del tipo

especfico de cerveza (claro, obscura, etc.) Para la fabricacin de la cerveza bsicamente

existen cuatro etapas: 1) proceso de germinacin de las semillas del cereal (Malteado); 2) la

extraccin e hidrlisis de componente de la cebada seguido del hervido con la adicin de

lpulo (Mosto); 3) fermentacin y 4) procesamiento final, involucra las etapas de filtracin,

estabilizacin y embotellado.

De las etapas antes mencionadas la fermentacin es el proceso ms lento, donde las clulas

de levadura aisladas son cultivadas en suspensin que fermentarn el mosto en reactores

por lote, sin agitacin externa.




La cerveza, por definicin, es una bebida alcohlica no destilada que se obtiene de la

fermentacin de un mosto elaborado a partir de malta de cebada, con o sin la adicin de

otros cereales no malteados. La mezcla de los cereales con agua se transforma en azcares

mediante la digestin enzimtica de las levaduras. Posteriormente el lpulo y/o sus

derivados son agregados a la mezcla agua-mosto para finalmente ser sometida a un proceso

de coccin.

Existen dos tipos bsico de cerveza: ale y lager; cada uno con subtipos con diferentes

caractersticas en cuanto a sus propiedades organolpticas.

Ingredientes de la cerveza.

Para la elaboracin de cerveza se requiere de las siguientes materias primas:

Agua; materia prima de mayor proporcin, potable, que a una escala industrial debe

seguir la NOM-142-SSA1-1995.

Malta; es un cereal en etapa temprana de germinacin, cuyo proceso de germinacin

es controlado y detenido mediante la aplicacin de secado. Esta materia prima

contiene las enzimas necesarias para hidrolizar los hidratos de carbono complejos,

paso importante para la obtencin de mosto.

Lpulo; se obtiene a partir de los conos maduros de la planta Humulus lupulus y se

agrega al mosto como extracto o productos secados en dosis que varan en funcin

del sabor y aroma final deseados para la cerveza.

Un proceso general para la fabricacin de cerveza comprende las siguientes cuatro etapas

principales:

1. Preparacin de la malta. Tiene por objetivo la obtencin de un polvo rico en

enzimas. Para hacer esto, el grano de cebada tiene que ser puesto a germinar a una

temperatura de 10-16C, con una humedad de 42-46% en un tiempo de 60 horas.

2. Produccin del mosto. La malta ya molida se mezcla con agua, esta mezcla se

calienta gradualmente hasta una temperatura de 48C por aproximadamente 20

minutos, en la que se activan principalmente las proteasas, las beta-glucanasas y la

beta-amilasa. Se contina el calentamiento progresivo por etapas. La solucin se




filtra y al lquido obtenido se le aade el lpulo. Finalmente la solucin se somete a

ebullicin pro una hora para obtener el mosto. Las proteasas hidrolizan las protenas

de la malta, dando como resultado la formacin de pptidos y aminocidos, que ms

adelante, durante la fermentacin servirn como nutrientes para la levadura. Al

llevarse a cabo la coccin del mosto se cubren 7 objetivos tecnolgicos:

concentracin de slidos en el mosto, extraccin de los componentes del lpulo,

inactivacin de las enzimas de la malta, esterilizacin del mosto, eliminacin de

compuestos voltiles indeseables, formacin de los compuestos responsables del

aroma, sabor y color de la cerveza mediante reacciones de Maillard, coagulacin de

protenas y favorecimiento de la reaccin entre protenas para la formacin de

compuestos insolubles que precipitan clarificando as el producto.

3. Fermentacin. Se aplica una fermentacin alta para la elaboracin de cerveza tipo

ale, en la cual las levaduras forman un aglomerado que flota en el lquido o

pueden flocular a inicios de la fermentacin y hundirse en el lquido. En esta etapa

el mosto es sometido a temperaturas que van desde 15 a 22 C para cervezas ale,

donde se metabolizan los carbohidratos del mosto para generacin de etanol y CO2,

ver Figura 2.

4. Procesamiento final. Una vez concluida la maduracin, la cerveza es clarificada,

envasada y pasteurizada para su embotellamiento y distribucin.




Figura 2 Seguimiento de reacciones para obtener etanol a partir de glucosa.

Antecedentes de produccin de cerveza.

Garca, Snchez, Vidal y Vijande (2004) exponen en su artculo la cerveza artesanal, cmo

hacer cerveza en casa una cronologa histrica de produccin de cerveza, as como a partir

de procesos sencillos presentan la forma de elaborar cerveza en casa, cumpliendo las cuatro

etapas fundamentales, malta, mosto, fermentacin y filtrado.

Pablo Placente (2001) en su artculo en lnea publicado en ingenieraquimica.org, describe

paso a paso la elaboracin de cerveza de forma casera, sin la adicin de algn lpulo en el

proceso.




Anabel Snchez (2011) en su tesis fermentacin de malta empleando un sistema

semicontinuo en el proceso de elaboracin de cerveza establece de forma clara la

obtencin de una mayor productividad volumtrica de mosto fermentado a partir de malta

de cebada mediante el uso de un sistema semicontinuo, en comparacin con un sistema por

lote.

Martnez e Insuasti (2010) elaboraron cerveza artesanal utilizando cebada y yuca, as como

la aplicacin de las pruebas fisicoqumicas de la estabilidad como pH, acidez, densidad y

C02 estableciendo los niveles de azcar para la elaboracin de la cerveza artesanal y la

cantidad de lpulo requerido para la elaboracin de cerveza.

Los lpulos utilizados para la elaboracin de nuestra cerveza JINICH fueron Nugget

13.2%, Chinook 11.8% y Cascade 7%.

Lpulo Nugget. Es una de las variedades de lpulo ms populares para la elaboracin de

cerveza; contiene excelente amargor, con un fuerte aroma herbla y a maderas. Es un poco

picante, aroma a pino, resina muy fuerte y herbal, pero esto se ve eclipsado por su potencial

de amargor. Es ideal para dar un empuje de amargor en estilos que lo requieran. Entre sus

propiedades qumicas se encuentran: 11.0-12.5% (peso/peso) de alfa cidos, 3.5-4.0%

(peso/peso) de beta cidos, un aproximado de 2.0 mL/100g de aceites esenciales, mirceno

del 54%, este aceite mirceno es en la parte alta, que ayuda a proporcionar algunos de los

tonos leosos.

Lpulo Chinook:.Es una variedad de amargor con caractersticas de aroma, con altos cidos

alfa con carcter herbal, que da un gran aroma casi ahumado cuando es usado como un

lpulo aromtico durante los ltimos minutos del hervido o en dry hoping, mirceno del 35-

40% del total de aceite. Excelente para estilos Pale Ale.

