Profil Plasma microRNA pada Model tikus dari Cedera Hepatoseluler , Kolestasis, dan Steatosis

abstrakMicroRNAs ( miRNAs ) adalah molekul RNA kecil yang berfungsi untuk memodulasi ekspresi gen target , bermain pentingperan dalam berbagai proses fisiologis dan patologis . MiRNAs dalam cairan tubuh telah menerima cukupperhatian sebagai biomarker potensi berbagai penyakit . Dalam studi ini , kami membandingkan perubahan Mirna plasmaekspresi oleh cedera akut hati ( hepatoseluler cedera atau kolestasis ) dan cedera hati kronis ( steatosis , steatohepatitis danfibrosis ) menggunakan model tikus yang dibuat oleh pemerintahan bahan kimia atau diet khusus . Menggunakan array analisis Mirna , kami menemukanbahwa tingkat sejumlah besar miRNAs ( 121-317 miRNAs ) meningkat lebih dari 2 kali lipat dan tingkat dari sejumlah kecilmiRNAs ( 6-35 miRNAs ) yang menurun di bawah 0,5 kali lipat di semua model kecuali dalam model kolestasis disebabkan oleh saluran empeduligasi . Menariknya , profil ekspresi yang berbeda antara model , dan analisis clustering hirarkidiskriminasi antara cedera hati akut dan kronis . Selain itu, miRNAs yang ekspresi yang biasanya berubahpada setiap jenis luka hati bisa ditentukan . Perlu dicatat bahwa , dalam model cedera hati akut , tingkat plasma mir - 122 , yangpaling Mirna melimpah di hati , lebih cepat dan secara dramatis meningkat dari tingkat aminotransferase plasma ,mencerminkan sejauh mana cedera hepatoseluler . Penelitian ini menunjukkan bahwa profil Mirna plasma dapat mencerminkanjenis kerusakan hati ( liver injury misalnya akut / kronis atau cedera hepatoseluler / kolestasis / steatosis / steatohepatitis / fibrosis ) danmengidentifikasi miRNAs yang bisa menjadi biomarker spesifik dan sensitif dari kerusakan hati .

pengantarMicroRNAs ( miRNAs ) adalah keluarga noncoding RNA pendekyang produk akhir adalah 22 - nukleotida molekul RNA fungsional[ 1 ] . Mereka mengatur ekspresi gen target dengan mengikatdaerah yang saling melengkapi transkrip untuk menekan terjemahan ataumenyebabkan degradasi mRNA . Ada bukti yang berkembang bahwamiRNAs memainkan peranan penting dalam berbagai fisiologisdan proses patologis pada hewan [ 1,2 ] . Saat ini, lebih dari1400, 720 , dan 400 miRNAs telah diidentifikasi pada manusia ,mouse, dan tikus , masing-masing. Banyak miRNAs disajikan dalamtisu atau cara - sel tertentu . Ekspresi menyimpang dari miRNAs dijaringan telah terlibat dalam berbagai penyakit termasuk kanker[ 3 ] , hepatitis virus [ 4 ] , dan penyakit jantung [ 5 ] . Baru-baru ini , itumelaporkan bahwa miRNAs yang hadir dalam cairan tubuh sepertiplasma [ 6 ] , serum [ 6 ] , urine [ 7 ] , dan air liur [8,9 ] . ekspresi merekapola signifikan bervariasi dalam berbagai penyakit menyarankan merekapotensi sebagai biomarker [ 6,10,11 ] . Studi pertama plasmaprofil Mirna dalam luka hati itu dari Wang et al . [ 12 ] . merekakomprehensif menganalisis ekspresi Mirna plasma pada tikusdengan cedera hepatoseluler yang disebabkan oleh acetaminophen ( APAP )overdosis . Selanjutnya , dilaporkan bahwa plasma mir -122 tingkat meningkat pada model tikus cedera hepatoselulerdisebabkan oleh trichlorobromomethane atau karbon tetraklorida ( CCl4 )administrasi [ 13 ] , dan meningkat pada model tikus Dgalactosamine /lipopolisakarida - atau cedera hati yang diinduksi alkohol[ 14 ] . Namun, informasi tentang perubahan Mirna plasma olehluka hati masih terbatasCedera hati akut diklasifikasikan menjadi tiga jenis : hepatoselulercedera , kolestasis , atau tipe campuran [ 15,16 ] . Cedera hati kronis adalahpenyakit progresif menunjukkan peningkatan keparahan seperti steatosis ,steatohepatitis , fibrosis , sirosis dan kanker . Untuk diagnosisluka hati , alanin aminotransferase ( ALT ) , aspartat aminotransferase( AST ) , alkaline phosphatase ( ALP ) dan bilirubin total( T - Bil ) dalam darah yang umum digunakan. Namun, iniparameter tidak dapat benar-benar mengidentifikasi jenis luka hati . diSelain itu , parameter ini mungkin menunjukkan peningkatan dengan ekstrahepatikcedera seperti kerusakan otot atau cedera jantung [ 17,18 ] . Selain itu ,ALT tidak selalu berkorelasi dengan baik dengan data histomorphologichati [ 19,20 ] . Dalam studi ini , kami berusaha untuk membandingkan plasmaprofil ekspresi Mirna dalam berbagai jenis luka hati menggunakan tikusmodel untuk mengevaluasi apakah miRNAs plasma dapatpenanda yang dapat membedakan berbagai jenis luka hati . diSelain itu , kami menentukan perjalanan waktu perubahan yang dipilihkadar plasma Mirna dengan cedera hati akut , dan mengevaluasiutilitas miRNAs sebagai penanda kuantitatif dari luka hati .

