tierärztliche hochschule hannover · tierärztliche hochschule hannover studien zur pathogenese...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler

Spongiformer Enzephalopathien der Ziege

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Susanne Freyse

Karlsburg

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Martin H. Groschup

Institut für Neue und Neuartige Tierseuchenerreger,

Friedrich-Loeffler-Institut Insel Riems

1. Gutachter: Prof. Dr. Martin H. Groschup

2. Gutachter: Prof. Dr. Martin Ganter

Tag der mündlichen Prüfung: 17. April 2012

Diese Arbeit wurde im Rahmen eines von der Europäischen Union geförderten Forschungs-

projektes durchgeführt.

Meiner lieben Familie

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZU&GSVERZEICH&IS........................................................................................ VII

ABBILDU&GSVERZEICH&IS ...........................................................................................XI

TABELLE&VERZEICH&IS .............................................................................................. XII

1 EI&LEITU&G............................................................................................................... 1

2 LITERATURÜBERSICHT......................................................................................... 2

2.1 Das Prion-Protein ......................................................................................................... 2

2.1.1 Das Prion-Gen.............................................................................................................. 2

2.1.2 Das zelluläre Prion-Protein .......................................................................................... 2

2.1.3 Die pathologische Isoform des Prion-Proteins............................................................. 3

2.1.4 Prionenmodelle ............................................................................................................ 3

2.1.5 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien im Überblick ..................................... 4

2.2 Stammcharakterisierung der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien .. 5

2.2.1 Die Inkubationszeit und der Einfluss der Speziesbarriere ........................................... 6

2.2.2 Die Bedeutung proteinbiochemischer Parameter......................................................... 6

2.2.2.1 Das Glykosylierungsverhältnis und die molekulare Masse .................................... 7

2.2.2.2 Die Immunoreaktivität des pathologischen Prion-Proteins..................................... 8

2.2.2.3 Die Proteinase K-Stabilität des pathologischen Prion-Proteins .............................. 8

2.3 Scrapie bei Schaf und Ziege......................................................................................... 9

2.3.1 Das klinische Bild ........................................................................................................ 9

2.3.2 Der Einfluss des Genotyps des Prion-Gens ............................................................... 10

2.3.2.1 Das Prion-Gen des Schafs ..................................................................................... 10

2.3.2.2 Das Prion-Gen der Ziege....................................................................................... 11

2.3.3 Übertragungswege der Scrapie bei Schaf und Ziege ................................................. 12

2.3.4 Die Pathogenese der Scrapie...................................................................................... 14

2.3.4.1 Die Pathogenese der Scrapie im Schaf.................................................................. 14

2.3.4.2 Die Pathogenese der Scrapie in der Ziege............................................................. 15

2.3.5 Möglichkeiten der prämortalen Diagnostik von Scrapie bei Schaf und Ziege .......... 15

2.4 Die Histopathologie von Scrapie ............................................................................... 16

2.5 Scrapie in der Immunhistochemie ............................................................................ 17

Inhaltsverzeichnis II

2.6 Atypische Scrapie bei Schaf und Ziege..................................................................... 18

2.7 Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie der Rinder ........................................... 20

2.7.1 Die Histopathologie der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie der Rinder ......... 20

2.8 Die atypische Bovine Spongiforme Enzephalopathie der Rinder .......................... 21

2.9 Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie bei Schaf und Ziege ............................ 21

2.10 Die Diagnostik von Boviner Spongiformer Enzephalopathie und Scrapie ........... 23

2.11 Zusammenfassende Darstellung................................................................................ 25

3 TIERE, MATERIAL U&D METHODE& ............................................................... 26

3.1 Tiere ............................................................................................................................. 26

3.1.1 Damaskusziegen aus Zypern...................................................................................... 26

3.1.1.1 Voruntersuchungen ............................................................................................... 26

3.1.2 Ziegen der BSE-Pathogenesestudie ........................................................................... 28

3.2 Versuchsablauf ........................................................................................................... 30

3.2.1 Sektion der Damaskusziegen aus Zypern .................................................................. 30

3.2.2 Untersuchungen an Proben der Damaskusziegen ...................................................... 30

3.2.3 Die BSE-Pathogenesestudie....................................................................................... 31

3.2.3.1 Tierhaltung ............................................................................................................ 34

3.2.3.2 Inokulat.................................................................................................................. 34

3.2.3.3 Inokulation............................................................................................................. 34

3.2.3.4 Kontrolltiere .......................................................................................................... 35

3.2.3.5 Entnahme von Tonsillen- und Rektumbioptaten................................................... 35

3.2.3.6 Entnahme von Blutproben..................................................................................... 36

3.2.3.7 Nachzucht .............................................................................................................. 36

3.2.3.8 Sektion................................................................................................................... 37

3.2.3.9 Untersuchung des in den Sektionen entnommenen Probenmaterials.................... 39

3.2.3.10 Schnelltestdiagnostik............................................................................................. 40

3.3 Histologische Methoden ............................................................................................. 40

3.3.1 Herstellung der histologischen Präparate................................................................... 40

3.3.1.1 Die serielle Schnitttechnik..................................................................................... 41

3.3.2 Lichtmikroskopische Untersuchung .......................................................................... 42

3.3.3 Auswertung der mit Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitte ..................................... 42

Inhaltsverzeichnis III

3.3.4 Immunhistochemische Methoden .............................................................................. 43

3.3.4.1 Immunhistochemische Färbungen......................................................................... 43

3.3.4.2 Auswertung der immunhistologischen Präparate.................................................. 43

3.4 Proteinbiochemische Methoden ................................................................................ 44

3.4.1 Herstellung von Gehirnhomogenaten ........................................................................ 44

3.4.2 Fällung mit Phosphorwolframsäure ........................................................................... 44

3.4.3 Methanolfällung ......................................................................................................... 45

3.4.4 Proteinauftrennung mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese ...................................................................................................... 46

3.4.5 Westernblot und Immunochemie ............................................................................... 46

3.4.5.1 Bestimmung des Glykosylierungsverhältnisses und der molekularen Masse....... 47

3.4.5.2 Bestimmung der Antikörperbindungsverhältnisse ................................................ 47

3.4.5.3 Der diskriminatorische FLI-Immunoblot .............................................................. 48

3.4.6 Langzeit-Proteinase K-Resistenz von PrPSc............................................................... 49

3.5 Kontrollen und Referenzmaterial ............................................................................. 50

3.6 Statistische Analyse .................................................................................................... 50

4 ERGEB&ISSE............................................................................................................. 51

4.1 Caprine Isolate der Ziegen aus Zypern.................................................................... 51

4.1.1 Ergebnisse der Voruntersuchungen ........................................................................... 51

4.1.1.1 Ergänzende Daten zu den Ziegen mit PrPSc-reaktivem Schnelltestbefund ........... 51

4.1.1.2 Ergänzende Daten zu den Ziegen mit PrPSc-negativem Schnelltestbefund .......... 51

4.1.2 Biochemische Charakterisierung (FLI-Test) der caprinen Isolate aus Zypern .......... 53

4.1.2.1 Bestimmung der Glykosylierungsverhältnisse...................................................... 53

4.1.2.2 Bestimmung der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc......... 53

4.1.2.3 Bestimmung des Antikörperbindungsverhältnisses .............................................. 55

4.1.2.4 Differenzierung zwischen Scrapie und Boviner spongiformer Enzephalopathie

mittels FLI-Test ..................................................................................................... 57

4.1.3 Bestimmung der Langzeit-Proteinase K-Resistenz.................................................... 58

4.1.4 Ergebnisse der histologischen Untersuchungen......................................................... 60

4.1.4.1 Histopathologische Auswertung der Obexregion.................................................. 60

4.1.4.2 Immunhistochemische Auswertung der Obexregion ............................................ 62

Inhaltsverzeichnis IV

4.1.4.3 Immunhistochemische Auswertung ausgewählter Gewebe .................................. 65

4.1.5 Statistische Betrachtung aufgetretener Polymorphismen des Prion-Gens ................. 68

4.2 Pathogenesestudie Bovine Spongiforme Enzephalopathie in der Ziege................ 70

4.2.1 Untersuchung der Tonsillen- und Rektumbioptate .................................................... 70

4.2.2 Ergebnisse der Sektionen ausgewählter Tiere 6 bis 14 Monate post inoculationem . 70

4.2.2.1 Ergebnisse des Schnelltests und der proteinbiochemischen Untersuchungen ...... 72

4.2.2.2 Ergebnisse immunhistochemischer Untersuchungen............................................ 72

4.2.3 Ergebnisse der Sektionen ausgewählter Tiere 24 und 25 Monate post

inoculationem............................................................................................................. 74

4.2.3.1 Klinik der 24 und 25 Monate post inoculationem sezierten Tiere ........................ 74

4.2.3.2 Ergebnisse des Schnelltests und der proteinbiochemischen Untersuchungen ...... 75

4.2.3.3 Histopathologische Ergebnisse - Auswertung der Obexregion............................. 78

4.2.3.4 Immunhistochemischer PrPSc-Nachweis – Auswertung der Obexregion ............. 78

4.2.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung der Nachgeburtsproben ....... 80

5 DISKUSSIO& ............................................................................................................. 81

5.1 Ziel der Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler

Spongiformer Enzephalopathien der Ziege ............................................................. 81

5.2 Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate aus Zypern........................................ 81

5.2.1 Der Einfluss des Prion-Gen-Genotyps ....................................................................... 83

5.2.2 Proteinbiochemische Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate ............................. 85

5.2.2.1 Differenzierung der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie von Scrapie

mittels FLI-Test ..................................................................................................... 85

5.2.2.2 Langzeit Proteinase K-Verdau .............................................................................. 86

5.2.3 Histologische Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate ......................................... 87

5.2.3.1 Histopathologische und immunhistologische Veränderungen in der Obexregion 87

5.2.3.2 Immunhistologische Bewertung ausgewählter Gewebe........................................ 87

5.3 Die Pathogenesestudie zur Bovinen Spongiformen Enzephalopathie der Ziegen 90

5.3.1 Erkenntnisse zur Inkubationszeit, Klinik und Dauer der Klinik................................ 91

5.3.2 Einfluss des Prion-Gen-Genotyps auf die BSE-Erkrankung bei Ziegen ................... 92

5.3.3 Pathogenese der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie bei Ziegen...................... 93

5.3.4 Biopsien als prämortale Diagnostikmöglichkeit ........................................................ 94

Inhaltsverzeichnis V

5.3.5 Übertragung der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie über die Plazenta........... 95

5.3.6 Die Obexregion in der Diagnostik ............................................................................. 96

5.3.6.1 Histopathologie und Immunhistologie .................................................................. 96

5.3.6.2 Immunoblot (FLI-Test) ......................................................................................... 96

5.4 Kritische Beurteilung zur Bewertung des Untersuchungsmaterials und der

Untersuchungsmethoden ........................................................................................... 96

5.4.1 Bewertung der proteinbiochemischen Methoden ...................................................... 97

5.4.2 Bewertung der immunhistochemischen Methoden.................................................... 98

6 ZUSAMME&FASSU&G.......................................................................................... 100

7 SUMMARY............................................................................................................... 102

8 LITERATURVERZEICH&IS ................................................................................ 104

8.1 Gesetze und Verordnungen ..................................................................................... 130

9 A&HA&G .................................................................................................................. 132

9.1 Material ..................................................................................................................... 132

9.1.1 Antikörper gegen das Prion-Protein......................................................................... 132

9.1.1.1 Konjugate ............................................................................................................ 132

9.1.1.2 Vorbehandlung für die in der Immunhistologie verwendeten Antikörper .......... 133

9.2 Histologische Methoden ........................................................................................... 133

9.2.1 Protokolle ................................................................................................................. 133

9.2.1.1 Gewebeinfiltrationsautomat, Standardprotokoll ................................................. 133

9.2.1.2 Entparaffinisierung und Rehydrierung der histologischen Schnitte.................... 133

9.2.1.3 Dehydrierung der histologischen Schnitte .......................................................... 134

9.3 Schemata zur Auswertung von histologisch untersuchten Schnitten.................. 134

9.4 Tabellarische Übersichten über die in den Sektionen entnommenen Proben .... 135

9.5 Protokolle zur Fraktionierung der in der BSE-Pathogenesestudie entnommenen

Blut- und Milchproben............................................................................................. 138

9.5.1 Protokoll zur Fraktionierung von caprinem Citrat-Vollblut .................................... 138

9.5.2 Protokoll zur Verarbeitung von Serumproben ......................................................... 139

9.5.3 Protokoll zur Fraktionierung von capriner Vollmilch.............................................. 139

9.6 Ergebnistabellen ....................................................................................................... 140

9.6.1 Damaskusziegen aus Zypern.................................................................................... 140

Inhaltsverzeichnis VI

9.6.1.1 Ergebnisse des FLI-Tests .................................................................................... 140

9.6.1.2 Ergebnisse des Langzeit Proteinase K-Verdaus .................................................. 141

9.7 Puffer und Lösungen................................................................................................ 142

9.8 Rezepte....................................................................................................................... 147

9.9 Arzneimittel............................................................................................................... 148

9.10 Chemikalien .............................................................................................................. 148

9.11 Geräte und Verbrauchsmaterialien........................................................................ 150

Abkürzungsverzeichnis VII

Abkürzungsverzeichnis

A Ampère

Abb. Abbildung

A. bidest. Aqua bidestillata

AE arbiträre Einheiten

AK Antikörper

AS Aminosäuren

BFAV Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere

bov bovine

BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CJK Creutzfeldt-Jakob-Krankheit

CO2 Kohlendioxid

C-terminal Carboxy-terminal

DAB Diaminobenzidin

DM&V Nucleus parasympathicus nervi vagi, dorsal motor nucleus of the vagus

E&S enterisches Nervensystem

EU Europäische Union

Fa. Firma

FLI Friedrich-Loeffler-Institut

g gravitation

GALT gut-associated lymphoid tissue, darmassoziiertes lymphatisches Gewe-be

Ggl. Ganglion

gr. Gramm

GSS-Syndrom Gerstmann-Sträussler-Scheincker-Syndrom

h Stunde(n)

H Histidin

H.-E. Hämatoxylin-Eosin

I Isoleucin

IAH Institute for Animal Health, Edinburgh, United Kingdom

VIII Abkürzungsverzeichnis

IgG Immunglobulin G

IHC Immunhistochemie

i. m. intramuskulär

I&RA Institut National de la Recherche Agronomique, Tours bzw. Toulouse, France

i. v. intravenös

IVS Institute of Veterinary Services, Nicosia, Cyprus

K Lysin

Kap. Kapitel

kDa Kilo-Dalton

k. P. kein Probenmaterial

Ln. Lymphonodus

Ln. retroph. Lymphonodus retropharyngealis medialis

Lnn. Lymphonodi

LRS lymphoretikuläres System

M molar

M. Musculus

MAK monoklonaler Antikörper

MDT Magen-Darm-Trakt

Met Methionin

min Minute(n)

MM molekulare Masse

Mon. p. i. Monate post inoculationem

&. Nervus

&aOH Natriumhydroxid, Natronlauge

&BF neutral buffered formalin, neutral-gepuffertes Formalin

&cl./&cll. Nucleus/Nuclei

&RL Nationales Referenzlabor

&-terminal Amino-terminal

O.I.E. Office International des Epizooties

ORF open reading frame, offener Leserahmen

P Prolin

p Signifikanzwert

Abkürzungsverzeichnis IX

p. a. pro analysi

p. i. post inoculationem

PK Proteinase K

PMCA protein misfolding cyclic amplification

P&S peripheres Nervensystem

p. part. post partum

PP Peyer` Platte(n)

PR&P Prion-Gen

prox. proximal

PrP Prion-Protein

PrPc zelluläres Prion-Protein

PrPSc pathologisches Prion-Protein

PTA phosphotungic acid, Phosphorwolframsäure

PVDF-Membran Polyvinylidenfluorid-Membran

Q Glutamin

R Arginin

RAMALT recto-anal mucosa associated lymphoid tissue, lymphatisches Gewebe der rektoanalen Schleimhaut

rER raues endoplasmatisches Retikulum

rpm revolutions per minute

RT Raumtemperatur

S Serin

s. S. siehe Seite

SDS sodium dodecyl sulfate, Natriumdodecylsulfat

PAGE Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

sec Sekunde(n)

shp sheep

s. o. siehe oben

sog. so genannte

Tab. Tabelle

TBS Tris-buffered-saline, Tris-gepufferte Salzlösung

TME Transmissible Mink Enzephalopathie

TRI-PLOT triangular diagram plotting spreadsheet

X Abkürzungsverzeichnis

TSE/n Transmissible Spongiforme Enzephalopathie/n

u. und

u. a. unter anderem

usw. und so weiter

u. v. m. und vielem mehr

V Volt

v. a. vor allem

vCJK Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit

vgl. vergleiche

w/v weight-volume ratio

z. Bsp. zum Beispiel

Z&S Zentrales Nervensystem

Abbildungsverzeichnis XI

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Modell zur protein-only-Theorie von Prusiner…............................................... 4

Abb. 2 Schematische Darstellung des PrPSc von Scrapie… ........................................... 9

Abb. 3 Spongiforme Veränderungen des Neuropils und Vakuolisierung…................ 17

Abb. 4 Scrapiefälle (cases) bei Ziegen von 2002… ..................................................... 24

Abb. 5 Schematische Darstellung der an den Proben…............................................... 31

Abb. 6 Zeitlicher Ablauf der BSE-Pathogenesestudie………..…..……………...…...33

Abb. 7 Schematische Darstellung der Entnahmeorte von Proben…............................ 40

Abb. 8 Schema zur seriellen Schnitttechnik der Proben… .......................................... 42

Abb. 9 Altersstruktur der Damaskusziegen aus Zypern mit…..................................... 52

Abb. 10 Vergleichende Darstellung der Glykosylierungsmuster der 25….................... 54

Abb. 11 Vergleich des Quotienten der Signalintensiät des……………….……………56

Abb. 12 Standorte der Herden (A-Q) der Zypernziegen… ............................................ 58

Abb. 13 Darstellung der Stabilität von PrPSc nach… ..................................................... 59

Abb. 14 Vergleichende Darstellung der Proteinase K-Resistenz des PrPSc… ............... 60

Abb. 15 Schematische Abbildung eines Querschnitts durch den…............................... 61

Abb. 16 Graduelle Ausprägung vakuolärer Veränderungen in den… ........................... 63

Abb. 17 Graduelle Ausprägung der PrPSc-Ablagerungen in den… ............................... 64

Abb. 18 Befunde der Ziege ZYP 40: PrPSc-Ablagerungen… ........................................ 67

Abb. 19 Scrapie-positive Ziege ZYP 27: geringgradige, feinkörnig….......................... 67

Abb. 20 ZYP 24 (Obexbefund PrPSc-negativ): feinkörnige bis… ................................. 68

Abb. 21 Einzelbefund geringgradiger, fein- bis grobkörniger PrPSc-Ablagerungen….. 72

Abb. 22 Einzelbefund geringgradiger, fein- bis grobkörniger PrPSc-Ablagerungen….. 73

Abb. 23 Immunoblot zur Bestimmung des Glykosylierungsmusters, der….................. 77

Abb. 24 Vergleichende Darstellung der Glykosylierungsmuster der vier… ................. 77

Abb. 25: Grad der histopathologischen Veränderungen (A) und…................................ 79

XII Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Übersicht zu den Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien… .............. 5

Tab. 2 Wichtige Polymorphismen auf dem Prion-Gen (PRNP) von…....................... 11

Tab. 3 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien von Schaf, Ziege… ................ 25

Tab. 4 Übersicht der 25 im BioRad-Schnelltest PrPSc-reaktiv… ................................ 27

Tab. 5 Übersicht der 17 im BioRad-Schnelltest PrPSc-negativ…................................ 28

Tab. 6 Anamnestische Daten aller Ziegen der BSE-Pathogenesestudie….................. 29

Tab. 7 Übersicht über die immunhistochemisch, histopathologisch und… ................ 32

Tab. 8 Übersicht zu den Formalin- und Tiefgefrierproben…...................................... 37

Tab. 9 Sektionszeitpunkte der Ziegen aus der BSE-Pathogenesestudie….................. 38

Tab. 10 Parameter für die Einstufung eines TSE-Isolats…........................................... 49

Tab. 11 Übersicht der wichtigsten positiven Referenzen (Hirnstammmaterial)… ....... 50

Tab. 12 Anamnestische Daten der Damaskusziegen aus Zypern… .............................. 52

Tab. 13 Scrapie-Isolate der Damaskusziegen aus Zypern mit…................................... 57

Tab. 14 Übersicht der im Langzeit-Proteinase K-Resistenztest untersuchten…........... 59

Tab. 15 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung von Gewebeproben….66

Tab. 16 Vergleich der Ziegen aus Zypern mit… ........................................................... 70

Tab. 17 Verhältnis PrPSc-positiver Follikel zur Gesamtanzahl der… ........................... 71

Tab. 18 Übersicht zu den Befunden der in… ................................................................ 73

Tab. 19 Inkubationszeit, klinische Anzeichen und Zeitraum der… .............................. 74

Tab. 20 Ergebnisse des IDEXX Herd Chek-Schnelltests und… ................................... 75

Tab. 21 Übersicht über die in der Immunhistochemie…............................................. 132

Tab. 22 Übersicht über die Vorbehandlungen der in…............................................... 133

Tab. 23 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Ausprägungsgrades…..... 134

Tab. 24 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils…......................... 134

Tab. 25 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils…......................... 134

Tab. 26 Übersicht über die bei den Sektionen… ......................................................... 135



Tab. 29 Vergleich der klassischen caprinen und ovinen….......................................... 140

Tab. 30 Glykosylierungsverhältnisse der di-, mono- und unglykosylierten…............ 141

Einleitung 1

1 Einleitung

Scrapie und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) gehören zu den Transmissiblen

Spongiformen Enzephalopathien (TSEn) und stellen neurodegenerative, progressiv und letzt-

endlich tödlich verlaufende Erkrankungen bei kleinen Wiederkäuern und Rindern dar. Scra-

pie wurde erstmalig 1732 (MC GOWAN et al. 1922) beschrieben, während BSE erst wesent-

lich später Erwähnung fand (WELLS et al. 1987). Scrapie tritt unter natürlichen Bedingun-

gen bei Schafen und Ziegen auf. Als Ursache für das Auftreten von BSE bei Rindern wird

die Verfütterung von ungenügend erhitzten Tiermehlen an die Wiederkäuer in Großbritan-

nien vermutet. Im Gegensatz zu Scrapie ist BSE eine zoonotische Erkrankung, welche beim

Menschen die tödlich verlaufende Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJK) verursacht.

Die Empfänglichkeit der kleinen Wiederkäuer für Scrapie ist abhängig vom Genotyp. Bei

Schafen sind partiell resistente Genotypen gegen die Erkrankung beschrieben worden. Diese

bekannten genetischen Resistenzen werden züchterisch genutzt, um Scrapie-freie Schafher-

den zu etablieren. Auch bei Ziegen ist eine Abhängigkeit vom Genotyp für die Scrapie-

Empfänglichkeit nachgewiesen. Aufgrund einer weitaus größeren genetischen Diversität ge-

staltet sich die Aufnahme gezielter Zuchtprogramme bei Ziegen jedoch vergleichsweise

schwierig. Der erste natürlich aufgetretene BSE-Fall in kleinen Wiederkäuern wurde bei ei-

ner französischen Ziege diagnostiziert (ELOIT et al. 2005), nachdem bereits die BSE-

Infektion von Schaf und Ziege experimentell gezeigt werden konnte (FOSTER et al. 1993).

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung natürlicher capriner Scrapie-

Fälle aus Zypern und der Differenzierung dieser von capriner BSE. Des Weiteren wurde die

Pathogenese von BSE bei Ziegen untersucht. Nach der oralen Inokulation von Ziegen unter-

schiedlicher Genotypen konnten Erkenntnisse zur pathogenetischen Verteilung, zu Übertra-

gungswegen und den Möglichkeiten prämortaler Diagnostik in Abhängigkeit vom Genotyp

gewonnen werden.

Im Sinne des Verbraucherschutzes helfen diese Erkenntnisse u. a. spezifiziertes Risikomate-

rial zu definieren, die sinnvolle Nutzbarkeit prämortaler Diagnostikmethoden abzuschätzen,

BSE von Scrapie mittels diskriminatorischer Tests zu unterscheiden und resistentere Genoty-

pen in den europäischen Ziegenherden zu etablieren.

2 Literaturübersicht


2.1 Das Prion-Protein

2.1.1 Das Prion-Gen

Das Prion-Protein wird durch das Prion-Gen (PRNP) kodiert. Das PRNP liegt bei Schaf, Zie-

ge und Rind auf dem Chromosom 13 (IANNUZI et al. 1998) und ist heute eines der am häu-

figsten sequenzierten Gene. Es beinhaltet in Abhängigkeit von der jeweiligen Säugetierart

zwei oder drei Exons, wobei das letzte Exon den für das gesamte Prion-Protein kodierenden

open reading frame (ORF) enthält. Die Kodons des ORF kodieren bei den Bovidae und Cer-

vidae für die 256 Aminosäuren (AS) des Prion-Proteins, welches nach der posttranslationalen

Modifikation als vollständig prozessiertes Prion-Protein eine Größe von 210 AS aufweist. Für

das PRNP sind bei zahlreichen Tierarten Polymorphismen bekannt. Zwei Arten der Poly-

morphismen wurden bisher beschrieben. Zum einen handelt es sich um Polymorphismen ein-

zelner Nukleotide, welcher in der Regel den Austausch einzelner Aminosäuren bewirken, und

zum anderen um Insertionen oder Deletionen von Oktapeptid-Kopien (octapeptid repeats) in

der Amino-(N)-terminalen Domäne (GOLDMANN 2008).

2.1.2 Das zelluläre Prion-Protein

Das Prion-Protein (PrPc) ist ein 33-35 kDa großes zelluläres Glykoprotein, welches bei ver-

schiedenen Tierspezies und beim Menschen beschrieben wurde. Seine biologische Funktion

ist bis heute nicht endgültig geklärt. Strukturell besteht das PrPc aus drei α-helikalen Regio-

nen, von denen zwei über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind, sowie aus einem

zweisträngigen antiparallelen β-Faltblatt und einem flexiblen, unstrukturierten N-Terminus

(RIEK et al. 1996, 1997). Es wird im rauen endoplasmatischen Retikulum (rER) synthetisiert

und über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert, wo es durch einen Glyko-

sylphosphatidylinositol-Anker in der Zellmembran verankert wird. Das humane PrPc kann am

Asparagin auf Position 181 und 197, das murine PrPc an den Positionen 180 und 196 variabel

glykolysiert sein. Die Glykosylierung beeinflusst das Verhalten des PrPc im intrazellulären

Kreislauf zwischen der Zelloberfläche und endozytotischen Kompartimenten

(CANCELLOTTI et al. 2005). Das Prion-Protein kann in di-, mono- und ungklykosylierter

Form vorliegen. Es ist in milden Detergenzien löslich und wird durch die Proteinase K (PK)

Literaturübersicht 3

vollständig verdaut (OESCH et al. 1985). Bei PrP-Knockout-Mäusen konnte gezeigt werden,

dass sich diese Tiere normal entwickeln, fortpflanzen und keine Verschlechterung der Lernfä-

higkeit aufweisen (BÜELER et al. 1992; MANSON et al. 1994, 1995). Des Weiteren ist be-

kannt, dass PrPc vor oxidativem Stress schützt (BROWN et al. 1997, 1999 a; KLAMT et al.

2001), Kupfer bindet (HORNSHAW et al. 1995 a, b; BROWN et al. 1997, 1999 b) und bei

der Neurogenese und Differenzierung von Neuronen mitwirkt (STEELE et al. 2006), sowie in

der Zellerkennung eine Rolle zu spielen scheint (PRUSINER 1989). Es greift auch in die Re-

gulierung der zirkadianen Aktivität und des Schlafrhythmus ein (TOBLER et al. 1996). PrPc

wird außerdem als Mediator für die Ablagerung bzw. als Rezeptor von β-Amyloid an Sy-

napsen bei der Alzheimer-Erkrankung (neurodegenerative Erkrankung des Menschen) disku-

tiert (LAURÉN et al. 2009; KESSELS et al. 2010).

2.1.3 Die pathologische Isoform des Prion-Proteins

Wie das zelluläre Prion-Protein weist auch die pathologische Isoform des Prion-Proteins

(PrPSc) in der Primärstruktur dieselbe Aminosäuresequenz mit einer identischen molekularen

Masse auf, worauf eine fehlende Immunogenität zurückgeführt wird. Deutliche Unterschiede

zeigen sich in der Struktur und in den biochemischen Eigenschaften. So ist beim PrPSc der

Anteil der β-Faltblattstrukturen mit 43 % deutlich größer als beim PrPc (3 %), worin die stär-

kere Tendenz zur Selbstaggregation und Fibrillenbildung begründet ist (PAN et al. 1993). Die

fibrillären Aggregate können elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden und werden als

Scrapie-assoziierte Fibrillen (SAF) oder „prion rods“ bezeichnet (PRUSINER et al. 1983).

Das PrPSc erweist sich als resistenter gegenüber der Lösung in Detergenzien und der Verdau-

ung mit Proteinase K (PK). Beim PK-Verdau werden vom PrPSc ca. 70 Aminosäuren N-

terminal abgespalten, wodurch sich die molekulare Masse des PK-resistenten PrPSc auf 27-30

kDa verringert. Dieses PrPSc, welches auch als PrP27-30 bezeichnet wird, bleibt infektiös und

weist im Westernblot eine charakteristische Verschiebung („shift“) auf. Die größere PK-

Resistenz der pathologischen Isoform wird in zahlreichen Routinetests zum Nachweis von

PrPSc genutzt.

2.1.4 Prionenmodelle

Im Jahr 1982 beschrieb PRUSINER mit der „ protein-only-Theorie“ das Prion-Protein (PrPSc)

als auslösendes Agens der TSE-Erkrankungen. Das Prion-Protein, auch als „proteinaceous


infectious particle“ bezeichnet, initiiert die Umfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrPc) in

die pathogene Form (s. Abb. 1). Damit tritt PRUSINER der noch heute von DIRINGER et al.

(1994) und MANUELIDIS et al. (1994, 1995) vertretenen Virus-Theorie entgegen, welche

einen „slow“-Virus als Ursache der TSE-Erkrankungen favorisiert und er widerspricht der

Virino-Theorie (DICKINSON u. OUTRAM 1988), nach welcher eine sehr kleine behüllte,

Scrapie-spezifische Nukleinsäure die Erkrankungen auslöst und sich aufgrund ihrer geringen

Größe der Detektion entzieht. Für die Theorie von PRUSINER spricht, dass PrPSc in Verbin-

dung mit der Scrapie-Infektion steht (1982), dass PrP-Knockout-Mäuse nicht an Scrapie er-

kranken (BÜELER et al. 1993), und dass bis heute der Nachweis einer TSE-spezifischen

Nukleinsäure nicht gelungen ist. Außerdem bleiben die Eigenschaften der verschiedenen

TSE-Erkrankungen (Stämme) auch nach vollständiger Zerstörung aller Nukleinsäuren erhal-

ten und der experimentelle Beweis für die Virino-Theorie steht noch immer aus. Allerdings ist

auch die „protein-only-Theorie“ nicht unumstritten, da PrPSc nicht immer infektiös ist, und

dies die Frage nach einem unbekannten Agens aufwirft, welches an der Infektion mit beteiligt

sein könnte (LASMEZAS et al. 1997; BARRON et al. 2007; PICCARDO et al. 2007).

Zelluläres Prionprotein (PrPC) Pathologisches Prionprotein (PrPSc)

Konversion

Scrapie-assoziierte Fibrillen (SAF)

Aggregation

Abb. 1 Modell zur protein-only-Theorie von Prusiner (GOVAERTS et al. 2004).

2.1.5 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien im Überblick

Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSEn) sind infektiöse, neurodegenerative Er-

krankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), die durch die Akkumulation des pathologi-

schen Prion-Proteins gekennzeichnet sind. Nach einer monate- bis jahrelangen Inkubations-

zeit folgt ein progredienter Krankheitsverlauf, der stets tödlich endet. Die pathologischen

Veränderungen im ZNS sind durch die Trias Ablagerung von PrPSc, Vakuolisierung und Glio-

se gekennzeichnet. Eine Immunantwort des Wirtsorganismus auf das PrPSc fehlt jedoch voll-


ständig. TSEn kommen beim Menschen und zahlreichen Säugetierspezies vor und sind kli-

nisch insbesondere durch Sensibilitätsstörungen, Ataxien und Demenzerscheinungen gekenn-

zeichnet. Sie können in Folge einer Infektion oder sporadisch auftreten oder genetisch bedingt

sein. Einen Überblick über alle bekannten TSEn und deren Aetiologien gibt Tab. 1.

Tab. 1 Übersicht zu den Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien bei Mensch und Säugetie-ren und Angaben zu ihrer Aetiologie

Transmissible Spongiforme Enzephalopathien Aetiologie

Mensch Kuru Infektion Creutzfeldt-Jakob-Krankheit -iatrogen Infektion -sporadisch unbekannt -familiär-genetisch Mutation -neue Variante Infektion Gerstmann-Sträussler-Scheincker-Syndrom Mutation Fatale Familiäre Insomnie Mutation

Säugetiere Scrapie Infektion Atypische Scrapie unbekannt Bovine Spongiforme Enzephalopathie Infektion

Atypische Bovine Spongiforme Enzephalopathie unbekannt

(vermutlich sporadisch) Transmissible Nerz-Enzephalopathie Infektion Feline Spongiforme Enzephalopathie Infektion Chronische Auszehrungskrankheit der Hirschartigen Infektion Spongiforme Enzephalopathie der exotischen Wildwiederkäuer Infektion

2.2 Stammcharakterisierung der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien

Obwohl die Aminosäuresequenz des pathologischen Prion-Proteins unverändert bleibt, konn-

ten verschiedene TSE-Stämme isoliert werden. Sie unterscheiden sich nach Art der Klinik,

den Inkubationszeiten, der Übertragbarkeit, den neuropathologischen Veränderungen (Läsi-

onsprofil), den Inaktivierungseigenschaften und ihren biochemischen Charakteristika wie PK-

Resistenz und PK-Schnittstelle sowie dem Glykoprofil des PrPSc. Bereits 1961 beschrieben

PATTISON und MILLSON einen durch starken Pruritus („scratching“-Syndrom) und einen

von allgemeiner Depression dominierten („drowsy“-Syndrom) Scrapie-Stamm bei Ziegen.

Auch bei nachfolgenden Passagen dieses Stammes in Ziegen setzten sich die jeweiligen klini-

schen Formen fort. Als Hintergrund wurden zwei unterschiedliche Scrapie-Stämme vermutet.


Vergleichbares wurde für die Transmissible Nerz-Enzephalopathie (TME) bei Hamstern be-

schrieben. Der sog. „Hyper“-Stamm führte zu Übererregbarkeit und zerebellärer Ataxie, wäh-

rend der sog. „Drowsy“-Stamm Lethargie und Ataxie verursachte (BESSEN u. MARSH 1992

a, b, 1994).

2.2.1 Die Inkubationszeit und der Einfluss der Speziesbarriere

Wird die TSE von einer Spezies auf eine andere übertragen, so bewirkt die sog. Speziesbarrie-

re anfänglich verlängerte Inkubationszeiten, eine variierende Klinik und histopathologische

Veränderungen sowie eine verminderte Übertragungsrate der TSE bei den Rezipienten

(PATTISON et al. 1965). Die Inkubationszeit ist definiert als Zeitintervall zwischen der In-

fektion und dem Auftreten klinischer Symptome. Sie gilt als Stammcharakteristikum für TSE-

Erkrankungen. Erfolgen mehrere Passagen von TSEn innerhalb einer Spezies bzw. Mauslinie,

so verkürzt sich die Inkubationszeit und die histopathologischen Veränderungen bleiben kon-

stant. Mit der intrazerebralen Übertragung von TSE-Stämmen auf definierte Mauslinien ge-

lang es somit, die Übertragbarkeit, die Inkubationszeit und histopathologischen Läsionsprofile

des Erregers zu bestimmen und diesen näher zu charakterisieren.

Einen wesentlichen Einfluss auf die Übertragbarkeit hat die primäre Aminosäuresequenz des

Prion-Proteins der unterschiedlichen Spezies, denn eine Übertragung gelingt umso leichter, je

ähnlicher sich die Primärsequenzen sind (PRUSINER et al. 1990; BÜELER et al. 1994). Al-

lerdings erklärt dies nicht, warum einige der TSEn (z. Bsp. BSE) auf mehrere Spezies über-

tragbar sind. Weitere Einflussfaktoren können daher nicht ausgeschlossen werden

(COLLINGE et al. 1999; HILL u. COLLINGE 2004). Durch die Verwendung von transgenen

Mäusen, welche z. Bsp. das ovine (CROZET et al. 2001; VILOTTE et al. 2001), das bovine

(SCOTT et al. 1997; BUSCHMANN et al. 2000) oder das murine PrPc überexprimieren

(FISCHER et al. 1996), konnten die Speziesbarriere und die Inkubationszeiten stark reduziert

werden. Der Mausbioassay dient bis heute als sensitivster Test in der TSE-Diagnostik.

2.2.2 Die Bedeutung proteinbiochemischer Parameter

Zur Charakterisierung von TSE-Stämmen mittels proteinbiochemischer Methoden wird das

Glykosylierungsverhältnis, die molekulare Masse, die Immunoreaktivität sowie die PK-

Stabilität des PrPSc bestimmt. Anhand dieser Parameter kann einerseits eine Diskriminierung

der BSE-Stämme von den Scrapie-Stämmen vorgenommen werden, und andererseits die Cha-


rakterisierung der einzelnen Scrapie-Stämme erfolgen, weshalb diese Methodik eine Alterna-

tive zu den sehr zeitaufwendigen Mausbioassays darstellt. Die Methodik basiert auf der par-

tiellen Resistenz des PrPSc gegen den Verdau durch die PK. Während PrPc durch PK ausge-

hend vom N-terminalen Ende vollständig verdaut wird, werden von der pathologischen Form

62 Aminosäuren (AS) N-terminal abgetrennt und es verbleibt ein PK-resistentes „Core“-

Fragment von 141 AS (OESCH et al. 1985). Durch den PK-Verdau verschiebt sich die mole-

kulare Masse des PrPSc im Immunoblot von 33-35 kDa auf 27-30 kDa.

2.2.2.1 Das Glykosylierungsverhältnis und die molekulare Masse

Die Bestimmung des Anteils der di-, mono- und unglykosylierten Form des PrPSc am Gesamt-

signal (Glykosylierungsverhältnis) erfolgt nach Auftrennung des PK-verdauten Gehirnmateri-

als in der Gelelektrophorese (SDS-Gel) und der Darstellung der PrPSc-Fragmente im Immu-

noblot. KASCSAK et al. beschrieben erstmals 1985 deutliche Unterschiede im Glykosylie-

rungsverhältnis muriner Scrapie-Stämme. Bei Kuru, dem GSS-Syndrom und iatrogener bzw.

sporadischer CJK dominiert die monoglykosylierte Form, bei vCJK und Rinder-BSE die

diglykosylierte Form (COLLINGE et al. 1996; SOMERVILLE et al. 1997; KUCZIUS et al.