Lpulo Cascade: Contiene de 6-0 a 8.0% de cidos alfa, 5.0-5.5% de cidos beta,

1.1mL/100mg del total de aceites.




JUSTIFICACIN

La produccin de cerveza, hoy por hoy es considerada en todo el mundo como un tpico

ejemplo de biotecnologa tradicional. Como parte de la materia de Ingeniera de

Fermentaciones, uno de los procesos clsicos que involucra una fermentacin es

precisamente la fabricacin de cerveza.

El hecho de realizar nosotros una fermentacin para producir cerveza con Sacharomycces

cerevisiae integra conocimientos que hemos venido aprendiendo en nuestra carrera como

Ingenieros Farmacuticos, desde los mtodos microbiolgicos para tratar con la levadura,

las ruta biosinttica en la fermentacin, los mtodos analticos para las diferentes

determinaciones de valores como pH, contenido de azcar y porcentaje de alcohol, as

como la fisicoqumica de una buena cerveza.

Adems, en la elaboracin de la cerveza tendremos oportunidad de usar el biorreactor tipo

tanque agitado, el cual es usado casi universalmente en la industria de la fermentacin, y

nuestro inters en saber utilizarlo es muy grande, debido al numeroso tipo clulas que se

pueden hacer crecer en ese reactor.

Tambin decidimos optar por realizar este proyecto ya que nunca hemos producido cerveza

y una parte importante de cada materia que cursamos en nuestra carrera es aprender algo

nuevo. Al inicio del semestre, se nos plante la opcin de hacer penicilina en lugar de

cerveza pero la penicilina tambin la producimos en la materia de Biotecnologa

Farmacutica, as que nos pareci ms interesante el hecho de fabricar nuestra propia

cerveza.

Con este proyecto, queremos trabajar aprendiendo los principios bsicos de transformacin

de sustrato a un producto especfico como el alcohol y as aterrizar los conocimientos

tericos a algo tangible as como observar durante el proceso los puntos crticos de control

que influyen en que se obtenga una buena cerveza.




OBJETIVOS

Objetivo general:

Conocer, seleccionar y desarrollar una tcnica para la elaboracin de cerveza artesanal.

Objetivos especficos:

Aislar e identificar la cepa de Saccharomyces Cerevisiae a partir de una muestra de

cerveza.

Producir cerveza tipo Pale Ale, haciendo uso del mtodo dry hoping, en un

biorreactor tipo tanque agitado.

Modificar la formulacin de la cerveza tipo Pale Ale mejorando sus

caractersticas organolpticas.

MATERIALES Y MTODOS

Los siguientes materiales y metodologa se llevaron a cabo basndonos en el Manual de

prcticas de microbiologa (2013), adems se desglosan los materiales, reactivos, equipo y

metodologa empleada por objetivo establecido.

Aislamiento e identificacin de la cepa de Saccharomyces Cerevisiae a partir de una

muestra de cerveza.

Tabla de materiales, equipos y reactivos empleados.

Material

Cajas Petri desechables Puntas para micropipeta

estriles

Vaso de precipitado (500

mL)

Varilla de vidrio Micropipeta 20-200 m Micropipeta 100-1000 m

Matraz Erlenmeyer (250mL) Porta objetos Asa de nicromo

Mechero Bunsen Cubre objetos Atomizador

Equipo

Autoclave Incubadora Campana de flujo laminar

Microscopio de campo claro Balanza analtica

Reactivos

Agar Papa Dextrosa Agua destilada Muestra de cerveza




Metodologa (Diagrama de flujo)

Preparacin del medio de cultivo Papa Dextrosa (PDA).

Mtodo de extensin en placa

La muestra se pipetea

sobre la superficie de

la placa de agar (0,1

ml o menos).

La muestra se distribuye

uniformemente sobre la

superficie de agar

usando esparcidor de

vidrio estril.

Incubacin a 37C por 48

horas.

Resultados de propagacin de

placa

Colonias superficiales

Matraz de 250 mL

+ 100 mL de agua y

3.4 de PDA

Calentar con

agitacin suave

hasta su completa

disolucin y hervir

1 min.

Esterilizar en autoclave a

121 C (15 lb de presin)

durante 15 min. Enfriar a

45-50 C.

Vaciar en 4 cajas petri

y esperar a que

solidifique, rodeadas

por 3 mecheros bunsen




Prueba microscpica para identificar la levadura. Se empleara frotis en fresco

debido a que permite observar morfologa microscpica de la levadura en rea

asptica.

Pruebas bioqumicas para identificar levaduras

2. Fermentacin de carbohidratos

Inocular cada cepa en

una serie de tubos de

caldo rojo fenol.

Incubar los tubos a

37C durante 48 horas.

Hacer observaciones a

las 24 y 48 horas de

incubacin.

Determinar si ha crecimiento,

cambios en el color del indicador.

Prueba positiva (+) color amarillo

Prueba negativa (-) color rojo

Depositar muestra de

levadura en

potaobjetos con el asa

de nicromo

previamente

esterilizada.

Agregar 2 gotas de

agua destilada a la

muestra en el

portaobjetos.

Colocar un cubreobjetos

sobre este y llevar la

muestra al microscopio.

Observar la levadura al

microscopio con el

objetivo 40X.

Determinar morfologa de

la levadura.




2. Prueba de Ureasa

Morfologa colonial.

Caractersticas de Morfologa Colonial (Prescott, 1999).

Tamao de la colonia que comnmente se calcula en milmetros o tambin puede

ser descrito por medio de trminos relativos como una cabeza de alfiler, pequea,

mediana, grande.

Tambin es importante tomar en cuenta la pigmentacin de la colonia.

La forma de la colonia donde se destaca las caractersticas morfolgicas de la

colonia que incluye la forma, la elevacin y los bordes de la colonia.

El aspecto de la superficie de la colonia tambin puede identificarse con

caractersticas como si es brillante, opaca, mate, transparente.

Inocular desde la caja

Petri con el asa de

nicromo la cepa en

tubos con caldo de

urea.

Incubar los tubos a

37C durante 48 horas.

Hacer observaciones a las

24 y 48 horas de incubacin.

Prueba positiva (+) rojo

cereza

Prueba negativa (-) rosa

Observar la caja Petri

a travs de una lente.

Evaluar las

caractersticas de

morfologa colonial a

partir de la Figura 1.

Anotar observaciones

(resultados) encontrados.




Figura 1. Caractersticas morfolgicas de una colonia en general (Prescott, 1999).