Bahan dan MetodeKimia dan ReagenAPAP, a-naftil isotiosianat (ANIT) dan CCl4 adalahdibeli dari Wako Kimia Murni (Osaka, Jepang). Methapyrilene(MP) adalah dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO). diet standar(StdD), diet tinggi lemak (HFD) dan metionin kolin-kekurangan diet(MCDD) diperoleh fromOriental Ragi (Tokyo, Jepang). RNAisoadalah dari Takara (Shiga, Jepang). Mirvana PARIS kit, Megaplexkolam renang, TaqMan microRNA reverse Transkripsi kit, TaqMantes microRNA, TaqMan 26 Universal PCR Master Mix adaAmpErase UNG dan TaqMan Rodent microRNA Array v2.0 yangdari Applied Biosystems (Foster City, CA). Semua bahan kimia lainnya danpelarut adalah dari kelas tertinggi tersedia secara komersialAnimal ModelPemeliharaan hewan dan pengobatan dilakukan disesuai dengan National Institutes of Health Guide forKesejahteraan Hewan dari Jepang , yang disetujui oleh Institutional AnimalPerawatan dan Penggunaan Komite Kanazawa University, Jepang . itupenelitian disetujui oleh Komite Etika Animal ofKanazawa University ( No 31203 ) . Laki-laki 5 - minggu-tua Sprague -Tikus Dawley yang dibeli dari Jepang SLC ( Hamamatsu ,Jepang ) . Tikus ditempatkan dalam lingkungan yang terkendali ( suhu2561uC , kelembaban 50.610 % , dan 12 jam light/12 h gelapcycle) di fasilitas hewan kelembagaan dengan akses ke makanan danad libitum air . Tikus diaklimatisasi sebelum digunakan untukpercobaan . Untuk membuat model hepatoseluler cedera , tikus( n = 6-8 ) yang diberikan secara oral 500 mg / kg ( dosis rendah ) atau1.000 mg / kg ( dosis tinggi ) APAP ditangguhkan dalam 0,5 % karboksimetilselulosa( CMC ) setelah puasa . Dalam beberapa percobaan , tikus yangdiberikan APAP tanpa puasa . Tikus ( n = 6 ) yang secara lisandiberikan 300 mg / kg MP dilarutkan dalam 0,5 % CMC . tikus inidikorbankan 24 jam setelah administrasi . Untuk membuat kolestasismodel , tikus ( n = 5 ) yang diberikan secara oral 150 mg / kg ANITdilarutkan dalam minyak jagung dan dikorbankan 48 jam setelahadministrasi . Saluran empedu diligasi ( BDL ) atau palsu dioperasikan tikus( laki-laki , 5 - minggu-tua , n = 3-4 ) yang dibeli dari Jepang SLC , dandikorbankan 3 hari setelah operasi . Untuk membuat steatosis danModel steatohepatitis , tikus ( n = 5 ) diberi makan HFD dan MCDD ,masing-masing selama 8 minggu . Untuk membuat model fibrosis , tikus ( n = 5 )yang diberikan intraperitoneal 0,5 mg / kg CCl4 dilarutkan dalamminyak zaitun dua kali seminggu selama 10 minggu , dan dikorbankan 3 hari setelahpemerintahan terakhir. Setelah pengorbanan , darah dan hati yangdikumpulkan . EDTA ditambahkan sebagai antikoagulan untuk darah danterus es selama 30 menit . Setelah sentrifugasi , plasma dikumpulkandan disimpan di 280uC sampai digunakan . Sebuah bagian dari hati itu tetap dalambuffered netral 10 % formalin