1998). Vergleichbar zu Rinder-BSE dominierte bei oviner BSE ebenfalls die diglykosylierte

Form (STACK et al. 2002; NONNO et al. 2003; LEZMI et al. 2004; THURING et al. 2004;

GRETZSCHEL et al. 2005), was einen deutlichen Unterschied zu den meisten Scrapie-

Stämmen darstellte. Trotzdem ist anhand des Glykosylierungsmusters die Diskriminierung

der BSE v. a. von natürlich vorkommenden Scrapie-Stämmen nicht immer eindeutig möglich,

da auch letztere eine dominierende diglykosylierte Form des PrPSc aufweisen können

(BARON et al. 1999). Weitere Unterschiede fanden sich nach dem PK-Verdau für die mole-

kulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc von TSE-Stämmen, denn diese war für

Scrapie vorwiegend größer als für BSE (HILL et al. 1998; BARON et al. 2000; STACK et al.

2002). Neben dem TSE-Stamm und den Wirtseigenschaften üben der Genotyp des Empfän-

gertiers (SOMERVILLE et al. 1999), die Gewebeart der untersuchten Probe (RUBENSTEIN

et al. 1991), und bei ZNS-Proben der genaue Entnahmeort in den verschiedenen Gehirnregio-

nen (SOMERVILLE et al. 1999, 2005) einen Einfluss auf das Glykoprofil aus. Darüber hin-

aus stellte sich das Glykosylierungsmuster in Abhängigkeit von den verwendeten Antikörpern

different dar (GROSCHUP et al. 2000; SWEENEY et al. 2000), weshalb auch methodisch

bedingte Effekte bei der Auswertung zu berücksichtigen sind.


2.2.2.2 Die Immunoreaktivität des pathologischen Prion-Proteins

Da das PrPSc der verschiedenen TSE-Stämme unterschiedliche Schnittstellen für die PK be-

sitzt, ergibt sich für die zur Detektion verwendeten Antikörper ein unterschiedlicher Grad der

Bindung an die Proteolyseprodukte (s. Abb. 2, S. 9). Diese Besonderheit wurde im sog. FLI-

Test zur Diskriminierung von Scrapie und BSE bei kleinen Wiederkäuern genutzt

(GRETZSCHEL et al. 2005). Die Detektion von PrPSc in Schaf- und Rindermaterial erfolgt

dabei mit dem monoklonalen Antikörper (MAK) P4, welcher N-terminal im Bereich der PK-

Schnittstelle das PrPSc bindet, sowie mit dem MAK L42, welcher im PrPSc weiter C-terminal

bindet. Das PrPSc aus mit Scrapie infizierten Schafen wird nach dem PK-Verdau durch beide

Antikörper detektiert, während das Epitop des MAK P4 auf dem PrPSc aus mit BSE infizier-

ten Schafen und Rindern durch den PK-Verdau fast vollständig zerstört wird und daher durch

diesen Antikörper nur noch schwach oder gar nicht mehr zu detektieren ist. Die Bestimmung

des Quotienten aus der Intensität des MAK P4- und des MAK L42-Signals liefert schließlich

den entscheidenden Parameter des FLI-Tests zur Diskriminierung von Scrapie und BSE bei

kleinen Wiederkäuern (GRETZSCHEL et al. 2005). Vergleichbare Bindungseigenschaften

wie der MAK L42 zeigte auch der MAK 6H4, welcher von STACK et al. (2002) eingesetzt

wurde.

2.2.2.3 Die Proteinase K-Stabilität des pathologischen Prion-Proteins

Die Stabilität gegenüber dem PK-Verdau ist, wenn auch nur eingeschränkt, ein weiteres Cha-

rakteristikum von PrPSc zur Differenzierung von TSE-Stämmen, da diese teilweise sehr deut-

lich variieren kann. So zeigte beispielsweise bei Schafen das PrPSc atypischer Scrapiefälle

eine geringere PK-Stabilität als das PrPSc klassischer Scrapiefälle (BUSCHMANN et al. 2004

a), und auch das PrPSc der Rinder-BSE wies eine vergleichsweise geringere PK-Resistenz auf

(KUCZIUS u. GROSCHUP 1999; SWEENEY et al. 2000). Neben originärem Gehirnmaterial

der jeweiligen Donorspezies wurde auch Maus-passagiertes Gehirnmaterial mittels PK ver-

daut, wobei ein geringer Einfluss der Mauslinie auf die PK-Stabilität nicht auszuschließen

war (KUCZIUS u. GROSCHUP 1999). Für experimentelle Scrapie-Stämme von Hamster und

Maus, deren Differenzierung anhand des Glykosylierungsverhältnisses und der molekularen

Masse des PrPSc nicht gelang, konnte somit eine Unterscheidung anhand der PK-Stabilität

erfolgen (SAFAR et al. 1998; KUCZIUS u. GROSCHUP 1999).


Proteinase K

MAK P4 MAK L42

Scrapie-PrPSc

BSE-PrPSc

AS 96 -97

AS 81-89

89-104 shp* 145-163 shp*

145-163 shp*

Abb. 2 Schematische Darstellung des PrPSc von Scrapie und BSE mit den unterschiedlichen Protei-nase K-Schnittstellen (Pfeile). Der MAK L42 detektiert beide Proteine, während der MAK P4 nur Scrapie nicht aber BSE detektieren kann, da er weiter aminoterminal bindet. AS = Aminosäure, BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, MAK = monoklonaler Antikör-per, *Epitope der Antikörper, shp = sheep

2.3 Scrapie bei Schaf und Ziege

Scrapie wurde im Jahr 1732 in Großbritannien bei Schafen und im Jahr 1942 bei Ziegen erst-

malig beschrieben (MC GOWAN et al. 1922; CHELLE et al. 1942). Scrapie ist damit die am

längsten bekannte Erkrankung der TSEn. Sie tritt, mit Ausnahme von Australien und Neusee-

land, weltweit bei Schafen und Ziegen auf und wurde nach einem klinischen Hauptsymptom

„to scrape“ (kratzen) benannt.

2.3.1 Das klinische Bild

Klinisch kann beim Schaf zum einen die pruritische Form, welche durch einen ausgeprägten

Juckreiz und massiven Wollverlust gekennzeichnet ist, auftreten, und zum anderen die paraly-

tische Form, welcher die pruritische Komponente fehlt. Neben einem hypermetrischen Gang,

der zu dem Namen „Traberkrankheit“ führte, sind Kachexie und deutliche Verhaltensände-

rungen zu beobachten. Nach einer Klinikdauer von ca. drei bis vier Monaten kommt es

schließlich zum Tod der Schafe (CAPUCCHIO et al. 2001).

Bei Ziegen sind die Symptome häufig weniger stark ausgeprägt. Wie bei den Schafen sind

v. a. die drei- bzw. vierjährigen Tiere von der Erkrankung betroffen (PARRY 1983; WOOD

et al. 1992). Am häufigsten treten bei klinisch auffälligen Tieren Hyperästhesien, Ataxien und

Pruritus auf, weniger häufig dagegen wurden u. a. Konditionsverlust bei erhaltener Fresslust,

Speicheln und Schwermelken beobachtet (HOURRIGAN et al. 1969; WOOD et al. 1992). Im

Gegensatz zu Schafen zeigen erkrankte Ziegen häufig ein aggressives Verhalten und beißen


sich selbst oder ihre Artgenossen (CAPPUCHIO et al. 2001).

2.3.2 Der Einfluss des Genotyps des Prion-Gens

Die Sequenz des PRNP von Schaf und Ziege erreicht eine Homologie von mehr als 99 Pro-

zent (%) und ist stark konserviert (GOLDMANN et al. 1996; BILLINIS et al. 2002). Abwei-

chend vom am häufigsten vorkommenden Genotyp, dem sog. Wildtyp-Genotyp, wurden so-

wohl bei Schafen als auch bei Ziegen zahlreiche Polymorphismen im PRNP beschrieben,

welche einen entscheidenden Einfluss auf die Inkubationszeit und Pathogenese von TSE-

Erkrankungen bei diesen Tierarten haben und zur Ausbildung von Resistenzen führen können.

Die Polymorphismen im PRNP bewirken vermutlich sterische Konformationsänderungen im

Prion-Proteinmolekül, was wiederum die Neigung zur Umfaltung in die pathologische Form

beeinflusst (COHEN et al. 1994; HUANG et al. 1994; PRUSINER et al. 1997). Die wichtig-

sten Polymorphismen beider Tierarten sind in Tab. 2 (S. 11) zusammengefasst.

2.3.2.1 Das Prion-Gen des Schafs

Den größten Einfluss auf die Empfänglichkeit von Schafen für Scrapie besitzen die Poly-

morphismen der Kodons 136, 154 und 171 (HUNTER et al. 1996). Auf dem Kodon 136 kann

dabei für Valin (V) oder Alanin (A), auf dem Kodon 154 für Arginin (R) oder Histidin (H)

und auf dem Kodon 171 für R, Glutamin (Q) oder H kodiert werden (GOLDMANN et al.

1990, 1991; BELT et al. 1995). Die Genotypen der Schafe lassen sich nach ihrem Resistenz-

potential in fünf Genotypklassen einteilen. Die Genotypen werden dabei durch die Abkürzung

der kodierten Aminosäuren für die Kodons 136, 154 und 171 angegeben, die Allele werden

durch einen Schrägstrich getrennt. Die Einteilung der Schafgenotypen erfolgt in Klassen zwi-

schen der Genotypklasse 1 (A136R154R171/ARR), welcher die gegenüber einer Scrapie-

Infektion genetisch resistentesten Tiere zugeordnet sind und der Genotypklasse 5

(A136H154Q171/VRQ, A136R154H171/VRQ, A136R154Q171/VRQ oder V136R154Q171/VRQ), welcher

die hochempfänglichen Tiere angehören, die möglichst nicht zur Zucht verwendet werden

sollten. Vor dem Hintergrund dieser Erkenntnisse versucht man mit Hilfe von Zuchtpro-

grammen (u. a. in England, den Niederlanden, Deutschland u. Frankreich) die Häufigkeit des

V136R154Q171-Allels in den europäischen Schafherden zu verringern und die des A136R154R171-

Allels zu erhöhen, um die genetische Resistenz der Herden gegenüber klassischer Scrapie zu

erhöhen und somit Scrapie in den Herden zu dezimieren bzw. ganz auszulöschen.


Tab. 2 Wichtige Polymorphismen auf dem Prion-Gen (PRNP) von Schaf und Ziege. Für die Spezies Ziege sind bekannte Effekte der Polymorphismen aufgeführt.

PRNP Schaf PRNP Ziege Kodon

Wildtyp Polymorphismus Wildtyp Polymorphismus Effekt

136 Valin (V) Alanin (A)

142 Isoleucin (I)

Methionin (Met)

Verlängerung der Inkuba-tionszeit von BSE/Scrapie

146 Asparagin (N)

Serin (S) Asparaginsäure (D)

Resistenz gegenüber Scrapie erhöht

154 Arginin (R)

Histidin (H)

Arginin (R)

Histidin (H)

Verlängerung der Inkuba-tionszeit von Scrapie

171 Glutamin (Q)

Arginin (R) Histidin (H)

211 Arginin (R)

Glutamin (Q)


222 Glutamin (Q)

Lysin (K)


240 Serin (S) Prolin (P) fraglich

BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, grau hinterlegt = Leerfeld

2.3.2.2 Das Prion-Gen der Ziege

Trotz der großen genetischen Homologie des PRNP kleiner Wiederkäuer, unterscheiden sich

die Polymorphismen, die speziell bei der TSE-Resistenz der Ziege eine Rolle spielen, teilwei-

se deutlich von denen der Schafe (s. Tab. 2). Für das PRNP der Ziege wurden bisher 42 Po-

lymorphismen beschrieben, wovon neun als sog. stille Mutationen vorliegen (VACCARI et

al. 2009). Im Gegensatz zum Schaf sind bei Ziegen für das Kodon 136 (GOLDMANN et al.

1996) keine Polymorphismen bekannt und ein Q/R-Polymorphismus des Kodon 171 wurde

bisher nur in einer griechischen Ziege beschrieben (BOUZALAS et al. 2010). Die wichtigsten

Polymorphismen befinden sich auf den Kodons 142, 146, 154, 211 und 222. Für Ziegen, die

auf dem Kodon 142 für Methionin (Met) anstatt für Isoleucin (I) kodierten, wurde eine ver-

längerte Inkubationszeit der Scrapie-Erkrankung beschrieben, wobei sowohl die homozygoten

als auch heterozygoten Ziegen empfänglich für Scrapie blieben. Ein vergleichbarer Einfluss

dieses Polymorphismus zeigte sich auch bei mit BSE-infizierten Ziegen (GOLDMANN et al.

1996). Der AS-Austausch von Arginin zu Histidin am Kodon 154, welcher bei Schafen für

einen moderaten Schutz sorgt, führt bei Ziegen zu verlängerten Inkubationszeiten und partiell


protektiven Effekten gegenüber Scrapie (BILLINIS et al. 2002; VACCARI et al. 2006;

PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007). Der Asparagin (N)/Serin (S)- bzw. Asparaginsäure

(D)- Polymorphismus auf Position 146 konnte in Europa bisher nur bei Ziegen auf Zypern

beschrieben werden. Die Aminosäuren Serin oder Asparaginsäure bewirken hier eine deutlich

erhöhte Resistenz gegenüber Scrapie in heterozygoter Ausprägung und die Polymorphismen

in homozygoter Ausprägung wurden bisher nur bei gesunden Tieren gefunden

(PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007, 2010). Für den R/Q-Polymorphismus am Kodon

211 konnten BARILLET et al. (2009) erstmals zeigen, dass heterozygote Ziegen eine größere

Resistenz gegen Scrapie besitzen. In Italien sind Arginin und Lysin am Kodon 222 sehr stark

in der Ziegenpopulation verbreitet. Keines der heterozygoten R/K-Tiere war an Scrapie er-

krankt, was ebenfalls auf eine erhöhte Resistenz hindeutet (ACUTIS et al. 2004; VACCARI

et al. 2006). Allerdings wurden in Frankreich Scrapie-positive heterozygote Tiere dieses Ge-

notyps beschrieben, was eine vollständige Resistenz dieses Genotyps ausschließt (BARILLET

et al. 2009). Weitere Polymorphismen wie der AS-Austausch von Serin nach Prolin am Ko-

don 240 konnten bisher nur bei der Ziege beschrieben werden. Die Rolle des Kodons 240 für

die TSE-Empfänglichkeit der Ziege scheint jedoch unbedeutend, denn GOLDMANN et al.

(1996) und PAPASAVVA-STYLIANOU et al. (2007) konnten diesen AS-Austausch nicht

mit der Verlängerung der Inkubationszeit von Scrapie assoziieren. Die Bedeutung der Er-

kenntnis von BARILLET et al. (2009), dass eine erhöhte Resistenz der heterozygot am Ko-

don 142 (Met/I) kodierenden Ziegen ausschließlich in Verbindung mit homozygoter Ausprä-

gung des Prolin am Kodon 240 zu finden war, bleibt dagegen noch zu klären.

2.3.3 Übertragungswege der Scrapie bei Schaf und Ziege

Scrapie ist infektiös und kontagiös. Die Übertragung von Scrapie auf Schaf und Ziege erfolgt

unter natürlichen Voraussetzungen auf dem oralen Weg. Experimentell sind u. a. auch die

intrazerebrale und die intraperitoneale Infektion möglich. Adulte Schafe infizieren sich auf

dem natürlichen Weg v. a. durch die Aufnahme (oral) der infektiösen Nachgeburt, welche die

Weiden kontaminiert, oder durch den direkten Kontakt zu infizierten Tieren (PATTISON

1972, 1974; HADLOW et al. 1982; HOURRIGAN u. KLINGSPORN 1996; RYDER et al.

2004). Bedingt durch eine hohe Stabilität des PrPSc in der Umwelt ist ein Ansteckungsrisiko

über Jahre gegeben (BROWN u. GAJDUSEK 1991; WIGGINS 2009).


Die maternale Übertragung von Scrapie auf die Lämmer konnte schon sehr früh belegt wer-

den (PATTISON 1972, 1974). Ob es sich bei dieser vertikalen Übertragung aber um eine in-

trauterine oder perinatale Infektion der Lämmer handelt, ist bis heute ungeklärt. Im fetalen

Trophoblasten der Plazenta Scrapie-positiver Schafe konnte PrPSc bereits nachgewiesen wer-

den (RACE et al. 1998; ANDREOLETTI et al. 2002), wobei sich die PrPSc–Ablagerungen

ausschließlich in den Plazenten von Lämmern eines empfänglichen Genotyps befanden, was

darauf hindeutet, dass die Genotypen der Nachkommen Einfluss auf den Übertragungserfolg

von Scrapie haben (ANDREOLETTI et al. 2002; TUO et al. 2002; ALVERSON et al. 2006;

LACROUX et al. 2007). Allerdings konnte PrPSc bislang weder im Fetus selbst noch im Ute-

rus der Muttertiere nachgewiesen werden (FOOTE et al. 1993; TUO et al. 2002; WANG et

al. 2001), weshalb die Ansteckung der Lämmer im perinatalen Zeitraum wahrscheinlicher

erscheint (ANDREOLETTI et al. 2002).

Eine weitere Ansteckungsquelle im peripartalen Zeitraum stellt die Milch der Schafe dar. So

gelang der PrPSc-Nachweis bereits in der Milch subklinischer Tiere (KONOLD et al. 2008 b;

LACROUX et al. 2008; MADDISON et al. 2009), und die Übertragung von Scrapie auf

Schaflämmer mit der Milch konnte ebenfalls gezeigt werden (KONOLD et al. 2008 b). PrPSc–

Ablagerungen waren sowohl im Euter als auch in den Lymphonodi mammarii detektierbar

(LIGIOS et al. 2005; LACROUX et al. 2008). HUNTER et al. (2002) gelang es, Scrapie mit-

tels Blut auf Schafe zu übertragen. LIGIOS et al. (2005) und SISÓ et al. (2006) wiesen PrPSc

in der Niere von Schafen nach und VASCELLARI et al. (2007) und MADDISON et al.

(2010) gelang der PrPSc-Nachweis in der Speicheldrüse und in Sekreten der Maulhöhle von

Schafen. Weiterhin konnten KARIV-INBAL et al. (2006) PrPSc im Urin von experimentell

infizierten Hamstern nachweisen.

Ziegen infizieren sich vorrangig über den direkten Kontakt zu Schafen (HOURRIGAN et al.

1969) oder durch die Nutzung von zuvor durch Schafe beweidete Flächen. Eine entscheiden-

de Rolle spielt dabei vermutlich die Kontamination der Umwelt durch infektiöse Nachge-

burtsanteile (Plazenta). Auch wenn PrPSc bereits in der Mamma von Ziegen nachgewiesen

werden konnte (GONZÁLEZ et al. 2010 a), was für eine Übertragung von Scrapie mit der

Milch spricht, gelang der PrPSc-Nachweis bisher weder in den Nieren noch in den Speichel-

drüsen von Ziegen.


2.3.4 Die Pathogenese der Scrapie

Auf welchem Weg das PrPSc ins Gehirn gelangt, ist bis heute nicht vollständig geklärt. Nach

der oralen Aufnahme erfolgt zumeist die Akkumulation des PrPSc im darmassoziierten

lymphatischen Gewebe (gut associated lymphoid tissue, GALT). Danach kommt es zur Aus-

breitung im nicht darmassoziierten lymphatischen Gewebe und im peripheren Nervensystem

(PNS), bis PrPSc schließlich auch im zentralen Nervensystem (ZNS) nachweisbar ist. Es wird

vermutet, dass die Verbreitung des PrPSc dabei sowohl auf dem lymphatischen und hämato-

genen als auch auf dem neuronalen Weg erfolgt.

2.3.4.1 Die Pathogenese der Scrapie im Schaf

Beim Schaf akkumuliert das PrPSc im Verlauf der Pathogenese zuerst in der Tonsille und den

Peyer` Platten (PP) des Darms, wobei die PP des Ileums als erstes betroffen waren und daher

auch als primäre Eintrittspforte für Scrapie diskutiert wurden (ANDREOLETTI et al. 2002;

RYDER et al. 2009). Nachfolgend kann sich Scrapie innerhalb von drei bis sechs Monaten

auf das gesamte GALT des Magen-Darm-Trakts (MDT) ausbreiten und akkumuliert schließ-

lich in den tributären Gebieten des GALT wie dem Lymphonodus retropharyngealis medialis

(Ln. retroph.) und den Lymphonodi (Lnn.) mesenteriales (RYDER et al. 2009) sowie in einem

Großteil weiterer peripherer Lymphknoten und der Milz (JEFFREY et al. 2001 b; VAN

KEULEN et al. 2002). Ob die Beteiligung des GALT an der Pathogenese allerdings grund-

sätzlich notwendig ist, bleibt zu bezweifeln, da bei klinisch an Scrapie erkrankten Schafen

zwar Ablagerungen im ZNS detektiert werden konnten, das LRS dieser Tiere aber nicht be-

troffen war (VAN KEULEN et al. 1996; ANDREOLETTI et al. 2000; JEFFREY et al. 2002).

Nach der Akkumulation und Replikation im LRS konnte PrPSc auch im enterischen Nerven-

system (ENS) nachgewiesen werden, wobei ausgehend vom ENS des Ileums und Duodenums

schließlich auch weiter kranial bzw. kaudal im Magen-Darm-Trakt gelegene Anteile des ENS

PrPSc-positiv getestet wurden (VAN KEULEN et al. 1999, 2000; ANDREOLETTI et al.

2000). Es wird daher zum einen vermutet, dass Nervenfasern, welche die Follikel innervieren,

das PrPSc auf neuronalem Weg zum ENS und schließlich weiter ins ZNS transportieren

(BEEKES u. MCBRIDE 2000; RACE et al. 2000). Zum anderen wird der direkte Transport

des PrPSc über Nervenendigungen der Tunica mucosa ins ENS diskutiert (HEGGEBØ et al.

2003; JEFFREY et al. 2006 a). Anschließend könnte Scrapie über den #ervus (N.) vagus als


parasympathischen Nerven und/oder den sympathischen #. splanchnicus ins Rückenmark

aufsteigen, was den Nachweis von PrPSc im #ucleus (Ncl.) parasympathicus nervi vagi

(DMNV) sowie im Ganglion (Ggl.) coeliacum (es enthält sympathische und parasympathi-

sche Faseranteile) und in den sympathischen Wurzelzellen der intermediolateralen Säule des

Rückenmarks erklären würde (VAN KEULEN et al. 2000). Neben der neuronalen Ausbrei-

tung ist zusätzlich die Ausbreitung auf dem hämatogenen Wege nicht auszuschließen. Für

diesen alternativen Weg spricht einerseits der Nachweis von PrPSc-Ablagerungen in lymphati-

schen Geweben, welche nicht zum tributären Gebiet des Eintrittsortes von PrPSc gehören, und

in der Milz, die keine afferenten Lymphe erhält, sowie andererseits der Nachweis der Über-

tragbarkeit von Scrapie durch das Blut infizierter Schafe (VAN KEULEN et al. 2000;

HUNTER et al. 2002; RYDER et al. 2009).

2.3.4.2 Die Pathogenese der Scrapie in der Ziege

Über die Pathogenese von Scrapie bei Ziegen ist bisher nur vergleichsweise wenig bekannt. In

den 60-iger Jahren zeigten PATTISON u. MILLSON (1960, 1962) in Übertragungsversuchen

dass eine Vielzahl von Gewebeproben, u. a. auch die Milz, das Pankreas und die Leber von

intrazerebral mit Scrapie infizierten Ziegen nach der intrazerebralen Inokulation in caprine

Rezipienten infektiös waren. Nach der intraperitonealen Inokulation von Ziegen konnte Infek-

tiosität zuerst im LRS, später im MDT und schließlich im Rückenmark und im Hirnstamm

nachgewiesen werden (HADLOW et al. 1974). In aktuelleren Untersuchungen ließ dann der

Nachweis von PrPSc im lymphatischen und neuronalen Gewebe des MDT sowie im darm-

unabhängigen LRS und dem ZNS der Ziegen Ähnlichkeiten zur Pathogenese von Scrapie bei

Schafen erkennen. Es gelang, wenn auch nur vereinzelt, der Nachweis von PrPSc in den PP

des Ileums und Jejunums sowie zusätzlich im ENS von Ziegen. Eine breite Beteiligung des

LRS konnte ebenfalls nachgewiesen werden, wobei vorrangig die Tonsille und der Ln.

retroph. betroffen waren. Mit zunehmender Ausbreitung des PrPSc im LRS wurde auffallend

häufig auch das lymphatische Gewebe des Rektums PrPSc-positiv getestet (VALDEZ et al.

2003; GONZÁLEZ et al. 2009, 2010 a).

2.3.5 Möglichkeiten der prämortalen Diagnostik von Scrapie bei Schaf und Ziege

Die prämortale Diagnostik ermöglicht die Detektion und Tilgung präklinischer Tiere. Eine

Methode der prämortalen Detektion von TSEn stellt die Untersuchung von Bioptaten lympha-


tischer Gewebe wie der Tonsille (SCHREUDER et al. 1996, 1998; Jeffrey et al. 2001 b), des

3. Augenlids (O´ROURKE et al. 1998, 2000; THURING et al. 2000) oder aus dem Rektum

(GONZÁLEZ et al. 2005) dar, welche mittels immunhistochemischer Methoden oder im

Westernblot untersucht werden. Aussagekräftig für die diagnostische Fragestellung sind dabei

jedoch lediglich positive Ergebnisse. So konnte Scrapie beispielsweise bei 97 % von klinisch

auffälligen Schafen mittels Rektalbiopsie festgestellt werden. Von präklinischen Tieren konn-

ten außerdem 86 % als PrPSc-positiv ermittelt werden, wobei die positive Diagnostik teilweise

bereits nach etwa der Hälfte der Inkubationszeit gelang (GONZÁLEZ et al. 2006, 2008).

Vergleichbare Ergebnisse konnten auch mit der Untersuchung von Tonsillenbioptaten erzielt

werden (SCHREUDER et al. 1996, 1998).

Bei Ziegen akkumuliert PrPSc ebenfalls frühzeitig in der Tonsille, dem Ln. retroph. sowie dem

lymphatischen Gewebeanteil der rektoanalen Mukosa (RAMALT), wobei letzterer weniger

häufig betroffen war. Dabei stieg mit der Zahl betroffener Gewebe des LRS auch die Wahr-

scheinlichkeit des Nachweises von PrPSc-Ablagerungen im Rektum. Bisher gelang der PrPSc–

Nachweis in Rektumbioptaten und rektalen Sektionsproben von Ziegen aber äußerst unregel-

mäßig und, verglichen mit den Ergebnissen bei Schafen, mit geringerer Erfolgsrate

(GONZÁLEZ et al. 2009).

Eine alternative Untersuchungsmethode könnte die Methode der zellfreien Konversion, die

protein misfolding cyclic amplification (PMCA)-Methode darstellen, welche sich zunutze

macht, dass geringe und vormals nicht detektierbare PrPSc–Mengen die Umfaltung von appli-

ziertem PrPc katalysieren. Der Anteil des PrPSc nimmt dabei zu und wird u. a. mittels Immu-

noblot detektiert (KOCISKO et al. 1994; SABORIO et al. 2001). Nach ersten erfolgreichen

Analysen mit Blut, Urin oder Liquor cerebrospinalis von erkrankten Hamstern (CASTILLA

et al. 2005; SAÁ et al. 2006; ATARASHI et al. 2007, 2008), wiesen THORNE u. TERRY

(2008) PrPSc erstmals auch im Blut erkrankter Schafe nach. Dabei kam es aber zu spontanen

Umfaltungen des PrPc der Negativkontrolle, weshalb die PMCA methodisch als noch nicht

ausgereift gilt und noch weiterer Optimierung bedarf.

2.4 Die Histopathologie von Scrapie

Bei an TSE erkrankten Tieren weisen die Gehirne makroskopisch keine Veränderungen auf

(MARSH u. KIMBERLIN 1975). In der Histopathologie zeigen sich jedoch in meist bilateral


symmetrischer Ausprägung die drei wesentlichen pathomorphologischen Merkmale vakuoläre

Veränderungen, neuronale Degeneration und Gliose (v. a. Astrozytose). Bei den vakuolären

Veränderungen wird zwischen der vakuolären Degeneration der grauen Substanz und den

einzelnen oder multiplen Vakuolisierungen in den Perikarya der Neuronen unterschieden

(s. Abb. 3). Alle pathomorphologischen Veränderungen zusammen ergeben schließlich das

pathognomonische Bild. Bei klassischer Scrapie sind histopathologische Veränderungen v. a.

im #cl. parasympathicus n. vagi (DMNV) der Medulla oblongata zu finden, weshalb die

Diagnostik vorrangig auf diesen Bereich des ZNS zielt (WOOD et al. 1997).

Abb. 3 Spongiforme Veränderungen des Neuropils und Vakuolisierung einer Nervenzelle (Pfeil) im Obex einer an Scrapie erkrankten Ziege, H.-E.-Färbung, 10-er Objektiv, Balken = 40 µm.

Die neuropathologischen Veränderungen können in ihrem Ausprägungsgrad und der neuro-

anatomischen Verteilung je nach Scrapie-Stamm oder, wie bei Schafen, auch in Abhängigkeit

vom Genotyp und anderen individuellen Faktoren variieren (WOOD et al. 1997; ZLOTNIK

1958; LIGIOS et al. 2002; BEGARA-MCGORUM et al. 2002). Im Mausmodell dagegen

ergeben sich nach der Passagierung von Scrapie-positivem Material und der semiquantitativen

Bewertung der vakuolären Veränderungen in den verschiedenen Hirnregionen der Mäusege-

hirne stammspezifische Läsionsprofile, anhand derer unter Berücksichtigung der Inkubations-

zeiten die Differenzierung von TSE-Stämmen möglich ist (FRASER u. DICKINSON 1968).

Das Läsionsprofil wird dabei u. a. vom Mausstamm und vom Genotyp des Donors beeinflusst

(FRASER 1976).

2.5 Scrapie in der Immunhistochemie

Immunhistochemisch können PrPSc–Ablagerungen in den betroffenen Zellen und Geweben

der verschiedenen Organe detektiert werden. Anhand ihrer Reaktionsmuster (profiling) und


ihrer Detektierbarkeit durch verschiedene Antikörper (epitope mapping) lassen sich die PrPSc–

Ablagerungen u. a. im ZNS näher charakterisieren. So konnten für Scrapie zahlreiche Reakti-

onsmuster der PrPSc-Ablagerungen beschrieben werden (MILLER et al. 1993; VAN

KEULEN et al. 1995; FOSTER et al. 1996; HARDT et al. 2000; RYDER et al. 2001), wel-

che GONZÁLEZ et al. (2002, 2003) zu einem Profil (profiling) zusammen gefasst haben, in

dem extrazelluläre (Neuropil-, Gliazell-, Ependymzell- oder Endothelzell-assoziiert) und in-

trazelluläre Verteilungsmuster von PrPSc (intraneuronal, intraastrozytär und intramikroglial)

Berücksichtigung fanden. Bei Schafen zeigten sich typische Reaktionsmuster unabhängig von

der Rasse und dem Genotyp der Tiere, waren aber weitgehend vom TSE-Stamm abhängig

(JEFFREY et al. 2001 a; GONZÁLEZ et al. 2002, 2003, 2010 b). Intraneuronale PrPSc-

Ablagerungen korrelierten am häufigsten mit dem Auftreten von klinischen Symptomen

(GONZÁLEZ et al. 2002, 2003). Mit an unterschiedliche AS-Sequenzen des Prion-Proteins

bindenden Antikörpern war es außerdem möglich, verschiedene TSE-Stämme zu detektieren

und auf diese Art voneinander zu differenzieren. Bei diesem sog. epitope mapping wurde ext-

razelluläres PrPSc, welches als vollständiges Protein vorlag (JEFFREY et al. 1998), durch

andere Antikörper detektiert als beispielsweise intrazelluläres PrPSc, welches je nach TSE-

Stamm und zellabhängig unterschiedlich stark einer partiellen Proteolyse ausgesetzt war. Auf

diese Art war es möglich, natürliche ovine Scrapie-Fälle von oviner BSE und dem experimen-

tellen mauspassagierten Scrapie-Stamm SSBP/1 zu unterscheiden (JEFFREY et al. 2001 a,

2003; MARTIN et al. 2005). Bei Ziegen zeigten dagegen BSE, SSBP/1 und CH1641 überra-

schend ähnliche Phänotypien. Natürlich vorkommende caprine Scrapie-Fälle wiesen eine gro-

ße Variabilität auf, weshalb auch bei Ziegen, ähnlich wie bei Schafen, die Existenz einer

Vielzahl von Scrapie-Stämmen vermutet wird (JEFFREY et al. 2006 b).

2.6 Atypische Scrapie bei Schaf und Ziege

Atypische Scrapie wurde erstmals 1998 in norwegischen Schafen nachgewiesen

(BENESTAD et al. 2003) und unterschied sich neben veränderten biochemischen und patho-

genetischen Eigenschaften von klassischer Scrapie v. a. darin, dass mit Tieren zwischen drei

bis zu sechs Jahren ältere und nur einzelne Tiere einer Herde betroffen waren. Atypische

Scrapie konnte bei Schafen bereits in einigen Ländern der Europäischen Union

(EUROPÄISCHE UNION 2008), in der Schweiz (SEUBERLICH et al. 2007) und auf den

Falklandinseln (EPSTEIN et al. 2005) nachgewiesen werden. Bei Ziegen sind u. a. Fälle in


Frankreich, Spanien, in der Schweiz und Italien bestätigt worden (EUROPÄISCHE UNION

2008). Die Inzidenz von atypischer Scrapie ist deutlich geringer als die der klassischen Form

(BENESTAD et al. 2003; GAVIER-WIDEN et al. 2004; SOFIANIDIS et al. 2008) und kli-

nisch sind v. a. Ataxien, Kachexie, Schreckhaftigkeit und ein stark reduziertes Allgemeinbe-

finden zu beobachten (BENESTAD et al. 2003, 2008; ONNASCH et al. 2004; EPSTEIN et

al. 2005; KONOLD et al. 2007). Diese Scrapie-Form wurde auffälligerweise vorrangig in für

klassische Scrapie resistenten Schafen des A136R154R171-Genotyps nachgewiesen

(BUSCHMANN et al. 2004 b; LE DUR et al. 2005; DE BOSSCHERE et al. 2007) sowie bei

Ziegen, welche auf dem Kodon 154 für Histidin kodierten und daher als resistenter gegenüber

klassischer Scrapie eingestuft wurden (BILLINIS et al. 2002; VACCARI et al. 2006;

PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007; COLUSSI et al. 2008).

Das PrPSc atypischer Scrapie-Fälle ist wesentlich empfindlicher gegen den PK-Verdau als das

PrPSc der klassischen Form (BUSCHMANN et al. 2004 b). Der Verdau erfolgt sowohl am N-

terminalen, als auch am C-terminalen Ende (KLINGEBORN et al. 2006), was sich im

Westernblot durch ein undeutliches Bandenmuster der di-, mono- und ungykosylierten PrPSc-

Banden zwischen 30 und 18 kDa (HAYASHI et al. 2005) sowie durch zusätzliche Banden bei

11-12 kDa (BENESTAD et al. 2003; GRETZSCHEL et al. 2006; ARSAC et al. 2007) oder

sieben bis acht kDa (KLINGEBORN et al. 2006; NENTWIG et al. 2007) zeigt. Immunhisto-

chemisch sind die PrPSc-Ablagerungen der atypischen Form, im Gegensatz zu denen der klas-

sischen Scrapie, nicht im DMNV des Obex zu finden (BENESTAD et al. 2008). Vielmehr

sind vorrangig die Cortices des Zerebellums und des Zerebrums betroffen, während PrPSc-

Ablagerungen in der Obexregion, wenn überhaupt, vorwiegend in der weißen Substanz und

dem #cl. tractus spinalis nervi trigemini nachweisbar sind (BENESTAD et al. 2003, 2008;

ORGE et al. 2004; NENTWIG et al. 2007; SEUBERLICH et al. 2007). Im LRS wurde PrPSc

bisher nicht nachgewiesen, was einen weiteren Unterschied zur klassischen Scrapie darstellt,

und zusätzlich die prämortale Diagnostik anhand von Biopsien des lymphoretikulären Gewe-

bes verhindert. Es wird vermutet, dass diese atypische Form ohne Beteiligung des LRS ent-

weder direkt ins Gehirn gelangt, oder die Folge einer spontan auftretenden TSE-Erkrankung

ist (BENESTAD et al. 2003, 2008; BUSCHMANN et al. 2004 b; SEUBERLICH et al. 2007).


2.7 Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie der Rinder

BSE wurde erstmals 1986 bei englischen Rindern beschrieben, welche durch Hyperästhesien,

Koordinationsstörungen im Gangbild bis hin zu zunehmend aggressivem Verhalten oder

Ängstlichkeit klinisch auffällig wurden (WELLS et al. 1987). Der für Scrapie typische Pruri-

tus konnte an BSE-kranken Rindern dagegen nicht beobachtet werden. Die Ursache für BSE

fand man in der Verfütterung von ungenügend vorbehandelten tierischen Eiweißen an Rinder

(WILESMITH et al. 1991). BSE stellt eine Zoonose dar und verursacht beim Menschen die

Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (BRUCE et al. 1997).

In experimentellen Pathogenesestudien zeigten die Rinder nach oraler Infektion und nach In-

kubationszeiten von ca. 24 Monaten erste PrPSc–Ablagerungen im ZNS (HOFFMANN et al.

2007). Eine Rolle für die frühe Phase der Pathogenese könnten dabei die PP des Ileums spie-

len, welche bereits vier Monate post inoculationem positiv getestet werden konnten

(HOFFMANN et al. 2011), aber auch in den PP des Jejunums wurde eine geringe Infektiosi-

tät nachgewiesen. Im Gegensatz zur Scrapie-Erkrankung der kleinen Wiederkäuer ist bei Rin-

dern das LRS, abgesehen von den PP des Magen-Darm-Trakts, kaum betroffen. Lediglich in

der Tonsille konnte in der frühen Phase der Pathogenese Infektiosität nachgewiesen werden

(WELLS et al. 2005; ESPINOSA et al. 2007). Der Pathogeneseweg von BSE beim Rind be-

schränkt sich somit im Wesentlichen auf neuronales Gewebe (BUSCHMANN u.

GROSCHUP 2005 a). Ausgehend von den PP des Darms wird dabei zum einen der direkte

Weg des PrPSc über sympathische und parasympathische Fasern in den Hirnstamm, und zum

anderen über postganglionäre sympathische Fasern und das Rückenmark ins Gehirn diskutiert

(HOFFMANN et al. 2007; BALKEMA-BUSCHMANN et al. 2011; KAATZ et al. 2011).

2.7.1 Die Histopathologie der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie der Rinder

Bei der bovinen BSE sind in ähnlicher Weise wie bei klassischer Scrapie einzelne oder mul-

tiple Vakuolisierungen der neuronalen Perikarya und spongiforme Veränderungen im Neuro-

pil der grauen Substanz ausgeprägt, wobei letztere häufiger zu sehen sind (WELLS et al.