Produccin de cerveza tipo Pale Ale, haciendo uso del mtodo dry hoping, en un



Material

Vaso de precipitado (1L) Puntas para micropipeta

estriles


mL)

Matraz Erlenmeyer (6L) Micropipeta 20-200 m Micropipeta 100-1000 m

Matraz Erlenmeyer (250mL) Colador Cuchara de acero inoxidable

Mechero Bunsen Olla (5L) Atomizador

Manta de cielo Franela Tubos Falcon

Vaporera (10L) Botellas de vidrio (250mL) Pinzas para matraz

Torundas de algodn Tubos de 1.5mL Tiras reactivas

Cofia Guantes de ltex Mangueras

Papel aluminio Cinta masking tape

Equipo

Autoclave Incubadora Cmara de Neubauer

Microscopio Balanza analtica Centrfuga de discos

Centrfuga Refractmetro Refrigerador

Campana de flujo laminar Bomba peristltica Biorreactor tipo tanque

agitado ez-control

Reactivos

Agua destilada Lpulo Nugget 13.2% Lpulo CHINOOK 11.8%

Lpulo Cascade 7% Gas de CO2 1.72 Kg de malta de cebada

Agua Alcohol al 70% Alcohol al 96%

NaOH al 0.05N Muestra de S. Cerevisiae


Preparacin de la malta

Cebada

Remojo

Germinaci

n

Trituracin




Se colocaron 4 L del mosto en

Biorreactor tipo tanque agitado

durante 3 das.

Se tomaron 7 muestras de 1 mL a

diferentes horas del da (esto en

un lapso de 3 das en biorreactor)

para realizar las pruebas de

sustrato y biomasa.

Preparacin del mosto

Malta

Maceracin

Filtracin

Coccin

Adicin de lpulo

nugget 13.2%

durante coccin

30 min 50%

45 min 25%

55 min 35%

Filtracin

Fermentacin Mosto

Inoculacin de

levadura

Maduracin

Fermentacin

primaria Toma de muestra




Modificacin de la formulacin de la cerveza tipo Pale Ale para mejorar sus

caractersticas organolpticas


Material

Vaso de precipitado (1L) Puntas para micropipeta

estriles


mL)

Matraz Erlenmeyer (6L) Micropipeta 20-200 m Micropipeta 100-1000 m

Matraz Erlenmeyer (250mL) Colador Cuchara de acero inoxidable

Mechero Bunsen Olla (5L) Atomizador

Manta de cielo Franela Tubos Falcon

Vaporera (10L) Botellas de vidrio (250mL) Pinzas para matraz

Torundas de algodn Tubos de 1.5mL Tiras reactivas

Cofia Guantes de ltex Mangueras

Papel aluminio Cinta masking tape

Equipo

Autoclave Incubadora Cmara de Neubauer

Microscopio Balanza analtica Centrfuga de discos

Centrfuga Refractmetro Refrigerador

Campana de flujo laminar Bomba peristltica Biorreactor tipo tanque

agitado ez-control

Reactivos

Agua destilada Lpulo Nugget 13.2% Lpulo CHINOOK 11.8%

Lpulo Cascade 7% Gas de CO2 1.72 Kg de malta de cebada

Agua Alcohol al 70% Alcohol al 96%

NaOH al 0.05N Muestra de S. Cerevisiae


Procesamiento

Cerveza

madurada

Gasificado

Clarificacin

Envasado

Cerveza

La clarificacin se llev a cabo

en la centrifuga de discos, el

envasado se coloc en botellas

de 255 mL. Se gasific durante 5

min a un flujo de burbujeo

regular. Se tap con corcho y se

sello con parafina, esto para

evitar la perdida del CO2 y por

ltimo se refriger. (Snchez et

a.l,2011)




Es similar al proceso empleado en el partado Produccin de cerveza tipo Pale Ale,

haciendo uso del mtodo dry hoping, en un biorreactor tipo tanque agitado, sin embargo la

diferencia es el cambio en la concentracin de los reactivos (lpulos).

Centrifuga de discos (Usada para la clarificacin de la cerveza)

Diagrama de funcionamiento:

(Hojas Tcnica Uso y especificaciones. Alfa Laval Industries)

1. En un principio esta se debe de llenar

con el agente a centrifugar, en un

flujo constante de suspensin.

2. Pero esta permanece girando

desde que entre el flujo.

3. Una vez que el volumen es

totalmente ocupado, comienza

a formarse la torta.

4. Ya que est formada se abre una

pequea compuerta alrededor de de

la centrifuga, esto a travs de un

sistema de aire comprimido y es

programado para abrirse cada

determinado tiempo.

5. El lquido clarificado sale por la

parte superior y usualmente este se

recircula para asegurar la separacin

de los slidos.




RESULTADOS Y DISCUSIN

Aislamiento e identificacin de la cepa de Saccharomyces Cerevisiae a partir de una

muestra de cerveza.

Aislacin e identificacin mediante pruebas bioqumicas de la levadura Sacharomycces

Cerevisiae de una muestra de cerveza obtenida en el laboratorio de Ingeniera de

Fermentaciones de UPIIG.

Para llevar a cabo el aislamiento e identificacin de S. Cerevisiae se utiliz una muestra de

cerveza proporcionada en el laboratorio de Ingeniera de Fermentaciones de UPIIG que se

saba con anterioridad que contena la levadura de inters.

Para aislar la levadura, se decidi realizar la tcnica de extensin en placa debido a que es

un mtodo viable y comnmente usado para diversos grupos microbianos de importancia

en alimentos. Esta tcnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes,

pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxgeno,

permiten seleccionar grupos de levaduras o bacterias cuya presencia es importante en

diferentes alimentos; por ejemplo en el pan, la cerveza, el queso, el vino, etc. (Prescott,

1999).

Como lo que se pretende en el proyecto es aislar la levadura de una muestra de cerveza, el

mtodo de extensin en placa permite que al extender la muestra sobre la placa se haga

posible el adelgazamiento de la muestra de tal manera que en la superficie del agar quedan

las bacterias separadas unas de otras permitiendo que se aslen con mayor facilidad adems

de ser un mtodo ms rpido en comparacin con el vaciado en placa, ms sencillo que la

tcnica de diluciones en serie o la de estra cruzada debido a que si no se tiene el suficiente

cuidado y buen manejo de la tcnica, la estra cruzada puede salir mal y no lograr el total

aislamiento de la levadura. (Prescott, 1999)

El aislamiento de las colonias al cultivar es importante ya que con ello se puede examinar la

morfologa y realizar un frotis que junto con la evaluacin microscpica de los cultivos y la

morfologa de la colonia son lo ms importante para la identificacin del microorganismo.