Biokimia Assay dan patologis Pemeriksaan ALT Plasma, AST dan T-Bil tingkat ditentukan dengan menggunakan the Dri-Chem 4000 (FUJIFILM, Saitama, Jepang) sesuai dengan instruksi pabrik. Sampel tetap formalin yang ditanam dalam parafin dan dipotong, dan kemudian diwarnai dengan hematoxylin-eosin untuk pemeriksaan mikroskopis. Sebuah bagian dari hati beku tertanam dalam suhu pemotongan optimal (OCT) Senyawa (Sakura Finetek Jepang, Tokyo, Jepang) dan dipotong, dan kemudian diwarnai dengan Minyak O merah dan hematoxylin.

Evaluasi Stabilitas Plasma miRNAs Penelitian menggunakan sampel manusia telah disetujui oleh Etika Komite Kanazawa University, Jepang (No. 203). tertulis informed consent diperoleh dari semua mata pelajaran. sampel darah dikumpulkan dari 9 subjek laki-laki yang sehat (22-27 tahun) atau Tikus jantan 2 yang tidak diobati (6-minggu-tua). EDTA ditambahkan sebagai antikoagulan ke dalam darah dan terus es selama 30 menit. setelah sentrifugasi, plasma dikumpulkan dan dikumpulkan. pooled The Sampel dibagi menjadi masing-masing 30 mL, dan disimpan di 4uC, ruang suhu atau 37uC. Setelah 3, 6, 12 dan 24 jam, jumlah RNA yang miRNAs siap dan individual diukur seperti yang dijelaskan di bawah

TaqMan microRNA Assay Jumlah RNA termasuk RNA kecil dari plasma diisolasi menggunakan RNAiso sesuai dengan instruksi dari pabriknya. DrGentle Pengendapan selanjutnya (Takara) digunakan sebagai carrier. itu cDNA disintesis menggunakan TaqMan microRNA reverse Transkripsi kit dengan TaqMan microRNA tes 56 reaksi campuran menurut protokol pabrik. Untuk cDNA yang sampel, TaqMan 26Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG) dan TaqMan microRNA tes 56 campuran reaksi yang ditambahkan, dan real-time PCR dilakukan dengan menggunakan MP3000P (Stratagen, La Jolla, CA) dengan software MxPro QPCR.

TaqMan microRNA Analisis ArrayJumlah RNA termasuk RNA kecil dibuat dari 600 mlmengumpulkan plasma tikus ( n = 3-8 ) dengan menggunakan kit Mirvana PARISmenurut protokol pabrik kecuali bahwa asam /ekstraksi fenol / kloroform diulang dua kali . itucDNA disintesis dari RNA total dengan menggunakan Megaplexkolam menurut protokol pabrik . Primer yang digunakan dalamreaksi reverse transcription yang TaqMan stem-loop primeruntuk 365 miRNAs individu dan 3 kontrol endogen . preamplificationdilakukan dengan menambahkan dari 26TaqMan PreampMaster Mix dan 106 Megaplex Preamp Primer untuk cDNA yangsampel . Untuk produk preamplification , TaqMan 26UniversalPCR Master Mix (No AmpErase UNG ) ditambahkan . seluruh Thecampuran diterapkan pada port individu TaqMan Array RodentMicroRNA A + Kartu B Set v2.0 , 384 - baik kartu mikrofluidamengandung 375 ( A array) atau 210 ( B array) primer -probe set untukmiRNAs individu. Kuantitatif real-time PCR dilakukanmenggunakan Cepat sistem Real-Time PCR 7900HT ( Applied Biosystems )dengan software v.2.4 SDS . Tingkat ekspresi dievaluasi dengan menggunakankomparatif ambang siklus metode ( Ct ) . Nilai Ct berkisar dari 040 . miRNAs memberikan nilai Ct .32 di semua kelompok dihilangkandari analisis data karena ini nilai cut- off direkomendasikan olehprodusen . Data yang disajikan sebagai ( 40 - Ct ) . DCTnilai [ DCT = ( 40 - Ct model) 2 ( 40 - control Ct ) ] dihitungperubahan sebagai lipat . Pengelompokan dilakukan dengan menggunakan hirarkiCluster 3.0 software ( linkage lengkap) dan Mapletree