1989). Eine reaktive Aktivierung der Gliazellen tritt ebenfalls auf, wobei v. a. die Astrozyten

betroffen sind (WELLS et al. 1987). Im Unterschied zu Scrapie sind die vakuolären Verände-

rungen am intensivsten im #cl. tractus solitarii und #cl. tractus spinalis n. trigemini der

Obexregion (Stammhirn) ausgeprägt, der DMNV ist vergleichsweise weniger stark betroffen


(WELLS et al. 1989). Das Läsionsprofil von BSE beim Rind ist, wie durch die Untersuchung

von hunderten BSE-Fällen festgestellt wurde, unabhängig von der Rasse des Rindes, der Ap-

plikationsart und Dosierung der infektiösen Substanz oder vom PRNP-Genotyp und weitge-

hend einheitlich (SIMMONS et al. 1996). In diesem Punkt unterscheidet sich die BSE des

Rindes deutlich von Scrapie und scheint lediglich einem einzigen Stamm anzugehören.

2.8 Die atypische Bovine Spongiforme Enzephalopathie der Rinder

Lange Zeit wurde BSE einem einzigen stabilen Stamm zugeordnet, da es seine konstanten

Eigenschaften auch nach der Übertragung auf andere Spezies beibehielt (COLLINGE et al.

1996; BRUCE et al. 1997; HILL et al. 1997; STACK et al. 2002). Im Jahr 2004 traten jedoch

sog. atypische BSE-Fälle bei italienischen und französischen Rindern auf. Die proteinbio-

chemischen Eigenschaften des PrPSc dieser BSE-Fälle unterschieden sich stark von dem der

klassischen BSE-Form (BIACABE et al. 2004; CASALONE et al. 2004). Bei einer der atypi-

schen BSE-Formen dominierte nach dem PK-Verdau die monoglykosylierte Form des PrPSc

im Glykosylierungsmuster und die molekulare Masse der unglykosylierten Form war wesent-

lich kleiner als bei klassischer BSE beschrieben. Dieser Typ wurde als L-Typ („low“) be-

zeichnet. Vergleichbar mit der sporadischen CJK des Menschen, zeigten Rinder, die am L-

Typ erkrankten, Plaques im ZNS und das PrPSc dieser Form der atypischen BSE wies ähnli-

che biochemische Eigenschaften auf wie das PrPSc der sporadischen CJK. Ein Zusammenhang

zwischen beiden Erkrankungen blieb aber ungeklärt (CASALONE et al. 2004). Eine zweite

atypische BSE-Form zeigte das Glykosylierungsmuster von klassischer BSE mit einer über-

repräsentierten diglykosylierten Form des PrPSc und wies eine wesentlich größere molekulare

Masse der unglykosylierten Form auf als klassische BSE, weshalb dieser Typ als H-Typ

(„high“) bezeichnet wurde. Das histopathologische Bild der atypischen BSE wich ebenso vom

bekannten Muster der klassischen BSE ab wie die Verteilung von immunhistochemisch nach-

gewiesenen PrPSc–Ablagerungen. So war der Hirnstamm (inkl. DMNV) auffallend wenig

betroffen. Atypische BSE wurde bisher v. a. bei älteren Rindern u. a. in Frankreich, Italien,

Deutschland und Polen nachgewiesen (BIACABE et al. 2004; CASALONE et al. 2004;

POLAK et al. 2004; BUSCHMANN et al. 2006).

2.9 Die Bovine Spongiforme Enzephalopathie bei Schaf und Ziege

Nach dem Auftreten von klassischer BSE in Rindern gelang recht früh die experimentelle


Übertragung von BSE auf Schaf und Ziege (FOSTER et al. 1993), weshalb das Vorkommen

natürlicher BSE-Fälle bei diesen Tierarten schon zu diesem Zeitpunkt vorhersehbar war. Im

Jahr 2005 wurde schließlich durch ELOIT et al. der erste natürlich vorkommenden BSE-Fall

in einer französischen Ziege beschrieben, und im Rahmen retrospektiver Untersuchungen

älterer TSE-Fälle konnte eine zweite Ziege aus Schottland BSE-positiv getestet werden

(EUROPEAN FOOD SAFETY AGENCY 2009). Bei Schafen konnte bis heute kein natürlich

vorkommender BSE-Fall bestätigt werden.

Nach experimenteller Infektion von Schafen mit BSE zeigten diese nach Inkubationszeiten,

die zwischen ca. 500 und 2000 Tagen betragen konnten, Pruritus und u. a. Tremor sowie Ata-

xien mit einem stark progressiven Verlauf, was zu einem sich verschlechternden Allgemein-

zustand und zu einem mitunter raschen Versterben der Tiere über Nacht führte (FOSTER et

al. 2001; JEFFREY et al. 2001 c; BELLWORTHY et al. 2005 b; KONOLD et al. 2008 a).

Die Krankheitsdauer variierte stark zwischen einem und 94 Tagen (HOUSTON et al. 2003).

Wie bereits für Scrapie beschrieben, konnte auch bei der BSE-Infektion ein Einfluss des

PRNP-Genotyps festgestellt werden. So ist der A136R154R171-Genotyp auch bei BSE mit er-

höhter Resistenz assoziiert (BAYLIS et al. 2002; HOUSTON et al. 2003). Nach oraler Infek-

tion konnte PrPSc, abgesehen von den PP des Magen-Darm-Trakts, u. a. in der Milz und in

zahlreichen Lymphknoten wie dem Ln. retroph. und in der Tonsille nachgewiesen werden,

was dem Verteilungsbild von Scrapie beim Schaf entspricht (BELLWORTHY et al. 2005 b;

VAN KEULEN et al. 2008). Die Übertragung auf Schaflämmer gelang nach oraler Inokulati-

on der Muttertiere und unter weitgehend natürlicher Haltung der Tiere. Es bleibt aber abzu-

klären, auf welchem Weg dabei die Ansteckung erfolgte (BELLWORTHY et al. 2005 a). Die

Übertragung von BSE durch Blut infizierter Schafe konnte zudem durch HOUSTON et al.

(2000) und HUNTER et al. (2002) gezeigt werden.

Ziegen, welche bei experimentellen Untersuchungen oral mit BSE infiziert wurden, erkrank-

ten nach Inkubationszeiten zwischen 941 und 1501 Tagen (FOSTER et al. 1993) und zeigten

eine Krankheitsdauer von sechs Tagen bis zu drei Wochen (FOSTER et al. 2001). Nach intra-

zerebraler oder subkutaner Infektion wurde eine Krankheitsdauer von sieben bis zu 60 Tagen

beschrieben. Klinisch wiesen diese Ziegen vorwiegend Ataxien, Lethargie und zunehmenden

Gewichtsverlust auf sowie einen vergleichsweise gering ausgeprägten Pruritus. Die vertikale

Übertragung von BSE war weder durch Embryotransfer, noch durch den Paarungsakt auf das


männliche Tier oder intrauterin auf die Lämmer möglich (FOSTER et al. 1993, 1999, 2001).

2.10 Die Diagnostik von Boviner Spongiformer Enzephalopathie und Scrapie

Die Diagnostik von BSE und Scrapie erfolgt in der Europäischen Union (EU) auf Grundlage

der Verordnung (EG) 999/2001. Nach einer Häufung von BSE-Fällen bei Rindern im Verei-

nigten Königreich in den Jahren 1992/93 erreichten die Fallzahlen in den Jahren 2001/02 in

Deutschland und in den anderen EU-Mitgliedsstaaten einen Höhepunkt. Die im Rahmen der

Verordnung (EG) 999/2001 ergriffenen Maßnahmen zur Bekämpfung der BSE, die vorrangig

das Verbot der Verfütterung tierischen Eiweißes an Säugetiere, die Definition und Entfernung

spezifizierter Risikomaterialien sowie großflächige BSE-Schnelltestuntersuchungen beinhal-

teten, ließen in den darauf folgenden Jahren die Anzahl von BSE-Fällen kontinuierlich sinken,

so dass seit Anfang 2009 in Deutschland und 14 weiteren EU-Mitgliedsstaaten das Testalter

für Schlachtrinder und Risikotiere (gefallenen und not- bzw. krank geschlachtete Rinder) von

30 Monaten auf 48 Monate angehoben werden konnte. Aktuell sanken die BSE-Fallzahlen in

Deutschland auf zwei BSE-Fälle im Jahr 2009, und im Jahr 2010 konnte kein einziger Fall

nachgewiesen werden. Eine weitere Anhebung des Testalters für Schlachtrinder, die in aus-

gewählten EU-Ländern geboren worden sind, auf 72 Monate erfolgte schließlich im Juli 2011

(BSE-Untersuchungsverordnung 2002). Von Schafen und Ziegen müssen seit 2002 in den

EU-Mitgliedsstaate alle über 18 Monate alten Tiere stichprobenartig mittels TSE-Schnelltest

untersucht werden, um die Inzidenzen von TSE-Erkrankungen bei kleinen Wiederkäuern ab-

schätzen zu können. Für die Untersuchung auf das PrPSc der BSE bzw. Scrapie mittels

Schnelltests, wird aus dem Bereich des Obex und zusätzlich für die Detektion etwaiger atypi-

scher Fälle aus dem Zerebellum entnommenes Probenmaterial verwendet (GROSCHUP u.

STOLZE 2002; BUSCHMANN et al. 2004 c; BUSCHMANN u. GROSCHUP 2005 b). Für

die Schnelltestung in den staatlichen und privaten Labors sind dafür zur Zeit (Stand Januar

2011) für BSE neun bzw. für Scrapie drei Schnelltests zugelassen (Verordnung (EU)

956/2010), deren reaktive Ergebnisse zur abschließenden Bestätigung an das Nationale Refe-

renzlabor (NRL) für Transmissible Spongiforme Enzephalopathien am Friedrich-Loeffler-

Institut (FLI) auf der Insel Riems gesendet werden. Dort erfolgt die weitere diagnostische

Abklärung mittels von der Office International des Epizooties (O.I.E.) zugelassener Bestäti-

gungstests (ANONYM 2009, 2010). Als bestätigende Methoden gelten histopathologische

und immunhistochemische Untersuchungen, der Immunoblot, der Nachweis charakteristi-


scher Fibrillen mittels Elektronenmikroskopie sowie für BSE ein weiterer TSE-Schnelltest.

Werden TSE-Fälle von Schafen und Ziegen bestätigt, so muss zum einen von allen positiv

getesteten Schafen der Genotyp des Prion-Proteins bestimmt werden, und zum anderen seit

Januar 2005 bei allen klassischen TSE-Fällen ein differentialdiagnostischer Test zur Unter-

scheidung von BSE und Scrapie durchgeführt werden (Verordnung (EG) 36/2005).

In Deutschland findet sich eine vergleichsweise geringe Scrapie-Inzidenz bei Schafen, auch

wenn die Zahl der Scrapie-Fälle und v. a. der atypischen Scrapie-Fälle mit der Intensivierung

der Überwachung ab 2002 deutlich angestiegen sind. Es konnte in der BRD bis zum heutigen

Tage kein Scrapie-Fall bei einer Ziege nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu stellt das

Vorkommen von Scrapie bei Ziegen in anderen europäischen Ländern ein wesentlich größeres

Problem dar (s. Abb. 4).

Abb. 4 Scrapiefälle (cases) bei Ziegen von 2002 bis 2007 in den 27 Mitgliedstaaten der Europäi-schen Union sowie Island, der Schweiz und Norwegen (Zitat aus VACCARI et al. 2009).


2.11 Zusammenfassende Darstellung

In Tab. 3 sind die wichtigsten Informationen des Literaturteils zu den TSEn von Rind, Schaf

und Ziege in Kurzform aufgelistet.

Tab. 3 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien von Schaf, Ziege und Rind mit Angaben zur Klinik, Pathogenese und zu den betroffenen Gebieten im zentralen Nervensystem

Tierart Form Klinik Genotyp- abhängig

Pathogenese Diagnostik (Kerngebiet)

Scrapie

klassisch Pruritus, Ataxien, chronische Auszehrung4

ja26

LRS, GALT, PNS/ENS, ZNS23, Milch27, Plazen-ta24,Blut12

Obex (DMNV)1 Schaf

atypisch Ataxien, chronische Auszehrung3,17,14

o. A. ZNS3 Obex, Zerebellum1

klassisch Pruritus, Ataxien, Aggressivität, Schwer-melken4,10,22

ja8 LRS, GALT, ENS, ZNS9,19

Obex (DMNV)1 Ziege

atypisch Ataxien16 o. A. ZNS18 Obex, Zerebellum1

Bovine Spongiforme Enzephalopathie

Schaf klassisch Pruritus, Ataxien2,6,13,15 ja7 LRS, GALT, ZNS2,20, Blut11,12

Obex1

Ziege klassisch Pruritus, Ataxien, chro-nische Auszehrung5,6

ja8 ZNS5,6 Obex1

klassisch Ataxien, Hypersensibili-tät, Aggressivität21

o. A. Tonsille, GALT, ZNS, PNS/ENS28

Obex (Ncl. tr. sp. n. trig., Ncl. tr. sol.)1 Rind

atypisch o. A. o. A. ZNS25 Obex1

LRS = Lymphoretikuläres System, GALT = gut-associated lymphatic tissue, ENS/PNS = enterisches/peripheres Nervensystem, ZNS = zentrales Nervensystem, Ncl. tr. sp. n. trig. = Nucleus tractus spinalis nervi trigemini, Ncl. tr. sol. = Nucleus tractus solitarii, DMNV = Nucleus parasympathicus nervi vagi, o. A. = ohne Angabe 1 ANONYM 2009, 2010 9 GONZÁLEZ et al. 2009, 2010 a 17 ONNASCH et al. 2004 2 BELLWORTHY et al. 2005 b 10 HOURRIGAN et al. 1969 18 SEUBERLICH et al. 2007 3 BENESTAD et al. 2003 11 HOUSTON et

al. 2000 19 VALDEZ et al. 2003

4 CAPUCCHIO et al. 2001 12 HUNTER et al. 2002 20 VAN KEULEN et al. 2008 5 FOSTER et al. 1993 13 JEFFREY et al. 2001 c 21 WELLS et al. 1987 6 FOSTER et al. 2001 14 KONOLD et al. 2007 22 WOOD et al. 1992 7 GOLDMANN et al. 1994 15 KONOLD et al. 2008 a 8 GOLDMANN et al. 1996 16 NENTWIG et al. 2007

23 ANDREOLETTI et al. 2000, VAN KEULEN et al. 2000, 2002, RYDER et al. 2009 24 ANDREOLETTI et al. 2002, TUO et al. 2002 25 BIACABE et al. 2004, CASALONE et al. 2004 26 DICKINSON u. OUTRAM et al. 1988, GOLDMANN et al. 1991, BELT et al. 1995 27 LACROUX et al. 2008, MADDISON et al. 2009 28 WELLS et al. 2005, ESPINOSA et al. 2007, HOFFMANN et al. 2007, 2011

26 Tiere, Material und Methoden


3.1 Tiere

Für diese Arbeit wurden zum einen Damaskusziegen aus Zypern im Rahmen des europäi-

schen Scrapie-Tilgungsprogramms zur Charakterisierung europäischer Scrapiefälle und zum

anderen Ziegen einer Alpine-Saanen-Mischrasse in einer BSE-Pathogenesestudie im Rahmen

des EU-Projektes GoatBSE (FOOD-CT-2006-36353) untersucht.

3.1.1 Damaskusziegen aus Zypern

Alle untersuchten Ziegen der lokalen Damaskus-Rasse wurden im griechischen Teil Zyperns

im Rahmen des europäischen Scrapie-Tilgungsprogramms (VO (EG) 999/2001, VO (EG)

1041/2006) aus 20 Herden des Distrikts Nicosia selektiert und zur Sektion in die Pathologie

des Institute of Veterinary Services (IVS) des Ministry of Agriculture, #atural Resources and

Environment in Nicosia, Zypern gebracht. Die Arbeiten im IVS wurden von Penelope Papa-

savva-Stylianou, Pavlos Toumazos und ihren Mitarbeitern unterstützt. Die Selektion der zu

sezierenden Tiere aus den Herden erfolgte durch den Bestandstierarzt oder durch Mitarbeiter

des IVS anhand Scrapie-typischer, klinischer Merkmale wie Alopezie, Kachexie oder Ata-

xien. Die 42 sezierten Ziegen und deren anamnestischen Daten inkl. erster Schnelltestbefunde

und Angaben zum PRNP-Genotyp sind in den Tabellen Tab. 4 (S. 27) und Tab. 5 (S. 28) auf-

geführt. Alle beprobten Ziegen waren weiblichen Geschlechts und wurden entweder mit

Schafen zusammen gehalten oder standen auf Weiden, welche zuvor zur Haltung von Schafen

genutzt wurden.

3.1.1.1 Voruntersuchungen

Von allen 42 Tieren wurde anhand einer frischen Hirnstammprobe im Labor des IVS in Niko-

sia, Zypern ein BioRad TeSeE-Schnelltest, den Herstellerangaben in der Gebrauchsinformati-

on folgend, durchgeführt, um den Scrapie-Status jedes einzelnen Tieres festzustellen. Anhand

der Testergebnisse wurden 25 der sezierten Ziegen als PrPSc-reaktiv und die restlichen 17

Ziegen als PrPSc-negativ befundet. Durch Cynthia H. Panagiotidis wurden an der Aristoteles

Universität in Thessaloniki, Griechenland die Kodons 142, 146, 151, 154, 211, und 222 des

Prion-Gens jeder Ziege mittels cycle-sequencing-Verfahren, wie bei ACUTIS et al. (2006)

beschrieben, genotypisiert. Eine zusätzliche Genotypisierung einzelner Kodons erfolgte später

Tiere, Material und Methoden 27

durch die Firma Agrobiogen GmbH in Hilgertshausen mittels Pyrosequenzierung. Der über-

wiegende Teil der untersuchten Ziegen wies den sog. Wildtyp-Genotyp

I142N146R151R154R211Q222 (n=36) auf. Davon abweichend wurden bei sechs Tieren Poly-

morphismen auf den Kodons 142 (homozygot Methionin, n=1), 146 (heterozygot Asparagin-

säure, n=2; heterozygot Serin, n=1; homozygot Serin, n=1), 151 (heterozygot Histidin, n=1)

und 154 (heterozygot Histidin, n=1) sequenziert. Das Ergebnis der Genotypisierung des

PRNP aller untersuchten Ziegen ist ebenfalls in Tab. 4 und Tab. 5 (S. 28) aufgeführt.

Tab. 4 Übersicht der 25 im BioRad-Schnelltest PrPSc-reaktiv getesteten Damaskusziegen inklusive anamnestischer Daten und des Prion-Gen-Genotyps

Kodon &ummer

Schnelltest- Ergebnisse

Alter (Jahre)

Herde Ort 142 146 151 154 211 222

ZYP 3 reaktiv (1,892) 4 B Koutrafas I N R R R Q

ZYP 8 reaktiv (1,675) 4 C Yeri I N R R R Q

ZYP 9 reaktiv (1,579) 4 D Psimolofou I N R R R Q

ZYP 10 reaktiv (1,985) 3 E Dali I N R R R Q

ZYP 11 reaktiv (1,856) 4 F Deftera I N R R R Q

ZYP 12 reaktiv (2,193) 3 G Ayios Ioannis I N R R R Q

ZYP 13 reaktiv (1,992) 4 G Ayios Ioannis I N R R R Q

ZYP 14 reaktiv (1,871) 4 F Deftera I N R R R Q

ZYP 16 reaktiv (2,204) 4 H Lympia I N R R R Q



ZYP 20 reaktiv (1,961) 3 I Lympia I N R R R Q

ZYP 21 reaktiv (1,511) 5 J Lakatamia I N R R R Q

ZYP 22 reaktiv (1,151) 5 J Lakatamia I N R R R Q

ZYP 25 reaktiv (1,227) 3 K Mathiatis I N R R R Q

ZYP 26 reaktiv (1,731) 4 L Dali I N R R R Q

ZYP 27 reaktiv (1,141) 3 M Ayios Ioannis I N R R R Q



ZYP 31 reaktiv (1,255) 4 N Latsia I N R R R Q

ZYP 33 reaktiv (1,784) 2 O Deftera I N R R R Q

ZYP 34 reaktiv (1,376) 2 P Deftera I N R R R Q

ZYP 35 reaktiv (1,452) 4 P Deftera I N R R R Q

ZYP 40 reaktiv (1,069) 4 R Lympia I N R R/H R Q

ZYP 41 reaktiv (1,674) 4 O Deftera I N R R R Q BioRad-Schnelltest: Cut-Off = 0,213; H = Histidin, I = Isoleucin, N = Asparagin, Q = Glutamin, R = Arginin


Tab. 5 Übersicht der 17 im BioRad-Schnelltest PrPSc-negativ getesteten Damaskusziegen inklusive anamnestischer Daten und des Prion-Gen-Genotyps

Kodon &ummer

Schnelltest- Ergebnisse

Alter (Jahre)

Herde Ort 142 146 151 154 211 222

ZYP 2 negativ (0,017) 7 A Kokkinotrimithia I N/S R R R Q

ZYP 4 negativ (0,049) 7 A Kokkinotrimithia I S R R R Q

ZYP 6 negativ (0,014) 7 A Kokkinotrimithia I N R R R Q

ZYP 18 negativ (0,016) 4 H Lympia I N R R R Q

ZYP 23 negativ (0,011) 6 K Mathiatis I N R R R Q

ZYP 24 negativ (0,012) 2 K Mathiatis I N R R R Q

ZYP 28 negativ (0,010) 2 M Ayios Ioannis I N/D R R R Q

ZYP 32 negativ (0,018) 4 O Deftera I N R R R Q

ZYP 36 negativ (0,010) 3 Q Aglangia M N R R R Q

ZYP 37 negativ (0,010) 3 Q Aglangia I N R R R Q

ZYP 38 negativ (0,010) 3 Q Aglangia I N R R R Q

ZYP 39 negativ (0,007) 4 Q Aglangia I N/D R/H R R Q

ZYP 42 negativ (0,007) 2 S Lympia I N R R R Q



ZYP 45 negativ (0,010) 5 T Lympia I N R R R Q

ZYP 46 negativ (0,010) 4 T Lympia I N R R R Q BioRad-Schnelltest: Cut-Off = 0,213; D = Asparaginsäure, H = Histidin, I = Isoleucin, M = Methionin, N = Asparagin, Q = Glutamin, R = Arginin, S = Serin

3.1.2 Ziegen der BSE-Pathogenesestudie

Im Rahmen der „BSE-Pathogenesestudie der Ziege“ (Tierversuchsvorhaben des Landes

Mecklenburg-Vorpommern mit der Registriernummer: LVL M-V/TSD/7221.3-2.5-001/05)

wurden 39 Ziegen einer Alpine-Saanen-Mischrasse Anfang August des Jahres 2007 im BSE-

Stall des Friedrich-Loeffler-Instituts (FLI), Insel Riems in den Versuch genommen. Eine Ü-

bersicht ausgewählter anamnestischer Daten aller 39 Ziegen findet sich in Tab. 6 (S. 29). Die

Tiere wurden zwischen dem 04.01. und dem 14.02.2007 im L` Institut #ational de la Recher-

che Agronomique (L`INRA), Toulouse in Frankreich geboren. Die Kodons 142, 154, 211, 222

und 240 aller Ziegen wurden durch LABOGENA (Jouy-en-Josas, Frankreich) mittels

SNaPshot®-Technik sequenziert. Für die Versuchsherde wurden anschließend 27 kastrierte

Bocklämmer sowie 12 weibliche Ziegenlämmer ausgewählt, die drei verschiedene PRNP-

Genotypen aufwiesen, um mögliche genetische Einflüsse auf die Empfänglichkeit für BSE

untersuchen zu können.


Tab. 6 Anamnestische Daten aller Ziegen der BSE-Pathogenesestudie geordnet nach Genotypen

Labornummer PR&P-Genotyp

(Kodon 142, 154, 211, 222 und 240) Geburtsdatum Geschlecht

ZG 01 IRRQS/IRRQS 04.01.2007 weiblich ZG 14 IRRQP/IRRQS 15.01.2007 männlich ZG 17 IRRQP/IRRQP 17.01.2007 weiblich ZG 18 IRRQP/IRRQP 17.01.2007 weiblich ZG 19 IRRQP/IRRQS 18.01.2007 männlich ZG 24 IRRQS/IRRQS 22.01.2007 männlich ZG 26 IRRQP/IRRQS 22.01.2007 männlich ZG 27 IRRQP/IRRQS 23.01.2007 männlich ZG 30 IRRQP/IRRQS 30.01.2007 männlich ZG 32 IRRQP/IRRQS 30.01.2007 männlich ZG 33 IRRQP/IRRQS 30.01.2007 männlich ZG 34 IRRQP/IRRQS 07.02.2007 weiblich ZG 35 IRRQP/IRRQS 09.02.2007 männlich ZG 38 IRRQS/IRRQS 14.02.2007 männlich ZG 39 IRRQP/IRRQS 29.01.2007 männlich ZG 04 IRQQS/IRRQS 08.01.2007 männlich ZG 05 IRQQS/IRRQS 10.01.2007 weiblich ZG 06 IRQQS/IRRQS 10.01.2007 weiblich ZG 12 IRQQS/IRRQP 15.01.2007 weiblich ZG 13 IRQQS/IRRQP 15.01.2007 männlich ZG 20 IRQQS/IRRQP 21.01.2007 weiblich ZG 21 IRQQS/IRRQP 21.01.2007 männlich ZG 22 IRQQS/IRRQP 21.01.2007 männlich ZG 28 IRQQS/IRRQP 23.01.2007 männlich ZG 29 IRQQS/IRRQS 25.01.2007 männlich ZG 31 IRQQS/IRRQS 30.01.2007 männlich ZG 36 IRQQS/IRRQP 11.02.2007 männlich ZG 02 IRRKS/IRRQP 05.01.2007 männlich ZG 03 IRRKS/IRRQS 07.01.2007 männlich ZG 07 IRRKS/IRRQS 11.01.2007 weiblich ZG 08 IRRKS/IRRQS 12.01.2007 männlich ZG 09 IRRKS/IRRQP 12.01.2007 männlich ZG 10 IRRKS/IRRQS 12.01.2007 männlich ZG 11 IRRKS/IRRQS 13.01.2007 weiblich ZG 15 IRRKS/IRRQS 16.01.2007 weiblich ZG 16 IRRKS/IRRQP 17.01.2007 männlich ZG 23 IRRKS/IRRQP 22.01.2007 männlich ZG 25 IRRKS/IRRQS 22.01.2007 weiblich ZG 37 IRRKS/IRRQS 12.02.2007 männlich

PRNP = Prion-Gen, I = Isoleucin, K = Lysin, P = Prolin, Q = Glutamin, R = Arginin, S = Serin, grau markiert = Kontrolltiere

Vereinfacht wird der Genotyp nachfolgend anhand der Aminosäuren angeben, welche durch

die Kodons 142, 211 und 222 kodiert werden. Mit fünfzehn Ziegen (n=15) kodieren die meis-


ten Ziegen der Versuchsherde auf den Kodons 142, 211 bzw. 222 homozygot für die Amino-

säuren Isoleucin (I), Arginin (R) und Glutamin (Q) (I142R211Q222/IRQ). Dieser Genotyp wird

aufgrund seines häufigen Auftretens in der weltweiten Ziegenpopulation auch als so genann-

ter „Wildtyp“ bezeichnet und besitzt vermutlich die größte Empfänglichkeit für BSE. Die

beiden anderen Genotypen, von denen der eine heterozygot für Glutamin und Arginin am

Kodon 211 (I142Q211Q222/IRQ) und der andere für Glutamin und Lysin (K) auf dem Kodon

222 kodiert (I142R211K222/IRQ), besitzen dagegen vermutlich eine größere Resistenz. Von letz-

teren Genotypen wurden je zwölf Ziegen in die Herde aufgenommen.

3.2 Versuchsablauf

3.2.1 Sektion der Damaskusziegen aus Zypern

Die Ziegen wurden tierschutzgerecht narkotisiert und mit T61 euthanasiert. In der sich an-

schließenden Sektion unter S2-Bedingungen wurden von jedem Tier 56 Proben TSE-steril

entnommen (s. Tab. 26-Tab. 28, S. 135-137). Die Entnahme der Proben des Kopfbereichs

inklusive der Proben des zentralen Nervensystems (ZNS), der Magen-Darm-Trakt (MDT)-

Proben und der Proben des verbleibenden Tierkörpers fand während der Sektion jeweils

räumlich getrennt voneinander statt, um eine TSE-sterile Probenentnahme (ohne Kreuzkon-

taminationen) zu gewährleisten. Zusätzlich wurde bei der Probenentnahme selbst für jede

Probe ein Einmalbesteck verwendet, sowie ein regelmäßiger Wechsel der Einmalhandschuhe

vorgenommen. Konserviert wurde schließlich von paarig vorliegenden Proben jeweils die

Probe einer Körperseite in Formalin bzw. die der anderen Körperseite als Tiefgefrierprobe zur

Lagerung bei -70 °C. Unpaarig vorliegende Proben wurden halbiert und die beiden Hälften

jeweils auf gleiche Art konserviert.

3.2.2 Untersuchungen an Proben der Damaskusziegen

Von dem während der Sektion der Damaskusziegen gewonnenen Probenmaterial wurde eine

Auswahl an Proben des ZNS (Hirnstamm, Obexregion), des lymphoretikulären Systems

(Tonsille, Ln. retroph., 3. Augenlid, Milz), des Magen-Darm-Trakts (Rektum) und Proben zur

Überprüfung möglicher Übertragungswege (Euter, Niere, Uterus, Plazenta) im BioRad-

Schnelltest (IVS Nicosia, Zypern), in der Immunhistochemie und bzw. oder mittels protein-

biochemischer Methoden (FLI-Immunoblot, Langzeit-PK–Verdau) untersucht. Eine Übersicht


der angewendeten Methoden findet sich in Abb. 5, eine Übersicht der untersuchten Proben

gibt Tab. 7 (S. 32).

42 Damaskusziegen

Obex

positiv (n = 25) negativ (n = 17)

1. Tonsille

2. Ln. retropharyngealis medialis

3. 3. Augenlid

4. Milz

5. Rektum

BioRad- Schnelltest

Immunhistochemie

Immunhistochemie

Bei einem positiven Befund in 1.-5.

6. Euter

7. Niere

8. Uterus

9. Plazenta

Immunhistochemie

Western Immunoblot

(FLI- Test)

Stammhirn

Proteinase K- Resistenz

(48h-Langzeitverdau)

Stammhirn

(ausgewählte Tiere, n = 5)

Abb. 5 Schematische Darstellung der an den Proben der Damaskusziegen vorgenommenen Untersu-chungen (h = Stunden, n = Anzahl der Tiere, Ln. = Lymphonodus).

3.2.3 Die BSE-Pathogenesestudie

Der Ablauf der BSE-Pathogenesestudie ist in der Abb. 6 (S. 33) anhand eines Zeitstrahls dar-

gestellt. Die im Verlauf vorgenommenen Probenentnahmen, Sektionen und Zuchtereignisse

sind dort entsprechend mit Monat und Jahr vermerkt. Nähere Erläuterungen, die verschiede-

nen Zeitpunkte betreffend, folgen in den Kapiteln (Kap.) 3.2.3.1-3.2.3.10 (S. 34-40).


Tab. 7 Übersicht über die immunhistochemisch, histopathologisch und im FLI-Test untersuchten Proben der im BioRad-Schnelltest PrPSc-reaktiv (A) und PrPSc-negativ (B) getesteten Da-maskusziegen aus Zypern

Immunhistochemie/HE FLI-Test Ziege

Obex Ln.

retroph. Tons. 3.Lid Milz Rektum Euter Plaz. Uterus &iere

Hirn-stamm

A

ZYP 3 x k.P. x x x x x x x x x

ZYP 8 x x x x x x x k.P. x x x

ZYP 9 x x x x x x x x k.P. x x ZYP 10-12

x x x x x x x x x x x

ZYP 13 x x x x x x k.P. k.P. x x x

ZYP 14 x x x x x x x x x x x ZYP 16, 17, 19

x x x x x x x k.P. x x x

ZYP 20 x x x x x x x x x x x

ZYP 21 x x k.P. x x x x x x x x

ZYP 22 x k.P. x x x x k.P. k.P. k.P. x x

ZYP 25 x x x x x x x k.P. k.P. k.P. x


ZYP 27 x x x x x x x x x x x ZYP 29-31

x x x x x x x x x x x






B

ZYP 2 x x x x x x n.u. n.u. n.u. n.u. n.d.


ZYP 6 x x x x x k.P. n.u. n.u. n.u. n.u. n.d.



ZYP 24 x x k.P. x x x x k.P. x x n.d.

ZYP 28 x x x x x x n.u. n.u. n.u. n.u. n.d. ZYP 32, 36-39

x x x x x x n.u. n.u. n.u. n.u. n.d.

ZYP 42-46

x x x x x x n.u. n.u. n.u. n.u. n.d.

Ln. retroph. = Lymphonodus retropharyngealis medialis, Tons. = Tonsille, Plaz. = Plazenta, HE = Hematoxylin-Eosin-Färbung, x = untersucht, k. P. = kein Probenmaterial, n. u./n. d. = nicht unter-sucht/nicht durchgeführt

Tiere, M

aterial und Methoden

33

Abb. 6 Zeitlicher Ablauf der BSE-Pathogenesestudie.

Sektionen, &otsektionen (kurze und lange rote Balken)

Mon. p. i. = Monate post inoculationem

n = Anzahl Tiere


3.2.3.1 Tierhaltung

Die Ziegenherde des BSE-Pathogeneseversuchs wurde in den Stallungen des FLI Insel Riems

unter L3**-Bedingungen gehalten. Der Stall bot neben einem separaten Fütterungsbereich mit

Fressgattern einen Auslaufbereich und separierbare Schlafboxen. Die Aufstallung erfolgte

einstreulos, um die veterinärhygienischen Bestimmungen zur Dekontamination und Entsor-

gung zu gewährleisten. Der Fütterungsbereich und die Liegeboxen waren mittels Fußboden-

heizung, die Liegeboxen optional auch durch Deckenstrahler, beheizbar. Der Stallbereich war

klimatisch nicht von der Außenwelt abgetrennt. Temperatur, Licht sowie Belüftung entspra-

chen somit weitgehend den klimatischen externen Bedingungen. Bei extremer Witterung

konnte die Temperatur durch Deckenlüfter bzw. durch die Heizvorrichtungen dem Optimalbe-

reich der Tiere angepasst werden. Die Tiere wurden mit Heu und Heucobs gefüttert. Zeitweise

wurde Quetschhafer sowie Blattgrün diverser Laubbäume bedarfsabhängig zugefüttert. Mit

jeder Tagesration erhielten die Ziegen eine auf die Gesamtration abgestimmte Mineralfutter-

mischung. Trinkwasser und Salzlecksteine für kleine Wiederkäuer standen ad libitum zur

Verfügung.

3.2.3.2 Inokulat

Das Gehirnmaterial zur Herstellung des Inokulats wurde vom Institute for Animal Health

(IAH) in Edinburgh, Großbritannien zur Verfügung gestellt. Es stammt aus einem Gehirnpool

von drei, intrazerebral mit Rinder-BSE infizierten Ziegen des I142R211Q222/IRQ-Genotyps

(FOSTER et al. 1993, GOLDMANN et al. 1996). Aus diesem Ziegenhirnmaterial wurde am

FLI Insel Riems ein 20 %-iges Gehirnhomogenat hergestellt. Dazu wurde das Gehirnmaterial

unter TSE-sterilen Bedingungen abgewogen und mit dem entsprechenden Volumen steriler,

isotoner Kochsalzlösung in einem Douncer zu einem homogenen Inokulat verarbeitet. Die

Lagerung des Inokulats bis zum Tag der Inokulation erfolgte bei -20 °C.

3.2.3.3 Inokulation

Am 07.08.2007, die Ziegen waren zu diesem Zeitpunkt zwischen sechs bis sieben Monaten

alt, wurden 37 von 39 Ziegen mit je 1 gr. BSE-positiven caprinen Gehirnmaterials pro Tier

oral inokuliert. Das Inokulat wurde hierzu nach dem Auftauen durch mehrmaliges Aufziehen

in einer 20 ml-Spritze erneut durchmengt. Die Applikation von 5 ml des 20 %-igen Inokulats

pro Ziege erfolgte mittels einer 10 ml-Spritze seitlich über das Diastema in den hinteren Ra-


chenbereich. Mit den nachfolgenden Schluckbewegungen der Ziege war der Inokulationsvor-

gang jeweils abgeschlossen. Während des Inokulationsvorgangs und für weitere drei Tage

(Zeit einer vollständigen Darmpassage) erfolgte die Haltung der Ziegen auf Stroh, um die

Kontamination der Stallungen durch ausgeschiedenes und gegebenenfalls noch infektiöses

Inokulat so weit wie möglich einzuschränken. Anschließend wurde die Einstreu entfernt,

fachgerecht entsorgt und eine Desinfektion des Stallbereichs mit 2-molarer (M) Natronlauge

(NaOH) mit mindestens einer Stunde Einwirkzeit vorgenommen, welche nach zwei Wochen

ein weiteres Mal wiederholt wurde.

3.2.3.4 Kontrolltiere

Als Negativkontrollen dienten zwei kastrierte Böcke aus der Herde, welche den PRNP-

Genotyp I142R211Q222/IRQ aufwiesen (s. Tab. 6, S. 29). Die Böcke wurden zufällig aus den 15

Tieren des Wildtyp-Genotyps ausgewählt und dienten als Kontrolle zur Überprüfung des ho-

rizontalen Übertragungsweges. Sie wurden in der Zeit zwischen der Inokulation und den dar-

auf folgenden, wiederholten Stalldekontaminationen räumlich getrennt von dem Rest der

Herde gehalten und erst danach wieder in die Herde reintegriert.

3.2.3.5 Entnahme von Tonsillen- und Rektumbioptaten

Im Rahmen der Pathogenesestudie wurden 9, 12 sowie 20 Monate post inoculationem (Mon.

p. i.) jeweils allen Ziegen, welche sich zu diesen Zeitpunkten aktuell in der Herde befanden,

Tonsillen- und Rektumbioptate entnommen. Die Durchführung der Bioptatentnahme an Ton-

sillen, wurde bei einem Besuch (2007) in der Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen

Hochschule Hannover unter der Aufsicht von Professor Martin Ganter an Schafen trainiert

und dann im FLI, Insel Riems bei den Ziegen in gleicher Art und Weise angewendet. Die

Entnahme der Rektumbiopsien orientierte sich an den Angaben von GONZÁLEZ et al.

(2008). Bei jeder Biopsie wurden die Ziegen intravenös (i. v.) mit 10-15 mg/kg Ketamin-

hydrochlorid und intramuskulär (i. m.) mit 0,1-0,5 mg/kg Xylazinhydrochlorid narkotisiert.