(Prescott, 1999)

Para caracterizar la morfologa celular de microorganismos de debe analizar el tamao

celular, forma celular y distribucin de las clulas unas con respecto a otras. Tambin

puede observarse la movilidad de los microorganismos bajo microscopio con condiciones

de preparacin hmeda o por inoculacin en medios semislidos. (Tortora et al., 2007)




Para la observacin de la morfologa colonial, se tomaron fotos a simple vista y se

describieron algunas caractersticas observadas (Tabla 1), se observaron las cajas Petri

proporcionadas en el microscopio, se identificaron las colonias y se describi la morfologa

observada (Tabla 1). Adems se realiz un frotis para su observacin en el microscopio de

campo claro bajo el objetivo de 40 X (Figura 4).

Resultados de la morfologa celular.

Como se puede observar en la figura 4 el cultivo de la levadura no est axnico, es decir, no

se logr aislar S. Cerevisae con la tcnica de extensin en placa, en la figura se ven dos

tipos de morfologa celular, se ven unas clulas ms grandes que otras, unas son circulares

y otras tiene forma ovalada. Esto quiere decir que en realidad, obtuvimos dos tipos de

levadura, no slo una. Podramos argumentar tambin que el medio pudo haberse

contaminado, pero no ocurri esto ya que realizamos un stock en el procedimiento e incluso

en un inicio se dejaron las cajas de Petri con el PDA sin el inculo en la incubadora durante

24 horas para verificar que no se contaminara el medio o que el pH cambiara. Uno de los

puntos crticos de control en el procedimiento llevado a cabo para aislar la levadura de

inters fue que la muestra de cerveza que se nos proporcion no estaba estril, por lo tanto

pudo contener microorganismos que afectaron la aislacin de la levadura.

La morfologa colonial de S. Cerevisiae segn el Atlas consultado (Koneman et al., 2006)

se puede observar en la figura 4 y la morfologa colonial obtenida se muestra en la figura 5.

Figura 4. S. Cerevisae. La forma celular es ovalada y circular, se observan distintos tamaos.

Clula ms grande.

Forma ovalada

Clula ms pequea.

Forma circular




Figura 4. Morfologa colonial tpica

de S. cerevisiae obtenida con la tcnica

de extensin en placa.

Adems la posible cepa de levadura que pudo haberse obtenido pudo ser Saccharomyces

carlsbergensis debido a sus caractersticas morfolgicas y coloniales que la hacen tener

similitud con las que observamos en nuestra caja. Su morfologa es circular (no ovalada

como la de S. cerevisiae) y presenta un anillo caf alrededor y el centro ligeramente oscuro.

En la figura 6 podemos observar la morfologa de S. carlsbergensis bajo el microscopio de

campo claro bajo 1000X.

La levadura Saccharomyces carlsbergensis hoy en da se emplea esta levadura en la

investigacin de ciertos procesos de la gluclisis. Este tipo de levadura es diferente en

muchos aspectos de la S. cerevisiae; no esporulan fcilmente y un bajo porcentaje de las

esporas son viables. Adems, S. carlsbergensis parece crecer a una temperatura ms baja en

comparacin con la que crece S. cerevisiae. S. carlsbergensis es polipoide, contiene partes

de al menos dos genomas divergentes. (Kerridge, 1958).

Figura 5. Morfologa colonial de

S. cerevisiae obtenida de la

muestra de cerveza con la tcnica

de extensin en placa.

Figura 6. Morfologa celular tpica de

Saccharomyces carlsbergensi bajo 1000X




Despus de la observacin en el microscopio y tomando en cuenta que el cultivo no result

ser axnico, se procedi a realizar la tcnica de estra cruzada en medio PDA, de tal manera

que se tom una muestra de las colonias que se vean ms grandes en la caja de cultivo

(figura 5) ya que de acuerdo al Atlas consultado esas colonias son tpicas de Sacharomyces

cerevisiae y se llev a cabo la tcnica de estra cruzada en placa la cual consiste en girar la

placa al ir rayando sobre el agar hasta formar un pentgono con el fin de que el inculo se

vaya diluyendo, al final de la siembra las levaduras deben quedar bien separadas unas de

otras para aislar la levadura nuevamente y lograr obtener slo S. cerevisiae. Posteriormente

se dej incubar por 48 horas a 37C, el resultado obtenido se muestra en la figura 7.

Figura 7. S. cerevisiae aislada con la tcnica de estra cruzada

Adems se observ su morfologa en el microscopio de campo claro (figura 8) para

identificar que efectivamente era S. cerevisiae y present una morfologa ovoide

caracterstica de ese tipo de levadura y ahora todas las clulas que se vean eran ovoides y

presentaban las mismas caractersticas en el anillo y en el centro por lo tanto el cultivo ya

es axnico.




Figura 8. Morfologa de S. cerevisiae asilada. Observacin bajo el objetivo de 100 X en

microscopio de campo claro.

Durante 200 aos las caractersticas morfolgicas (estructurales) han ayudado a los

taxonomistas a clasificar los organismos. Hoy en da la identificacin de un

microorganismo por medio de la morfologa nos dice poco acerca de las relaciones

filognicas. Sin embargo, las caractersticas morfolgicas an son tiles para la

identificacin de las levaduras, bacterias y hongos. (Tortora, et al., 2007).

Existen clasificaciones para casi todos los microorganismos e identificar la morfologa es

una ventaja para cuando no se sabe qu clase de microorganismo se maneja es decir si es un

hongo o una bacteria, cada uno tiene caractersticas muy especficas por lo cual si se

conocen dichas caractersticas es fcil diferenciar uno del otro.

S. Cerevisae es un hongo, una levadura utilizada en la fabricacin de pan, cerveza y vino

comnmente, debido a que es un hongo normalmente se encuentran vista al microscopio

agrupaciones de esferas pequeas.

Las colonias, son agrupaciones del microorganismo de inters (en este caso de levadura)

que son visibles en los medios de cultivo, gracias a las formas que generan. Este tipo de

agrupaciones son formadas por un solo tipo de microorganismo, lo que quiere decir que

tienen la misma informacin gentica. La morfologa colonial y celular, son las

caractersticas que, junto con el aspecto de las colonias y el tipo del medio en el que se han




incubado, siendo diferenciales y selectivos; todo esto, forma parte de procedimientos

llevados a cabo en laboratorios microbiolgicos (Koneman, et al., 2006).

En la tabla 1 se pueden observar los resultados obtenidos de la morfologa colonial de S.

Cerevisiae aislada mediante la tcnica de estra cruzada.