Analisis Statistik Data dinyatakan sebagai rata-rata 6 SD. Perbandingan dari kedua kelompok dibuat dengan U-test Mann-Whitney. Perbandingan beberapa kelompok dibuat dengan Kruskal-Wallis dilanjutkan dengan uji Dunn. A nilai P, 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Sebagai kesimpulan, penelitian ini menunjukkan bahwa profil ekspresi miRNAs plasma berbeda sesuai dengan jenis luka hati. Meskipun penelitian sebelumnya melaporkan perubahan beberapa miRNAs dalam plasma atau jaringan dengan penyakit menggunakan satu Model, menyiratkan kemungkinan asosiasi dengan perkembangan penyakit, perbandingan profil ekspresi Mirna Model seberang akan menjadi penting untuk memahami implikasi fisiologis perubahan miRNAs. kita bisa mengidentifikasi miRNAs yang bisa menjadi biomarker spesifik dan sensitif dari setiap jenis kerusakan hati (misalnya cedera akut / kronis hati atau cedera hepatoseluler / kolestasis / steatosis / steatohepatitis / fibrosis) menggunakan model tikus. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan apakah miRNAs dapat digunakan sebagai biomarker pada pasien dengan berbagai jenis luka hati.

hasilBiokimia Plasma dan histopatologi model tikuscedera hati akut dan kronisPlasma ALT dan AST tingkat secara signifikan meningkat olehadministrasi APAP (Gambar 1A ) . Ketinggian ALTdan tingkat AST di dosis tinggi tikus APAP diobati adalah jauhlebih tinggi dibanding dosis tikus APAP - diperlakukan rendah. hepatoseluler Thecedera diamati di daerah pericentral . Dengan demikian,APAP - diinduksi model cedera hepatoseluler didirikan . Selanjutnya,kami berusaha untuk membangun model cedera hepatoseluler lain oleh

administrasi MP . Pada tikus diobati, ALT plasma danTingkat AST meningkat signifikan dan hepatoseluler yangcedera diamati pada daerah periportal (Gambar 1A ) . Dengan demikian , kitadidirikan dua jenis model cedera hepatoseluler . Dalam ANITtreatedtikus , kadar plasma ALT dan T - Bil yang jauhmeningkat (Gambar 1 ) . Merosot dan menghilang saluran empedu sertanekrosis ringan atau peradangan yang diamati . Dengan demikian, ANITinducedModel kolestasis didirikan . Selanjutnya, kami mengevaluasiModel kolestasis lain dengan BDL . Pada tikus diobati, plasmaALT dan AST tingkat yang cukup tinggi (Gambar 1 ) .Pembesaran saluran empedu serta nekrosis ringan atau peradangandiamati . Dengan demikian , kami mendirikan dua jenis kolestasisModel . Pada tikus HFD - makan , kadar plasma ALT dan AST yangtidak berubah , sedangkan pada tikus MCDD - makan , tingkat ALTcenderung lebih tinggi dibandingkan pada tikus StdD -makan (Gambar 1C ) . sitosolikhipertrofi dan jelas vakuola mengandung lipid yang diamati padaTikus HFD - makan . Diffuse steatosis macrovesicular dan infiltrasisel-sel inflamasi yang diamati pada tikus MCDD -makan . akumulasilemak diamati pada kedua kelompok dengan Minyak O merah pewarnaan .Dengan demikian , kami menganggap bahwa steatosis dan steatohepatitis modeldidirikan . Pada tikus CCl4 - diobati, ALT plasma danTingkat AST yang cukup tinggi (Gambar 1D ) . Fibrosis , adiposadegenerasi , dan infiltrasi sel-sel inflamasi yang diamatipada daerah periportal . Akumulasi lemak juga diamati olehMinyak O merah pewarnaan . Dengan demikian , kami mendirikan model fibrosis .