Mit einem Maulgatter erfolgte dann die Öffnung der Maulhöhle, um die Tonsillen zugänglich

zu machen. Mit dem auf dem Laryngoskopgriff (Lichtquelle) montierten Einmalgebrauchs-

spatel konnte der kaudale Rachen ausgeleuchtet werden und zuerst der Entnahmebereich des

Tonsillenbioptats mit ca. 5 mg/kg 2 %-igem Lidocainhydrochlorid oberflächlich anästhesiert

werden. Die Entnahme eines circa 2 mm breiten, 3 mm langen und 2 mm hohen Bioptats er-


folgte schließlich mit einer Biopsiezange. Anschließend wurde zur Entnahme des Rektalbiop-

tats der Anus mittels eines Rektalspekulums zum einmaligen Gebrauch, welches unter Zuhil-

fenahme von Gleitgel eingeführt wurde, gespreizt. Nach der oberflächlichen Lokalanästhesie

der Entnahmestelle (s. o.) wurde die Rektalschleimhaut mit einer chirurgischen Pinzette an-

gehoben und ein ca. 5 mm breites, 8 mm langes und 3 mm hohes Bioptat ca. 1 cm kranial des

mukokutanen Übergangs mit einem Scherenschlag entnommen. Die Fixierung aller Bioptate

erfolgte umgehend nach der Entnahme in Formalin (4 %-iges neutral buffered formalin

(NBF)).

3.2.3.6 Entnahme von Blutproben

Im Rahmen der laufenden Probennahmen wurden alle vier Monate zu den Zeitpunkten 4, 8,

12, 16, 20 und 24 Mon. p. i. allen Ziegen, welche sich zu dem Entnahmezeitpunkt noch in der

Herde befanden, 200 ml Citratblut sowie 10 ml Blut zur Serumgewinnung entnommen. Die

Proben wurden nach einem etablierten Protokoll in Thrombozyten, Plasma, Erythrozyten,

Leukozyten (s. Kap. 9.5.1, S. 138) und Serum (s. Kap. 9.5.2, S. 139) fraktioniert und an-

schließend bei -70 °C konserviert. Die Untersuchung der Blutproben war nicht Gegenstand

dieser Arbeit.

3.2.3.7 &achzucht

Für die Zucht wurde im September 2008 ein hornloser, Weiße Deutsche Edelziegenbock des

Genotyps I142R211Q222 (homozygot) mit je einer Ziege der drei Genotypen (ZG 01, ZG 12 und

ZG 25) zusammen eingestallt und getrennt von der restlichen Herde gehalten. Im März des

folgenden Jahres haben die drei Muttertiere auf natürlichem Weg abgelammt und ihre Läm-

mer bis zum Absetzen im Juli 2009 gesäugt. Bei der Geburt wurden die Kotelydonen der Pla-

zenta, der Nabelstrang und die restlichen Kotelydonen-freien Fruchthüllen (Allantochorion

und Amnion) beprobt. Nach Möglichkeit wurde dabei ein Teil von jeder Probe bei -70 °C tief

gefroren und ein weiterer Teil in Formalin fixiert (s. Tab. 8, S. 37). Die Untersuchung der

Proben von Plazenta und Nabelstrang erfolgte immunhistochemisch, um die vertikale Über-

tragung von BSE bei Ziegen zu überprüfen.

Während der Laktationsphase wurde die Milch als Kolostrum täglich bzw. als Milchprobe bis

zur 20-igsten Woche post partum (p. part.) einmal wöchentlich beprobt und als Vollmilch,

bzw. nach einem etablierten Protokoll fraktioniert in Rahm, Milchzellen und entrahmte Milch


bei -70 °C tief gefroren. Die Untersuchung der Milchproben war nicht Gegenstand dieser Ar-

beit. Der Ziegenbock wurde kurz vor dem Ablammen und die Muttertiere wurden nach dem

Absetzen der Lämmer in die Herde reintegriert. Die weitere Haltung der Lämmer erfolgte in

einer separaten Gruppe getrennt von der Herde. Sowohl der Bock, als auch die Lämmer wur-

den in die laufenden Probenentnahmen von Blut und Biopsien (s. Kap. 3.2.3.5-3.2.3.6, S. 35-

36) mit einbezogen.

Tab. 8 Übersicht zu den Formalin- und Tiefgefrierproben der Nachgeburten von den Muttertieren der drei Genotypen

Vatertier (Genotyp)

Muttertier (Genotyp)

Anzahl Lämmer

Plazenta (Kotelydonen)

Nabelstrang Fruchthüllen

ZG 01 (I142R211Q222/IRQ)

2 -70 °C/NBF NBF -70 °C

ZG 12 (I142Q211Q222/IRQ)

3* -70 °C/NBF -70 °C/NBF -70 °C ZG 40

(I142R211Q222/IRQ)

ZG 25 (I142R211K222/IRQ)

3 -70 °C/NBF k. P. -70 °C

*ein totgeborenes Lamm, Genotyp = Aminosäuren der Kodons 142, 211 und 222, I = Isoleucin, K = Lysin, Q = Glutamin, R = Arginin, k. P. = kein Probenmaterial, -70 °C/NBF = Konservierung bei -70 °C bzw. in 4 %-igem ungepufferten Formalin

3.2.3.8 Sektion

Die Ziegen wurden, wie in Tab. 9 (S. 38) dargestellt, zu den verschiedenen Zeitpunkten se-

ziert, wobei jedem weiblichen Tier insgesamt 136 und jedem männlichen Tier 135 Proben aus

den Bereichen des Kopfes (inklusive Gehirn), des Rückenmarks, des Magen-Darm-Trakts und

des Tierkörpers entnommen wurden (s. Tab. 26-Tab. 28, S. 135-137). Die zu sezierenden Tie-

re wurden dazu tierschutzgerecht mittels Injektionsnarkose mit 10-15 mg/kg Ketamin-

hydrochlorid und 0,1-0,5 mg/kg Xylazinhydrochlorid i. v. anästhesiert und anschließend mit

T61 (4-6 ml pro 50 kg Körpergewicht) euthanasiert. Die sich anschließende Sektion fand un-

ter L3**-Bedingungen statt. Zur Gewährleistung der TSE-sterilen Entnahme aller Proben,

wurden die Ziegen eines Genotyps an einem Tag und nacheinander in der Sektionshalle se-

ziert. Pro Sektionstag konnten maximal drei Ziegen aufgearbeitet werden. Für jedes Tier stan-

den am Sektionstag separate Besteckkästen zur Verfügung. Nach der Dekontamination mit

2 M NaOH und im Autoklaven bei 136 °C und 3 bar Dampfdruck für 4 h wurden diese bei

nachfolgenden Sektionen nur für Ziegen des gleichen Genotyps verwendet. Im Bestecksatz

waren die Instrumente für die Entnahme der Kopfproben, der Proben des zentralen Nerven-


systems (ZNS), der Körperproben sowie für die Entnahme der Magen-Darm-Trakt-Proben

gesondert gekennzeichnet, so dass es zu keiner Kreuzkontamination durch die Bestecksätze

zwischen den verschiedenen Organsystemen kommen konnte. Des Weiteren wurde die Ent-

nahme der Kopf- und ZNS-Proben, der Magen-Darm-Trakt-Proben und der Tierkörperproben

auf jeweils räumlich voneinander getrennten Sektionstischen vorgenommen.

Tab. 9 Sektionszeitpunkte der Ziegen aus der BSE-Pathogenesestudie (geordnet nach Genotypen)

Monate p. i. Datum I142R211K222/IRQ I142Q211Q222/IRQ I142R211Q222/IRQ

ZG 16 (184 T. p. i.) -- --

ZG 23 (184 T. p. i.) -- -- 07.02.2008

ZG 37 (184 T. p. i.) -- --

-- ZG 04 (189 T. p. i.) --

-- ZG 06 (189 T. p. i.) -- 12.02.2008

-- ZG 36 (189 T. p. i.) --

-- -- ZG 26 (191 T. p. i.)

-- -- ZG 32 (191 T. p. i.)

6 Monate p. i.

14.02.2008

-- -- ZG 35 (191 T. p. i.)

9 Monate p. i. 11.05.2008 -- ZG 21 (278 T. p. i.) --

-- ZG22 (364 T. p. i.) -- 05.08.2008

-- ZG31 (364 T. p. i.) --

ZG 02 (366 T. p. i.) -- --

ZG 08 (366 T. p. i.) -- -- 07.08.2008

ZG 09 (366 T. p. i.) -- --

-- -- ZG 19 (371 T. p. i.)

-- -- ZG 24 (371 T. p. i.)

12 Monate p. i.

12.08.2008

-- -- ZG 30 (371 T. p. i.)

14 Monate p. i. 27.10.2008 -- -- ZG 271 (447 T. p. i.)

14.08.2009 ZG 10 (738 T. p. i.) -- --

19.08.2009 -- ZG 13 (743 T. p. i.) ZG 33 (743 T. p. i.) 24 Monate p. i.

29.08.2009 -- -- ZG 01* (753 T. p. i.)

-- -- ZG 34* (765 T. p. i.) 10.09.2009

-- -- ZG 38* (765 T. p. i.) 25 Monate p. i.

30.09.2009 -- -- ZG 39 (785 T. p. i.)

*Das Tier musste aufgrund von tierschutzrelevanten, klinischen Anzeichen seziert werden. 1Das Tier musste außerplanmäßig aufgrund anderweitiger Erkrankungen notseziert werden. (T.) p. i. = (Tage) post inoculationem, I = Isoleucin, K = Lysin, Q = Glutamin, R = Arginin, grau markiert = Kontrolltier

Von jedem Tier wurden, soweit sie bilateral vorhanden waren, die Proben von der linken


Körperseite für die Tiefgefrierlagerung bei -70 °C entnommen und die Proben der rechten

Körperseite in Formalin (4 %-iges NBF) konserviert. Unpaariges Probenmaterial wurde nach

der Entnahme halbiert und je zur Hälfte tief gefroren bzw. in Formalin (4 %-iges NBF) kon-

serviert. Die Formalinproben wurden mit Hilfe des Sektionsbestecks entnommen. Die Ent-

nahme der einzelnen Tiefgefrierproben erfolgte unter Verwendung von Einmalskalpellen und

Einmalpinzetten sowie unter Verwendung von verschließbaren Petrischalen für den einmali-

gen Gebrauch. Während der Sektion wurden, soweit zur Einhaltung der TSE-Sterilität not-

wendig, regelmäßig die Einmalhandschuhe und weitere Gebrauchsmaterialien gewechselt.

Wurden an einem Tag mehrere Ziegen seziert, so erfolgte, nach Abschluss der Sektion einer

Ziege und vor Beginn der Sektion der folgenden Ziege, eine Zwischenreinigung der Oberflä-

chen der Tische mit heißem Leitungswasser und die Abdeckung der Oberflächen mit frischer

Einmalfolie. Für das folgende Tier wurden dann separate Besteckkästen und Probenentnah-

meutensilien verwendet. Nach Beendigung eines Sektionstags wurde die gesamte Sektions-

halle, nach einer ersten gründlichen Reinigung mit heißem Leitungswasser, mit 2 M NaOH

für eine Stunde dekontaminiert und die Besteckkästen inkl. aller Instrumente wurden nach der

einstündigen Dekontamination mit 2 M NaOH zusätzlich noch bei 136 °C und 3 bar Dampf-

druck für 4 h autoklaviert.

3.2.3.9 Untersuchung des in den Sektionen entnommenen Probenmaterials

Von dem in den Sektionen gewonnenen Probenmaterial wurden der Obex und das Rücken-

mark des siebten Thorakalwirbels aus dem Probenmaterial des zentralen, und das Ganglion

(Ggl.) coeliacum aus dem Probenmaterial des peripheren Nervensystems, für die weiteren

Untersuchungen ausgewählt. Bei der Probe des Ggl. coeliacum konnte aufgrund der anatomi-

schen Nähe beider Ganglien nicht zwischen dem Ggl. coeliacum und dem Ggl. mesentericum

craniale unterschieden werden. Letzteres wurde somit immer in die Auswertung mit einbezo-

gen und ist nicht gesondert aufgeführt. Als repräsentative Proben des lymphoretikulären Sys-

tems dienten der Ln. retropharyngealis medialis, die Tonsille und von den früh sezierten Tie-

ren auch die kaudalen Lnn. jejunales. Von den Proben des Magen-Darm-Trakts wurden die

ilealen Peyer` Platten sowie der Ileozäkaleingang ausgewählt. Die ausgewählten Proben (s.

Abb. 7, S. 40) wurden immunhistochemisch auf PrPSc-Ablagerungen sowie auf histopatholo-

gische Veränderungen untersucht.


Obex

Th7

Ggl. coeliacum

IleozäkaleingangIleale Peyer` Platte

Tonsille

Ln. retroph. med.

Lnn. jejunales

Abb. 7 Schematische Darstellung der Entnahmeorte von Proben des zentralen (orange) und periphe-ren Nervensystems (blau), des lymphoretikulären Systems (gelb) und des Magen-Darm-Trakts (grün) für die immunhistochemische/histopathologische Untersuchung, Ln./Lnn. = Lymphonodus/i, retroph. med. = retropharyngealis medialis, Ggl. = Ganglion, Th7 = Rük-kenmark auf Höhe des siebten Thorakalwirbels

3.2.3.10 Schnelltestdiagnostik

Die Untersuchung aller sezierter Ziegen aus dem BSE-Pathogeneseversuch im IDEXX Herd

Chek-Schnelltest wurde im Rahmen der laufenden TSE-Diagnostik am Institut für Neue und

Neuartige Tierseuchenerreger des Friedrich-Loeffler-Instituts, Insel Riems gemäß den Her-

stellerangaben durchgeführt. Die Absicherung der Schnelltest-Ergebnisse erfolgte dabei stets

durch die Untersuchung der Proben in der Immunhistochemie sowie im Immunoblot nach

Aufkonzentrierung des PrPSc mittels Phosphorwolframsäurefällung (s. Kap. 3.3, S. 40 und

Kap. 3.4, S. 44).

3.3 Histologische Methoden

3.3.1 Herstellung der histologischen Präparate

Die bei den Sektionen entnommenen Gewebeproben wurden für mindestens zwei Wochen in

einer 4 %-igen, neutral gepufferten Formalinlösung (NBF) fixiert. Um die Untersuchung einer


größtmöglichen Probenmenge zu gewährleisten, wurde nach dem Zuschneiden der Proben die

maximal mögliche Menge an Probengewebe in die Einbettkassetten gefüllt. Zur Dekontami-

nierung der Gewebeoberflächen wurden die Einbettkassetten für eine Stunde in 98 %-iger

Ameisensäure belassen und anschließend für 40 min unter fließendem kaltem Leitungswasser

neutralisiert. Danach erfolgte die Einbettung der Proben im Gewebeinfiltrationsautomaten

(ASP 300, Fa. Leica) nach dem Standardprotokoll (s. Kap. 9.2.1, S. 133) über Nacht und in

Paraffinblöckchen. Von den zu untersuchenden Blöckchen wurden schließlich an einem Rota-

tionsmikrotom 3 µm dicke Schnitte angefertigt, die in einem Wasserbad auf Objektträger ge-

zogen wurden und nach der Glättung in einem ca. 45-50 °C warmen Streckbad für zwei Tage

bei 60 °C in einem Wärmeschrank an die Objektträgeroberfläche antrockneten. Für Schnitte

zur Hämatoxylin-Eosin (H.-E.)-Färbung wurden Superfrost-Objektträger verwendet. Die

Schnitte, die für immunhistochemische Färbungen vorgesehen waren, wurden auf haftungsbe-

ständigere Superfrost Plus-Objektträger gezogen, um der stärkeren mechanischen Beanspru-

chung des Gewebes bei diesem Verfahren gerecht zu werden.

3.3.1.1 Die serielle Schnitttechnik

Von den Blöckchen aller untersuchten Proben wurden standardmäßig mittels serieller Schnitt-

technik die Gewebeschnitte von drei Ebenen gewonnen und anschließend entsprechend ge-

färbt. Das Verfahren ist schematisch in Abb. 8 (S. 42) dargestellt und zeigt, dass nach dem

Schneiden von fünf 3 µm-Schnitten der ersten Ebene, die nächsten zehn 3 µm-Schnitte ver-

worfen wurden, um dann in der zweiten Ebene erneut fünf 3 µm-Schnitte auf die Objektträger

zu ziehen. Schließlich wurden nach den nächsten zehn verworfenen 3 µm-Schnitten die letz-

ten fünf 3 µm-Schnitte der dritten Ebene gewonnen. Somit konnten in einem Abstand von 30

µm drei Zellebenen im Probengewebe untersucht werden. Bei den Bioptaten (geringe Proben-

dicke) wurden die Blöckchen lediglich in einer Ebene geschnitten. Bei ausgesuchten Proben

wurde für eine intensivere Suche nach PrPSc die Ebenenanzahl nach gleichem Muster von drei

auf fünf angehoben. Von den fünf gewonnenen Schnitten pro Ebene wurden vier für die im-

munhistochemischen Färbungen und ein Schnitt für die H.-E.-Färbung verwendet.


Schnitte der Ebene I (5 Schnitte zu je 3 µm)

Schnitte der Ebene II (5 Schnitte zu je 3 µm)

Schnitte der Ebene III (5 Schnitte zu je 3 µm)

Abschnitt wird verworfen (ca. 30 µm)


Paraffin-Gewebeblock

Schnitte der Ebene I (5 Schnitte zu je 3 µm)

Schnitte der Ebene II (5 Schnitte zu je 3 µm)

Schnitte der Ebene III (5 Schnitte zu je 3 µm)



Paraffin-Gewebeblock

Abb. 8 Schema zur seriellen Schnitttechnik der Proben für die histologische Untersuchung

3.3.2 Lichtmikroskopische Untersuchung

Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte an einem Standardmikroskop unter Verwen-

dung von 2,5-er, 10-er, 20-er und 40-er Objektiven.

3.3.3 Auswertung der mit Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitte

Die H.-E.-Schnitte (ROMEIS 1989) aller Proben wurden auf pathomorphologische Verände-

rungen untersucht. In der Obexregion wurden dabei in den unterschiedlichen Kerngebieten

nur kreisrunde optisch vollständig leere Räume als pathomorphologisch relevant bewertet,

wenn diese Veränderung mehr als nur einmal im entsprechenden Kerngebiet auftrat. Einzeln

auftretende kleine Vakuolen sowie nicht kreisrunde oder nicht vollständig optisch leere Va-

kuolen wurden als Artefakte infolge der Gewebepräparation gewertet. Für die Bewertung der

Kerngebiete wurde jeweils ein Gesichtsfeld, mit dem 10-er Objektiv des Lichtmikroskops

betrachtet, herangezogen. Bis zu fünf Vakuolen im Gesichtsfeld wurden als geringgradig, fünf

bis 10 Vakuolen als mittelgradig und mehr als 10 Vakuolen als hochgradig histopathologisch

verändert bewertet (s. Tab. 23, S. 134). Aus den Ergebnissen der einzelnen Kerngebiete wur-

de dann der Grad der spongiformen Enzephalopathie für die gesamte Obexregion ermittelt,

wobei der vorherrschende Grad morphologischer Veränderungen berücksichtigt wurde, wel-

cher in den meisten Kerngebieten festgestellt wurde.


3.3.4 Immunhistochemische Methoden

3.3.4.1 Immunhistochemische Färbungen

In den immunhistochemischen Untersuchungen wurden als Antikörper der MAK L42 (Epi-

top: 145-163 shp), der MAK 6C2 (Epitop: 114-120 bov; Jan Langeveld, Central Veterinary

Institute Wageningen UR in Lelystad, Niederlande) und der MAK F99 (Epitop: 220-225 shp)

verwendet (s. Tab. 21, S. 132). Die Verdünnung der Antikörper erfolgte Antikörper-spezifisch

(s. Tab. 21, S. 132) in 10 %-igem Ziegenserum-Tris-buffered-saline (TBS) mit 0,03 % Natri-

umazid, und für jeden Antikörper wurde nach der Entparaffinisierung und Rehydrierung der

Schnitte (s. Kap. 9.2.1, S. 133) die entsprechende Vorbehandlung des Gewebes zur Demas-

kierung der Epitope vorgenommen (s. Tab. 22, S. 133). Nach der Vorbehandlung mit Amei-

sensäure wurden die Schnitte für 5 min unter fließendem Wasser gespült und schließlich in

frisch mit Wasserstoffperoxid (3 %-ig) versetztem Methanol 30 min inkubiert. Nach diesem

und jedem weiteren Schritt der Vorbehandlung wurden die Schnitte dreimal in TBS gespült

und anschließend von der Küvette in ein Cover-Plate-System überführt, um dann 150 µl des

ersten Antikörpers aufzutragen. Nach 2 h Inkubationszeit wurden die Schnitte dreimal mit

TBS gespült und 100 µl des zweiten Antikörpers (Dako EnVision+System-HRP) wurden auf-

getragen, worauf eine 30-minütige Inkubationszeit folgte. Vor der 10-minütigen Inkubation

der Schnitte in der jeweils frisch mit Wasserstoffperoxid versetzten DAB-Lösung (30 %-ig),

wurden die Schnitte dreimal in TBS gespült und von den Cover Plates zurück in die Küvetten

überführt. Anschließend erfolgte die dreimalige Waschung der Schnitte in TBS, sowie einmal

kurz in A. bidest, und dann die Färbung für 10 min in Hämatoxylin. Unter fließendem, kaltem

Leitungswasser inkubierten die Schnitte schließlich für 15 min. Danach wurden sie entwässert

(s. Kap. 9.2.1, S. 133) und mit Entellan® im Eindeckelautomat eingedeckelt. Für jeden Schnitt

in der immunhistologischen Färbung wurde ein weiterer Schnitt der gleichen Schnittebene als

Negativkontrolle mitgeführt, welcher in der immunhistologischen Färbung anstatt mit dem

verdünnten Erstantikörper nur mit einer entsprechenden Menge an 10 %-igem Ziegenserum-

TBS mit 0,03 % Natriumazid inkubiert wurde. Als Positivreferenz diente bei jeder immunhis-

tologischen Färbung ein PrPSc–positiver Schnitt von Schaf- oder Ziegenhirn.

3.3.4.2 Auswertung der immunhistologischen Präparate

Bei der Auswertung der immunhistologischen Präparate wurden das Vorkommen, die Lokali-


sation und der Grad der PrPSc–Ablagerungen beurteilt. Soweit es möglich und für die Auswer-

tung erforderlich war, wurden die auszuwertenden Anteile des Gewebes im Schnitt ausge-

zählt. Wies ein Präparat positive Befunde auf, so wurde für das lymphoretikuläre Gewebe und

das Gewebe des enterischen Nervensystems der Anteil betroffener Follikel bzw. Ganglien an

der Gesamtzahl im Schnitt untersuchter Follikel bzw. Ganglien geschätzt (s. Tab. 24, S. 134).

Für die Auswertung der Schnitte der Obexregion wurde der Anteil des PrPSc-positiven Gewe-

bes für die gesamte Obexregion und in den verschiedenen Kerngebieten geschätzt (Tab. 25,

S. 134). Die von PrPSc–Ablagerungen betroffenen Zellen wurden nach Möglichkeit in allen

untersuchten Gewebeanteilen bestimmt. Das PrPSc stellte sich als dunkelbraunes feinkörnig

bis grobscholliges Reaktionsprodukt dar und war im Kontrollschnitt nicht nachweisbar. Es

wurde als positiv bewertet. Dagegen wurde Hämosiderin, ein eisenhaltiges Pigment, welches

sich auch im Kontrollschnitt als hellbraunes, grobkörniges Material nachweisen ließ und ho-

mogen hellbraune Färbungen, v. a. in Randbereichen und in Bereichen von Schnittartefakten,

als negativ bewertet. Ebenfalls als negativ bewertet wurden dunkelbraune bis hellbraune,

teilweise feinkörnig bis grobkörnige Färbungen v. a. von Epithelzellen der unterschiedlichen

Gewebe, welche ebenfalls in der Negativkontrolle angefärbt waren.

3.4 Proteinbiochemische Methoden

3.4.1 Herstellung von Gehirnhomogenaten

Zur Herstellung der 10 %-igen Gehirnhomogenate bei Ziege, Schaf und Rind wurden 180 mg

Gehirnmaterial aus dem Bereich der Obexregion oder alternativ aus dem Bereich der Medulla

cranialis, der Medulla caudalis, des Thalamus und des Zerebellum, in einem Ribolyser-

Röhrchen, welches mit vier Ribolyser-Stahlkugeln bestückt wurde, abgewogen und mit dem

neunfachen Volumen (w/v) an Sucrose-DOC-NP40-Lysispuffer versetzt. In einem Ribolyser

wurde das Gewebe in einen 45-sec-Zyklus bei 6500 rpm homogenisiert. Danach wurde das

Homogenat für 5 Minuten bei 17000 g zentrifugiert, um den Zelldetritus zu sedimentieren.

Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen und, sofern er nicht direkt weiter bearbeitet

wurde, bei -20 °C gelagert.

3.4.2 Fällung mit Phosphorwolframsäure

Die Fällung mit Phosphorwolframsäure (PTA-Fällung) ermöglicht die spezifische Anreiche-


rung von PrPSc. Phosphorwolframsäure bildet bei neutralem pH-Wert und in Gegenwart von

Magnesiumionen spezifische Aggregate mit dem pathologischen Prion-Protein, nicht aber mit

der physiologischen Form. Die Aggregate des PrPSc sammeln sich durch das Zentrifugieren

v. a. im Pellet, womit eine Anreicherung des PrPSc aus den Gehirnhomogenaten erreicht wird.

Von den Gehirnhomogenaten wurden im Standardprotokoll 100 µl des 10 %-igen Homoge-

nats mit 0,5 µl Benzonase (Endkonzentration 50 Units/ml) und 1,0 µl Magnesiumchlorid

(Endkonzentration 1 mM) versetzt und bei 37 °C für 30 min schüttelnd inkubiert. Anschlie-

ßend wurden die Proben mit Proteinase K bei einer Endkonzentration von 50 µg/ml und bei

55 °C eine Stunde unter Schütteln verdaut. Der PK-Verdau wurde dann durch die Zugabe von

2 µl Pefabloc® irreversibel geblockt und die Proben danach bei 95 °C für 5 min schüttelnd

denaturiert. Nachfolgend wurden die Proben mit 100 µl PBS mit 4 % Sarkosyl versetzt und

für 30 min bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Nach Zugabe von 16 µl der PTA-Stammlösung

(Endkonzentration 0,3 % PTA) erfolgte die Inkubation der Probe unter Schütteln bei 37 °C

für 1 h und anschließend wurde diese bei 17000 g für 30 min zentrifugiert. Der Überstand

wurde vorsichtig abgenommen und das Pellet vollständig in 30 µl Gel-Beladungspuffer

(2xCVL-Puffer) aufgenommen. Abweichend vom Standardprotokoll wurde bei Proben mit

starkem Signal im Westernblot das Ausgangsvolumen des Homogenats bedarfsabhängig in

Mengen zwischen 30 und 75 µl, bei Proben mit schwächerem Signal in Mengen von bis zu

200 µl eingesetzt.

3.4.3 Methanolfällung

Bei qualitativ schlechterem Probenmaterial oder beim Einsatz sehr großer Gehirnhomogenat-

volumina wurde zur Verbesserung des Laufbildes das mit der oben beschriebenen Methode

der PTA-Fällung gefällte PrPSc vor der Aufnahme in 2xCVL-Puffer zuerst in 45 µl Lysispuf-

fer aufgenommen und mit 5.0 µl Thyroglobulin versetzt und kurz gevortext. Nach Zugabe

von 500 µl Methanol (99,8 %-ig) folgte eine einstündige Lagerung bei –20 °C und anschlie-

ßend wurde das PrPSc erneut für 30 min bei 17000 g abzentrifugiert, um dann nach Abnahme

des Überstands das Pellet für 20 min im Schüttler bei 37°C zu trocknen. Nach dem Trocknen

erfolgte schließlich die Aufnahme in die entsprechende Menge 2xCVL-Puffer.


3.4.4 Proteinauftrennung mittels &atriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde das Mi-

ni-Protean II System der Firma BioRad verwendet. Es wurden 16 %-ige Polyacrylamid-

Minigele von 0,75 mm Dicke eingesetzt. Vor dem Auftragen der Proben wurden diese bei

95 °C für 5 min denaturiert. Bei Gelen, die zur Ermittlung der molekularen Masse dienen soll-

ten, wurde zweimal randständig 7 µl des Histidin-markierten FLI-Markers aufgetragen

(GROSCHUP et al. 2001). Die Proteinauftrennung erfolgte im Sammelgel bei 100 Volt (V)

und im Trenngel bei 200 V.

3.4.5 Westernblot und Immunochemie

Nach dem Auftrennen der Proteine in der SDS-Gelelektrophorese wurden diese mittels

Westernblot in einer Semi-Dry-Blotting-Apparatur auf eine PVDF-Membran übertragen. Da-

zu wurde die PVDF-Membran vollständig in Methanol gebadet und anschließend mit den

sechs Lagen Whatman-Chromatographiepapier und dem Minigel in Blottingpuffer ge-

schwenkt. Auf drei Lagen Whatman-Chromatographiepapier wurde im Semi-Dry-Blotgerät

die PVDF-Membran gelegt, auf diese das Minigel und zuoberst erneut drei Lagen Whatman-

Chromatographiepapier. Anschließend wurden die Proteine bei einer Spannung von 15 V und

einer Stromstärke von 0,3 Ampère (A) pro Minigel über 45 min geblottet. Nach dem Blotten

wurde die PVDF-Membran zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen in 10 ml 5 %-iger

Magermilch für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Die hier verwendeten primä-

ren Antikörper, wie der monoklonale Antikörper (MAK) P4 (89-104 shp) und der MAK L42

(145-163 shp), wurden in 5 %-iger Magermilch 1:2000 verdünnt, und die Membran wurde

darin 1 h inkubiert. Für die Detektion des Histidin-markierten FLI-Markers bei der Entwick-

lung der Blots mit dem MAK L42 wurde als primärer Antikörper zusätzlich ein anti-Histidin-

Antikörper in einer Verdünnung von 1:4000 verwendet. Nach dreimaligem Waschen der

Blots mit PBS-Tween für jeweils 10 min, erfolgte die einstündige Inkubation der Membran

mit dem an alkalische Phosphatase gekoppelten Sekundärantikörper (s. Kap. 9.1.1.1, S. 132),

welcher in PBS-Tween 1:2000 verdünnt wurde. Nachfolgend wurde erneut dreimal mit PBS-

Tween für jeweils 10 min gewaschen, um dann die Membran für zweimal je 2 min in Assay-

puffer zu inkubieren. Danach erfolgte die Entwicklung jeder Membran mit ca. 1,5 ml CDP-

Star für 5 min. Anschließend wurden die gut abgetropften Membranen in eine Klarsichtfolie


verpackt, um sie im VersaDoc Imaging System für 120 sec einzuscannen.

3.4.5.1 Bestimmung des Glykosylierungsverhältnisses und der molekularen Masse

Zur Bestimmung der Glykosylierungsverhältnisse wurden nach dem PK-Verdau die Anteile

des mono-, di- und unglykosylierten PrPSc am Gesamtsignal berechnet. Hierzu und zur Be-

stimmung der molekularen Masse der einzelnen Formen wurde die Quantity One Software

nach Messung im VersaDoc Imaging System verwendet. Die Grundeinstellungen am Versa-

Doc Imaging System wurden den Herstellerangaben im VersaDoc-Manual entnommen und

waren für die Messungen und Auswertungen aller Blots identisch. Vorraussetzung für die

Auswertung der Signale war, dass deren Signalstärken im linearen Messbereich des VersaDoc

Imaging System zwischen 60 000 und 200 000 counts lagen. Hierzu wurden vor den eigentli-

chen Messungen die erforderlichen Signalstärken in einem Probelauf bestimmt. Der FLI-

Marker mit Markern der Größen 23,0 kDa, 21,5 kDa, 20,3 kDa, 19,2 kDa, 18,0 kDa. 17,1 kDa

und 16,2 k Da (GROSCHUP et al. 2001) wurde für die Bestimmung der molekularen Masse

als Standardmarker festgelegt. Das Gehirnmaterial der in Tab. 4 (S. 27) aufgelisteten Scrapie-

positiv getesteten Zypernziegen, Gehirnmaterial von capriner BSE aus der Pathogenesestudie,

einer ovinen und einer bovinen BSE-Probe sowie die positive Scrapie-Probe eines Schafs

wurden zur Bestimmung der Glykosylierungsverhältnisse nach der PTA-Fällung auf vier ver-

schiedene Gele aufgetragen, welche dann nach dem Blotten mit dem MAK L42 entwickelt

wurden. Aus den Messungen dieser vier Gele wurden der Mittelwert und die Standardabwei-

chung (Microsoft Office Excel) für die Glykosylierungsverhältnisse und die molekularen

Massen ermittelt.

Die Stammhirnproben der Ziegen aus der BSE-Pathogenesestudie wurden zur Bestätigung der

Schnelltestdiagnostik nach der PTA-Fällung zunächst nur auf ein Gel aufgetragen, welches

nach dem Blotten mit dem MAK L42 entwickelt wurde. Bei einem positiven Befund, wurde

dann mit diesen Proben, wie bereits für die Zypernziegen beschrieben (s. o.), verfahren, und

es erfolgte anhand von in der Regel vier Gelläufen die Ermittlung der Glykosylierungs-

verhältnisse und der molekularen Massen.

3.4.5.2 Bestimmung der Antikörperbindungsverhältnisse

Für die in Kapitel 3.4.5.1 (s. o.) bearbeiteten Proben wurde zur Differenzierung zwischen

Scrapie und BSE außerdem das Antikörperbindungsverhältnis ermittelt. Das dabei zugrunde


liegende Prinzip basiert darauf, dass das PrPSc einer BSE-Probe von der PK weiter N-terminal

geschnitten wird als das PrPSc einer Scrapie-Probe. Während Antikörper wie der MAK L42

ihre Bindungsstelle ausreichend weit C-terminal in der „core“-Region haben (Epitop 145-163

shp), um sowohl BSE als auch Scrapie zu detektieren, kann der MAK P4 (Epitop 93-99 shp),

lediglich Scrapie erkennen, da seine Bindungsstelle bei BSE im Strukturbereich vor der

Schnittstelle der PK liegt (s. Abb. 2, S. 9). Die untersuchten Proben wurden nach der PTA-

Fällung in identischen Volumina auf vier Gele aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.

Nach dem Blotten wurden je zwei Gele mit dem MAK L42 bzw. mit dem MAK P4 entwi-

ckelt. Zur Bestimmung der Signalstärken der Probe im Westernblot am VersaDoc Imaging

System wurde in einem Scanvorgang je eine der mit MAK L42 und MAK P4 entwickelten

Blot-Membranen gemessen. Mit Hilfe der Quantity One Software erfolgte dann die Auswer-

tung und anschließend konnte aus den erhobenen Daten das Verhältnis der Signalstärke im

Westernblot vom MAK P4 zum MAK L42 aus dem gleichen Scanvorgang berechnet werden.

Als positive Referenzen wurden auf jedes Gel ein klassisches Scrapie-Isolat vom Schaf und

ein BSE-Isolat vom Rind aufgetragen. Randständig wurde beiderseits der FLI-Marker stan-

dardmäßig aufgetragen.

3.4.5.3 Der diskriminatorische FLI-Immunoblot

Der FLI-Immunoblot (FLI-Test) stellt eine Methode zur biochemischen Charakterisierung des

pathologischen Prion-Proteins von TSE-Erkrankungen unter Berücksichtigung des Glykosy-

lierungsverhältnisses und der molekularen Masse des unglykosylierten PrPSc (s. Kap. 3.4.5.1,

S. 47) sowie des MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnisses (s. Kap. 3.4.5.2,

S. 47) dar und ermöglicht es, anhand dieser Parameter Scrapie von der BSE der kleinen Wie-

derkäuer zu unterscheiden (GRETZSCHEL et al. 2005). Dem FLI-Test nach wird ein Isolat

nur dann als BSE-ähnlich eingestuft, wenn der prozentuale Anteil der diglykosylierten Form

des PrPSc am Gesamtsignal (MAK L42) größer 50 % ist, die molekulare Masse des unglyko-

sylierten PrPSc um mehr als 0,5 kDa geringer ist als die der internen Scrapie-Referenz und das

MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnis geringer als 0,4 ausfällt (s. Tab. 10, S.

49).

Mittels FLI-Test wurden die 25 in den Voruntersuchungen Scrapie-positiv getesteten Isolate

der Ziegen aus Zypern, ein ovines Scrapie-Isolat (Stdl. 171), vier caprine Isolate der BSE-


Pathogenesestudie (ZG 01, ZG 33, ZG 34, ZG 38), ein ovines (468) sowie ein bovines BSE-

Isolat (R 8/09) untersucht.

Tab. 10 Parameter für die Einstufung eines TSE-Isolats als BSE-ähnlich im FLI-Test

Ergebnis Parameter Wert

Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc am Gesamtsignal > 50 %

MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnis < 0,4 BSE-ähnlich Differenz molekularer Massen der unglykosylierten Form des PrPSc zur unglykosylierten Form des PrPSc der internen Scrapie-Referenz

∆ > 0,5 kDa

MAK = monoklonaler Antikörper

3.4.6 Langzeit-Proteinase K-Resistenz von PrPSc

Für klassisches ovines Scrapie- und bovines BSE-Material konnte bei der Inkubation von

Hirnmaterial eine geringere Resistenz des BSE-Materials gegen den Langzeit-Verdau mit PK

festgestellt werden (SWEENEY et al. 2000). Das für diese Untersuchung verwendete Pro-

benmaterial wurde aus der Obexregion des Stammhirns entnommen. Aus dem Material wur-

de, wie unter Kap. 3.4.1 (S. 44) beschrieben, ein 10 %-iges Gehirnhomogenat in Sucrose-

DOC-NP40-Lysispuffer unter Zugabe von PBS (Endkonzentration 20 mM PBS) hergestellt.

Nach dem Abzentrifugieren des Homogenats wurde der flüssige Überstand für 2-4 Ansätze je

Probe verwendet. Zu 600 µl des 10 %-igen Gehirnhomogenats pro Standardansatz wurde die-

ser nach Zugabe von Magnesiumchlorid (Endkonzentration 1 mM) und Benzonase (Endkon-

zentration 50 Units/ml) mit PK (Endkonzentration 100 µg/ml) unter Schütteln bei 55 °C ver-

daut. Nach 1 h, 6 h, 24 h und 48 h Inkubation wurden jedem Ansatz standardmäßig 150 µl

Probe entnommen und mittels einer PTA-Fällung (Protokoll s. Kap. 3.4.2, S. 44, ohne den

Denaturierungsschritt bei 95°C für 5 min) weiter aufkonzentriert. Das Pellet aus der PTA-

Fällung wurde in 45 µl 2xCVL aufgenommen und bei -20 °C gelagert. Auf jedes der bestück-

ten Gele pro Ansatz konnte dann nach der 5-minütigen Denaturierung bei 95 °C für jeden

Zeitwert ein identisches Volumen der Probe in 2xCVL (ca. 15-30 µl) aufgetragen werden. Als

positive Referenz diente auf jedem Gel ein klassisches Scrapie-Isolat. Nach SDS-Page und

Westernblot wurde die Signalstärke des PrPSc nach einer, sechs, 24 und 48 h mit der Quantity

One Software am VersaDoc-Messgerät ermittelt. Unter Festsetzung des Einstundenwertes als

100 % konnten unter Verwendung einer Excel-Kalkulationstabelle der prozentuale Anteil des


noch vorhandenen PrPSc nach 6, 24 und 48 h berechnet werden. Abweichend vom Standard-

protokoll wurde bei Proben mit schwachem Signal im Westernblot das Ausgangsvolumen des

Homogenats bedarfsabhängig bis auf 800 µl erhöht. Pro Zeitpunkt wurde der Ausgangsmenge

entsprechend dann bis zu 200 µl Homogenat zur anschließenden PTA-Fällung entnommen.