Tabla 1. Resultados se las observaciones de la morfologa colonial a simple vista.

Caracterstica Descripcin

Medio de cultivo Slido

Aspecto Seco

Color Beige

Superficie Lisa

Elevacin Plana

Forma Circular

Pigmento No presente

Consistencia Suave

Borde Entero

El desarrollo, crecimiento, reproduccin y adaptacin de las clulas est estrechamente

ligado a su relacin con el medio extracelular; estas variaciones en el entorno producen

como consecuencia una respuesta de adaptacin a las nuevas situaciones, que pueden ser

determinante para su supervivencia. Para ello poseen sensores que activan cambios y

mecanismos metablicos que conllevan a una respuesta especfica (Salle, 1967).

Las pruebas bioqumicas se basan en cuatro aspectos, primero el sustrato contenido en el

medio de cultivo, segundo la enzima o va metablica secretada o que est dentro del

microorganismo, tercero el producto y por ltimo un revelador y/o indicador (Salle, 1967).

La Saccharomyces Cerevisiae es una levadura, un hongo unicelular, del grupo de los

ascomicetos, crece de forma ptima a un pH cido. La alcalinizacin extracelular interfiere

con el correcto transporte de nutrientes y cationes necesarios para su supervivencia y, por

ello, la exposicin a pH alcalino supone una situacin de estrs. S. Cerevisiae es capaz de

sobrevivir a valores de pH de 5.0 a 6.0. Es un anaerobio facultativo, adems desarrolla un

metabolismo oxidativo y un metabolismo fermentativo. (Ortiz, 2013)

Pruebas bioqumicas

Prueba de Fermentacin de carbohidratos.

Se utiliz un medio de cultivo caldo bsico rojo de fenol siendo 39 g los necesarios para

preparar un litro de medio, teniendo como formulacin qumica los siguientes compuestos:




Peptona 10g.

Extracto de carne 1g.

Cloruro de sodio 5g

Agua destilada 1000 mL.

Indicador de pH: Rojo de fenol.

-cido: color amarillo con pH de 6.8

-Alcalino: color rojo con pH de 8.4

-Medio no inoculado de color rojo intenso con pH de 7.4

El fundamento de esta prueba se basa en el proceso metablico de xido-reduccin que

ocurre en un medio ambiente anaerobio y, en lugar de oxgeno, un sustrato orgnico sirve

como aceptor final de hidrgeno. Este efecto es detectado observando cambios de color en

los indicadores de pH a medida que se forman los productos cidos (metabolitos). La

prueba resulta negativa si la coloracin del medio es rosa-rojizo (alcalina) o color naranja y

es positiva si la coloracin es amarilla (cida) (Cercenado y Cantn, 2010).

Las bacterias anaerobias y anaerobias facultativas a menudo fermentan carbohidratos a

cidos orgnicos y gas. (Bailn et al, 2003)

En la figura 9, se observan los cambios de color para el medio de cultivo caldo bsico de

fenol, obteniendo un resultado positivo para la prueba de fermentacin de carbohidratos

interpretndose que los compuestos de carbono incorporados en el sustrato fueron

degradados a monmeros y transportados a la clula para posteriormente ser metabolizados

por la va fermentativa debido a las condiciones anaerobias del medio. Fsicamente esto se

observa por el cambio de color amarillo que indica la acidez en el medio de cultivo

significando la fermentacin (degradacin) de los compuestos de carbono, siendo este

compuesto, en la formulacin, el extracto de carne.

Prueba de ureasa.

B

Figura 9. A) Tubos Falcon con medio de cultivo caldo bsico de fenol inoculado con

Saccharomyces cerevisiae al tiempo cero de incubacin. B) Se observa el cambio de coloracin del

medio de cultivo caldo bsico de fenol de un color rojizo a un color amarillo a las 48 horas de

incubacin siendo la temperatura de incubacin 37C.

A B




Se utiliz un medio de cultivo caldo urea de Christensen cuya formulacin (3.87 g de

polvo) para 100 mL de agua es la siguiente:

Extracto de levadura 0.10g

Urea 20.0g

Fosfato monopotsico 9.10g

Fosfato de sodio 9.50g

Rojo de fenol 0.01g

Indicador de pH: Rojo de fenol

cido: amarillo con pH de 6.8.

Alcalino: rosado con pH de 8.4

Medio no inoculado: amarillo con pH de 6.8

Este tipo de prueba determinar la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando

dos molculas de amoniaco por la accin de la enzima ureasa produciendo un cambio de

color en el medio. Las levaduras pueden degradar la urea si tienen la enzima ureasa. Tiene

como reaccin qumica la siguiente:

+ 22 2 + 2 + 23

El amoniaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, producindose

alcalinizacin y aumento del pH del medio que se detecta por la presencia del indicador

(Cercenado y Cantn, 2010).

La hidrlisis de la urea es catalizada por la ureasa para dar dos molculas de amoniaco. La

ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposicin de los

compuestos orgnicos. El resultado es positivo si la coloracin es rosada intenso, negativo

si la coloracin es amarilla (Bailn et al, 2003) Los resultados obtenidos para sta prueba se

muestran en la figura 10.




En la figura 10, se observa el cambio de color del caldo urea de rojo a rosado leve, esto nos

indica que la prueba es positiva, por lo cual en el medio existe una baja concentracin de

amonaco que alcaliniza el medio. La baja concentracin de amoniaco puede explicarse

debido a que durante el proceso metablico de la Saccharomyces cerevisiae la degradacin

de la urea no siempre sigue inmediatamente el metabolismo de la arginina. En

consecuencia, la urea es excretada progresivamente por los microorganismos de levadura y

puede ser reabsorbida ms tarde para ser utilizada como una fuente de nitrgeno. La

excrecin de urea y re-absorcin afectan la cantidad de urea presente en el medio. Adems

degrada la urea en una reaccin de amonaco en dos pasos, primero se puede utilizar para

sintetizar nuevas molculas nitrogenadas complejas y dos producir CO2, donde la urea es

carboxilada en alofanato por carboxilasa. (Coulon J. et al, 2006).

Tabla 2. Resumen de los resultados obtenidos para las pruebas bioqumicas aplicadas a

Saccharomyces cerevisiae.

Prueba bioqumica Resultado

Fermentacin de carbohidratos Positiva

Prueba de Ureasa Positiva

Figura 10. A) Tubos Falcon con 20 mL de cultivo caldo urea cada uno, inoculados con

Saccharomyces cerevisiae, ntese su coloracin rojiza a un tiempo cero de incubacin.

B) Se observan los tubos Falcon transcurridas 48 horas de incubacin, se aprecia una

coloracin rosada en el caldo urea.