Stabilitas miRNAs plasmaTelah dilaporkan bahwa miRNAs dalam plasma manusiastabil [ 6 ] , tetapi tidak ada informasi mengenai stabilitas miRNAsdalam plasma tikus . Kami menyelidiki stabilitas miRNAs pada tikusplasma dibandingkan dengan mereka dalam plasma manusia . Kami memilih mir - 16 ,mir - 21 dan Mir - 122 karena urutan mereka adalah identik dalam tikusdan manusia dan miRNAs ini secara substansial dinyatakan dalamplasma . Kami menemukan bahwa miRNAs ini dalam plasma tikus yang tidak stabildi 37uC , sedangkan dalam plasma manusia yang stabil , mendukungpenelitian sebelumnya (Gambar 2 ) . Tingkat degradasi bervariasitergantung pada jenis miRNAs tikus . The mir - 21 dan Mir - 122mengalami penurunan 2% dan 1 % dari kontrol , masing-masing, setelah6 jam inkubasi pada 37uC , sedangkan mir - 16 dipertahankan pada 30 %kontrol . Tingkat mir - 122 adalah 10 kali lipat lebih tinggi daripadatingkat mir - 16 dan Mir - 21 , yang menunjukkan tingkat yang sama . Dengan demikian,muncul bahwa tingkat degradasi tidak berhubungan dengantingkat ekspresi . Ketika sampel plasma diinkubasi padasuhu kamar ( , 25uC ) , degradasi miRNAs adalahdilemahkan . Selain itu , degradasi miRNAs adalah jauhditekan ketika miRNAs disimpan di 4uC . Oleh karena itu ,untuk studi berikutnya , kami terus sampel plasma tikus di atas essampai ekstraksi RNA .