3.5 Kontrollen und Referenzmaterial

Das für die immunhistochemischen Färbungen und proteinbiochemischen Untersuchungen

verwendete Material der Positivreferenzen stammte von Fällen, welche in der Routinedia-

gnostik des Nationalen Referenzlabors (NRL) für Transmissible Spongiforme Enzephalo-

pathien des Friedrich-Loeffler-Instituts Insel Riems als Scrapie bzw. BSE positiv befundet

worden waren, bzw. von experimentell gewonnenem Positivmaterial. In der Immunhistoche-

mie wurde dabei positives Stammhirnmaterial von Schaf und Ziege verwendet, in der Prote-

inbiochemie positives Gehirnmaterial von Schaf, Ziege und Rind. Einen Überblick über die

wichtigsten Referenzproben zeigt Tab. 11. Das Material der Kontrollen stammte von Fällen,

welche in der Routinediagnostik des Nationalen Referenzlabors (NRL) für Transmissible

Spongiforme Enzephalopathien des Friedrich-Loeffler-Instituts Insel Riems ein PrPSc-

negatives Ergebnis aufwiesen.

Tab. 11 Übersicht der wichtigsten positiven Referenzen (Hirnstammmaterial) für die proteinbioche-mischen Untersuchungen

Labornummer BSE/Scrapie Tierart Herkunft/ R 8/09 bovine BSE Rind BRD, Routinediagnostik

ZG 01* caprine BSE (experimentell)

Ziege FLI-Insel Riems, BRD

ov. BSE 486* ovine BSE (experimentell)

Schaf INRA-Tours, Frankreich

Stdl. 171 ovine Scrapie Schaf Stendal, BRD, Routinediagnostik *Isolat aus oraler BSE-Pathogenesestudie, BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, BRD = Bun-desrepublik Deutschland, FLI = Friedrich-Loeffler-Institut, INRA = Institut National de la Recherche Agronomique

3.6 Statistische Analyse

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Exakten Fisher-Test unter Berücksichtigung

einer maximalen Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % (α = 5 %), d. h., untersuchte Zusammen-

hänge mit Testergebnissen (p) kleiner 0,05 (p < 0,05) wurden als statistisch signifikant gewer-

tet. Die statistischen Berechnungen erfolgten in R, Version 2.8.1 (2008).

Ergebnisse 51

4 Ergebnisse

4.1 Caprine Isolate der Ziegen aus Zypern

4.1.1 Ergebnisse der Voruntersuchungen

Die Ziegen wurden in den Herden auf Zypern nach klinischen Anzeichen wie Alopezie, Ka-

chexie oder Ataxien für die Sektion ausgesucht. Von den 42 klinisch auffälligen Tieren wie-

sen in der Schnelltestdiagnostik im Rahmen der Voruntersuchungen 25 Ziegen einen PrPSc–

reaktiven (59,5 %) und 17 einen PrPSc-negativen Befund (40,5 %) auf. Die wesentlichen Er-

gebnisse aus den Voruntersuchungen an den Damaskusziegen aus Zypern sind in Tab. 4

(S. 27) und Tab. 5 (S. 28) dargestellt. Dabei wurde gesondert auf das Alter, den Genotyp

(Kodon 142, 146, 151, 154, 211, und 222) und auf das Ergebnis des BioRad-Schnelltests so-

wie, soweit erforderlich, auf die Herkunft der Ziegen eingegangen.

4.1.1.1 Ergänzende Daten zu den Ziegen mit PrPSc-reaktivem Schnelltestbefund

Der BioRad-Schnelltest an 42 weiblichen Damaskusziegen aus Zypern ergab für 25 Ziegen

mit Ergebniswerten zwischen 1,069 bis 2,204 einen PrPSc-reaktiven Befund (Cut-Off 0,213).

Von diesen Ziegen waren 15 Ziegen (60 %) vier Jahre alt, fünf Ziegen (20 %) drei Jahre alt,

zwei Ziegen zweijährig (4 %) und die restlichen drei Ziegen fünf bis sechs Jahre alt (16 %)

(s. Abb. 9, S. 52).

Abgesehen von einem einzelnen Tier (ZYP 40) der Herde R, welches einen R/H-

Polymorphismus auf dem Kodon 154 zeigte (I142N146R151R/H154R211Q222), wiesen alle anderen

als PrPSc-reaktiv getesteten Ziegen den Wildtyp-Genotyp I142N146R151R154R211Q222 auf

(s. Tab. 12, S. 52).

4.1.1.2 Ergänzende Daten zu den Ziegen mit PrPSc-negativem Schnelltestbefund

Siebzehn Ziegen wiesen, mit Ergebniswerten zwischen 0,007 bis 0,049 im BioRad-

Schnelltest, einen PrPSc-negativen Befund (Cut-Off 0,213) auf. Zwar war auch hier mit fünf

Ziegen (28 %) die Mehrzahl der Tiere vier Jahre alt, vier Tiere waren aber dreijährig (24 %)

und je ein Tier (6 %) fünf- bzw. sechsjährig. Mit je drei Zwei- und Siebenjährigen (je 18 %)

gab es viele relativ junge bzw. wesentlich ältere Tiere (s. Abb. 9, S. 52).

Die Ziegen mit PrPSc-negativem Befund wiesen wesentlich häufiger Polymorphismen des

52 Ergebnisse

PRNP auf als die Ziegen mit PrPSc-reaktivem Befund. Von 17 Tieren zeigten fünf mindestens

einen und eines dieser Tiere sogar zwei Polymorphismen. Am Kodon 142 kodierte die Ziege

ZYP 36 homozygot für Methionin. Polymorphismen am Kodon 146, welche bisher v. a. bei

zypriotischen Ziegen berichtet wurden (PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007), traten bei

vier Ziegen auf. Davon kodierten zwei Ziegen heterozygot für Asparagin und Asparaginsäure

(ZYP 28, 39) bzw. Serin (ZYP 2) und ein Tier homozygot für Serin (ZYP 4) auf diesem Ko-

don.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

2 3 4 5 ≥ 6

Alter (in Jahren)

Anz

ahl T

iere

reaktiv

negativ

Abb. 9 Altersstruktur der Damaskusziegen aus Zypern mit PrPSc-reaktivem (n = 25 Tiere) bzw.

PrPSc-negativem Befund (n = 17 Tiere) im BioRad-Schnelltest

Tab. 12 Anamnestische Daten der Damaskusziegen aus Zypern inklusive der Polymorphismen des Prion-Gens sowie Informationen zu den Herdenmitgliedern

Herdenmitglieder Schnell-test:

positiv Tier Kodon

Polymor-phismus

Alter (Jahre)

Ort/Herde Tiere (gesamt)

Schnelltest positiv: ja/nein

ja ZYP 40 154 R/H 4 Lympia/R n=1 1/0

ZYP 2 N/S 7

ZYP 4 S/S 7 Kokkinotrimithia/A n=3 0/3

ZYP 28 2 Ayios Ioannis/M n=4 3/1 ZYP 39

146

N/D 4

ZYP 39 151 R/H 4

nein

ZYP 36 142 M/M 3

Aglangia/Q n=4 0/4

AS = Aminosäure, D = Asparaginsäure, H =Histidin, M = Methionin, N = Asparagin, R = Arginin, S = Serin, n = Anzahl Tiere

Ergebnisse 53

Die Ziege ZYP 39 wies zusätzlich am Kodon 151 einen zweiten Polymorphismus (R/H) auf.

Die Ziege ZYP 28 wies von vier untersuchten Ziegen der Herde M als einzige einen Poly-

morphismus (N/D146) auf und zeigte einen PrPSc-negativen Befund im Schnelltest (s. Tab. 12,

S. 52).

4.1.2 Biochemische Charakterisierung (FLI-Test) der caprinen Isolate aus Zypern

Im FLI-Test wurde Stammhirnmaterial der 25 im Schnelltest positiv getesteten Ziegen und im

Vergleich dazu ein caprines BSE-Isolat (ZG 01, eigene BSE-Pathogenesestudie), ein ovines

BSE-Isolat (468) und ein bovines BSE-Isolat (R 8/09) sowie ein ovines klassisches Scrapie-

Isolat (Stdl. 171) untersucht (s. Tab. 11, S. 50). Die Ergebnisse zu den Glykosylierungs-

verhältnissen, zur molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc und dem MAK

P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnis aller Proben sind in der Tab. 29 (S. 140) im An-

hang aufgeführt. Auf diese wird in den folgenden Abschnitten näher eingegangen.

4.1.2.1 Bestimmung der Glykosylierungsverhältnisse

Die Glykosylierungsverhältnisse aller untersuchten Proben sind in der Abb. 10 (S. 54) in ei-

nem Dreiecksdiagramm (Triangular diagram plotting spreadsheet, TRI-PLOT) dargestellt.

Der Anteil der diglykosylierten Form am Gesamtsignal des PrPSc war bei allen caprinen Scra-

pie-Proben und dem ovinen Scrapie-Isolat deutlich geringer als bei den BSE-Isolaten von

Ziege, Rind und Schaf. Auffälligerweise wiesen acht der 25 Proben einen Anteil von mehr als

50 % des Gesamtsignals für die diglykosylierte Form des PrPSc auf.

Das Verhältnis des diglykosylierten PrPSc zum monoglykosylierten PrPSc betrug bei boviner

BSE 61:25 %, bei oviner BSE 59:26 % und bei capriner BSE 62:25 %. Bei dem untersuchten

ovinen Scrapie-Isolat lag das Verhältnis des Signalanteils der diglykosylierten zur monogly-

kosylierten PrPSc-Bande am Gesamtsignal bei 46:30 %. Die 25 caprinen Scrapie-Isolate wie-

sen für die diglykosylierte Form des PrPSc einen Anteil zwischen 43 und 52 % auf, der Anteil

der monoglykosylierten Form des PrPSc lag dagegen zwischen 26 und 32 %.

4.1.2.2 Bestimmung der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc

Die molekulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc, welche als Mittelwert aus 4 bis 5

Gelläufen ermittelt wurde, betrug für bovines BSE 18,5 kDa, für ovines BSE 18,7 kDa und

für caprines BSE 18,8 kDa. Für das klassische ovine Scrapie-Isolat betrug sie 19,2 kDa und

54 Ergebnisse

lag, wie die 25 caprinen Zypernisolate auch, für jeden einzelnen Blot deutlich über der mole-

kularen Masse der internen bovinen BSE-Referenz. Beim Vergleich der Mittelwerte der mo-

lekularen Massen der unglykosylierten Form des PrPSc aus allen Gelläufen konnten dagegen

nicht alle caprinen Scrapie-Isolate eindeutig vom bovinen, ovinen oder caprinen BSE-Isolat

differenziert werden. Für die caprinen Scrapie-Isolate lagen die molekularen Massen zwi-

schen 18,0 und 19,4 kDa.

unglykosyliertes PrPSc (%)

60 40 2080 0

20 80

20

40

0

40

100

60

60

80

monoglykosyliertes PrP Sc (%

)digl

ykos

ylie

rtes P

rPSc

(%)

60 40 2080

Abb. 10 Vergleichende Darstellung der Glykosylierungsmuster der 25 caprinen Isolate aus Zypern ( ), des caprinen (ZG 01- ), des ovinen (486 - ) und des bovinen BSE-Isolats (R 8/07 – ) sowie des ovinen Scrapie-Isolats (Stdl. 171 - ) in einem Dreiecksdiagramm. Auf der linken Achse ist der Anteil des diglykosylierten PrPSc, auf der rechten Achse der An-teil des monoglykosylierten PrPSc und auf der unteren Achse der Anteil des unglykosylierten PrPSc am Gesamtsignal im Westernblot dargestellt. Die Scrapie-Isolate positionieren sich klar distanziert von den BSE-Isolaten, deren diglykosylierte Form des PrPSc mehr als 50 % des Gesamtsignals ausmacht.

Die molekulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc des bovinen (18,5 kDa) bzw. des

ovinen BSE-Isolats (18,7 kDa) war somit geringer als die des caprinen BSE-Isolats (18,8

kDa). Acht caprine Scrapie-Isolate zeigten ebenfalls eine geringere molekulare Masse des

unglykosylierten PrPSc (18,0 bis 18,7 kDa) im Vergleich zum caprinen BSE-Isolat und vier

Ergebnisse 55

Isolate aus Zypern wiesen eine vergleichbare molekulare Masse auf (18,8 kDa). Das ovine

Scrapie-Isolat (19,2 kDa) sowie 12 caprine Scrapie-Isolate zeigten mit Werten bis zu 19,4

kDa eine größere molekulare Masse des unglykosylierten PrPSc als das caprine BSE-Isolat.

Bei der Bildung der Differenz zwischen der molekularen Masse (MM) der unglykosylierten

Form des PrPSc der untersuchten Isolate und der molekularen Masse der unglykosylierten

Form der jeweiligen internen Scrapie-Referenz (MMProbe-MMScrapiereferenz) ergaben sich für die

verschiedenen BSE-Isolate Differenzwerte von -0,67 bis -0,56 kDa. Somit waren ausschließ-

lich die molekularen Massen des unglykosylierten PrPSc der BSE-Isolate mehr als 0,5 kDa

kleiner als die molekularen Masse der internen Scrapie-Referenz, was nach GRETZSCHEL et

al. (2005) als BSE-ähnliches Charakteristikum zu werten ist. Die Differenzwerte für die un-

tersuchten Scrapie-Isolate von Schaf und Ziege lagen zwischen -0,1 bis 0,49 kDa. Die mole-

kularen Massen des unglykosylierten PrPSc dieser Isolate waren somit nicht um mehr als

0,5 kDa kleiner als die der internen Scrapie-Referenz. Die Isolate sind folglich als Scrapie-

ähnlich einzustufen (s. Abb. 11, S. 56 u. Tab. 29, S. 140).

4.1.2.3 Bestimmung des Antikörperbindungsverhältnisses

Der Quotient aus der Signalintensität des MAK P4 und des MAK L42 (Antikörperbindungs-

verhältnis) lag für das bovine BSE-Isolat am niedrigsten bei 0,03 und für das ovine sowie das

caprine BSE-Isolat bei 0,16. Demnach wurden alle drei BSE-Isolate wesentlich schlechter

durch den MAK P4 detektiert als durch den MAK L42. Der Wert für das Antikörperbin-

dungsverhältnis des ovinen Scrapie-Isolats in Höhe von 1,43 war dagegen deutlich höher,

wobei 12 caprine Zypernisolate ebenfalls einen Wert größer 1,0 aufwiesen, bei einem Maxi-

malwert von bis zu 1,76. Dreizehn der caprinen Zypernisolate wiesen einen Wert kleiner 1

auf, wobei kein Wert unter 0,69 lag (s. Abb. 11, S. 56 u. Tab. 29, S. 140).

56

Ergebnisse

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

ZYP 3ZYP 8ZYP 9ZYP10ZYP11ZYP12ZYP13ZYP14ZYP16ZYP17ZYP19ZYP20ZYP21ZYP22ZYP25

ZYP27ZYP29ZYP30ZYP31ZYP33ZYP34ZYP35ZYP40ZYP41

ZYP26ov.

Scrapi

e

R 8/09

486

ZG 01

AE

/ kD

a

Abb. 11 Vergleich des Quotienten der Signalintensiät des P4 und des L42-Signals (Mittelwerte aus 2 Gelläufen) und des Differenzwer-tes der molekularen Masse des unglykosylierten PrPSc der Proben zur molekularen Masse des unglykosylierten PrPSc der inter-nen Scrapie-Referenzen (Mittelwerte aus 4 Gelläufen; ZYP 22 und ZYP 25 aus 5 Gelläufen) von je einem caprinen (ZG 01), ovinen (468) und bovinen BSE-Isolat (R 8/09), einem ovinen Scrapie-Isolat (Stdl. 171) und von caprinen Isolaten aus Zypern (ZYP)

Beschriftung der X-Achse:

P4-/L42-Antikörperbindungsverhältnis (arbiträre Einheiten, AE)

Differenzwerte aus den Messwerten der molekularen Masse des unglykosylierten PrPSc der jeweiligen Probe und der internen Scrapie-Referenz (in kDa)

Ergebnisse 57

4.1.2.4 Differenzierung zwischen Scrapie und Boviner spongiformer Enzephalopathie mittels FLI-Test

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die untersuchten bovinen, ovinen und caprinen BSE-

Isolate (R 8/09, 468 und ZG 01) dem FLI-Test-Kriterien von BSE entsprachen. Im Gegensatz

dazu wiesen aber die 25 Isolate der Zypernziegen und das ovine Scrapie-Isolat eindeutig

Scrapie-ähnliche Eigenschaften auf. Zwar zeigten acht der 25 Hirnstammproben einen Anteil

des diglykosylierten PrPSc von mehr als 50 %, das MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungs-

verhältnis und die Differenz der molekularen Massen des unglykosylierten PrPSc zu der mole-

kularen Masse der internen Scrapie-Referenz sprachen aber eindeutig für ein Scrapie-

ähnliches Isolat, weshalb diese acht Isolate ebenfalls als Scrapie-ähnlich eingestuft wurden.

Die acht im Glykosylierungsmuster abweichenden Scrapie-Isolate, besaßen alle denselben

Wildtyp-PRNP-Genotyp (homozygot I142N146R151R154R211Q222) und gehörten zu Herden, die

in großer räumlicher Nähe zueinander weideten. Es gab aber in den Herden der Tiere mit den

beschriebenen Abweichungen im Glykosylierungsmuster auch Ziegen, welche keine derarti-

gen Abweichungen aufwiesen (s. Tab. 13 u. Abb. 12, S. 58), und auch Ziegen aus nahe gele-

genen Herden desselben Ortes (z. Bsp. Herde F und P, s. Abb. 12, S. 58) zeigten keine Ab-

weichungen im Glykosylierungsmuster der Scrapie-Isolate.

Tab. 13 Scrapie-Isolate der Damaskusziegen aus Zypern mit einem Anteil des diglykosylierten PrPSc am Gesamtsignal von mehr als 50 % im Immunoblot (FLI-Test) und ergänzende Angaben

Labor-nummer

Anteil diglykosyliertes PrPSc (%)

PR&P-Genotyp 142, 146, 211

Ort Herde Herden-

mitglieder

ZYP 13 50,1 (±1,4) INR/INR Ayios Ioannis G ZYP 12*

ZYP 17 50,6 (±2,7) INR/INR Lympia

ZYP 19 50,1 (±4,8) INR/INR Lympia H ZYP 16* + 18

ZYP 25 50,6 (±7,1) INR/INR Mathiatis K ZYP 23 + 24

ZYP 27 51,7 (±2,7) INR/INR Ayios Ioannis



M ZYP 28

ZYP 33 50,9 (±1,9) INR/INR Deftera O ZYP 32 + 41*

I = Isoleucin, N = Asparagin, R = Arginin, (±) = Standardabweichung, *Obexregion TSE-positiv

58 Ergebnisse

Abb. 12 Standorte der Herden (A-Q) der Zypernziegen (ZYP) zueinander. Die Distanz zwischen den

Herden der Ziegen, die im Glykosylierungsmuster einen Anteil des diglykolysierten PrPSc am Gesamtsignal > 50 % (*) aufwiesen, betrug weniger als 30 km.

(BILDQUELLE: www.intercyprus.com/maps/cyprus-tourist-map.jpg)

A - Kokkinotrimitias E, L - Dali J - Lakatamia B - Koutrafas F, O*, P - Deftera *ZYP 33 K - Mathiatis *ZYP 25 C - Yeri G*, M* - Ayios Ioannis *ZYP 13, 27, 29, 30 N - Latsia D - Psimilofou H*, I, R, S, T - Lympia *ZYP 17, 19 Q – Aglanglia

4.1.3 Bestimmung der Langzeit-Proteinase K-Resistenz

Die Langzeit-PK-Resistenz wurde für die in Tab. 14 (S. 59) aufgeführten Proben bestimmt.

Das ovine und caprine BSE-Isolat dienten dabei als BSE-Referenz der kleinen Wiederkäuer.

Von den caprinen Scrapie-Isolaten wurden vier Isolate ausgewählt, welche im FLI-Test durch

einen Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc am Gesamtsignal von mehr als 50 % auffäl-

lig geworden waren. Das Isolat einer weiteren Ziege (ZYP 21) erwies sich anhand von drei

eindeutig Scrapie-ähnlichen Parametern als repräsentativ für den Großteil der caprinen Scra-

pie-Isolate. Die Auswahl sowohl von BSE-Proben als auch aus den Scrapie-Isolaten sollte

mögliche stammspezifische Unterschiede in der PK-Resistenz aufzeigen. Die caprinen Scra-

pie-Isolate zeigten über den Verlauf des PK-Langzeitverdaus eine tendenziell geringere Resis-

tenz als die caprine oder auch die ovine BSE. Ausgewählte Blots dazu zeigt Abb. 13 (S. 59).

In Abb. 14 (S. 60) ist der Verlauf des Langzeit-PK-Verdaus graphisch dargestellt. Von den

Ergebnisse 59

beiden BSE-Isolaten zu den Zeitpunkten 6 h, 24 h und 48 h waren noch ca. 75-79 %, 53-63 %

bzw. 33-39 % des PrPSc unverdaut. Die caprine BSE verhielt sich dabei etwas resistenter ge-

gen den Protease-Verdau. Bei den caprinen Scrapie-Isolaten lagen nur noch 61-72 %,

33-42 % bzw. 20-28 % des PrPSc-Materials unverdaut zu den definierten Zeitpunkten vor (s.

Tab. 30, S. 141).

Tab. 14 Übersicht der im Langzeit-Proteinase K-Resistenztest untersuchten Proben

Labornummer BSE/Scrapie Tierart Herkunft Material ZYP 13 Scrapie* Ziege Ayois Ioannis, Zypern Hirnstamm ZYP 19 Scrapie* Ziege Lympia, Zypern Hirnstamm ZYP 21 Scrapie* Ziege Lakatamia, Zypern Hirnstamm ZYP 27 Scrapie* Ziege Ayois Ioannis, Zypern Hirnstamm ZYP 30 Scrapie* Ziege Ayois Ioannis, Zypern Hirnstamm

486 ovine BSE (experimentell)

Schaf Tours, Frankreich Hirnstamm

ZG 01 caprine BSE (experimentell)

Ziege Insel Riems, BRD Hirnstamm

*klassische Scrapie, Hirnstamm = Anteile der Pons, der Medulla oblongata und der Obexregion, BSE = Bovine Spongiforme Enzephalopathie, BRD = Bundesrepublik Deutschland

caprine BSE (ZG 01)

1 h 6 h 24 h 48 h 1 h 6 h 24 h 48 h

ovine BSE (486)

1 h 6 h 24 h 48 h

caprine Scrapie (ZYP 13)

1 h 6 h 24 h 48 h

caprine Scrapie (ZYP 21)

Abb. 13 Darstellung der Stabilität von PrPSc nach Proteinase K-Verdau für 1, 6, 24 und 48 h der caprinen (ZG 01), ovinen BSE (486) und capriner Scrapie (ZYP 13, ZYP 21) im Westernblot; Antikörper: MAK L42

60 Ergebnisse

0102030405060708090

100

1 6 24 48

Zeit (in h)

%

ZG 01

486

ZYP 13

ZYP 19

ZYP 21

ZYP 27

ZYP 30

Abb. 14 Vergleichende Darstellung der Proteinase K-Resistenz des PrPSc von capriner BSE (ZG 01), oviner BSE (486) und fünf caprinen Scrapie-Isolaten (ZYP) aus Zypern. Im Diagramm wur-de der prozentuale Anteil der Signalstärke des PrPSc im Westernblot nach 6, 12 und 24 h am Gesamtsignal nach 1 h (= 100%) dargestellt. Es wurden Mittelwerte aus 4 Gelläufen ver-wendet (ZYP 21 drei Gelläufe). Auf die Darstellung des Standardfehlers wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit verzichtet.

4.1.4 Ergebnisse der histologischen Untersuchungen

Nach der Voruntersuchung von Stammhirnproben aller Zypernziegen im BioRad-Schnelltest

wurden die Obexregion sowie ausgewählte Gewebe des LRS (Ln. retroph., Tonsille, 3. Au-

genlid und Milz), des Magen-Darm-Trakts (Rektum) und des enterischen Nervensystems

(Rektum) auf histopathologische Veränderungen und immunhistologisch auf das Vorhanden-

sein von PrPSc untersucht. Von den histopathologischen Befunden werden dabei nur die Be-

funde der Obexregion ausführlich beschrieben, da diese für die Diagnose und Charakterisie-

rung der Scrapie-Erkrankung von Bedeutung sind.

4.1.4.1 Histopathologische Auswertung der Obexregion

Die immunhistochemischen und histopathologischen Untersuchungen der Obexregion aller 42

Zypernziegen ergaben für 25 Ziegen TSE-positive und für 17 Ziegen TSE-negative Ergebnis-

se. Diese Resultate bestätigten die Ergebnisse des BioRad-Schnelltests. Die pathomorphologi-

schen Veränderungen und PrPSc-Ablagerungen der 25 Scrapie-positiv getesteten Obices wur-

den in den sechs Hauptkerngebieten #cl. motorius n. hypoglossi, #cl. parasympathicus n.

vagi (DMNV), #cl. tractus solitarii, #cl. cuneatus, #cl. tractus spinalis n. trigemini und in

Ergebnisse 61

den #uclei (Ncll.) olivares näher untersucht (s. Abb. 15). Von 25 Obices waren nur 22 nach

diesem Schema auswertbar, da in einigen weiter kaudal entnommenen Hirnstammproben

nicht alle Kerngebiete entsprechend angeschnitten worden waren. Als pathomorphologische

Veränderungen traten sowohl Vakuolisierungen der Neurone (nicht in den #cll. olivares) als

auch spongiforme Veränderungen des Neuropils auf, wobei letztere insgesamt häufiger auftra-

ten. Acht Tiere zeigten eine geringgradige, neun eine mittelgradige und fünf Tiere eine hoch-

gradige spongiforme Enzephalopathie der Obexregion. Die drei nicht in den Kerngebieten

auswertbaren Tiere wiesen eine geringgradige (ZYP 21) bzw. eine hochgradige (ZYP 34 und

40) spongiforme Enzephalopathie auf.

Abb. 15 Schematische Abbildung eines Querschnitts durch den Hirnstamm auf der Ebene der Obex-region. In den Untersuchungen berücksichtigte Kerngebiete sind mit den Nummern 1 - 6 ge-kennzeichnet (nach ANONYM 2010)

1 -Nucleus motorius nervi hypoglossi 4 -Nucleus cuneatus 2 -Nucleus parasympathicus nervi vagi 5 -Nucleus tractus spinalis nervi trigemini

3 -Nucleus tractus solitarii 6 -Nuclei olivares

Tiere mit einer geringgradigen spongiformen Enzephalopathie der Obexregion (n=8) wiesen

im DMNV, #cl. tractus solitarii und dem #cl. tractus spinalis n. trigemini stets patho-

morphologische Veränderungen auf, welche in den beiden zuerst genannten Kerngebieten

vorwiegend geringgradig und in letzterem überwiegend mittelgradig ausgeprägt waren. In den

anderen drei untersuchten Kerngebieten waren diese pathomorphologischen Veränderungen

62 Ergebnisse

vorwiegend geringgradig ausgeprägt, konnten aber auch, wie v. a. für die #cll. olivares zu-

treffend (sechs von acht Tieren waren in diesem Kerngebiet ohne histopathologischen Be-

fund), vollständig fehlen.

Tiere mit einer mittelgradig ausgeprägten spongiformen Enzephalopathie der Obexregion

(n=9) wiesen ebenfalls alle pathomorphologische Veränderungen in dem DMNV, dem #cl.

tractus solitarii und dem #cl. tractus spinalis n. trigemini sowie zusätzlich auch im #cl. mo-

torius n. hypoglossi auf. Der Ausprägungsgrad der Veränderungen war vorwiegend mittelgra-

dig und nur der DMNV war überwiegend geringgradig betroffen. Der #cl. cuneatus und die

#cll. olivares waren vorwiegend mittelgradig betroffen und auch hier wiesen die #cll. oliva-

res häufig keine Veränderungen auf (sechs von neun Tieren waren in den #cll. olivares ohne

histopathologischen Befund).

Bei den Tieren mit einer hochgradigen spongiformen Enzephalopathie traten, mit Ausnahme

von den #cll. olivares, in allen Kerngebieten der Obexregion vakuoläre Veränderungen auf,

welche vorwiegend hochgradig ausgeprägt waren. In den #cll. olivares konnten dagegen nur

drei (v. a. geringgradig betroffen) von fünf Tieren positiv befundet werden. Die detaillierten

Ergebnisse der vakuolären Veränderungen der untersuchten Tiere sind in Abb. 16 (S. 63) auf-

geführt.

4.1.4.2 Immunhistochemische Auswertung der Obexregion

Immunhistochemisch waren insgesamt mittel- (10 Tiere) bzw. hochgradige (12 Tiere) diffuse

feingranuläre bis grobkörnige PrPSc-Ablagerungen mit wenigen Ausnahmen in allen sechs

untersuchten Kerngebieten der Obexregion nachweisbar. In einem wesentlich geringeren Ma-

ße gelang dagegen der PrPSc-Nachweis in der weißen Substanz der 22 Proben der Obexregion.

PrPSc konnte sowohl in den Glia- und Nervenzellen als auch extrazellulär im Neuropil nach-

gewiesen werden. Der Grad von intraneuronalen PrPSc–Ablagerungen in den Kerngebieten

dieser Ziegen konnte teilweise deutlich zwischen den verschiedenen Kerngebieten variieren.

Sie traten zu einem geringeren Grad in den Kerngebieten #cl. n. hypoglossi, DMNV und #cl.

tractus solitarii verglichen zu den anderen drei Kerngebieten auf. Ein unmittelbarer Zusam-

menhang zwischen dem Grad der PrPSc-Ablagerungen und dem Grad der pathologischen Ver-

änderungen in den betroffenen Kerngebieten war im direkten Vergleich nicht feststellbar.

Ergebnisse 63

A

Ncl.motorius n.hypoglossi

DMNV Ncl. tractussolitarii

Ncl.cuneatus

Ncl. tr.spinalis n.trigemini

Ncll. olivares

Zyp 8

Zyp 9*

Zyp 11

Zyp 17

Zyp 19

Zyp 25

Zyp 27

Zyp 31

mgr.

ggr.

hgr.

negativ

Gra

d de

r V

erän

deru

ngen

geringgradige spongiforme Enzephalopathie

B



Ncl.cuneatus


Ncll. olivares

Zyp 3

Zyp 10

Zyp 13

Zyp 14

Zyp 20

Zyp 26

Zyp 29

Zyp 30

Zyp 33

mgr.

ggr.

hgr.

negativ

Gra

d de

r V

erän

deru

ngen

mittelgradige spongiforme Enzephalopathie

C



Ncl.cuneatus


Ncll. olivares

Zyp 12

Zyp 16

Zyp 22

Zyp 35

Zyp 41mgr.

ggr.

hgr.

negativ

Gra

d de

r V

erän

deru

ngen hochgradige spongiforme Enzephalopathie

Abb. 16 Graduelle Ausprägung vakuolärer Veränderungen in den sechs Kerngebieten der Obexregion

der Damaskusziegen aus Zypern mit einer gering- (A), mittel- (B) und hochgradigen (C) spongiformen Enzephalopathie. Ncl./Ncll. = Nucleus/Nuclei, n. = nervi, tr. = tractus, DMNV = Nucleus parasympathicus nervi vagi, ggr. = geringgradig, mgr. = mittelgradig, hgr. = hochgradig. *Beurteilung des Ncl. tractus solitarii war für dieses Tier nicht möglich.

64 Ergebnisse

Die 10 Tiere mit insgesamt mittelgradigen PrPSc-Ablagerungen in der gesamten Obexregion

(s. Abb. 17, A) zeigten vorwiegend hochgradige PrPSc-Ablagerungen im DMNV. Die Kern-

gebiete #cl. tractus solitarii, #cl. tractus spinalis n. trigemini, #cl. motorius n. hypoglossi

und #cl. cuneatus waren dagegen vorwiegend mittelgradig von Ablagerungen betroffen. Die

#cll. olivares der Hälfte der untersuchten Tiere war gering-, die der anderen Hälfte mittelgra-

dig betroffen.

Die 12 Tiere mit insgesamt hochgradigen PrPSc-Ablagerungen in der Obexregion (s. Abb. 17,

B) wiesen, außer im #cl. motorius n. hypoglossi vorwiegend hochgradige Ablagerungen in

den untersuchten Kerngebieten auf. Der #cl. motorius n. hypoglossi war hingegen überwie-

gend mittelgradig betroffen.

A

Ncl. motorius n.hypoglossi


Ncl. cuneatus Ncl. tractusspinalis n.trigemini

Ncll. olivares

Zyp 9*

Zyp 19

Zyp 22

Zyp 25

Zyp 26

Zyp 27

Zyp 29

Zyp 31

Zyp 33

Zyp 41

mgr.

ggr.

hgr.

negativ

Gra

d de

r Pr

PS

c -A

blag

erun

gen

B

Ncl. motorius n.hypoglossi


Ncl. cuneatus Ncl. tractusspinalis n.trigemini

Ncll. olivares

Zyp 3

Zyp 8

Zyp 10

Zyp 11

Zyp 12

Zyp 13

Zyp 14

Zyp 16

Zyp 17

Zyp 20

Zyp 30

Zyp 35

mgr.

ggr.

hgr.

negativ

Gra

d de

r P

rPS

c -A

blag

erun

gen

Abb. 17 Graduelle Ausprägung der PrPSc-Ablagerungen in den sechs Kerngebieten der Obexregion der Damaskusziegen aus Zypern mit einem mittel- (A) bzw. hochgradigen (B) Gesamtbe-fund für die PrPSc-Ablagerungen der Obexregion. Ncl./Ncll. = Nucleus/Nuclei, n = nervi, DMNV = Nucleus parasympathicus nervi vagi, ggr. = geringgradig, mgr. = mittelgradig, hgr. = hochgradig. *Beurteilung des Ncl. tractus solitarii war für dieses Tier nicht möglich.

Ergebnisse 65

4.1.4.3 Immunhistochemische Auswertung ausgewählter Gewebe

Zusätzlich zur Obexregion erfolgte die immunhistochemische Untersuchung weiterer Körper-

proben aus unterschiedlichen Gewebeanteilen nach dem in Abb. 5 (S. 31) dargestellten Sche-

ma. Von allen 42 Zypernziegen wurden mit dem Ln. retroph., der Tonsille, dem 3. Augenlid,

der Milz und dem GALT des Rektums fünf Proben des lymphoretikulären Systems, und mit

dem Plexus submucosus und myentericus des Rektums auch das enterische Nervensystem auf

PrPSc-Ablagerungen hin untersucht. Konnten in mindestens einer dieser Proben PrPSc-

Ablagerungen detektiert werden, so wurden zur Prüfung möglicher Übertragungswege zusätz-

lich das Euter, die Niere, der Uterus und, soweit vorhanden, die Plazenta gleichermaßen im-

munhistochemisch untersucht. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der immunhistochemi-

schen Untersuchungen zeigt Tab. 15 (S. 66).

Die in der Obexregion Scrapie-positiv getesteten 25 Ziegen zeigten zumeist eine breite Betei-

ligung des lymphoretikulären Gewebes, wobei die einzelnen Gewebe überwiegend mittel- bis

hochgradig von PrPSc-Ablagerungen betroffen waren. Abgesehen von drei Ziegen (ZYP 3,

ZYP 9 und ZYP 12) traten zusätzlich PrPSc–Ablagerungen im Plexus myentericus und bzw.

oder im Plexus submucosus auf. Von diesem breiten Verteilungsmuster des PrPSc in den ver-

schiedenen Proben des LRS wich ausschließlich die Ziege ZYP 40 ab, welche neben einem

mittelgradigen positiven Befund in der Obexregion PrPSc–Ablagerungen ausschließlich im

Ln. retroph. aufwies, welche zudem nur geringgradig ausgeprägt waren. Im ENS dieses Tieres

konnte PrPSc außerdem im Plexus myentericus des Rektums (hochgradig) detektiert werden

(s. Abb. 18, S. 67), während alle anderen untersuchten Proben ohne positiven Befund blieben.

Der Ln. retroph. (23/23), die Tonsille (20/22) und die Milz (24/25) des LRS waren am häu-

figsten und überwiegend hochgradig betroffen. Es waren nur zwei von 22 auswertbaren Pro-

ben der Tonsillen (2/22) und eine von 25 Proben der Milzen (1/25) PrPSc-negativ bei gleich-

zeitig positivem Befund für den Ln. retroph.. Weniger häufig, aber vorrangig mittel- bis

hochgradig betroffen, zeigten sich das 3. Lid (18/25) und das GALT (21/24) sowie das zu-

meist geringgradig betroffene ENS des Rektums (je 22/25). Bei 11 Ziegen konnten beide Ple-

xus des ENS positiv getestet werden (11/25), 21 Ziegen (21/25) zeigten PrPSc–positive Er-

gebnisse im Plexus myentericus, und im Plexus submucosus waren es 12 von 25 Ziegen.

66 Ergebnisse

Tab. 15 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung von Gewebeproben der Damaskuszie-gen aus Zypern. Nur Tiere mit mindestens einem positiven PrPSc-Befund sind aufgeführt.

Tiere ZYP

Obex Ln.

retroph. Tonsille 3.Lid Milz

Rektum (LRS)

Rektum (ENS)

Plazenta

3 +++ k.P. +++ +++ ++ +++ negativ negativ negativ

8 +++ +++ negativ +++ + negativ + Pl.my. k.P.

9 ++ +++ +++ +++ +++ +++ negativ negativ negativ

10 +++ +++ ++ +++ + +++ + Pl.my. negativ

11 +++ + +++ negativ + negativ + Pl.my. negativ

12 +++ ++ 0 + + ++ negativ negativ negativ

13 +++ + +++ +++ +++ +++ ++ Pl.my.+sub. k.P.

14 +++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ Pl.my.+sub. negativ

16 +++ + + + + ++ + Pl.my.+sub. k.P.

17 +++ ++ +++ +++ + +++ + Pl.my. k.P.

19 ++ ++ + + +++ +++ ++ Pl.my. k.P.

20 +++ ++ +++ + ++ +++ ++ Pl.my.+sub. negativ

21 ++ + k.P. + ++ + +++ Pl.my.+sub. +

22 ++ k.P. +++ negativ + + + Pl.my. k.P.

25 ++ + +++ +++ ++ ++ ++ Pl.my.+sub. k.P.

26 ++ +++ 0 negativ + + +++ Pl.sub. +

27 ++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ Pl.my.+sub. +

29 ++ +++ + +++ +++ +++ ++ Pl.my.+sub. negativ

30 +++ ++ +++ negativ + +++ + Pl.my.+sub. negativ

31 ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ Pl.my.+sub. negativ

33 ++ +++ +++ ++ ++ +++ ++ Pl.my.+sub. k.P.