A B A




Produccin de cerveza tipo Pale Ale, haciendo uso del mtodo dry hoping, en un


Conteo en cmara de Neubauer.

Se tomaron en total cinco muestras durante un da de fermentacin para hacer el conteo

de las clulas de la levadura y obtener una cintica que nos mostrara la produccin de

biomasa. Se realiz el conteo de cada muestra en cmara de Neubauer.

Figura 11. Se observan los cuadros representativos para un conteo en cmara de Neubauer.

La muestra de cerveza JINICH fue contada en la regin tres de la cmara a 1/16 del cuadro

tres.




Figura 12. Grfica de la produccin de biomasa de Saccharomyces Cerevisiae en la

fermentacin de mosto para la produccin de cerveza.

Podemos observar en la Figura 12 el crecimiento de la Saccharomyces Crevisiae con una

concentracin inicial a un tiempo de cero horas de 5.5x106 cel/mL y una concentracin

final despus de veinte horas de 1.25x107 cel/mL

La velocidad especfica de crecimiento () para produccin de biomasa o generacin de

clulas de Saccharomyces cerevisiae tiene un valor de 0.0339 h-1

(ver anexo, apartado II),

con un tiempo de duplicacin de 20.44 horas (ver anexo, apartado III).

Conteo de clulas en cmara de Neubauer:

16 cuadros Nmero de clulas por cuadro

Cuadro 1 extremo superior izquierdo

14

Cuadro 2 extremo superior derecho

15

Cuadro 3 central 13

Cuadro 4 extremo inferior izquierdo 14

14

Cuadro 5 extremo inferior derecho 14

Dado el conteo anterior, la concentracin celular obtenida de la suspensin de

Saccharomyces cerevisiae del inculo es de 3.5 x 107 clulas/mL (Ver anexo, apartado

ll).

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

0 5 10 15 20 25

Co

nce

ntr

aci

n (

cel/

mL)

Tempo (h)




Cintica de crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae sobre medio de

cultivo (mosto) en un Biorreactor tipo tanque agitado.

Condiciones iniciales de operacin: T= 23C; pH = 5.5; Volumen = 4 L; Tiempo = 24 h

Figura 16. Cintica de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en Biorreactor tipo

Tanque Agitado.

Figura 17. Regresin de datos para la obtencin de la velocidad especfica de crecimiento.

El coeficiente de mantenimiento () para produccin de biomasa o generacin de clulas de

Saccharomyces cerevisiae tiene un valor en este caso de 0.1772 hr-1

de acuerdo a la

ecuacin de regresin obtenida en la figura 13 (y = 0.1772x + 13.399) y las ecuaciones

empleadas (ver Anexo).

12.5

13

13.5

14

14.5

15

15.5

16

16.5

17

17.5

0 5 10 15 20 25 30

Ln (

# c

lula

s/m

L)

Tiempo (h)

y = 0.1772x + 13.399 R = 0.7749

12.5

13.5

14.5

15.5

16.5

17.5

18.5

0 5 10 15 20 25 30

Ln (

# c

lu

las/

mL)

Tiempo (h)




En la figura 18, se muestra la produccin de biomasa y consumo de sustrato cuantificados

en g/L.

Figura 18. Consumo de sustrato y produccin de biomasa de S. cerevisiae en biorreactor

tipo tanque agitado.

Nota: Para convertir los grados Brix medidos a g/L simplemente se hace la correlacin

usando las tablas correspondientes de la relacin entre los grados Brix y el ndice de

refraccin a la temperatura a la cual se midieron los grados Brix y la cantidad de azcar por

litro de agua. (Tabla 6).

Tabla 6. Grados Brix obtenidos durante la fermentacin de S. Cerevisae en el biorreactor

tipo tanque agitado.

Tiempo (h) Temperatura

(C)

Grados Brix

medidos

g/L azcar Alcohol

probable

0 23 4.03 44.841 2.33

2 23 4.13 45.878 2.36

4 23 4.03 44.768 2.39

6 23 3.41 37.744 1.95

8 24 2.44 27.171 1.41

10 24 1.36 15.146 0.78

12 24 1.08 11.963 0.54

14 24 0.93 10.354 0.58

16 24 0.90 9.963 0.57

El alcohol probable se obtuvo mediante las tablas obtenidas de

http://www.ictsl.net/downloads/refractometros.pdf, correlacionado los valores de los grados

Brix.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 5 10 15

Co

nsu

mo

de

sust

rato

(g/

L)

Tiempo (h)

Consumo de sustrato(g/L)

Biomasa (g/L)




Determinacin de variables que influyen en el cuerpo, conservacin y sabor de la

cerveza.

Segn posada (1995), la calidad de la cerveza depende de varios factores que tienen

relacin con las materias primas utilizadas, con el proceso de elaboracin y principalmente

con las personas que evalan esta calidad. Entre los parmetros ms importantes de

evaluacin de calidad estn el sabor, la presencia y permanencia de espuma, color, grado

alcohlico y la presencia de residuos o precipitados (estabilidad).

A continuacin se muestran los resultados obtenidos de las determinaciones de los valores

correspondientes de la cerveza producida.

Tabla 3. Resultados obtenidos de las determinaciones de los valores de pH, grados Brix y

grados de alcohol de la cerveza producida.

pH Brix % Alcohol

4.3 4.0 3.93 %

El valor obtenido para el pH (4.3), est dentro del rango sealado por Kunze (1996) para la

cerveza tipo Pale Ale que l produjo, el cual indica que el pH se sita entre 4,2 y 4,4. Sin

embargo, Swistowiez (1977) registra un valor ms bajo de 4,1 0,2.

Para poder calcular el porcentaje de alcohol, despus de tomar la densidad inicial (antes de

fermentar) se tom la siguiente lectura (densidad final) cuando sali del fermentador

(biorreactor tipo tanque agitado). Cabe mencionar que la densidad final siempre ser menor

debido a que la levadura ha consumido parte de los azcares disueltos en el mosto. (Hough

y Gonzlez, 1990).

La glucosa, es el azcar principal que es convertido en alcohol por la levadura. Las

reacciones que se llevan a cabo convierten cada molcula de glucosa en dos molculas de

etanol (CH3CH2OH) y dos molculas de dixido de carbono (CO2):

C6H12O6 => 2(CH3CH2OH) + 2(CO2)

Ahora, si revisamos la tabla peridica, el peso molecular del etanol o es: 46.0688 g/mol y

por otro lado el peso molecular del dixido de carbono es: 44.0098 g/mol. Estos nmeros

son necesarios para calcular la cantidad de alcohol en la cerveza.