Profil ekspresi Plasma miRNAs dalam model tikus dari haticederaProfil ekspresi miRNAs plasma dalam model tikusdari luka hati ditentukan oleh TaqMan microRNA Arrayanalisis . Metode normalisasi dunia ( koreksi denganjumlah tingkat ekspresi miRNAs terdeteksi ) umumnya digunakanuntuk normalisasi dalam array analisis . Jumlah miRNAs yangterdeteksi , atau nilai-nilai Ct di antaranya adalah , 32 , di hatikelompok cedera kecuali kelompok BDL cenderung lebih besar dibandingkanpada kelompok kontrol ( Tabel 1 ) . Oleh karena itu , kami menganggap bahwametode normalisasi global akan menjadi tidak pantas .Atau , kita dikonfirmasi oleh pengukuran cel - mir -39 tingkat (a Mirna dalam C. elegans ) bahwa efisiensi ekstraksidan deteksi miRNAs yang hampir sama di semua kelompok . itujumlah miRNAs , yang memberikan nilai Ct , 32 dalam setidaknya satukelompok , adalah 433 . Kami melakukan analisis pengelompokan untuktingkat ekspresi dari 433 Mirna . Seperti ditunjukkan dalam Gambar . 3A , semuakelompok dibagi menjadi tiga , 1 ) APAP ( tinggi ) , MP , danKelompok ANIT , 2 ) HFD , APAP ( rendah) , CCl4 , kelompok MCDD dankontrol , dan 3 ) palsu dan kelompok BDL . Selanjutnya, kami menelitilipat perubahan dalam ekspresi Mirna . Jumlah miRNAsmenampilkan .2 kali lipat kenaikan atau ,0.5 kali lipat penurunan hatikelompok cedera dibandingkan dengan kelompok kontrol ditunjukkan padaTabel 1 . Dalam kebanyakan kelompok , jumlah meningkat miRNAs yanglebih besar dibandingkan miRNAs menurun sedangkan , di BDLkelompok , jumlah miRNAs menurun lebih besar dibandingkanmeningkat miRNAs . Kami melakukan analisis pengelompokan untuklipat perubahan miRNAs (Gambar 3B ) . Hal ini menunjukkan bahwaprofil para APAP ( tinggi) dan MP kelompok adalah serupa . ituprofil kelompok ANIT mirip dengan di atas dua kelompok , tetapibahwa kelompok BDL cukup berbeda . Profil dariKelompok CCl4 , HFD , dan MCDD yang kira-kira dekat satu sama lain ,dan kelompok CCl4 dengan tingkat ALT meningkat dekat dengankelompok dengan cedera hati akut . Dengan demikian , hal itu menunjukkan bahwaperubahan ekspresi Mirna berbeda antara akutdan cedera hati kronis .Di antara miRNAs up- diatur dalam APAP ( tinggi ) kelompok( 317 miRNAs ) dan kelompok MP ( 295 miRNAs ) , 283 miRNAs yangumum (Gambar 4A ) . Di antara 6 miRNAs turun-diatur dalamAPAP ( tinggi ) dan kelompok 10 miRNAs turun-diatur dalam MPkelompok , hanya 2 miRNAs yang umum . Di antara 280 diregulasimiRNAs dalam kelompok ANIT dan 60 up- diaturmiRNAs dalam kelompok BDL , 57 miRNAs yang umum (Gambar 4B ) .Di antara 10 miRNAs turun-diatur dalam kelompok dan ANIT130 miRNAs turun-diatur dalam kelompok BDL , 2 miRNAs yangumum . Di antara 121 up- diatur miRNAs di HFDkelompok , 186 up - diatur miRNAs dalam kelompok MCDD dan 225up - diatur miRNAs dalam kelompok CCl4 , 63 miRNAs yangumum . Di antara 16 miRNAs turun-diatur dalam HFDkelompok , 35 miRNAs dalam kelompok MCDD dan 27 miRNAs dalamKelompok CCl4 , hanya 3 miRNAs yang umum . Untuk mengetahui potensibiomarker untuk cedera hepatoseluler , kolestasis , dan steatosis , yangmiRNAs yang ekspresinya umumnya berubah samajenis luka hati dibandingkan seluruh jenisluka hati . Sebagai hasilnya , kami menemukan bahwa 16 miRNAs yangdiatur up - khususnya dalam model cedera hepatoseluler , 2miRNAs dan 3 miRNAs secara khusus turun - diatur dalamkolestasis dan steatosis model , masing-masing (Gambar 4 , Tabel 2 ) . itudisarankan bahwa miRNAs ini akan menjadi biomarker baru untukcedera hepatoseluler , kolestasis , dan steatosisSelanjutnya, kita melihat miRNAs yang ekspresinya adalahkhusus berubah pada masing-masing model . Dengan perbandingan disemua model , kami menemukan bahwa 12 dari 38 miRNAs ( jumlah diregulasidan turun-diatur miRNAs ) dan 11 dari 20 Mirnasecara khusus diubah dalam kelompok APAP dan MP ,masing-masing ( Gambar 4 A , Tabel 3 ) . Ini dianggap bahwamiRNAs dapat digunakan untuk mengetahui daerah yang rusak , atau pericentraldaerah periportal . Sejak 223 miRNAs dan 3 miRNAs yangup - diatur dalam ANIT dan BDL kelompok , masing-masing juga diregulasidalam model cedera hepatoseluler , tidak ada miRNAs yangditemukan khusus untuk model ini . Namun, 8 dari 8 miRNAsdan 101 dari 208 miRNAs secara khusus turun - diatur dalamANIT dan BDL kelompok , masing-masing (Gambar 4B , Tabel 3 ) . itumenyarankan bahwa miRNAs ini akan menjadi calon biomarkerintrahepatik dan ekstrahepatik kolestasis . Kami menemukan bahwa 3 dari28 miRNAs , 17 dari 50 miRNAs , dan 11 dari 92 Mirna yangkhusus diubah dalam HFD , MCDD , dan CCl4 kelompok ,masing-masing (Gambar 4C , Tabel 3 ) . Disarankan bahwa miRNAsakan menjadi calon biomarker steatosis , steatohepatitis dan fibrosis, masing-masing. Terutama, miRNAs yang ekspresi berubah hanya dalam kelompok HFD mungkin terkait dengan lemak akumulasi tanpa peradangan atau fibrosis.emua kelompok kecuali kelompok BDL dan HFD menunjukkan nekrosis dan peradangan. Berdasarkan fakta, kami berusaha untuk mengidentifikasi miRNAs yang ekspresi yang berubah dalam menanggapi nekrosis dan peradangan. Dengan mencari miRNAs yang ekspresi yang umumnya meningkat di APAP, MP, ANIT, MCDD, dan CCl4 kelompok, tetapi tidak di BDL dan HFD kelompok, kami menemukan bahwa 67 miRNAs mungkin mencerminkan nekrosis dan peradangan (Gambar 4D). Di antara mereka, kami focued pada mir-122, yang paling melimpah Mirna dalam hati [21], dalam percobaan berikutnya