34 ++ +++ +++ +++ +++ +++ + Pl.my. k.P.

35 +++ +++ +++ negativ + + + Pl.my. negativ

40 ++ + negativ negativ negativ negativ +++ Pl.my. negativ

41 ++ ++ +++ negativ + 0 + Pl.my. k.P.

24 negativ + k.P. negativ + + negativ negativ k.P. Ln. retroph. = Lymphonodus retropharyngealis medialis, LRS = lymphoretikuläres System, ENS = enterisches Nervensystem, Pl. my. = Plexus myentericus, Pl. sub. = Plexus submucosus, k. P. = kein Probenmaterial, 0 = keine Follikel im Anschnitt, Ergebnis nicht auswertbar, + bis +++ = gering-, mit-tel- bzw. hochgradige PrPSc-Ablagerungen, grau hinterlegt = Ziege ist PrPSc-negativ im Obex

PrPSc war im LRS, unabhängig davon, wie viele Follikel betroffen waren, in Makrophagen

und Lymphozyten nachweisbar. Ein fein- bis grobkörniges Reaktionsmuster war dabei vor-

herrschend, aber auch teilweise grobschollige PrPSc–Ablagerungen konnten v. a. in den

Makrophagen nachgewiesen werden. Häufig war auch ein sog. follikulär-dendritisches Mus-

ter im LRS nachweisbar, bei dem feinkörnige PrPSc-Ablagerungen in Form eines netzartigen

Ergebnisse 67

Reaktionsmusters auftraten. Im ENS gelang der Nachweis von fein- bis grobkörnigen PrPSc-

Ablagerungen v. a. intraneuronal sowie in einem geringeren Maße auch in den Gliazellen.

Abb. 18 Befunde der Ziege ZYP 40: PrPSc-Ablagerungen in Makrophagen des Lymphonodus retropharyngealis medialis (A) und in Neuronen des Plexus myentericus des Rektums (B); Immunhistochemie MAK 6C2, 40-er Objektiv, Balken = 10 µm

In der Plazenta gelang der Nachweis von PrPSc lediglich bei drei von 15 untersuchten Ziegen

(ZYP 21, 26 und 27). Die feinkörnig bis grobscholligen PrPSc–Akkumulationen waren ge-

ringgradig ausgeprägt und intrazellulär in Trophoblastenzellen und Epithelzellen des Endo-

metriums im Bereich der plazentären Kotelydonen nachweisbar (s. Abb. 19).

M

F

M

F

E

TT

A A1

Abb. 19 Scrapie-positive Ziege ZYP 27: geringgradige, feinkörnig bis grobschollige PrPSc-Ablagerungen in Trophoblasten- ( ) und Endometriumepithelzellen ( )der plazentären Ko-telydone; A und A1 = Originalbild und 2-fache Vergrößerung des Originals, M = maternaler Anteil, F = fetaler Anteil, T = Trophoblastenzelle, E = Endometriumepithelzelle; Immun-histochemie MAK 6C2, 40-er Objektiv, Balken 10 µm

68 Ergebnisse

In anderen fetalen bzw. in den maternalen Anteilen der Plazenta oder in uterinen Strukturen

war PrPSc nicht nachweisbar. Die Tiere ZYP 21, 26 und 27 wiesen außerdem vorwiegend ge-

ring bis mittelgradige PrPSc–Ablagerungen im Obex, in den meisten der untersuchten Proben

des LRS und hochgradige PrPSc–Ablagerungen im ENS auf (s. Tab. 15, S. 66).

In den untersuchten Proben von Euter (Proben von 23 Tieren untersucht) und Niere (Proben

von 24 Tieren untersucht) der Ziegen konnten keine PrPSc–Ablagerungen detektiert werden.

Eine der 17 in der Obexregion PrPSc-negativ getesteten Ziegen (ZYP 24) zeigte geringgradige

PrPSc-Ablagerungen im Ln. retroph., der Milz und dem lymphatischen Gewebe des Rektums

(s. Abb. 20). Die PrPSc-Ablagerungen konnten in Makrophagen und Lymphozyten der Ziege

ZYP 24 detektiert werden und im Ln. retroph. zeigte sich zusätzlich ein follikulär-

dendritisches Färbemuster. Die Untersuchung der Tonsille dieses Tiers war mangels Proben-

materials nicht möglich. Im 3. Augenlid gelang der Nachweis von PrPSc ebenso wenig wie im

Euter, im Uterus oder in der Niere.

Abb. 20 ZYP 24 (Obexbefund PrPSc-negativ): feinkörnige bis grobschollige PrPSc-Ablagerungen im lymphatischen Gewebe des Lymphonodus retropharyngealis medialis (A – Ein follikulär-dendritisches Färbemuster ist netzartig zwischen den Lymphozyten und Makrophagen er-kennbar.), der Milz (B) und des Rektum (C) der Ziege; Immunhistochemie MAK 6C2, 40-er Objektiv, Balken = 20 µm

4.1.5 Statistische Betrachtung aufgetretener Polymorphismen des Prion-Gens

Von den 42 untersuchten Ziegen aus Zypern, wurden 25 Ziegen mittels Untersuchung der

Ergebnisse 69

Obexregion im Schnelltest Scrapie-positiv und 17 Ziegen Scrapie-negativ getestet. Diese Be-

funde wurden durch die proteinbiochemische und immunhistochemische Untersuchung der

Obexregion bestätigt. Bei der immunhistochemischen Untersuchung ausgewählter Gewebe

des LRS konnte bei einer Ziege mit Scrapie-negativem Befund in der Obexregion PrPSc im

Ln. retroph., in der Milz und dem lymphatischen Gewebe des Rektums nachgewiesen werden.

Demnach wiesen insgesamt 26 Ziegen in mindestens einer der untersuchten Proben einen

positiven Befund auf (Gruppe 1) und 16 Ziegen blieben Scrapie-negativ (Gruppe 2).

Von den Tieren der Gruppe 1 wies ein Tier einen Polymorphismus des PRNP auf, von den

Ziegen der zweiten Gruppe wiesen fünf Tiere mindestens einen Polymorphismus auf. Mit

dem Vergleich dieser beiden Gruppen im Exakten Fisher-Test ergab sich ein signifikanter

Unterschied für das Auftreten von Polymorphismen bei den Tieren beider Gruppen (p =

0,023). Die Ziegen mit mindestens einem Polymorphismus auf den untersuchten Kodons

(142, 146, 151, 154, 211 oder 222) wiesen demnach signifikant häufiger einen Scrapie-

negativen Befund auf, als Ziegen ohne Polymorphismen auf diesen Kodons.

Beide Gruppen wurden gezielt in Hinblick auf die jeweils an den Kodons 142, 146, 151, 154,

211 und 222 auftretenden Polymorphismen verglichen. Wegen der bereits in vorhergehenden

Studien beobachteten erhöhten Resistenz gegen Scrapie (GOLDMANN et al. 1996;

BILLINIS et al. 2002; VACCARI et al. 2006; PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007,

2010), standen diese Kodons besonders im Fokus. Die mit dem Exakten Fisher-Test errechne-

ten p-Werte für aufgetretene Polymorphismen auf den Kodons zeigt Tab. 16 (S. 70).

Auf den Kodons 211 und 222 traten keine Polymorphismen auf, die Gruppen sind somit iden-

tisch (p = 1). An den Kodons 142 und 151 trat jeweils bei einem Tier mit negativem Scrapie-

Befund und an dem Kodon 154 trat bei einem positivem Tier ein Polymorphismus auf. Die

Unterschiede für die genannten Polymorphismen beider Gruppen sind mit p-Werten von je-

weils 0,381 nicht signifikant. Für das Kodon 146, auf dem vier Tiere mit einem negativen

Scrapie-Befund einen Polymorphismus zeigten, ließ sich dagegen ein signifikanter Unter-

schied (p = 0,016) zwischen den Gruppen feststellen. Die hier untersuchten Ziegen mit einem

Polymorphismus am Kodon 146 (N/D, S/S und N/S) waren demnach signifikant häufiger

Scrapie-negativ, als Ziegen ohne Polymorphismen auf diesem Kodon.

70 Ergebnisse

Tab. 16 Vergleich der Ziegen aus Zypern mit mindestens einem positiven bzw. mit negativem Scra-pie-Befund in Hinblick auf signifikante Unterschiede (p < 0,05 im Exakten Fisher-Test) be-züglich der Häufigkeiten von Polymorphismen an den gezielt untersuchten Kodons 142, 146, 151 und 154

Kodon 142 Kodon 146 Kodon 151 Kodon 154 Scrapie-Befund

Met/Met N/D S/S N/S R/H R/H

positiv (n = 26)

1 Tier (p = 1)

1 Tier (p = 0.381)

2 Tiere (p = 0,139)

1 Tier (p = 0.381)

1 Tier (p = 0.381)

1 Tier (p = 0.381) negativ

(n = 16)

gesamt 4 Tiere*

(p = 0,016) *signifikanter Unterschied festgestellt, Met = Methionin, D = Asparaginsäure, H = Histidin, N = Asparagin, R = Arginin, S = Serin, grau hinterlegt = Leerfeld; berechnet in R, Version 2.8.1 (2008)

4.2 Pathogenesestudie Bovine Spongiforme Enzephalopathie in der Ziege

4.2.1 Untersuchung der Tonsillen- und Rektumbioptate

Die Tonsillen- und Rektumbioptate wurden von allen jeweils noch lebenden Ziegen der Herde

zu den Zeitpunkten 9 (n = 29), 12 (n = 21) und 20 Mon. p. i. (n =18) entnommen und in der

Immunhistochemie mittels MAK L42 oder MAK 6C2 untersucht (Tab. 17, S. 71). In den

Schnitten der Tonsillenbioptate konnten bis zu acht Follikel ausgewertet werden, in den Biop-

taten der Rektalschleimhaut waren es bis zu 11 Follikel. Von 68 entnommenen Tonsillenbiop-

taten waren sechs (8,8 %), von 68 entnommenen Rektumbioptaten 33 Bioptate (48,5 %) auf-

grund fehlender Follikel nicht auswertbar. In keinem der untersuchten und auswertbaren Fol-

likel konnte PrPSc nachgewiesen werden. Auch das die Follikel umgebende Gewebe wies kei-

ne detektierbaren PrPSc-Ablagerungen auf.

4.2.2 Ergebnisse der Sektionen ausgewählter Tiere 6 bis 14 Monate post inoculationem

Sechs Mon. p. i. erfolgte die planmäßige Euthanasie und Sektion von je drei Ziegen pro Ge-

notyp (3x I142R211Q222/IRQ, 3x I142Q211Q222/IRQ und 3x I142R211K222/IRQ), 8 Mon. p. i. muss-

te ein Tier (I142Q211Q222/IRQ) infolge einer Urolithiasiserkrankung außerplanmäßig euthana-

siert und seziert werden und 12 Mon. p. i. wurden acht weitere Ziegen entsprechend der Zeit-

vorgaben in der Versuchsplanung (3x I142R211Q222/IRQ, 2x I142Q211Q222/IRQ und 3x

I142R211K222/IRQ) euthanasiert und seziert. Ein Kontrolltier (ZG 27, I142R211Q222/IRQ) musste

Ergebnisse 71

ebenfalls außerplanmäßig infolge einer Erkrankung an Urolithiasis 14 Mon. p. i. in einer Not-

sektion seziert und beprobt werden (s. Sektionszeitpunkte in Tab. 9, S. 38). Keine der insge-

samt 19 sezierten Ziegen wies klinische Symptome für BSE auf.

Tab. 17 Verhältnis PrPSc-positiver Follikel zur Gesamtanzahl der auswertbaren Follikel in den Ton-sillen- und Rektalbioptaten der Ziegen aus den drei Gruppen mit unterschiedlichen Genoty-pen zu definierten Zeitpunkten post inoculationem

9 Mon. p. i. 12 Mon. p. i. 20 Mon. p. i. Tier Genotyp

Tonsille Rektum Tonsille Rektum Tonsille Rektum

ZG 01 0/3 0/1 0/1 0 ZG 14* 0/1 0/2 0/1 0/5 0/2 0 ZG 17 0/1 0/1 0/6 0/3 0/5 0/3 ZG 18 0/2 0/2 0/2 0/4 0/2 0 ZG 19 0/8 0/1

ZG 24 0 0/2

ZG 27* 0/2 0 0/2 0 ZG 30 0/3 0/2

ZG 33 0/4 0/2 0/8 0/3 0/2 0 ZG 34 0/2 0/1 0/1 0/3 0/1 0/3 ZG 38 0/2 0 0/4 0 0/2 0/11 ZG 39 0/1 0/1 0/3 0 0/2 0/4 ZG 40

I142R211Q222/IRQ

0/1 0/1

ZG 05 0 0/3 0/1 0/3 0/1 0/1 ZG 12 0/4 0/3 0/1 0 ZG 13 0 0/2 0/2 0 0/1 0 ZG 20 0/1 0 0/4 0/2 0/3 0

ZG 22 0/2 0/1

ZG 28 0/4 0/3 0/2 0 0/1 0 ZG 29 0/1 0/3 0 0 0/3 0 ZG 31

I142Q211Q222/IRQ

0/3 0

ZG 02 0/3 0

ZG 03 0/2 0 0/3 0 0/3 0 ZG 07 0/3 0/3 0/8 0 0/1 0 ZG 08 0/3 0/1

ZG 09 0 0

ZG 10 0/1 0 0/0,5 0 0 0 ZG 11 0/2 0 0/1 0 0/1 0 ZG 15 0/1 0/4 0/1 0 0 0 ZG 25

I142R211K222/IRQ

0/1 0/1 0/1 0 *Kontrolltiere, I = Isoleucin, K = Lysin, Q = Glutamin, R = Arginin, Mon. p. i. = Monate post inocula-tionem; Anzahl positiver Follikel/Anzahl Follikel gesamt, grau hinterlegt = Leerfeld

72 Ergebnisse

4.2.2.1 Ergebnisse des Schnelltests und der proteinbiochemischen Untersuchungen

Von allen 19 Tieren wurde Stammhirnmaterial in einem IDEXX Herd Chek-Schnelltest und

nach Anreicherung der Probe mittels PTA-Fällung im Immunoblot (MAK L42) zum Nach-

weis von PrPSc getestet. Das Stammhirnmaterial aller Tiere zeigte im IDEXX Herd Chek

deutlich negative Ergebnisse (erster Test: 0,104 bis 0,229 bei einem Cut-off-Wert von 0,334;

zweiter Test 0,074 bis 0,089 bei einem Cut-off-Wert: 0,252). Auch im Immunoblot konnte

kein PrPSc detektiert werden. Die Tiere wurden aufgrund dieser Datenlage als BSE-negativ

bewertet.

4.2.2.2 Ergebnisse immunhistochemischer Untersuchungen

Einen Überblick über die Proben und die Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchung

gibt Tab. 18 (S. 73). Lediglich bei zwei Ziegen gelang dabei der Nachweis von PrPSc. Ein Tier

des wahrscheinlich weniger empfänglichen Genotyps I142Q211Q222/IRQ (ZG 22) der 12 Mon.

p. i. sezierten Ziegen, zeigte 364 Tage post inoculationem (Tage p. i.) geringgradige fein- bis

grobkörnige PrPSc–Ablagerungen in Makrophagen des lymphatischen Gewebes im Bereich

des Ileozäkaleingangs (s. Abb. 21). Bei einem weiteren Tier des empfänglichen

I142R211Q222/IRQ-Genotyps (ZG 24) konnten nach einer ähnlichen Inkubationszeit (371 Tage

p. i.) geringgradige PrPSc–Ablagerungen in einer Nervenzelle des Ggl. coeliacum mittels

MAK 6C2 nachgewiesen werden (s. Abb. 22, S. 73). In den immunhistologischen Untersu-

chungen der anderen Proben, in denen auch hunderte Follikel des LRS untersucht wurden,

gelang dagegen der Nachweis von PrPSc nicht.

Abb. 21 Einzelbefund geringgradiger, fein- bis grobkörniger PrPSc-Ablagerungen in Makrophagen

des lymphoretikulären Gewebes am Ileozäkaleingang der Ziege ZG 22 (I142Q211Q222/IRQ-Genotyp) 364 Tage post inoculationem; Immunhistochemie MAK 6C2 (A) und F99 (B), 40-er Objektiv, Balken 10 µm.

Ergebnisse 73

Abb. 22 Einzelbefund geringgradiger, fein- bis grobkörniger PrPSc-Ablagerungen in einer Nervenzel-le des Ganglion coeliacum der Ziege ZG 24 (I142R211Q222/IRQ-Genotyp) 371 Tage post ino-culationem; Immunhistochemie MAK F99; 40-er Objektiv, Balken 10 µm.

Tab. 18 Übersicht zu den Befunden der in der Immunhistochemie untersuchten Proben der Ziegen der drei PRNP-Genotypen aus der BSE-Pathogenesestudie zu den Zeitpunkten sechs und 8-14 Monate post inoculationem

Tier Genotyp Ln.

retroph. Tonsille IPP ICE

Lnn. jej. (caud.)

Obex Ggl. coel. T7

6 Monate post inoculationem

ZG 16 0/1245 n.u. 0/31 0/31 0/356 - - -

ZG 23 0/1077 0/251 0/446 0/13 0/320 - - -

ZG 37

I142R211K222/IRQ

0/669 0/306 0/406 0/182 0/406 - - -

ZG 04 0/1204 0/468 0/441 0/376 0/412 - - - ZG 06 0/1147 0/485 0/612 0/26 0/458 - - n.u.

ZG 36

I142Q211Q222/IRQ

0/875 0/224 0/551 0/16 0/733 - - n.u.

ZG 26 0/1149 0/315 0/168 0/33 0/285 - - -

ZG 32 0/1449 0/452 0/532 0/144 0/313 - - n.u.

ZG 35

I142R211Q222/IRQ

0/762 0/367 0/533 0/192 0/458 - - n.u.

8-14 Monate post inoculationem

ZG 02 0/1251 0/318 0/252 0/92 n.u. - - -

ZG 08 0/976 0/141 0/338 0/25 n.u. - - -

ZG 09

I142R211K222/IRQ

0/1292 0/93 0/232 0/33 n.u. - - - ZG 21 0/335 0/49 0/14 0/16 n.u. - - - ZG 22 0/763 0/365 0/137 1/348 n.u. - - - ZG 31

I142Q211Q222/IRQ 0/876 0/49 0/388 0/12 n.u. - - -

ZG 19 0/1551 0/229 0/175 0/16 n.u. - - -

ZG 24 0/620 0/211 0/306 0/27 n.u. - 1 &Z -

ZG 30 0/525 0/210 0/250 0/8 n.u. - - -

ZG 27*

I142R211Q222/IRQ

0/1227 0/308 0/463 0/91 n.u. - - n.u. *Kontrolltier, Genotyp = Aminosäuren für die Kodons 142, 211 und 222; I = Isoleucin, K = Lysin, Q = Glutamin, R = Arginin; Ln. retroph. = Lymphonodus retropharyngealis medialis; IPP = ileale Peyer` Platte, ICE = Ileozäkaleingang, Lnn. jej. (caud.) = Lymphonodi jejunales (caudal), Ggl. coel. = Ganglion coeliacum; n. u. = nicht untersucht, NZ = Nervenzelle. Die zwei positiven Befunde sind farbig hervorgehoben. Für die Proben des lymphatischen Gewebes ist das Verhältnis für die Anzahl PrPSc-positiver Follikel zu den insgesamt untersuchten Follikeln angegeben.

74 Ergebnisse

4.2.3 Ergebnisse der Sektionen ausgewählter Tiere 24 und 25 Monate post

inoculationem

Vierundzwanzig Mon. p. i. wurden pro Genotyp ein Tier und zusätzlich eine hochgradig kli-

nisch an BSE erkrankte Ziege (ZG 01) seziert. Die Ziege ZG 01 gehörte dem vermutlich emp-

fänglicheren I142R211Q222/IRQ-Genotyp an und hatte ca. fünf Monate zuvor als Muttertier

zwei Lämmer ausgetragen. Einen Monat später erfolgte die Euthanasie und Sektion von zwei

klinisch auffälligen Ziegen (ZG 34, ZG 38) sowie eines Tieres ohne klinische Anzeichen (ZG

39). Alle drei Tiere wiesen ebenfalls den I142R211Q222/IRQ-Genotyp auf (s. Tab. 9, S. 38).

4.2.3.1 Klinik der 24 und 25 Monate post inoculationem sezierten Tiere

Einen Überblick über die Klinik der vier erkrankten Ziegen gibt Tab. 19.

Tab. 19 Inkubationszeit, klinische Anzeichen und Zeitraum der Klinik der 24 und 25 Monate post inoculationem klinisch an BSE erkrankten Ziegen des I142R211Q222/IRQ-Genotyps

Tiere Inkubationszeit

(Tage post inoculationem) klinische Anzeichen Zeitraum der Klinik

ZG 33 743 Hypersensibilität am Kopf fraglich, da am Tag der Sektion aufgefallen

ZG 01 753

Nahrungsaufnahme vermindert Fresslust erhalten Kachexie Fellverlust, Pruritus Hypersensibilität, Endstadium

3-6 Wochen

ZG 34

ZG 38 765

Nahrungsaufnahme vermindert Fresslust erhalten Fellverlust Hypersensibilität

ca. 2 Wochen

Die Ziege ZG 33, welche den I142R211Q222/IRQ-Genotyp aufwies, wurde 743 Tage p. i. plan-

mäßig seziert und fiel durch eine auffällige Scheu bei der Manipulation am Kopf kurz vor der

Sektion auf.

Die Ziege ZG 01 (I142R211Q222/IRQ-Genotyp) musste außerplanmäßig infolge einer behand-

lungsresistenten Gewichtsabnahme 753 Tage p. i. euthanasiert werden. Das Tier wies neben

einer deutlichen Abmagerung einen ausgeprägten Pruritus unbekannter Genese auf, was sich

in zahlreichen haarlosen Stellen im Bereich der Hornbasis sowie dorsal der Schwanzwurzel

infolge fortwährenden Kratzens zeigte. Das herabgesetzte Allgemeinbefinden fand bei der

Ziege seine Ausprägung in vermindertem Ohrspiel, unkontrolliertem Speicheln sowie stark

verlangsamter Nahrungsaufnahme bei erhaltener Fresslust. Nach Berührung in der Kopf- bzw.

Ergebnisse 75

Steißgegend konnten heftige Abwehrreaktionen des Tieres beobachtet werden, welche sich im

Bereich der Hinterhand in Form von Hypermetrien äußerten. Erste klinische Anzeichen in

Form von Hypersensibilitäten nach Berührung v. a. im Steißbereich waren bereits drei bis

sechs Wochen vor der Sektion des Tieres festzustellen.

Zwei weitere Ziegen (ZG 34, ZG 38) desselben Genotyps wiesen 765 Tage p. i. eine deutliche

BSE-Symptomatik auf. So zeigten die Tiere im Kopfbereich und in der Steißgegend deutliche

haarlose Stellen. Allerdings konnte bei beiden ein Pruritus-bedingtes Kratzen nicht beobachtet

werden. Aufgrund des Ausprägungsgrades dieser Fellveränderungen, wurde die Krankheits-

dauer auf mindestens 1-2 Wochen geschätzt. Die Tiere reagierten mit teilweise übermäßigen

Abwehrbewegungen auf Berührungen an den Hintergliedmaßen und im Kopfbereich und

zeigten ein stark reduziertes Allgemeinverhalten in Form von vermindertem Ohrenspiel und

verzögerter Nahrungsaufnahme bei erhaltener Fresslust.

4.2.3.2 Ergebnisse des Schnelltests und der proteinbiochemischen Untersuchungen

Von allen sieben Ziegen der drei Genotypen, die 24 und 25 Mon. p. i. seziert wurden (s.

Tab. 9, S. 38), erfolgte die Untersuchung von Stammhirnmaterial in einem IDEXX Herd

Chek-Schnelltest und im FLI-Test. Die Ergebnisse beider Tests sind in Tab. 20 dargestellt, die

Blots zeigt Abb. 23 (S. 77).

Tab. 20 Ergebnisse des IDEXX Herd Chek-Schnelltests und proteinbiochemischer Untersuchungen (FLI-Test) der 24 und 25 Monate post inoculationem sezierten sieben Ziegen der BSE-Pathogenesestudie

Anteil am Gesamtsignal (%) MM (kDa)

Tiere IDEXX Schnell-

test diglyk. PrPSc

monoglyk. PrPSc

unglyk. PrPSc

unglyk. PrPSc

Differenz zur

ScrapieRef.

P4/L42- AK-

bindungs- verhältnis

ZG 10 0,104* -- -- -- -- -- -- ZG 13 0,124 -- -- -- -- -- -- ZG 33 3,104 64,6 (±3,5) 24,8 (±3,4) 10,7 (±0,7) 18,3 (±0,2) -1,2 (±0,4) 0,15 (±0,03) ZG 01 3,105 62,1 (±3,7) 25,0 (±1,9) 13,0 (±2,3) 18,8 (±0,6) -0,56 (±0,1) 0,16 (±0,03) ZG 34 3,256 66,5 (±4,2) 23,2 (±2,7) 10,4 (±1,8) 18,4 (±0,3) -1,17 (±0,3) 0,02 (±0,01) ZG 38 3,227 65,2 (±2,8) 25,0 (±1,2) 9,75 (±1,7) 18,7 (±0,4) -0,69 (±0,6) 0,01 (±0) ZG 39 0,129* -- -- -- -- -- --

di-, mono-, unglyk. = di-, mono-, unglykosylierte Form des PrPSc, MM = molekulare Masse, Differenz zur ScrapieRef. = Differenz aus molekularer Masse der unglykosylierten Form des PrPSc der Probe und des Scrapie-Referenzmaterials, AK = Antikörper, ± = Standardabweichung, Cut-off-Wert: 0,179 bzw. *0,254

76 Ergebnisse

Die planmäßig sezierten Ziegen ZG 10 (I142R211K222/IRQ) und ZG 13 (I142Q211Q222/IRQ) so-

wie ein weiteres zusätzlich seziertes Tier (ZG 39, I142R211Q222/IRQ) lagen mit ihren Tester-

gebnissen im IDEXX Herd Chek deutlich unter dem Grenzwert von 0,179 (ZG 13) bzw. unter

0,254 (ZG 10 u. ZG 39) und wurden als BSE-negativ bewertet. BSE-positiv waren die Ziegen

des I142R211Q222/IRQ-Genotyps ZG 33 (planmäßig seziert), ZG 01, ZG 34 und die ZG 38,

welche mit Testergebnissen von 3,105 bis 3,225 weit über dem Grenzwert von 0,179 lagen

und bereits eine BSE-Symptomatik zeigten.

Im FLI-Test wurde die molekulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc von allen vier

im Schnelltest BSE-positiv getesteten Ziegen bestimmt. Mit Werten zwischen 18,3 und 18,8

kDa wiesen diese stets eine kleinere molekulare Masse auf als die jeweilige interne Scrapie-

Referenz. Das MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnis lag mit Werten zwischen

0,01 und 0,16 sehr niedrig, das Verhältnis der diglykosylierten Form des PrPSc zur monogly-

kosylierten Form betrug 62,1-66,5 % zu 23,2-25,0 %. Der Anteil der diglykosylierten Form

des PrPSc der caprinen BSE-Proben (ZG 01, ZG 33, ZG 34 u. ZG 38) besaß damit einen deut-

lich größeren Anteil am Gesamtsignal als die interne Scrapie-Referenz und war gleichzeitig

auch bei allen Tieren eindeutig größer als 50 %. Somit wiesen alle Ziegen einen Anteil der

diglykosylierten Form des PrPSc über 50 %, ein Antikörperbindungsverhältnis von deutlich

unter 0,4 auf, und die molekulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc der Proben war

mehr als 0,5 kDa geringer als die der internen Scrapie-Referenz. Die Proben wurden anhand

der Befunde als eindeutig BSE-ähnlich charakterisiert (Abb. 23, S. 77). Werte über 60 %,

welche die caprinen Isolate für den Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc zeigten (s.

Abb. 24, S. 77), wurden weder von der ovinen (489) noch von der bovinen (R8/07) BSE-

Referenz erreicht. Das caprine Scrapie-Isolat (ZYP 21) wies mit prozentualen Anteilen der

diglykosylierten zur monoglykosylierten Form des PrPSc von ca. 45 zu 32 % ähnlich wie ovi-

ne Scrapie (46:30 %) einen wesentlich geringeren Anteil der diglykosylierten Form auf (s.

Abb. 24, S. 77).

Ergebnisse 77

bovi

ne B

SE

capr

ine Sc

rapi

e

ZG 3

9

Mar

ker

ZG 3

4

ZG 3

8

23 kDa

23 kDa

bovi

ne B

SE

capr

ine Sc

rapi

e

ZG 0

1

Mar

ker

ZG 1

3

ZG 3

3

ZG 1

0

23 kDa

23 kDa

L42

P4

L42

P4

Abb. 23 Immunoblot zur Bestimmung des Glykosylierungsmusters, der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc und des MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungs-verhaltens der in der BSE-Pathogenesestudie 24 und 25 Monate post inoculationem sezierten Ziegen (ZG); Marker: FLI-Marker

0

40

60

80

60

40

20

80 60 40 20

digl

ykos

ylie

rtes P

rPSc

%

monoglykosyliertes

PrP Sc %

unglykosyliertes PrPSc %

Abb. 24 Vergleichende Darstellung der Glykosylierungsmuster der vier caprinen BSE-Isolate ( ), des caprinen Scrapie-Isolats (ZYP 21- …), des ovinen (486 - ) und des bovinen BSE-Isolats (R 8/07 – ) sowie des ovinen Scrapie-Isolats (Stdl. 171 - ) in einem Dreiecksdiagramm. Auf der linken Achse ist der Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc, auf der rechten Achse der Anteil der monoglykosylierten Form des PrPSc und auf der unteren Achse der An-teil der unglykosylierten Form des PrPSc am Gesamtsignal im Westernblot dargestellt. Die Scrapie-Isolate positionieren sich klar distanziert vom ovinen und bovinen BSE-Isolat und den im gleichen Bereich angeordneten vier caprinen BSE-Isolaten.

78 Ergebnisse

4.2.3.3 Histopathologische Ergebnisse - Auswertung der Obexregion

Sechs ausgesuchte Kerngebiete der Obexregion (s. Abb. 15, S. 61) der Ziegen wurden nach

der H.-E.-Färbung auf TSE-spezifische histopathologische Veränderungen untersucht. Die

vier klinisch auffälligen von insgesamt sieben untersuchten Ziegen zeigten TSE-positive Be-

funde (spongiforme Auflockerung des Neuropils, vakuoläre Degeneration der Neurone), wo-

bei 2 Tiere (ZG01, ZG 34) hochgradige und je ein Tier mittel- (ZG 38) bzw. geringgradige

(ZG 33) Veränderungen aufwiesen (s. Abb. 25 A, S. 79).

Die zwei Ziegen mit der hochgradigen spongiformen Enzephalopathie (ZG 01, ZG 34) wiesen

in der Mehrzahl der untersuchten Kerngebiete hochgradige Alterationen auf. Lediglich in den

#cll. olivares der ZG 34 waren mittelgradige Veränderungen feststellbar. Der #cl. tractus

solitarii der Ziege ZG 01 war nicht beurteilbar. Das Tier ZG 38, welches eine mittelgradige

spongiforme Enzephalopathie aufwies, zeigte neben hochgradigen vakuolären Veränderungen

im DMNV und #cl. tractus spinalis n. trigemini geringgradige Veränderungen im #cl. cunea-

tus sowie einen negativen Befund in den #cll. olivares. Der #cl. tractus solitarii und der #cl.

motorius n. hypoglossi wiesen mittelgradige Veränderungen auf. Die Ziege ZG 33 mit einer

geringgradigen spongiformen Enzephalopathie, zeigte geringgradige Vakuolisierungen und

spongiforme Veränderungen ausschließlich im DMNV und im #cl. tractus spinalis n. trige-

mini. Der #cl. tractus solitarii konnte nicht beurteilt werden.

Die Ziegen ZG 10, ZG 13 und ZG 39 zeigten keine histopathologischen Veränderungen in der

Obexregion.

4.2.3.4 Immunhistochemischer PrPSc-&achweis – Auswertung der Obexregion

Sechs definierte Kerngebiete (vgl. Abb. 15, S. 61) der Obexregion wurden in der Immun-

histochemie auf PrPSc-Ablagerungen untersucht. Korrespondierend zu den histopathologi-

schen Befunden wiesen diese Obexregionen der vier klinisch erkrankten Ziegen hochgradige

PrPSc-Ablagerungen auf. Diese Ablagerungen waren fein- bis grobkörnig diffus überwiegend

in der grauen Substanz, aber auch in geringerem Maße in der weißen Substanz nachweisbar.

Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung aller betroffenen Tiere sind in der

Abb. 25 B (S. 79) dargestellt.

Ergebnisse 79

A

mgr.

ggr.

hgr.

negativ

Gra

d de

r V

erän

deru

ngen

Ncl. motoriusn. hypoglossi

DMNV Ncl. tractus solitarii

Ncl. cuneatus Ncl. tr. spinalis n. trigemini

Ncll. olivares

ZG 01*

ZG 33*

ZG 34

ZG 38

B

Ncl. motoriusn. hypoglossi

DMNV Ncl. tractus solitarii

Ncl. cuneatus Ncl. tr. spinalis n. trigemini

Ncll. olivares

ZG 01*

ZG 33*

ZG 34

ZG 38

mgr.

ggr.

hgr.

negativ

Gra

d de

r V

erän

deru

ngen

Abb. 25: Grad der histopathologischen Veränderungen (A) und der PrPSc-Ablagerungen (B) definier-

ter Kerngebiete der Obexregion der vier klinisch erkrankten Ziegen (24/25 Monate post ino-culationem, BSE-Pathogenesestudie), Ncl./Ncll. = Nucleus/Nuclei, n. = nervi, DMNV = Nucleus parasympathicus nervi vagi, ggr. = geringgradig, mgr. = mittelgradig, hgr. = hoch-gradig. *Der Ncl. tractus solitarii dieser Tiere konnte nicht beurteilt werden.

Die Kerngebiete #cl. motorius n. hypoglossi, DMNV und #cl. tractus solitarii (letzteres

konnte bei den Ziegen ZG 01 und 33 nicht beurteilt werden) waren bei allen Tieren hochgra-

dig betroffen. Die Kerngebiete #cl. cuneatus, #cl. tractus spinalis n. trigemini und die #cll.

olivares wiesen dagegen nur bei der bereits im Endstadium erkrankten Ziege ZG 01 hochgra-

dige PrPSc-Ablagerungen auf. Bei den Ziegen ZG 33 und ZG 38 wurden die Ablagerungen als

mittelgradig bewertet. Die Ziege ZG 34 wies im #cl. tractus spinalis n. trigemini und in den

#cll. olivares mittelgradige PrPSc-Ablagerungen auf, der #cl. cuneatus war hochgradig von

den Ablagerungen betroffen.

80 Ergebnisse

Die PrPSc-Ablagerungen in den Kerngebieten konnten überwiegend extrazellulär sowie intra-

zellulär von Gliazellen und Neuronen nachgewiesen werden. Hochgradige PrPSc-Ablager-

ungen waren dabei nicht zwangsweise an hochgradige histopathologische Veränderungen

gebunden. Ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen dem Grad der vakuolären Verände-

rungen und dem Grad der PrPSc-Ablagerungen in den betroffenen Kerngebieten konnte nicht

festgestellt werden.

In der Obexregion der Ziegen ZG 10, ZG 13 und ZG 39 waren keine PrPSc-Ablagerungen

nachweisbar. Die Tiere wurden als TSE-negativ bewertet (s. auch Befunde der Histopatholo-

gie).

4.2.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung der &achgeburtsproben

Von der Nachgeburt der drei Muttertiere der verschiedenen PRNP-Genotypen wurden die

Kotelydonen der Plazenta und Proben des Nabelstrangs immunhistochemisch untersucht. Die

Beprobung der Nachgeburt des I142R211Q222/IRQ-Muttertiers ZG 01 im März 2009 erfolgte

nur 5 Monate vor der erkrankungsbedingten Euthanasie des Tieres im August 2009. Es waren

in keiner der untersuchten Proben PrPSc-Ablagerungen nachweisbar. Die beiden Muttertiere

der anderen Genotypen I142Q211Q222/IRQ (ZG 12) sowie I142R211K222/IRQ (ZG 25) waren auch

> 1000 Tage p. i. klinisch noch vollständig unauffällig.

Diskussion 81

5 Diskussion

5.1 Ziel der Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler Spongi-

former Enzephalopathien der Ziege

In den durchgeführten Studien wurden Damaskusziegen aus Zypern auf caprine Scrapie und

oral mit BSE inokulierte Ziegen aus einer Pathogenesestudie untersucht. Hierbei sollte der

Einfluss der PRNP-Genotypen auf die Empfänglichkeit ermittelt und im Falle der zyprioti-

schen Damaskusziegen mit weiteren anamnestischen Daten verglichen werden. Die Pathoge-

nese sollte mittels histopathologischer und immunhistologischer sowie proteinbiochemischer

Methoden zum Nachweis des PrPSc untersucht werden. Anhand der ermittelten proteinbio-

chemischen Eigenschaften sollte der Vergleich der caprinen Scrapie-Isolate mit den caprinen

BSE-Isolaten und einem zusätzlichen ovinen und bovinen BSE-Isolat erfolgen, um die Scra-

pie-Isolate eindeutig von BSE differenzieren zu können. Außerdem sollte die Möglichkeit der

horizontalen und vertikalen Übertragung bzw. der Übertragung im perinatalen Zeitraum un-

tersucht werden, und mit der Untersuchung der in der BSE-Pathogenesestudie in definierten

Zeitintervallen entnommenen Bioptate aus Tonsille und Rektum sollte überprüft werden, in-

wieweit der Einsatz einer prämortalen Diagnostik für die Detektion der caprinen BSE möglich

ist. Anhand der Erkenntnisse über den Genotyp-abhängigen pathogenetischen Verlauf von

TSEn bei Ziegen und anhand identifizierter Übertragungswege sollten schließlich Empfeh-

lungen zum Schutz des Verbrauchers und für eine effiziente Diagnostik und Bekämpfung

dieser Zoonose formuliert werden.

5.2 Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate aus Zypern

Scrapie wurde auf Zypern erstmals 1985 bei Schafen (TOUMAZOS 1988) und ein Jahr später

bei Ziegen (TOUMAZOS 1991) beschrieben und war vermutlich über den Handel mit infi-

zierten Schafen nach Zypern gelangt. Ziegen werden in Zypern traditionell überwiegend zu-

sammen mit Schafen in einer Herde gehalten. Trotz der Anwendung von Tierseuchenkon-

trollmaßnahmen (frühe Diagnostik, Quarantänemaßnahmen, teilweise oder komplette Keu-

lung betroffener Herden), hat sich die Infektion mittlerweile auf den gesamten zypriotischen

Schaf- und Ziegenbestand ausgebreitet (GRAVENOR et al. 2004).