Por los pesos moleculares mencionados podemos decir entonces, que por cada 44.0098

g/mol de CO2 que se liberan, se producen 46.0688 gramos de etanol. O lo que es lo mismo,

por cada gramo de CO2, se producen 1.05 gramos de etanol.

Entonces ahora podemos calcular el contenido de alcohol en la cerveza.




Densidad inicial: 1,045 g/mL

Densidad final: 1.015 g/mL

Si las restamos nos da la cantidad de CO2 que se liber, que es 0.03 g/mL, si lo

multiplicamos por 1.05 nos da el peso del alcohol en el fermentador. Que en este caso es

de: 0.0315 g/mL.

Alcohol en la cerveza = (Densidad inicial-Densidad final)*1.05 = 0.0315 g/mL

Densidad final de la cerveza: 1.015 g/mL

Entonces al dividir ambas podemos calcular el porcentaje de alcohol en nuestra cerveza:

Alcohol en la cerveza/ Densidad final = (0.0315 g/mL)/1.015 g/mL * 100 = 3.103 %

Este es el porcentaje de alcohol por peso, que tiene nuestra cerveza. Sin embargo es ms

comn expresar el porcentaje de alcohol en volumen. (%ABV). (Hough y Gonzlez,

1990). Entonces para obtener el porcentaje de alcohol en volumen, slo hay que dividirlo

por la densidad del alcohol, lo que nos da:

3.103/0.79= 3.92 %

O utilizar esta frmula general: (Hough y Gonzlez, 1990)

%ABV= (Densidad inicial-densidad final)*131

%ABV= (1.045 g/mL-1.015 g/mL)*131= 3.93%

Y as concluimos que nuestra cerveza tiene un 3.93 % de Alcohol.

Los principales productos de fermentacin son etanol y CO2, aunque tambin se forman

otros subproductos del crecimiento de la levadura, que contribuyen de forma importante al

perfume y aroma de la cerveza. (Tabla 4). Los cidos orgnicos, alcoholes y steres son

especialmente importantes (Brown et al., 1989).

Tabla 4. Productos de las fermentaciones de levaduras.




Anlisis organolptico

A continuacin se nombran algunos parmetros fsico-qumicos usados comnmente para

describir una cerveza, y que pueden ser utilizados para medir de alguna manera su calidad.

El anlisis organolptico se llev a cabo con 10 personas en las instalaciones de la Unidad

Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera campus Guanajuato a las cuales se les dio una

muestra de la cerveza para que la evaluaran. Los resultados obtenidos se muestran en las

siguientes grficas.

Figura 12. Calificaciones otorgadas por los degustadores en cunto al color de la cerveza.

0123456789

10

Cal

ific

aci

n

Degustadores

Color

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Cal

ific

aci

n

Degustadores

Sabor

Figura 13. Calificacin obtenida en la evaluacin del sabor segn los

degustadores. 1= Amarga, 2= Poco Amarga, 3= Muy amarga.




Figura 14. Calificaciones del olor de cerveza segn los degustadores.

Segn Garca et al., (1993) hay distintos tipos de cerveza en el mundo, algunas de sus

caractersticas se muestran en la tabla 3. Como podemos ver, lo que distingue a una cerveza

tipo Pale Ale de las dems es su sabor muy amargo, adems de que contiene mucho lpulo

es clara y seca.

Tabla 5. Distintos tipos de cerveza en el mundo, sus nombres y sus caractersticas.

Tipo de cerveza Caractersticas

LAGER

Hell o Pale Clara, mucho lplulo, seca, poco cuerpo

Dortmunder Igual que la pilsener, pero con menos lpulo y sabor ms suave

Munich Oscura, sabor intenso, poco lpulo, poco amarga, dulce, mucho cuerpo

Bock, Marzen Igual que la Munich pero con ms alcohol

ALE

Pale ale Clara, mucho lpulo, seca, muy amarga

Brown ale Oscura, poco lpulo, dulce

Bitter Clara, mucho lpulo, mucho cuerpo (pale ale de barril)

Mild Ale Semioscura, dulce, poco densa, amarga

Stout o Porter Muy oscura, mucho cuerpo, mucho lpulo, amarga, dulce o seca

Si observamos la figura 13, la mayora de los degustadores calificaron como Amarga y

muy amarga la cerveza obtenida, caracterstica que concuerda con lo consultado en la

literatura (Tabla 5).

8.48.68.8

99.29.49.69.810

10.2

Cal

ific

aci

n

Degustadores

Olor




Finalmente en la tabla 4 se agrupan las caractersticas obtenidas de la cerveza producida a

la cual nombramos cerveza JINICH.

Tabla 4. Propiedades organolpticas de la cerveza JINICH

Caracterstica Observaciones

Color Amarillo

Tonalidad del color Claro

Vivacidad Poca capacidad del desprendimiento de gas

disuelto en la cerveza.

Consistencia de la espuma Ligera, con tamao de poros de gas en

superficie cerrados.

Persistencia de la espuma en el vaso No

Color de la espuma Blanco intenso

Aroma Agradable, terroso intenso

Alcohol Intenso

Sabor Un amargo intenso

Sensacin residual Perdura en la boca despus del consumo.

Las tipo Pale Ale segn el programa de certificacin para juzgar cervezas (2008) estipulan

que tienen un aspecto amarillo claro o cobre suave, claridad buena o brillante. Espuma

blancuzca de baja a moderada. Puede tener una espuma de poca altura debido a la baja

carbonatacin. Sabor amargo medio a alto.. El sabor del lpulo es de moderado a bajo (a

terroso, resinoso y/o floral en las variedades tpicamente inglesas, aunque pueden usarse

variedades de lpulo. Carcter maltoso de bajo a medio con un gusto final seco. Su sabor en

la boca es de cuerpo liviano a medio-liviano.

Adems de todo lo anterior la formacin de espuma es uno de los factores ms importantes

en la evaluacin de calidad que realizan los consumidores, ya que con esto se transmite la

primera impresin del producto cuando es servido un vaso de cerveza. La espuma se forma

por gases que se encuentran finamente repartidos en el lquido y materias slidas,

principalmente el CO2.

Segn Swistowiez (1977), los elementos de la formacin de espuma son las protenas de

alto peso molecular derivadas de la malta y provenientes del lpulo. Las maltas demasiado

modificadas o poco desecadas tienden a producir espumas pobres. Cuanto menor sea la

relacin de malta y lpulo, ms pobre ser la espuma.