Tentu saja waktu perubahan Mirna plasma pada tikus dengan akutkerusakan hatiKami memeriksa perjalanan waktu perubahan Mirna plasma ditikus dengan cedera hati akut , dengan fokus pada mir - 122 . Kami mengukurALT plasma dan tingkat mir - 122 dari waktu ke waktu dalam enam tikusdiberikan 1000 mg / kg APAP . Tingkat ALT mulaimeningkatkan 6 jam setelah administrasi , mencapai puncaknya pada 24 jamdan kemudian menurun (Gambar 5A ) . Sebaliknya , plasma mir - 122tingkat mulai meningkat 3 jam setelah administrasi , mencapai puncaknyapada 12-36 jam dan kemudian menurun . Meskipun ada yang besarperbedaan antar dalam tingkat ALT , antarindividu yangperbedaan plasma tingkat mir - 122 adalah relatif kecil . seharusnyadicatat bahwa perubahan plasma mir - 122 lebih dinamisdibandingkan dengan ALT . Selanjutnya, kita melihat lima ekor tikus yang diobati dengan 300 mg /kg MP . The ALT dan tingkat mir - 122 mulai meningkat 3 jam setelahadministrasi , tetapi tingkat dan laju peningkatan mir - 122lebih dramatis daripada tingkat ALT (Gambar 5B ) . iniHasil penelitian menunjukkan bahwa tingkat plasma Mirna berubah lebihsensitif dari tingkat ALT lakukan dalam menanggapi cedera hati akut .

Asosiasi plasma mir-122 meningkat dengan cedera hepatoseluler Kami memeriksa apakah peningkatan plasma mir-122 adalah karena cedera hati atau bahan kimia diberikan. Untuk mengatasi masalah ini, 500 mg / kg APAP yang diberikan secara oral kepada tikus tanpa puasa. Berbeda dengan administrasi APAP dengan puasa, yang mengalami penurunan tingkat glutathione hati, pengobatan perubahan histopatologi tidak disebabkan (data tidak ditampilkan) atau suatu elevasi ALT pada tikus (4164 U / L dibandingkan 3466 U / L di kontrol) (Gambar 6). Pada tikus ini, plasma tingkat mir-122 yang hampir sama seperti yang di tikus kontrol (nilai 40-Ct: 7.162.6 vs 7.161.6 memegang kendali). Oleh karena itu, kita bisa menyimpulkan bahwa peningkatan plasma mir-122 adalah karena luka hati, tetapi tidak untuk APAP itu sendiri.Ketika 500 mg / kg APAP diberikan dengan puasa, hepatocellular nekrosis dan peradangan yang diamati pada semua 12 tikus, dengan skor + (7 tikus, lingkaran tertutup), + + (1 tikus, segitiga tertutup), dan + + + (4 tikus, persegi ditutup). Dalam 7 tikus menunjukkan ringan (+) perubahan histopatologi, peningkatan tingkat ALT tidak signifikan (1046107, 3,1 kali lipat dari kontrol), tetapi peningkatantingkat mir-122 memang luar biasa (10.661.0, 11,3 kali lipat dari kontrol). di Selain itu, sejauh mana peningkatan mir-122 mencerminkan perubahan histopatologi (+ + 15.2 dan + + + 20.061.5). Pada tikus diberikan 1000 mg / kg APAP dengan puasa, antarindividu yang variabilitas Mirna (20.761.7) adalah kurang dari ALT (696.065.615). Dengan demikian, disarankan agar Mirna akan menjadi lebih biomarker sensitif dan kuantitatif dari luka hati, dengan rendah variabilitas antarindividu, daripada biomarker konvensional, ALT.