Die insgesamt 42 untersuchten Damaskusziegen aus Zypern wurden anhand klinischer Anzei-

82 Diskussion

chen für Scrapie aus den Herden ausgewählt und seziert. Die Obexregion der Tiere wurde

mittels BioRad-Schnelltest auf PrPSc untersucht und die Kodons 142, 146, 151, 154, 211 so-

wie 222 des PRNP aller Tiere wurden sequenziert. Die Untersuchung der pathogenetischen

Verbreitung des PrPSc erfolgte immunhistochemisch in Proben der Obexregion, des LRS und

des MDT sowie im Euter, in der Niere, dem Uterus und der Plazenta. Mit der Bestimmung

des Glykosylierungsverhältnisses, der molekularen Masse der unglykosylierten Form des

PrPSc und des MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnisses der Isolate im Immu-

noblot (FLI-Test) erfolgte die proteinbiochemische Charakterisierung der Isolate und deren

Differenzierung von caprinen, ovinen und bovinen BSE-Isolaten. Die PK-Resistenz fünf aus-

gewählter Isolate wurde außerdem in einem Langzeitverdau über 48 h ermittelt und mit der

PK-Resistenz von BSE-Isolaten kleiner Wiederkäuer (caprine und ovine BSE) verglichen.

Siebzehn der 42 Ziegen zeigten im BioRad-Schnelltest ein PrPSc-negatives, 25 Ziegen ein

PrPSc-reaktives Ergebnis. Diese Befunde der Obexregion konnten immunhistochemisch bestä-

tigt werden. In den weiteren immunhistochemisch untersuchten Proben konnten bei 26 Ziegen

(Obex PrPSc-positiv n = 25, Obex PrPSc-negativ n = 1) in mindestens einer der Proben des

LRS oder ENS (MDT) PrPSc-Ablagerungen detektiert werden. In fast allen Tieren zeichnete

sich, bei einer einzelnen zweijährigen Ziege selbst bei negativem Obexbefund (ZYP 24), eine

breite Beteiligung dieser Systeme ab. Eine Ziege (ZYP 40) mit positivem Obex-Befund zeigte

dagegen mit auf den Ln. retroph. (geringgradig) und das ENS des Rektums (hochgradig) be-

schränkten PrPSc-Ablagerungen ein abweichendes PrPSc-Verteilungsmuster. Dieses Tier wies,

im Unterschied zu den anderen PrPSc-positiven Ziegen (alle homozygot

I142N146R151R154R211Q222), am Kodon 154 einen R/H-Polymorphismus auf. In der Plazenta von

drei Ziegen (Obex PrPSc-positiv) konnte PrPSc nachgewiesen werden. Im Euter, in der Niere

und im Uterus war PrPSc nicht detektierbar.

Von den Ziegen, die mindestens einen Polymorphismus auf den untersuchten Kodons des

PRNP aufwiesen, zeigten signifikant mehr Tiere einen negativen Befund für den PrPSc-

Nachweis, als von denen ohne Polymorphismen. Ein weiterer signifikanter Unterschied ließ

sich für vier Ziegen mit einem Polymorphismus am Kodon 146 feststellen. Ziegen, die einen

Polymorphismus am Kodon 146 zeigten, waren signifikant häufiger Scrapie-negativ, als Zie-

gen, die an diesem Kodon keinen Polymorphismus zeigten.

Diskussion 83

Insgesamt acht der 25 Ziegen mit PrPSc-positivem Obexbefund wiesen im FLI-Test, abwei-

chend von allen anderen Isolaten, einen Anteil der diglykosylierten Form des PrPSc von mehr

als 50 % und damit ein eher BSE-typisches Glykosylierungsmuster auf. Anhand der Gesamt-

heit der proteinbiochemischen Eigenschaften wurden diese Isolate aber ebenso wie die ande-

ren 17 Isolate als Scrapie-ähnlich eingestuft.

5.2.1 Der Einfluss des Prion-Gen-Genotyps

In einer ersten umfassenderen Studie über Genotypen zypriotischer Ziegen (PAPASAVVA-

STYLIANOU et al. 2010) zeigten die Tiere am häufigsten den Wildtyp-Genotyp

I142N146R151R154. Polymorphismen traten vorwiegend am Kodon 146, 154 und 240 auf, aber

auch am Kodon 142 und 151 konnten Polymorphismen festgestellt werden. Diese Poly-

morphismen des caprinen PRNP wurden bereits in vorhergehenden Untersuchungen in Her-

den unterschiedlicher Länder beschrieben (GOLDMANN et al. 1996; BILLINIS et al. 2002;

KUROSAKI et al. 2004; ZHANG et al. 2004; PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007).

PAPASAVVA-STYLIANOU et al. (2010) untersuchten insgesamt 717 Damaskusziegen bzw.

mischrassige Damaskusziegen aus 75 unterschiedlichen Herden, die als Scrapie-positiv (kli-

nisch auffällig, Gehirn PrPSc-positiv), Scrapie-negativ (klinisch auffällig, Gehirn PrPSc-

negativ) und als gesunde Kontrollen (ohne Klinik, Gehirn PrPSc-negativ) in der Untersuchung

berücksichtigt wurden. Die Allelfrequenzen von Met142 (0,1 %), von D146 (6,6 %) und S146

(3,6 %) und von H151 bzw. H154 (1,5 % bzw. 3,3 %) im PRNP der Scrapie-positiven und –

negativen Ziegen wurden dabei ermittelt.

Die untersuchten 42 Damaskusziegen aus Zypern aus 20 Herden wurden in vergleichbarer

Weise anhand klinischer Merkmale für die Sektionen ausgewählt. Die Mehrzahl der Tiere

wies ebenfalls den Wildtyp-Genotyp auf und die Allelfrequenz der Polymorphismen S146

(3,6 %) und H151 (1,2 %) war vergleichbar, während die des Polymorphismus M142 (2,4 %)

deutlich höher und die der Polymorphismen D146 (2,4 %) und H154 (1,2 %) um ca. die Hälfte

geringer war, als in der Studie von PAPASAVVA-STYLIANOU et al. (2010). Die Gesamt-

anzahl von 42 Tieren ist sicher zu gering, um als repräsentative Stichprobe betrachtet zu wer-

den. Es zeigte sich im Exakten Fisher-Test für diese Ziegen jedoch, dass Tiere mit mindestens

einem Polymorphismus auf dem PRNP signifikant häufiger einen Scrapie-negativen Befund

(n = 5) aufwiesen als Ziegen, die als Scrapie-positiv befundet wurden (n = 1). Ein Einfluss der

84 Diskussion

PRNP-Polymorphismen auf die Scrapie-Empfänglichkeit von Ziegen lässt sich somit auch für

diese 42 Ziegen bestätigten.

Der gezielte statistische Vergleich mittels Exaktem Fisher-Test zwischen Ziegen mit einem

positiven und einem negativen Schnelltestbefund ergab lediglich für das Vorkommen von

Polymorphismen am Kodon 146 einen signifikanten Unterschied. Vier Ziegen mit einem ne-

gativen Schnelltestbefund zeigten an dieser Position die Aminosäurepolymorphismen N/S,

N/D bzw. kodierten homozygot für Serin. Ziegen ohne Polymorphismus am Kodon 146 wie-

sen demnach signifikant häufiger einen positiven Schnelltestbefund auf. Dieses Resultat steht

im Einklang mit Untersuchungen, in denen PAPASAVVA-STYLIANOU et al. (2007, 2010)

für Ziegen auf Zypern mit heterozygoten Polymorphismen des Kodon 146 bereits eine erhöh-

te Resistenz gegen Scrapie und für Ziegen mit homozygoten Polymorphismen eine vollstän-

dige Resistenz feststellen konnten. Weiterhin zeigte sich bei einer dieser vier Ziegen (ZYP

39) neben einem N/D-Polymorphismus des Kodons 146 noch ein R/H-Polymorphismus auf

dem Kodon 151. Für Polymorphismen auf dem Kodon 151 ist bisher kein Einfluss auf die

Scrapie-Empfänglichkeit beschrieben worden (PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007,

2010). Für die Häufigkeiten der aufgetretenen Polymorphismen auf den Kodons 142, 151 und

154 konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Ziegen mit einem positiven bzw.

negativen Schnelltestbefund festgestellt werden. Die nachfolgend hinsichtlich der Scrapie-

Empfänglichkeit diskutierten Einzelbefunde von Tieren, die diese Polymorphismen aufweisen

müssen daher als rein spekulativ betrachtet werden. Eine dreijährige gesunde Ziege (ZYP 36)

kodierte homozygot für Methionin (Met) auf dem Kodon 142. Das Tier wies weder in den

Proben des ZNS (Obex) noch in den Körperproben (Ln. retroph., Tonsille, 3. Lid, Milz, Rek-

tum) PrPSc auf und befand sich in einem Alter, in dem bevorzugt Ziegen an Scrapie erkran-

ken. In vorhergehenden Untersuchungen konnte für Methioninträger am Kodon 142 eine ver-

längerte Inkubationszeit im Vergleich zu Ziegen ohne Methioninpolymorphismus für die

Scrapie- und BSE-Infektion nachgewiesen werden (GOLDMANN et al. 1996). Es wäre dem-

nach durchaus denkbar, dass sich bei der Ziege ZYP 36, für den Fall einer Infektion mit Scra-

pie, die Inkubationszeit verlängert. Ein einzelnes Tier (ZYP 40) der Scrapie-positiven Ziegen

zeigte einen R/H-Polymorphismus auf dem Kodon 154. Während im ENS der ZYP 40 der

PrPSc–Nachweis in einem ähnlich starken Maße gelang wie im ENS der anderen Scrapie-

positiven Ziegen, war das LRS der ZYP 40 nur sehr eingeschränkt von Ablagerungen betrof-

Diskussion 85

fen (geringgradig im Ln. retroph.). Ein Einfluss dieses Polymorphismus am Kodon 154 auf

die Verteilung des PrPSc und auf das Fortschreiten der Erkrankung bei diesem Tier ist denk-

bar, zumal für Polymorphismen am Kodon 154 bereits ein protektiver Effekt und die Verlän-

gerung der Inkubationszeit bei Ziegen beschrieben werden konnte (BILLINIS et al. 2002;

VACCARI et al. 2006; PAPASAVVA-STYLIANOU et al. 2007). Möglicherweise schränkt

hier das Histidin auf dem Kodon 154 ebenso die Ablagerung von PrPSc im LRS und ZNS ein,

wie es GONZÁLEZ et al. (2010 a) für das Methionin auf dem Kodon 142 diskutiert haben

und wie es für Schafe des Genotyps V136R154Q171/ARR ebenfalls beschrieben wurde (VAN

KEULEN et al. 1996; SCHREUDER et al. 1996, 1998; ANDREOLETTI et al. 2000).

5.2.2 Proteinbiochemische Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate

Der Prion-Hypothese von PRUSINER (1982) nach ist die Umfaltung des zellulären Prion-

Proteins in die pathologische Form eine Grundvoraussetzung für die Genese der TSE-

Erkrankungen. Die verschiedenen TSE-Stämme wie BSE und Scrapie unterscheiden sich in

ihren biologischen und biochemischen Eigenschaften. Unterscheidungsmerkmale stellen u. a.

das Glykoprofil des PrPSc im Immunoblot und die Resistenz gegenüber dem Verdau mit Pro-

teinase K und deren Schnittstelle am PrPSc dar.

5.2.2.1 Differenzierung der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie von Scrapie mit-

tels FLI-Test

Im FLI-Test erfüllten lediglich die drei als Referenzproben mitgeführten BSE-Isolate von

Ziege, Schaf und Rind die drei Kriterien für eine Bewertung „Scrapie-ähnlich“ nicht und

wurden folglich als BSE-ähnlich eingestuft. Die 25 in der Obexregion positiv getesteten Da-

maskusziegen aus Zypern sowie ein ovines Scrapie-Isolat (Referenzmaterial) wurden dagegen

eindeutig als Scrapie-ähnlich charakterisiert. Alle untersuchten TSE-Isolate der Zypernziegen

sind somit eindeutig Scrapie zu zuordnen und liefern keinerlei Anhaltspunkte für ein natürli-

ches Vorkommen von BSE in der Ziegenpopulation im europäischen Teil Zyperns.

Das abweichende Glykosylierungsmuster von acht der untersuchten Scrapie-Isolate deutet auf

das Vorliegen verschiedener capriner Scrapie-Stämme hin. Eine Vielfalt von Scrapie-Isolaten

konnte bereits in vorhergehenden proteinbiochemischen Untersuchungen von ovinen Isolaten

gezeigt werden, welche unterschiedliche Glykosylierungsmuster sowie eine geringere mole-

kulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc aufwiesen und teilweise anhand der aufge-

86 Diskussion

führten Parameter nicht von BSE-Isolaten zu unterscheiden waren (HILL et al. 1998;

BARON et al. 1999; HOPE et al. 1999). Die betroffenen acht Ziegen besitzen außerdem alle

denselben genetischen Hintergrund und entstammen aus gemeinsamen Herden bzw. aus Her-

den, welche in räumlicher Nähe zueinander liegen. Die Übertragung eines Scrapie-Stammes

zwischen den benachbarten Herden wäre somit durchaus denkbar. Für eine endgültige Cha-

rakterisierung der Scrapie-Stämme ist aber die Übertragung der Isolate auf Mäuse und die

Auswertung dieser im Läsionsprofil unter Berücksichtigung der Inkubationszeiten notwendig

(FRASER u. DICKINSON 1968).

5.2.2.2 Langzeit Proteinase K-Verdau

Das caprine BSE-Isolat und in einem noch stärkeren Maße das ovine BSE-Isolat zeigten eine

teilweise deutlich größere Resistenz gegenüber dem Verdau mit PK über 48 Stunden als die

caprinen Scrapie-Isolate. Dieses Ergebnis kontrastiert mit Ergebnissen aus vorhergehenden

Untersuchungen an Scrapie-positivem Schafmaterial und bovinem BSE-Material im Langzeit-

Proteinase K-Verdau (SWEENEY et al. 2000) sowie an Maus-passagierten Scrapie- und

BSE-Isolaten (KUCZIUS u. GROSCHUP 1999), in denen BSE stets eine geringere PK-

Resistenz im Vergleich zum untersuchten Scrapie-Material aufwies und anhand dieser Eigen-

schaft von Scrapie unterscheidbar war.

Von den fünf caprinen Scrapie-Isolaten waren vier Isolate im FLI-Test durch einen Anteil der

diglykosylierten Form des PrPSc von mehr als 50 % am Gesamtsignal im Glykosylierungs-

muster aufgefallen und ein Isolat (ZYP 21) wies einen Anteil der diglykosylierten Form des

PrPSc von unter 50% auf. Die Scrapie-Isolate wiesen weitgehend ähnliche Ergebnisse im PK-

Langzeitverdau auf und ließen sich nicht untereinander, aber anhand ihrer geringeren PK-

Resistenz eindeutig von den BSE-Isolaten unterscheiden. Es ist demnach anzunehmen, dass

sowohl caprine, als auch ovine BSE eine höhere Resistenz gegenüber dem Langzeitverdau

mit PK aufweisen als caprine Scrapie und dass die PK-Resistenz im Langzeitverdau zur Dis-

kriminierung zwischen den Isolaten herangezogen werden kann. Interessanterweise zeigte

sich, dass BSE-Isolate kleiner Wiederkäuer eine größere Resistenz gegenüber dem Verdau

mit Proteinase K zu besitzen scheinen als bovine BSE, welche in vorhergehenden Untersu-

chungen durch ihre vergleichsweise geringere Resistenz von ovinen Scrapie-Stämmen ab-

grenzbar war (KUCZIUS u. GROSCHUP 1999; SWEENEY et al. 2000). Weiterführende

Diskussion 87

Untersuchungen könnten diese Annahme bestätigen helfen.

5.2.3 Histologische Charakterisierung capriner Scrapie-Isolate

Bei TSE-Erkrankungen wie z. Bsp. Scrapie und BSE treten die histopathologischen Verände-

rungen vorwiegend bilateral symmetrisch im Hirnstamm (Obexregion) unter Ausprägung der

drei neuropathologischen Hauptmerkmale vakuoläre Veränderungen, neuronale Degeneration

und Gliose auf (HADLOW 1961; WELLS et al. 1987, 1989; WOOD et al. 1997). Immun-

histochemisch lassen sich unter Verwendung spezifischer Antikörper die PrPSc-Ablagerungen

in der Region nachweisen.

5.2.3.1 Histopathologische und immunhistologische Veränderungen in der Obexregion

Die Untersuchung der 42 Obices der Damaskusziegen aus Zypern erfolgte, wie in der Abb. 15

(S. 61) bereits gezeigt, anhand von sechs Kerngebieten in der Obexregion und bestätigte den

PrPSc-Nachweis der TSE-Schnelltests in der Obexregion von 25 Ziegen. Am stärksten von

vakuolären Veränderungen betroffen waren erwartungsgemäß der DMNV, der #cl. tractus

solitarii, der #cl. motorius n. hypoglossi und der #cl. tractus spinalis n. trigemini, wobei die

beiden erstgenannten auch die meisten PrPSc-Akkumulationen in der Immunhistochemie zeig-

ten. Allerdings konnten trotz dieser eindeutigen PrPSc-Akkumulationen bei einigen Tieren

v. a. in den #cll. olivares oder im #cl. cuneatus keine vakuolären Veränderungen nachgewie-

sen werden. Die Ergebnisse aus vorhergehenden Untersuchungen von WOOD et al. (1997),

nach denen der DMNV der Medulla oblongata am häufigsten und auch bei gering ausgepräg-

ten histopathologischen Veränderungen betroffen ist und demnach vorrangig zur histopatho-

logischen Diagnostik der klassischen Scrapie herangezogen wird, lassen sich auch anhand

dieser Befunde bestätigen. Die Pathogenese der histopathologischen Veränderungen von

TSEn ist bis heute nicht geklärt. Ähnlich wie bei der BSE der Rinder bereits beschrieben

(WELLS et al. 1994), bleibt auch in diesem Fall fraglich, warum der Nachweis von PrPSc

nicht in jedem Fall an das Vorhandensein von vakuolären Veränderungen gebunden ist.

5.2.3.2 Immunhistologische Bewertung ausgewählter Gewebe

Von den 26 Damaskusziegen aus Zypern, bei denen in mindestens einer der untersuchten

Proben der PrPSc-Nachweis gelang, zeigte ein präklinisches Tier (ZYP 24, homozygot

I142N146R151R154R211Q222) geringgradige PrPSc–Ablagerungen im LRS einzelner Proben, ob-

88 Diskussion

wohl die Obexregion PrPSc-negativ befundet worden war. Dieses erst zweijährige Tier befand

sich vermutlich noch in der Inkubationszeit und die klinische Symptomatik, welche die Aus-

wahl der Ziege für die Sektion bedingt hatte, dürfte anderer Genese gewesen sein. Da weder

mit der Schnelltestdiagnostik noch in der Immunhistochemie bei Verwendung von Material

der Obexregion ein Scrapie-positiver Befund detektiert wurde, zeigte sich an dieser Stelle ein

Schwachpunkt der auf die Obexregion fokussierten Diagnostik. Von den 26 Scrapie-positiven

Ziegen wurden 4 % nicht als solche erkannt. Ähnliche Ergebnisse erbrachten Untersuchungen

an Schafen aus Scrapie-positiv getesteten Herden. Durch die ausschließliche Testung von

Stammhirn im Schnelltest oder in der Immunhistochemie konnten ca. 7-14 % der mit Scrapie

infizierten Schafe nicht als solche erkannt werden, da sich bei ihnen nur im peripheren LRS

und neuronalen Gewebe PrPSc nachweisen ließ (THORGEIRSDOTTIR et al. 2002; ERSDAL

et al. 2003; VASCELLARI et al. 2005; GONZÁLEZ et al. 2006; RECKZEH et al. 2007).

Aufgrund dieser Literaturbefunde und eigener vergleichbarer Daten sollten bei Ziegen und

Schafen lymphoretikuläre Gewebe wie z. Bsp. der Ln. retroph. in die Diagnostik mit einbezo-

gen werden, zumal der Lymphknoten für die Entnahme zugänglich ist und lymphatisches

Gewebe bereits mittels Schnelltest auf PrPSc untersucht werden kann.

Von den Ziegen mit positivem PrPSc-Nachweis im ZNS wiesen alle, mit Ausnahme der

ZYP 40, eine breite Verteilung von PrPSc-Ablagerungen in den untersuchten Proben des LRS

auf. Bei der ZYP 40 beschränkten sich diese hingegen auf den Ln. retroph. und das ENS des

Rektums. Vor dem Hintergrund, dass dieses Tier PrPSc–Ablagerungen auch im ZNS aufwies

und mit vier Jahren schon etwas älter war, dürfte als Ursache für das abweichende Vertei-

lungsmuster der PrPSc–Ablagerungen ein frühes Stadium der Inkubationszeit eher als unwahr-

scheinlich gelten. Die proteinbiochemischen Eigenschaften dieses Tieres waren zudem ver-

gleichbar mit denen der meisten anderen untersuchten Ziegen aus Zypern, was gegen das Vor-

liegen eines differenten Scrapie-Stammes spricht. Als Besonderheit zeigte die ZYP 40 als

einzige der Ziegen einen R/H-Polymorphismus auf dem Kodon 154. Eine mögliche Einfluss-

nahme des Genotyps auf die Verteilung des PrPSc wurde bereits unter Punkt 5.2.1 (S. 83) ein-

gehend diskutiert.

Durch die breite Verteilung von PrPSc im LRS wurde bei allen diagnostizierten Ziegen durch-

gängig mindestens eine der für die prämortale Diagnostik relevanten Proben (Tonsille, 3. Au-

genlid, Rektum) als positiv befundet. Es ist daher denkbar, dass selbst die geringen Gewebe-

Diskussion 89

mengen, die bei der Bioptatentnahme aus der Tonsille und dem Rektum für die Befunderhe-

bung gewonnen werden, die Detektion positiver Tiere sehr wahrscheinlich ermöglichen. Die

prämortale Detektion von Scrapie in der Tonsille und dem Rektum von Ziegen sollte somit in

vergleichbarer Form wie bei Schafen möglich sein, auch wenn in vorhergehenden Studien nur

für die Tonsille und nicht für die Rektumbiopsien ähnlich häufig PrPSc-Ablagerungen wie bei

den Schafen diagnostiziert werden konnten (GONZÁLEZ et al. 2009) und für das 3. Lid bei

Ziegen bisher noch keine wissenschaftlichen Erhebungen zur Veröffentlichung gelangten.

Entgegen vorangegangener Untersuchungen, in denen PrPSc bereits im Euter (LIGIOS et al.

2005) und der Niere von Schafen nachgewiesen werden konnten (SISÓ et al. 2006, LIGIOS

et al. 2007), wies das Eutergewebe der Damaskusziegen keine detektierbaren PrPSc–

Ablagerungen auf. Ebenso wenig gelang der PrPSc–Nachweis in der Niere. Allerdings konn-

ten erstmals in fetalen wie auch in maternalen Anteilen der plazentären Kotelydonen von drei

Ziegen vereinzelte PrPSc–Ablagerungen nachgewiesen werden, was bisher lediglich bei Scra-

pie-positiven Schafen beschrieben wurde (TUO et al. 2001, 2002). Diese drei Tiere zeigten in

fast allen Proben des lymphoretikulären Gewebes und im ZNS positive Befunde, wenn auch

in unterschiedlichen Ausprägungsgraden. In der Plazenta scheint die Ablagerung von PrPSc

daher sehr wahrscheinlich erst in der späten Phase der Pathogenese mit der breiten Verteilung

des PrPSc zu erfolgen. Eine Verbreitung von Scrapie über die Plazenta könnte somit erfolgen.

Es bleibt aber abzuklären, ob PrPSc intrauterin oder erst später durch Plazentophagie oder bei

Beweidung, der durch die Nachgeburt kontaminierten Weiden auf die Nachkommen oder

andere Herdenmitglieder übertragen wird. Bei Schafen scheint die Übertragung der Erkran-

kung von der Mutter auf die Lämmer eher peripartal zu erfolgen, da bis heute der Nachweis

von PrPSc in den Feten nicht gelungen ist und der Nachweis einer intrauterinen Übertragung

noch immer aussteht (FOOTE et al. 1993; WANG et al. 2001; ANDREOLETTI et al. 2002;

TUO et al. 2002). Die PrPSc–Ablagerungen wurden ausschließlich in den Plazenten detektiert,

die Lämmern des empfänglichen Genotyps zu zuordnen waren. Es ist daher davon auszuge-

hen, dass die Neigung zu plazentären PrPSc-Ablagerungen vom Genotyp beeinflusst wird

(ANDREOLETTI et al. 2002; TUO et al. 2002; ALVERSON et al. 2006; LACROUX et al.

2007). Der Genotyp der Nachkommen der Zypernziegen entzog sich unserer Kenntnis, wes-

halb keine Aussagen zum Einfluss des Genotyps der Lämmer auf die Verteilung der PrPSc–

Ablagerungen in der Plazenta gemacht werden können. Prophylaktisch sollte aber auf die Be-

90 Diskussion

seitigung der Nachgeburt aus dem Stall und von den Weiden hingewirkt werden, um ein adä-

quates TSE-Hygienemanagement in den Ziegenherden zu gewährleisten.

5.3 Die Pathogenesestudie zur Bovinen Spongiformen Enzephalopathie der Ziegen

BSE konnte von FOSTER et al. erstmals 1993 experimentell auf Ziegen übertragen werden,

was die Möglichkeit von natürlich vorkommender BSE in Ziegen vermuten ließ. Im Jahr 2005

wurde schließlich der erste natürlich vorkommende BSE-Fall in einer französischen Ziege

beschrieben (ELOIT et al.). Die Bestätigung eines weiteren BSE-Falls erfolgte im Rahmen

der Nachtestung alter TSE-Fälle bei Ziegen 2009 in einer schottischen Ziege, die bereits 1990

verstorben war (EUROPEAN FOOD SAFETY AGENCY 2009).

Für die BSE-Pathogenesestudie wurden insgesamt 39 Ziegen einer Alpine-Saanen-Mischrasse

in den Versuch genommen. Je 12 Tiere wiesen davon den I142Q211Q222/IRQ-Genotyp bzw. den

I142R211K222/IRQ-Genotyp auf und 15 Ziegen den I142R211Q222/IRQ-Genotyp (Wildtyp). Abge-

sehen von zwei Ziegen des Wildtyp-Genotyps, welche als laterale Kontrollen dienten, wurden

37 Ziegen oral mit je einem Gramm BSE-positivem, caprinem Gehirnmaterial inokuliert.

Zeitversetzt erfolgten Bioptatentnahmen und Sektionen, in denen Probenmaterial der Tonsille

und des Rektums sowie eine Vielzahl von Proben des Kopfbereichs (inklusive Gehirn), des

Rückenmarks, des Magen-Darm-Trakts und des Tierkörpers entnommen wurden (s. Tab. 26-

Tab. 28, S. 135-137). Mit der Paarung je eines Muttertiers jedes Genotyps mit einem Wildtyp-

Ziegenbock wurden die Nachzucht von Lämmern und die Gewinnung von Nachgeburtspro-

ben realisiert. Die Proben des ZNS, MDT, des LRS und PNS wurden ebenso immunhistolo-

gisch untersucht, wie die Bioptate und Proben der Nachgeburtsanteile. Die Untersuchung der

Obexregion erfolgte außerdem histopathologisch, im BioRad-Schnelltest und zur proteinbio-

chemischen Charakterisierung im FLI-Test.

Der Nachweis von geringgradigen PrPSc-Ablagerungen gelang zuerst in einer präklinischen

Ziege (ZG 22) des vermutlich weniger BSE-empfänglichen I142Q211Q222/IRQ-Genotyps

364 Tage p. i. im GALT des Ileozäkaleingangs. Bei einem weiteren Tier (ZG 24) des vermut-

lich BSE-empfänglicheren I142R211Q222/IRQ-Genotyps (Wildtyp) konnte PrPSc in geringgradi-

gem Maße 371 Tage p. i. in nur einer Nervenzelle des Ggl. coeliacum nachgewiesen werden.

Erste klinisch kranke Tiere konnten zwischen 743 bis 765 Tage p. i. (24/25 Mon. p. i.) vor-

rangig durch Fellverluste in der Kopfregion und Steißgegend (teilweise kombiniert mit Pruri-

Diskussion 91

tus) und durch ein reduziertes Allgemeinbefinden identifiziert werden. Die Klinik der an BSE

erkrankten Ziegen zeigte sich über eine Dauer von circa zwei bis sechs Wochen. Die histo-

pathologischen, immunhistochemischen Untersuchungen sowie der Schnelltest ergaben ein-

deutig TSE-positive Befunde, und im FLI-Immunoblot konnte der BSE-ähnliche Charakter

des Probenmaterials bestätigt werden. Zeitlich lag die Probengewinnung der Nachgeburt eines

der Muttertiere ca. fünf Monate vor der BSE-bedingten Euthanasie dieses Muttertieres. Im

Probenmaterial der Nachgeburten der drei Muttertiere war der Nachweis von PrPSc ebenso

wenig möglich wie in den über die gesamte Inkubationszeit zu festgelegten Zeitpunkten ent-

nommenen Bioptaten aus Tonsille und Rektum. Die letzte Biopsie erfolgte sechs Monate vor

der Sektion der ersten, klinisch an BSE erkrankten Tiere.

5.3.1 Erkenntnisse zur Inkubationszeit, Klinik und Dauer der Klinik

In der BSE-Pathogenesestudie des FLI erkrankten die ersten Ziegen des als empfänglich gel-

tenden I142R211Q222/IRQ-Genotyps (Wildtyp) ca. zwei Jahre nach der oralen Inokulation mit

caprinem BSE-Hirnmaterial (Zweitpassage). Die ermittelten Inkubationszeiten zwischen 743

bis 765 Tagen p. i. erscheinen auf den ersten Blick wesentlich kürzer als die in den vorherge-

henden Studien ermittelten Inkubationszeiten bei FOSTER et al. (1993), in denen nach oraler

Übertragung von BSE-positivem Rinderhirn (Erstpassage) zwei Ziegen mit Inkubationszeiten

von 941 und 1501 Tagen infiziert werden konnten. Allerdings waren von den letztgenannten

Tieren lediglich die Kodons 142, 143 und 240 des PRNP der untersuchten Ziegen bekannt,

was einen Vergleich, wenn überhaupt dann nur annäherungsweise möglich macht. Dass neben

den Ziegen der als unempfänglicher geltenden PRNP-Genotypen I142Q211Q222/IRQ und

I142R211K222/IRQ auch zwei Tiere des I142R211Q222/IRQ-Genotyps bereits eine Inkubationszeit

von weit über 1000 Tagen p. i. aufweisen, deutet auf eine breite Streuung der Inkubationszei-

ten auch innerhalb derselben Genotypgruppen hin. Dies könnte einen Hinweis darauf darstel-

len, dass nicht immer alle inokulierten Tiere einer Studie auch erkranken zumal eine verrin-

gerte Übertragungsrate bereits in vorhergehenden Studien beschrieben worden war (FOSTER

et al. 1993, 1994, 2001). Als mögliche Ursache für eine verringerte Übertragungsrate oder

derart auffällig differierende Inkubationszeiten bei Ziegen eines Genotyps sollten außerdem

individuell beeinflussende Faktoren einer jeden einzelnen Ziege in Betracht gezogen werden.

Klinisch zeigten die Ziegen der BSE-Pathogenesestudie, ähnlich den in vorhergehenden, ex-

92 Diskussion

perimentellen Studien beschriebenen Symptomen (FOSTER et al. 1993, 2001), eine verrin-

gerte Nahrungsaufnahme bei erhaltener Fresslust. Vormals ebenfalls beschriebene Ataxien

fehlten dagegen in unseren Beobachtungen. Der Pruritus in der Kopf- und Steißgegend war

bei den Ziegen der BSE-Pathogenesestudie am FLI wesentlich stärker ausgeprägt und kon-

trastierte zu bisherigen Angaben bei BSE-infizierten Ziegen ohne ausgeprägte Pruritus-

Symptomatik. Eine solche Symptomatik war bisher eher als klinisches Merkmal von Scrapie

bei Ziegen bekannt (HOURRIGAN et al. 1969; WOOD et al. 1992). Der Zeitraum von zwei

bis sechs Wochen, in denen die BSE-Klinik beobachtet werden konnte, ist ebenfalls ver-

gleichbar mit einer vormals beschriebenen Krankheitsdauer zwischen sechs bis 60 Tagen

(FOSTER et al. 1993, 2001). Allerdings entsprach dieser Zeitraum in unserer Studie nicht in

jedem Fall der genauen Krankheitsdauer, da die Ziegen vorrangig zu vorgegebenen Zeitpunk-

ten und nicht aufgrund der Schwere der Erkrankung seziert wurden.

In den Ziegen der BSE-Pathogenesestudie am FLI erfolgte mit der Inokulation von caprinem

BSE-Material bereits die zweite Passage von BSE, während bei FOSTER et al. (1993, 2001)

und LANTIER et al. (2010) BSE in einer ersten Passage von Rindern auf Ziegen übertragen

wurde. Ein Einfluss der Häufigkeit der Passage des Inokulats auf die Klinik und die Inkubati-

onszeiten wäre vor dem Hintergrund einer bestehenden Speziesbarriere durchaus denkbar

(PATTISON et al. 1965). Die Erhebung weiterer Daten an den noch verbliebenen Ziegen der

Herde dürften zur Klärung dieser Frage beitragen.

5.3.2 Einfluss des Prion-Gen-Genotyps auf die BSE-Erkrankung bei Ziegen

In der BSE-Pathogenesestudie am FLI wurden neben Tieren des I142R211Q211/IRQ-Wildtyps

Ziegen mit einem Q/R-Polymorphismus am Kodon 211 und Ziegen mit einem K/Q-

Polymorphismus am Kodon 222 untersucht. Über den Einfluss des PRNP-Genotyps auf die

Empfänglichkeit von Ziegen für BSE ist bisher sehr wenig veröffentlicht worden, da der Ein-

fluss beider Polymorphismen bisher nur für die Scrapie-Erkrankung der Ziegen untersucht

wurde. Für den Q/R-Polymorphismus am Kodon 211 zeigten BARILLET et al. (2009), dass

heterozygote Ziegen eine größere Resistenz gegen Scrapie aufwiesen. Der K/Q-

Polymorphismus am Kodon 222 war bei italienischen Ziegen sehr stark in der Ziegenpopula-

tion verbreitet. Keines der bisher untersuchten heterozygoten K/Q-Tiere (Kodon 222) war an

Scrapie erkrankt, was auf eine erhöhte Resistenz dieses Genotyps hindeutete (ACUTIS et al.

Diskussion 93

2004; VACCARI et al. 2006). Eine vollständige Resistenz ist jedoch bei diesem Genotyp

nicht gegeben, da heterozygote Tiere in Frankreich bereits Scrapie-positiv getestet worden

sind (BARILLET et al. 2009). Die ersten Ziegen, welche nach oraler Inokulation in der BSE-

Pathogenesestudie klinisch erkrankten (n=4; Inkubationszeit 743-765 Tage p. i.) gehörten alle

dem Wildtyp-Genotyp an. Auch nach einer Inkubationszeit von über 1000 Tagen sind noch

keine Ziegen der beiden anderen Genotypen klinisch auffällig geworden. Dies deutet mit ho-

her Wahrscheinlichkeit auf eine erhöhte Empfänglichkeit des I142R211Q222/IRQ-Genotyps ge-

genüber der BSE-Erkrankung hin. Außerdem spricht die Differenz der Inkubationszeiten von

über 230 Tagen zwischen den verschiedenen Genotypen für einen Einfluss des Genotyps auf

die Länge der Inkubationszeit. Verlängerte Inkubationszeiten für Ziegen, die Polymorphismen

am Kodon 211 und 222 aufwiesen, konnten bisher nur für die Scrapie-Erkrankung gezeigt

werden (ACUTIS et al. 2004; VACCARI et al. 2006; BARILLET et al. 2009). Ein vergleich-

barer Effekt der Polymorphismen auf die BSE-Erkrankung von Ziegen ist mit weiteren Daten

nach Abschluss dieser Studie zu belegen.

In den präklinischen Ziegen der Pathogenesestudie wurde 12 Monate p. i. in der Probe des

Ileozäkaleingangs einer Ziege des I142Q211Q222/IRQ-Genotyps PrPSc nachgewiesen, womit

zumindest die Empfänglichkeit dieser Tiere für eine BSE-Infektion bewiesen ist. Wann die

Tiere dieses Genotyps an BSE erkranken, wird sich in der kommenden Zeit zeigen. Von den

Ziegen mit dem Q/K-Polymorphismus am Kodon 222 konnte auch in den untersuchten Pro-

ben der präklinischen Tiere kein PrPSc nachgewiesen werden. Dieser Fakt spricht zusätzlich

dafür, dass für den I142R211K222/IRQ-Genotyp mit der vergleichsweise höchsten Resistenz

gegen die Erkrankung mit BSE aller hier untersuchten Genotypen zu rechnen ist.

5.3.3 Pathogenese der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie bei Ziegen

Von den präklinischen Ziegen der BSE-Pathogenesestudie konnte in insgesamt 19 untersuch-

ten Tieren PrPSc nur im lymphatischen Gewebe des Ileozäkaleingangs einer Ziege (ZG 22, 12

Mon./364 Tage p. i. seziert) nachgewiesen werden. Selbst das lymphatische Gewebe des I-

leums und vom LRS die Proben des Ln. retroph. sowie der Tonsille, welche bei einer Scrapie-

Erkrankung stets am häufigsten betroffen sind (VAN KEULEN et al. 1996; RECKZEH et al.

2007), blieben negativ. Ein weiterer positiver Befund ergab sich für eine Nervenzelle des Ggl.

coeliacum der Ziege ZG 24 (12 Mon./371 Tage p. i. seziert). Aufgrund dieser Einzelbefunde

94 Diskussion

lässt sich vermuten, dass sich BSE in der Ziege, anders als Scrapie, ohne wesentliche Beteili-

gung des LRS im Organismus ausbreitet. Sehr wahrscheinlich erfolgt eine neuronale Ausbrei-

tung über sympathische und/oder parasympathische Fasern ins ZNS. LANTIER et al. (2010)

konnten allerdings nach der oralen Inokulation mit boviner BSE geringe Mengen von PrPSc in

den Peyer` Platten, dem Mesenteriallymphknoten und der Milz einer klinisch erkrankten Zie-

ge des Wildtyp-Genotyps (24-26 Mon. p. i.) nachweisen. Diese Fakten verweisen auf eine

etwas stärkere Ausbreitung von BSE im LRS von Ziegen, zumindest im Falle einer Erstüber-

tragung. Das Ausmaß der pathogenetischen Beteiligung des LRS von Ziegen an der BSE-

Erkrankung bleibt daher, auch unter Berücksichtigung des PRNP-Genotyps, mit Weiterfüh-

rung des Versuchs abzuklären. Nachfolgend wird sich zeigen, ob die BSE-Pathogenese bei

Ziegen ebenso umfangreich über das LRS erfolgt, wie bei Schafen bereits eruiert (VAN

KEULEN et al. 2008), oder ob das LRS nur unwesentlich an der Pathogenese beteiligt ist, wie

es bei Rindern beschrieben worden war (WELLS et al. 2005; ESPINOSA et al. 2007;

HOFFMANN et al. 2007, 2011).