Cabe mencionar que no pudimos evaluar este factor en la cerveza producida porque ocurri

un accidente con la cerveza ya embotellada, alguien la meti al congelador por descuido

ocasionando que se congelara por completo y se desgasificara como ocurre con todos los

productos gaseados cuando se congelan, la cerveza gasificada que se tena se puede

observar en la figura 15, donde se aprecia la formacin de espuma.




Figura 15. Generacin de espuma en la cerveza producida (Antes de haberse congelado)

Otras de las caractersticas que son importantes evaluar para validar la calidad de una

cerveza son el amargor y la turbidez, los cuales influyen mucho en el sabor y color del

producto final. (Hough y Gonzlez, 1990).

La cerveza final obtenida se puede apreciar en la figura 16. Embotellada y etiquetada. La

marca: JINICH.

Figura 16. Cerveza artesanal marca JINICH elaborada a partir de la fermentacin S.

cerevisiae en un biorreactor tipo tanque agitado.

Espuma generada

en el primer

embotellamiento

de la cerveza.




CONCLUSIN

Se aisl S. Cerevisiae mediante la tcnica de estra cruzada en agar PDA, se identific y

determin la morfologa colonial y celular de S. Cerevisiae mediante pruebas bioqumicas y

una vez aislada la cepa se utiliz para realizar una fermentacin en un biorreactor tipo

tanque agitado obteniendo cerveza tipo Pale Ale artesanal clarificada con centrifuga de

discos. De los parmetros fsico-qumicos determinados se encontr que concuerdan con

los mencionados por literatura para ste tipo de cerveza producida con la implementacin

de tcnica Dry-Hopping.

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2014). Editorial: Madrid: Mdica Panamericana. Alemania. Pg. 148.

Prescott, Harley, Klein. (1999). Microbiologa. Mc Graw-Hill Interamericana de

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Rodrguez Cavallini E y colaboradores. (2005). Bacteriologa general: Principios y

Prcticas de Laboratorio. Universidad de Costa Rica. Costa Rica. pg.117

Salle A J. (1967). Fundamental Principles of Bacteriology. Mc Graw-Hill. Book

Company. N. Y.




Snchez A. (2011). Fermentacin de malta empleando un sistema semicontinuo en

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Universidad Tecnolgica de la Mixteca.

Trtora Gerard J., Funke Berdell R., Case Christine L. (2007) Introduccin a la

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Posada, J. 1998. Estudio Recopilatorio Cerveza y Salud. Escuela Superior de

Cerveza y Malta. Centro de informacin Cerveza y Salud. Madrid. Espaa.

ANEXO

Memoria de clculo.

Apartado I.

El rea del 1-16 de la regin tres de la cmara de Neubauer comprende:

rea= 0.05 mm x 0.05 mm= 0.0025 mm2

Volumen= 0.0025 mm2 x 0.1 mm= 2.5 x 10

-4 mm

3 = 2.5x10

-7 mL.

Frmula de concentracin celular:

= 4106

Apartado II.

Figura Regresin de datos para la obtencin del coeficiente de mantenimiento.

y = 0.0339x + 0.0851 R = 0.9558

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 5 10 15 20 25

ln(x

/x0)

Tiempo (h)




Se observa en la Figura la regresin de los datos del logaritmo de la concentracin de

biomasa con respecto al tiempo para determinar la velocidad especfica de crecimiento ();

partiendo de la siguiente ecuacin:

= x

0= t

y graficando

0 con respecto al tiempo para obtener la velocidad especfica de

crecimiento (), resultando una ecuacin final de:

y = 0.0339x + 0.0851

0= 0.0339t + 0.0851

Apartado III.

Para el tiempo de duplicacin empleamos la siguiente ecuacin:

=2

= 20.44

- Calculo del promedio de clulas por cuadrado:

Media (14+15+13+14 +14)/5 = 14 levaduras en 16 cuadros de 0.05 mm x 0.05 mm c/u

14

16 400

0.1 3

1000 3

1 3 102 = 3.5 107 /

Al utilizar un inculo activo y suponiendo que puede acortarse el tiempo que dura la fase

de latencia y la velocidad de crecimiento de la biomasa aumenta, transcurridas ciertas horas

las clulas crecen a una velocidad mxima constante (fase exponencial) y puede describirse

con la ecuacin:

dX/dt = X Dnde: X= es la concentracin de clulas (mg/mL) t = es el tiempo (h) = es la velocidad especfica de crecimiento (h-1) Al integrar la ecuacin dX/dt = X, obtenemos:

Xt = X0eut

Dnde: X0 es la concentracin de clulas en el tiempo 0.




Xt es la concentracin de clulas despus de un tiempo t en horas Tomando logaritmos naturales en la ecuacin: Xt = X0e

ut se obtiene:

Ln Xt = ln X0 +t

El crecimiento microbiano unicelular es auto cataltico, de modo que la velocidad de

crecimiento celular es proporcional a la concentracin de clulas ya presente. El

crecimiento de un microorganismo en un cultivo puede describirse tambin usando el

trmino de tiempo de duplicacin () que es el tiempo necesario para dividir una clula.

(Cahuancama, 2013).Si en un medio de cultivo se inoculara una clula viable y esta clula

creciera a velocidad mxima sin pasar por la fase de latencia, el crecimiento secuencial del

nmero de clulas que se observara sera: 1, 2,4, 8, 16, 32, 64, etc. Este crecimiento

secuencial puede representarse expresando el nmero de clulas en base dos.

(Cahuancama, 2013)

Entonces tenemos:

= 20

ln (

0)) =

ln (2

0)) =

Despejando el tiempo de duplicacin ():

= ln 2

Dada la regresin obtenida se tiene:

Y=0.1172x+13.399

Y= mx+b

Ln (# de clulas) =t

Con un tiempo de duplicacin de:

=2

0.1772 1/h = 3.9




Rendimientos.

Con los 1.72 Kg de malta utilizada se lograron obtener 4.3 litros de cerveza.

Los clculos para la adicin de lpulos y malta se muestran a continuacin:

1 Kg malta = 2.5 L mosto

4.3 (1

2.5 ) = 1.72

6.666 gr de lpulo = 1 L mosto

6.666 4.3 = 28.666 13.2%

A continuacin se muestra la cantidad de lpulo Nugget 13.2% agregado a los diferentes

tiempos

30 min 50% (28.66

100 %) = 14.33

45 min 25% (28.66

100 %) = 7.16

55 min 25% (28.66

100 %) = 7.16

En la tcnica Dry Hopping se usaron las siguientes cantidades del lpulo CHINOOK 11.8%

y Cascade 7%.

25% (28.66

100 %) = 7.16 11.8%

25% (28.66

100 %) = 7.16 7%

reporte fermentaciones

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