Bei den ab dem 24-igsten Monat p. i. klinisch auffällig gewordenen Ziegen wurden PrPSc-

Ablagerungen in der Obexregion nachgewiesen. Mit der Weiterführung des Projektes sind zur

weiteren Abklärung der Pathogenesewege die Untersuchungen an Proben des lymphoretikulä-

ren und neuronalen Gewebes fortzuführen.

5.3.4 Biopsien als prämortale Diagnostikmöglichkeit

Im Verlauf der BSE-Pathogenesestudie wurden Bioptate aus der Tonsille und dem Rektum zu

definierten Zeitpunkten untersucht, um Möglichkeiten für die Verwendung der prämortalen

Diagnostik von BSE bei Ziegen zu eruieren. Die Diagnostik präklinischer Tiere stellt v. a. vor

dem Hintergrund der sehr langen Inkubationszeit von BSE einen Weg zur Tilgung infizierter

Herden dar, sofern es gelingt die präklinischen Tiere bereits zu Beginn der Inkubationszeit zu

detektieren. Die in der Studie entnommenen Bioptate wiesen keine detektierbaren Mengen an

PrPSc auf. Selbst in den Bioptaten (Tonsille und Rektum) der an BSE erkrankten Ziegen (ZG

01, ZG 33, ZG 34 u. ZG 38), die nur ca. vier Monate nach der letzten Biopsie (20 Mon. p. i.)

euthanasiert und seziert wurden, war der PrPSc–Nachweis nicht möglich. Zwar konnten für

einige dieser Ziegen nur eine geringe Anzahl von ein bis zwei Follikeln untersucht werden

oder es fanden sich gar keine auswertbaren Follikel im Gewebeschnitt (s. Tab. 17, S. 71), es

Diskussion 95

blieben aber auch die Proben mit teilweise 11 Follikeln ohne jeden positiven Befund. Dies

steht im Widerspruch zu Erkenntnissen, die zur Scrapie-Infektion bei Schafen und Ziegen

gesammelt wurden. Bei Schafen konnten anhand von Rektumbiopsien bis zu 86 % der positi-

ven präklinischen Schafe detektiert werden (SCHREUDER et al. 1996, 1998; JEFFREY et al.

2001 b; GONZÁLEZ et al. 2006), bei Ziegen wurden, wenn auch mit einem vergleichsweise

geringeren Erfolg, die Scrapie-positiven Tiere mittels Tonsillen- und Rektumbiopsien mit

einer 53 bzw. 40 %-igen Sensitivität ermittelt (GONZÁLEZ et al. 2009). In dem umfangrei-

cheren Probenmaterial der Tonsille, welche nach der Sektion der Tiere entnommen wurde,

konnte ebenfalls kein PrPSc nachgewiesen werden. Weiterhin deutet ein einziger positiver

Befund im GALT des Ileozäkaleingangs eher auf eine eingeschränkte Beteiligung des LRS an

der Pathogenese von BSE bei Ziegen hin, und dies selbst erst in der fortgeschrittenen Inkuba-

tionsphase. Deshalb erscheint die prämortale Diagnostik anhand von Tonsillen- oder Rektum-

biopsien für BSE-Infektionen bei Ziegen kaum aussagefähig. Es bleibt abzuwarten, inwieweit

die Diagnostik über Blut- oder Milchproben Alternativen bieten wird, zumal sich der PrPSc-

Nachweis in Körperflüssigkeiten bisher sehr schwierig gestaltet.

5.3.5 Übertragung der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie über die Plazenta

In der Plazenta und in der Nabelschnur der in der Pathogenesestudie des FLI unmittelbar post

partum beprobten Muttertiere konnte kein PrPSc detektiert werden, obwohl eines der Mutter-

tiere (ZG 01) fünf Monate nach dem Ablammen, also bereits kurze Zeit später, klinisch an

BSE erkrankte. Auch wenn bisher keine klinischen Anzeichen für eine Infektion der Lämmer

mit BSE aufgetreten sind (mehr als 750 Tage post natum) und die Übertragung von BSE auf

vertikalem Wege dadurch mehr als fraglich erscheint, bleibt das Ende der Studie für eine kon-

krete Aussage bezüglich der intrauterinen Übertragung vom Muttertier auf die Lämmer abzu-

warten. Die vertikale Übertragung von BSE ausgehend vom Muttertier auf das Lamm ist

durchaus denkbar. So konnte bei Schafen bereits frühzeitig die Übertragung von Scrapie auf

die Lämmer u. a. durch die orale Aufnahme von Plazentargewebe nachgewiesen werden

(PATTISON 1972, 1974) und es gelang, wenn auch erst sehr viel später, der PrPSc–Nachweis

in der Plazenta Scrapie-positiver Schafe (RACE et al. 1998; ANDREOLETTI et al. 2002;

TUO et al. 2002). Da bisher aber der Nachweis von PrPSc weder im Fetus selbst (FOOTE et

al. 1993; WANG et al. 2001; TUO et al. 2002) noch im Uterusgewebe gelang, erscheint die

Übertragung der Scrapie-Erkrankung von der Mutter auf das Lamm sehr wahrscheinlich erst

96 Diskussion

später im peripartalen Zeitraum stattzufinden (ANDREOLETTI et al. 2002).

5.3.6 Die Obexregion in der Diagnostik

Die Obexregion des Hirnstammes besitzt eine zentrale Bedeutung für die Diagnostik von

TSEn bei Rind und kleinen Wiederkäuern, da dort entnommenes Probenmaterial für die

Schnelltests in der Routinediagnostik und für die Bestätigungstests in den Nationalen Refe-

renzlaboren (NRL) verwendet wird.

5.3.6.1 Histopathologie und Immunhistologie

Von den untersuchten Ziegen der BSE-Pathogenesestudie wiesen selbst die klinisch weniger

stark betroffenen Ziegen (ZG 33 und ZG 38) Veränderungen in den Kerngebieten auf, die bei

Rindern durch WELLS et al. (1989) für die Diagnostik präferiert wurden (#cl. tractus spina-

lis n. trigemini, #cl. tractus solitarii und DMNV). Der Nachweis von PrPSc in der IHC war

zusätzlich in allen Kerngebieten positiv. Die in der BSE-Diagnostik bei Rindern laut Hand-

buch des O.I.E. (ANONYM 2010) berücksichtigten Kerngebiete sind auch für die histopatho-

logische und immunhistochemische Befunderhebung bei capriner BSE unerlässlich.

5.3.6.2 Immunoblot (FLI-Test)

Die caprinen BSE-Isolate der Pathogenesestudie konnten ohne Ausnahme, ähnlich wie die

ovinen und bovinen BSE-Isolate, im FLI-Test anhand ihrer Glykosylierungsverhältnisse, dem

MAK P4-MAK L42-Antikörperbindungsverhältnis und der Differenz der molekularen Masse

der unglykosylierten Form des PrPSc und der internen Scrapie-Referenz deutlich als BSE-

ähnlich eingestuft und von Scrapie-Isolaten von Schaf und Ziege unterschieden werden. Diese

Ergebnisse zeigen, dass die diskriminatorische Charakterisierung capriner BSE von Scrapie-

Isolaten möglich ist. Der FLI-Test kann folglich auch, wie in Deutschland gemäß der Verord-

nung (EG) 36/2005 bei klassischen reaktiven Proben von kleinen Wiederkäuern gefordert, zur

diskriminatorischen Untersuchung capriner Reagenten verwendet werden.

5.4 Kritische Beurteilung zur Bewertung des Untersuchungsmaterials und der

Untersuchungsmethoden

Für die histopathologische, immunhistologische und proteinbiochemische Charakterisierung

bzw. Untersuchung der caprinen Scrapie-Stämme aus Zypern und der Ziegen im Rahmen der

Diskussion 97

BSE-Pathogenesestudie wurden die zahlreichen Gewebeproben unter TSE-sterilen Bedingun-

gen entnommen und umgehend tief gefroren oder in Formalin fixiert. Die Verfahrensweisen

in den Sektionen wurden bereits in einer BSE-Pathogenesestudie bei Rindern am FLI (2003

bis 2008) erfolgreich etabliert. Hierbei stellten die Vermeidung jeglicher Erreger-

Kontamination zwischen einzelnen Proben (TSE-sterile Entnahme) und die Entnahme ver-

gleichbarer Proben eine wesentliche Zielsetzung dar. Neben hochwertigem Probenmaterial

standen für die Untersuchungen Scrapie- und BSE-positive Referenzproben (Gehirnmaterial)

von Rind, Schaf und Ziege zur Verfügung, womit die Validität der auf Vergleich ausgerichte-

ten Tests abgesichert werden konnte.

Die Zahl der beprobten Ziegen aus Zypern muss als klein bewertet werden. Von diesen Tieren

wiesen wiederum nur Einzeltiere Polymorphismen des PRNP auf, weshalb Aussagen über den

Einfluss des PRNP-Genotyps auf die Scrapie-Empfänglichkeit nur eingeschränkt getroffen

werden können.

Nach Beendigung des BSE-Pathogeneseversuchs werden Aussagen zum Einfluss des PRNP-

Genotyps der Ziegen auf ihre Empfänglichkeit sehr wahrscheinlich möglich sein, da Unter-

schiede in den Inkubationszeiten zwischen den verschiedenen Genotypgruppen bereits jetzt

deutlich hervortreten.

Die Aussagekraft der im Rahmen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Bioptate aus

Tonsille und Rektum ist wegen der geringen Anzahl auswertbarer bzw. teilweise gänzlich

fehlender Follikel kritisch zu beurteilen (Tonsille 0 bis 8, Rektum 0 bis 11 Follikel), zumal

bei vergleichbaren Bioptatentnahmen in vorhergehenden Studien bei Schafen (GONZÁLEZ

et al. 2008) eine wesentlich größere Anzahl Follikel (> 30 Follikel) in den Bioptaten ausge-

wertet werden konnte. Allerdings war der immunhistochemische PrPSc-Nachweis auch in den

bei der Sektion gewonnenen umfangreicheren Tonsillenproben der Ziegen nicht möglich, ob-

wohl dabei teilweise mehr als 400 Follikel ausgewertet werden konnten.

5.4.1 Bewertung der proteinbiochemischen Methoden

Die molekulare Masse der unglykosylierten Form des PrPSc kann in Abhängigkeit vom ver-

wendeten Antikörper, vom Aufreinigungssystem u. v. m. im Immunoblot stark variieren,

weshalb nur molekulare Massen verglichen werden können, die methodisch identisch ermit-

telt wurden. Die Unterschiede in der molekularen Masse zwischen Scrapie und BSE sind

98 Diskussion

teilweise sehr gering (0,5 bis 1 kDa). Auf jedem Gel wurden deshalb entsprechende positive

Referenzproben mitgeführt, und durch eine wiederholte Durchführung der Analytik sollten

methodisch bedingte Abweichungen weitgehend minimiert werden.

Das Glykosylierungsverhältnis wird u. a. von der Aufreinigungsmethode und der Signalstärke

im Immunoblot beeinflusst, weshalb die Glykosylierungsverhältnisse verschiedener Proben

ebenfalls methodisch gleich behandelt und wiederholt untersucht wurden, um Abweichungen

in den Resultaten zu verringern.

Bei der Bestimmung des Antikörperbindungsverhältnisses wurde stets darauf geachtet, dass

sich die Signalstärken der Proben im linearen Bereich des VersaDoc-Imaging-Systems befan-

den (60 000 bis 200 000 counts), um nicht durch das Auftragen einer stärker konzentrierten

BSE-Probe bzw. einer schwach konzentrierten Scrapie-Probe das Antikörperbindungsverhält-

nis zu verfälschen. Eine stärker konzentrierte BSE-Probe könnte auch mit dem MAK P4

(BARON u. BIACABE 2001) detektiert werden, mit der Konsequenz, dass das Antikörper-

bindungsverhältnis (P4/L42) über 0,4 ansteigt. Bei einer zu schwach konzentrierten Scrapie-

Probe könnte der Wert für das Antikörperbindungsverhältnis sehr groß ausfallen, da Scrapie

durch den MAK P4 deutlich besser detektiert wird als durch den MAK L42.

Die Ermittlung der Stabilität der PrPSc-Proben gegen den Verdau mit Proteinase K im Lang-

zeitverdau wurde bisher vorrangig an murinem Material durchgeführt, um BSE von Scrapie-

Isolaten zu differenzieren. Dies ist mit caprinem Hirnmaterial ebenfalls möglich. Der Pro-

benmaterialeinsatz ist dabei teilweise unverhältnismäßig groß, weshalb, auch unter Berück-

sichtigung des relativ großen zeitlichen Aufwandes, der Nutzen des analytischen Verfahrens

kritisch zu betrachten ist, zumal eine Differenzierung zwischen BSE und Scrapie nicht immer

eindeutig möglich ist und somit stets ergänzende Tests zur Bestätigung erforderlich sind. Die

Proteinase K-Resistenz stellt somit lediglich einen ergänzenden Parameter zu den Differenzie-

rungsparametern des FLI-Tests Glykosylierungsverhältnis, molekulare Masse der unglykosy-

lierten Form des PrPSc und Antikörperbindungsverhältnis dar.

5.4.2 Bewertung der immunhistochemischen Methoden

Die Auswahl der Proben für die immunhistochemischen Untersuchungen erfolgte unter Be-

rücksichtigung von Erkenntnissen, welche bereits im Rahmen pathogenetischer Versuche bei

Ziegen oder bei anderen Wiederkäuerarten wie Schaf und Rind gesammelt und veröffentlicht

Diskussion 99

wurden. Vor dem Hintergrund bekannter Speziesunterschiede dienten die Ergebnisse aus Stu-

dien an Schafen oder Rindern dabei lediglich als Orientierung. Die Detektion des PrPSc in den

immunhistochemischen Untersuchungen erfolgte mittels MAK 6C2 bzw. MAK F99, welche

beide am C-Terminus des PrPSc binden und deshalb unabhängig vom differentiellen Proteina-

se K-Verdau sind. Diese Antikörper ermöglichten eine Hintergrund-freie Detektion von PrPSc

in den meisten untersuchten Geweben. In ektodermalen Geweben, v. a. in Trophoblastzellen

und neuronalem Gewebe, zeigten sich wiederholt unspezifische Färbungen. Diese konnten

aber durch den direkten Abgleich mit der entsprechenden Negativkontrolle desselben Färbe-

vorgangs oder durch die Untersuchung derselben Ebene mit einem zweiten Antikörper als

solche identifiziert werden. Die Validität des Verfahrens wurde durch das Mitführen eines

Schnittes mit eindeutig positivem Referenzmaterial in dem Färbevorgang gewährleistet.

100 Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

Susanne Freyse

Studien zur Pathogenese und Charakterisierung Transmissibler Spongiformer En-

zephalopathien der Ziege

An Scrapie erkrankte Ziegen aus Zypern und Ziegen aus einer oralen Bovine Spongiforme

Enzephalopathie (BSE)-Pathogenesestudie wurden mit dem Ziel untersucht, diese Transmis-

siblen Spongiformen Enzephalopathien (TSEn) mittels histopathologischer, immunhistologi-

scher sowie proteinbiochemischer Methoden und unter Einbeziehung genetischer Daten zu

charakterisieren. Zur Unterscheidung der caprinen Scrapie von den caprinen, ovinen und bo-

vinen BSE-Infektionen wurden die Glykosylierungsmuster, die molekularen Massen des

unglykosylierten krankheitsassoziierten Prion-Proteins (PrPSc) nach Proteinase K (PK)-

Verdau und die P4-L42-Antikörperbindungsverhältnisse (sog. FLI-Test) herangezogen. Wei-

terhin wurden relevante Gewebe zur Identifizierung pathogenetischer Wege und von horizon-

talen und vertikalen Übertragungswegen sowie Biopsien für die Beurteilung der prämortalen

Diagnostik immunhistologisch untersucht. Anhand der Erkenntnisse sollten Empfehlungen

zum Schutz des Verbrauchers, für eine effizientere Diagnostik und für die Bekämpfung der

Tierseuchen formuliert werden.

Im zentralen Nervensystem (ZNS) von 25 Ziegen aus Zypern war neben vakuolären Verände-

rungen PrPSc immunhistochemisch und mittels Schnelltest nachweisbar. Mit dem FLI-Test

konnte jeweils das Vorliegen einer Scrapie-Infektion bestätigt und eine BSE-Infektion ausge-

schlossen werden. Acht Scrapie-Isolate zeigten ein eher für BSE-typisches Glykosylierungs-

muster mit einem Anteil des diglykosylierten PrPSc von mehr als 50 Prozent, was auf einen

besonderen Scrapie-Stamm hindeutet. Die Bestimmung der PK-Resistenz erfolgte im Lang-

zeitverdau (48 Stunden) für fünf ausgewählte Isolate, die eine deutlich geringere PK-

Resistenz als caprine und ovine BSE-Vergleichsproben zeigten. Die PK-Resistenz bietet sich

daher als ergänzender Parameter an, um Scrapie- und BSE-Isolate zu unterscheiden.

PrPSc-Ablagerungen ließen sich regelmäßig in Proben des lymphoretikulären Systems (LRS)

nachweisen, selbst bei negativem Befund in der Obexregion. Daher eignet sich die Befundung

des LRS für die präklinische Scrapie-Diagnostik bei Ziegen. Eine Ziege (ZYP 40) mit positi-

vem Obex-Befund, zeigte ein auf den Lymphonodus retropharyngealis medialis und das ente-

Zusammenfassung 101

rische Nervensystem beschränktes abweichendes PrPSc-Verteilungsmuster, welches durch

deren R/H-Polymorphismus am Kodon 154 bedingt sein könnte. Dieser Einzelbefund gestat-

tet aber keine sicheren Aussagen. Der PrPSc-Nachweis gelang erstmalig in caprinem Plazen-

targewebe. Dieses Organ sollte hinsichtlich seiner Infektiosität und Rolle bei der Übertragung

von Scrapie weiterführend getestet werden. Eine reduzierte Scrapie-Empfänglichkeit abhän-

gig vom PRNP-Genotyp konnte für die Ziegen bestätigt werden, die mindestens einen Poly-

morphismus aufwiesen (p = 0,023) und davon insbesondere für die mit einem als protektiv

geltenden Polymorphismus auf dem Kodon 146 (p = 0,016).

In der BSE-Pathogenesestudie wurden 13 Ziegen des I142R211Q222/IRQ- und je 12 Ziegen des

I142Q211Q222/IRQ- bzw. I142R211K222/IRQ-Genotyps oral mit je einem Gramm caprinem, BSE-

positivem Hirnmaterial inokuliert. Von den sechs bis 14 Monate post inoculationem (p. i.)

sezierten 19 Ziegen konnte nach der Untersuchung des LRS, des ZNS und peripheren Ner-

vensystems sowie des Magen-Darm-Trakts lediglich im lymphatischen Gewebe des Ileozäka-

leingangs einer präklinischen Ziege (ZG 22, I142Q211Q222/IRQ-Genotyp, 364 Tage p. i.) und

im Ganglion coeliacum einer weiteren Ziege (ZG 24, I142R211Q222/IRQ-Genotyp, 371 Tage p.

i.) PrPSc nachgewiesen werden. Klinisch erkrankten bisher vier Ziegen (I142R211Q222/IRQ-

Genotyp, 743 bis 765 Tage p. i.) und zeigten Pruritus, Hyperästhesien und Abmagerung bei

erhaltener Fresslust über zwei bis sechs Wochen. Neben vakuolären Veränderungen war PrPSc

immunhistochemisch und mittels Schnelltest in der Obexregion nachweisbar. Der FLI-Test

bestätigte das Vorliegen von BSE. In keiner der Tonsillen- und Rektumbioptate und auch

nicht in den Nachgeburten der drei Muttertiere ließ sich PrPSc nachweisen.

Caprine BSE scheint sich demnach nach oraler Aufnahme innerhalb von ein bis zwei Jahren

vom Verdauungstrakt über das periphere Nervensystem und vermutlich in geringerem Maße

über das LRS bis in das Gehirn der Ziege auszubreiten. Die prämortale Diagnostik anhand

von Bioptaten, erscheint daher nicht zuverlässig zu sein. Zur Übertragung von BSE über die

Nachgeburt ist aufgrund der wenigen verfügbaren Daten derzeit keine Aussage möglich. Die

sich andeutende höhere Empfänglichkeit der Ziegen des I142R211Q222/IRQ-Genotyps für BSE

muss mit weiteren Daten untermauert werden.

Am Ende dieses langjährigen Infektionsexperiments werden valide Daten für die Definition

von spezifiziertem Risikomaterial, zur Wichtung diagnostischer Verfahren und zu BSE-

resistenteren Genotypen bei Ziegen zur Verfügung stehen.

102 Summary

7 Summary

Susanne Freyse

Studies of pathogenesis and characterization of transmissible spongiform

encephalopathies in goats

Scrapie infected goats of Cyprus and goats of an oral bovine spongiform encephalopathy

(BSE) pathogenesis study were examined with the objective of characterizing these

transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) by using histopathological,

immunohistological and biochemical methods and also by taking genetic data into

consideration. To differentiate between caprine scrapie and caprine, ovine and bovine BSE

infections, the glycosylation patterns, the molecular masses of the non-glycosylated forms of

the pathological isoform of the prion protein (PrPSc) after proteinase K (PK) digestion and the

P4/L42 antibody binding ratios were analyzed (FLI-test). In addition, relevant tissues and

biopsies were examined immunohistochemically to identify pathogenic pathways as well as

horizontal and vertical transmission routes, and to evaluate effective pre-mortal diagnostics.

Based on the findings, recommendations for consumer protection, for a more efficient

diagnostic and for better control of the epizootics should be given.

In the central nervous system (CNS) of 25 Cypriot goats, apart from vacuole formations PrPSc

could be detected immunohistochemically and by applying a rapid test system. Based on the

FLI-test, a scrapie infection could be confirmed for all the 25 isolates and BSE could be

excluded without any exception. Eight of the scrapie isolates exhibited a more BSE-like

glycosylation pattern, owing a fraction of the diglycosylated form of PrPSc of more than 50

percent, which indicated the existence of a still unknown scrapie strain. For five selected

isolates, proteinase K long term resistance against proteolysis was determined over 48 hours.

The five scrapie isolates were clearly less PK resistant than caprine and ovine BSE references.

Therefore, PK resistance measurement can be applied as a supplementary parameter to

differentiate scrapie from BSE isolates. Regularly, PrPSc accumulations could be detected

immunohistochemically in tissue samples of the lympho-reticular system (LRS), even when

the obex sample was diagnosed to be PrPSc negative. The examination of lymphatic tissues is

therefore suited for pre-mortal scrapie diagnostics in goats. One goat (ZYP 40), obex PrPSc

positive, exhibited PrPSc accumulation restricted to the retropharyngeal lymph node and

Summary 103

enteric nervous system, in conjunction with R/H polymorphism at codon 154. Interrelations

may exist, but more detailed conclusions are hindered by the low number of goats examined.

For the first time, PrPSc was detected in caprine placental samples. This organ should be

investigated more intensive concerning its infectivity and significance for scrapie

transmission. A reduced scrapie susceptibility according to the PRNP genotype was proven

for the goats with at least one polymorphism (p = 0,023), and especially for those showing

polymorphisms at codon 146 (p = 0,016).

In an experimental pathogenesis study 13 goats of the I142R211Q222/IRQ genotype and 12 goats

of the I142Q211Q222/IRQ and the I142R211K222/IRQ genotype, respectively, were orally

inoculated with one gram of caprine BSE-positive brain material. From the 19 goats, which

had been necropsied from six up to 14 months post inoculationem (p. i.) at the latest, the LRS,

the central and peripheral nervous system and the gut were examined immuno-

histochemically. PrPSc could be detected in the lymphatic tissue of the ileo-caecal junction of

one pre-clinical goat (ZG 22, I142Q211Q222/IRQ genotype, 364 days p. i.) only, and in the

celiac ganglion of another goat (ZG 24, I142R211Q222/IRQ genotype, 371 days p. i.). Four goats

became clinically affected (I142R211Q222/IRQ-genotype, 743 to 765 days p. i.) with symptoms

of pruritus, hyperaesthesia and cachexia, but with unchanged appetite over a two to six week

period. Apart from vacuole formations, PrPSc deposits could be detected

immunohistochemically and by rapid testing in the obex samples. BSE was confirmed in the

FLI test. PrPSc could not be detected, neither in the biopsies of the tonsils and the rectum, nor

in the afterbirths of the three goats.

These preliminary results show that orally administered caprine BSE spreads from the gut to

the brain within one to two years, passing the peripheral nervous system and assumingly less

the LRS. Therefore, pre-mortal diagnostic of caprine BSE based on biopsies does not seem to

be rather reliable. Due to the poor data, the question concerning transmission of BSE via the

afterbirth remains unanswered, yet. Goats of the I142R211Q222/IRQ genotype appear to be more

susceptible to BSE than those of the two other genotypes. This trend has to be further

substantiated.

After finishing this long-term infection study, valid data will be available to define specific

risk material for consumer protection, to interpret diagnostic methods and to give concrete

recommendations for the selection of highly BSE resistant genotypes for breeding.

104 Literaturverzeichnis


ACUTIS, P. L., A. BOSSERS, J. PRIEM, MV. RIINA, S. PELETTO, M. MAZZA, C. CASALONE, G. FORLONI, G. RU u. M. CARAMELLI (2006): Identification of prion protein gene polymorphisms in goats from Italian scrapie outbreaks. J. Gen. Virol. 87, Pt 4, 1029-1033

ACUTIS, P. L., L. SBAIZ, F. VERBURG, MV. RIINA, G. RU, G. MODA, M. CARAMELLI u. A. BOSSERS (2004): Low frequency of the scrapie resistance-associated allele and presence of lysine-171 allele of the prion protein gene in Italian Biellese ovine breed. J. Gen. Virol. 85, Pt 10, 3165-3172

ALVERSON, J., K. I. O'ROURKE u. T. V. BASZLER (2006): PrPSc accumulation in fetal cotyledons of scrapie-resistant lambs is influenced by fetus location in the uterus. J. Gen. Virol. 87, Pt 4, 1035-1041

ANDRÉOLETTI, O., P. BERTHON, D. MARC, P. SARRADIN, J. GROSCLAUDE, L. VAN KEULEN, F. SCHELCHER, J. M. ELSEN u. F. LANTIER (2000): Early accumulation of PrP(Sc) in gut-associated lymphoid and nervous tissues of susceptible sheep from a Romanov flock with natural scrapie. J. Gen. Virol. 81, Pt 12, 3115-3126

ANDRÉOLETTI, O., C. LACROUX, A. CHABERT, L. MONNEREAU, G. TABOURET, F. LANTIER, P. BERTHON, F. EYCHENNE, S. LAFOND-BENESTAD, J. M. ELSEN u. F. SCHELCHER (2002): PrP(Sc) accumulation in placentas of ewes exposed to natural scrapie: influence of foetal PrP genotype and effect on ewe-to-lamb transmission. J. Gen. Virol. 83, Pt 10, 2607-2616

ANONYM (2009): Scrapie. In: World Organisation for Animal Health (O.I.E.) Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2011; Chapter 2.7.13. pp 1-10 [Internet: URL http://www.oie.int/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/] (abgerufen am 05.05.2010)

ANONYM (2010): BSE. In: World Organisation for Animal Health (O.I.E.) Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2011; Chapter 2.4.6. pp 671-682 [Internet: URL http://www.oie.int/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/] (abgerufen am 05.05.2010)

ARSAC, J. N, O. ANDREOLETTI, J. M. BILHEUDE, C. LACROUX, S. L. BENESTAD u. T. BARON (2007):

Literaturverzeichnis 105

Similar biochemical signatures and prion protein genotypes in atypical scrapie and Nor98 cases, France and Norway. Emerg. Infect. Dis. 13, 1, 58-65

ATARASHI, R., R. A. MOORE, V. L. SIM, A. G. HUGHSON, D. W. DORWARD, H. A. ONWUBIKO, S. A. PRIOLA u. B. CAUGHEY (2007): Ultrasensitive detection of scrapie prion protein using seeded conversion of recombinant prion protein. Nat. Methods 4, 8, 645-650

ATARASHI, R., J. M. WILHAM, L. CHRISTENSEN, A. G. HUGHSON, R. A. MOORE, L. M. JOHNSON, H. A. ONWUBIKO, S. A. PRIOLA u. B. CAUGHEY (2008): Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nat. Methods 5, 3, 211-212

BALKEMA-BUSCHMANN, A., C. FAST, M. KAATZ, M. EIDEN, U. ZIEGLER, L. MCINTYRE, M. KELLER, B. HILLS u. M. H. GROSCHUP (2011): Pathogenesis of classical and atypical BSE in cattle. Prev. Vet. Med. 102, 2, 112-117

BARILLET, F., D. MARIAT, Y. AMIGUES, R. FAUGERAS, H. CAILLAT, K. MOAZAMI-GOUDARZI, R. RUPP, J. M. BABILLIOT, C. LACROUX, S. LUGAN, F. SCHELCHER, C. CHARTIER, F. CORBIÈRE, O. ANDRÉOLETTI u. C. PERRIN-CHAUVINEAU (2009): Identification of seven haplotypes of the caprine PrP gene at codons 127, 142, 154, 211, 222 and 240 in French Alpine and Saanen breeds and their association with classical scrapie. J. Gen. Virol. 90, Pt 3, 769-776

BARON, T. G., u. A. G. BIACABE (2001): Molecular analysis of the abnormal prion protein during coinfection of mice by bovine spongiform encephalopathy and a scrapie agent. J. Virol. 75, 1, 107-114

BARON, T. G., J. Y. MADEC u. D. CALAVAS (1999): Similar signature of the prion protein in natural sheep scrapie and bovine spongiform encephalopathy-linked diseases. J. Clin. Microbiol. 37, 11, 3701-3704

BARON, T. G., J. Y. MADEC, D. CALAVAS, Y. RICHARD u. F. BARILLET (2000): Comparison of French natural scrapie isolates with bovine spongiform encephalopathy and experimental scrapie infected sheep. Neurosci. Lett. 284, 3, 175-178

BARRON, R. M., S. L. CAMPBELL, D. KING, A. BELLON, K. E. CHAPMAN, R. A. WILLIAMSON u. J. C. MANSON (2007): High titers of transmissible spongiform encephalopathy infectivity associated with extremely low levels of PrPSc in vivo. J. Biol. Chem. 282, 49, 35878-35886


BAYLIS, M., W. GOLDMANN, F. HOUSTON, D. CAIRNS, A. CHONG, A. ROSS, A. SMITH, N. HUNTER u. A. R. MCLEAN (2002): Scrapie epidemic in a fully PrP-genotyped sheep flock. J. Gen. Virol. 83, Pt 11, 2907-2914

BEEKES, M., u. P. A. MCBRIDE (2000): Early accumulation of pathological PrP in the enteric nervous system and gut-associated lymphoid tissue of hamsters orally infected with scrapie. Neurosci. Lett. 278, 3, 181-184

BEGARA-MCGORUM, I., L. GONZÁLEZ, M. SIMMONS, N. HUNTER, F. HOUSTON u. M. JEFFREY (2002): Vacuolar lesion profile in sheep scrapie: factors influencing its variation and relationship to disease-specific PrP accumulation. J. Comp. Pathol. 127, 1, 59-68

BELLWORTHY, S. J., G. DEXTER, M. STACK, M. CHAPLIN, S. A. HAWKINS, M. M. SIMMONS, M. JEFFREY, S. MARTIN, L. GONZÁLEZ u. P. HILL (2005 a): Natural transmission of BSE between sheep within an experimental flock. Vet. Rec. 157, 7, 206

BELLWORTHY, S. J., S. A. HAWKINS, R. B. GREEN, I. BLAMIRE, G. DEXTER, I. DEXTER, R. LOCKEY, M. JEFFREY, S. RYDER, C. BERTHELIN-BAKER u. M. M. SIMMONS (2005 b): Tissue distribution of bovine spongiform encephalopathy infectivity in Romney sheep up to the onset of clinical disease after oral challenge. Vet. Rec. 156, 7, 197-202

BELT, P. B., I. H. MUILEMAN, B. E. SCHREUDER, J. BOS-DE RUIJTER, A. L. GIELKENS u. M. A. SMITS (1995): Identification of five allelic variants of the sheep PrP gene and their association with natural scrapie. J. Gen. Virol. 76, Pt 3, 509-517

BENESTAD, S. L., J. N. ARSAC, W. GOLDMANN u. M. NÖREMARK (2008): Atypical/Nor98 scrapie: properties of the agent, genetics, and epidemiology. Vet. Res. 39, 4, 19

BENESTAD, S. L., P. SARRADIN, B. THU, J. SCHÖNHEIT, M. A. TRANULIS u. B. BRATBERG (2003): Cases of scrapie with unusual features in Norway and designation of a new type, Nor98. Vet. Rec. 153, 7, 202-208

BESSEN, R. A., u. R. F. MARSH (1992 a): Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent. J. Virol. 66, 4, 2096-2101


BESSEN, R. A., u. R. F. MARSH (1992 b): Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters. J. Gen. Virol. 73, Pt 2, 329-334

BESSEN, R. A., u. R. F. MARSH (1994): Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy. J. Virol. 68, 12, 7859-7868

BIACABE, A. G., J. L. LAPLANCHE, S. RYDER u. T. BARON (2004): Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases. EMBO Rep. 5, 1, 110-115

BILDQUELLE (abgerufen am 31.12.2009) [Internet: URL http://www.intercyprus.com/maps/cyprus-tourist-map.jpg]

BILLINIS, C., C. H. PANAGIOTIDIS, V. PSYCHAS, S. ARGYROUDIS, A. NICOLAOU, S. LEONTIDES, O. PAPADOPOULOS u. T. SKLAVIADIS (2002): Prion protein gene polymorphisms in natural goat scrapie. J. Gen. Virol. 83, Pt 3, 713-721

BOUZALAS, I. G., C. I. DOVAS, G. BANOS, M. PAPANASTASOPOULOU, S. KRITAS, A. OEVERMANN, D. PAPAKOSTAKI, C. EVANGELIA, O. PAPADOPOULOS, T. SEUBERLICH, G. KOPTOPOULOS (2010): Caprine PRNP polymorphisms at codons 171, 211, 222 and 240 in a Greek herd and their association with classical scrapie. J. Gen. Virol. 91, Pt 6, 1629-1634

BROWN, D. R., K. QIN, J. W. HERMS, A. MADLUNG, J. MANSON, R. STROME, P. E. FRASER, T. KRUCK, A. VON BOHLEN, W. SCHULZ-SCHAEFFER, A. GIESE, D. WESTAWAY u. H. KRETZSCHMAR (1997): The cellular prion protein binds copper in vivo. Nature 390, 6661, 684-687

BROWN, D. R., B. S. WONG, F. HAFIZ, C. CLIVE, S. J. HASWELL u. I. M. JONES (1999 a): Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase. Biochem. J. 344, Pt 1, 1-5

BROWN, D. R. (1999 b): Prion protein expression aids cellular uptake and veratridine-induced release of copper. J. Neurosci. Res. 58, 5, 717-725

BROWN, P., u. D. C. GAJDUSEK (1991): Survival of scrapie virus after 3 years' interment. Lancet 337, 8736, 269-270


BRUCE, M. E., R. G. WILL, J. W. IRONSIDE, I. MCCONNELL, D. DRUMMOND, A. SUTTIE, L. MCCARDLE, A. CHREE, J. HOPE, C. BIRKETT, S. COUSENS, H. FRASER u. C. J. BOSTOCK (1997): Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent. Nature 389, 6650, 498-501

BÜELER, H., M. FISCHER, Y. LANG, H. BLUETHMANN, H. P. LIPP, S. J. DEARMOND, S. B. PRUSINER, M. AGUET u. C. WEISSMANN (1992): Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature 356, 6370, 577-582

BÜELER H., A. AGUZZI, A. SAILER, R. A. GREINER, P. AUTENRIED, M. AGUET u. C. WEISSMANN (1993): Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell 73, 7, 1339-1347

BÜELER, H., A. RAEBER, A. SAILER, M. FISCHER, A. AGUZZI u. C. WEISSMANN (1994): High prion and PrPSc levels but delayed onset of disease in scrapie-inoculated mice heterozygous for a disrupted PrP gene. Mol. Med. 1, 1, 19-30

BUSCHMANN, A., A. G. BIACABE, U. ZIEGLER, A. BENCSIK, J. Y. MADEC, G. ERHARDT, G. LÜHKEN, T. BARON u. M. H. GROSCHUP (2004 a): Atypical scrapie cases in Germany and France are identified by discrepant reaction patterns in BSE rapid tests. J. Virol. Methods. 117, 1, 27-36

BUSCHMANN, A., A. GRETZSCHEL, A. G. BIACABE, K. SCHIEBEL, C. CORONA, C. HOFFMANN, M. EIDEN, T. BARON, C. CASALONE u. M. H. GROSCHUP (2006): Atypical BSE in Germany--proof of transmissibility and biochemical characterization. Vet. Microbiol. 117, 2-4, 103-116

BUSCHMANN, A., u. M. H. GROSCHUP (2005 a): Highly bovine spongiform encephalopathy-sensitive transgenic mice confirm the essential restriction of infectivity to the nervous system in clinically diseased cattle. J. Infect. Dis. 192, 5, 934-942

BUSCHMANN, A., u. M. H. GROSCHUP (2005 b): TSE eradication in small ruminants--quo vadis? Berl. Münch. tierärztl. Wochenschr. 118, 9-10, 365-371

BUSCHMANN, A., G. LÜHKEN, J. SCHULTZ, G. ERHARDT u. M. H. GROSCHUP (2004 b): Neuronal accumulation of abnormal prion protein in sheep carrying a scrapie-resistant genotype (PrPARR/ARR). J. Gen. Virol. 85, Pt 9, 2727-2733


BUSCHMANN, A., E. PFAFF, K. REIFENBERG, H. M. MÜLLER u. M. H. GROSCHUP (2000): Detection of cattle-derived BSE prions using transgenic mice overexpressing bovine PrP(C). Arch. Virol. Suppl. 16, 75-86

BUSCHMANN, A., U. ZIEGLER u. M. H. GROSCHUP (2004 c): Standardization of BSE rapid test performances and experiences gathered during the implementation of large scale testing. Accred. Qual. Assur. 9, 191-197

CANCELLOTTI, E., F. WISEMAN, N. L. TUZI, H. BAYBUTT, P. MONAGHAN, L. AITCHISON, J. SIMPSON u. J. C. MANSON (2005): Altered glycosylated PrP proteins can have different neuronal trafficking in brain but do not acquire scrapie-like properties. J. Biol. Chem. 280, 52, 42909–42918

CAPUCCHIO, M. T., F. GUARDA, N. POZZATO, S. COPPOLINO, S. CARACAPPA u. V. DI MARCO (2001): Clinical signs and diagnosis of scrapie in Italy: a comparative study in sheep and goats. J. Vet. Med. A Physiol. Pathol. Clin. Med. 48, 1, 23-31

CASALONE, C., G. ZANUSSO, P. ACUTIS, S. FERRARI, L. CAPUCCI, F. TAGLIAVINI, S. MONACO u. M. CARAMELLI (2004): Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9, 3065-3070

CASTILLA, J., P. SAÁ u. C. SOTO (2005): Detection of prions in blood. Nat. Med. 11, 9, 982-985

CHELLE, P. L. (1942): Un cas de tremblante chez la chèvre. Bull. Acad. Vdt. Fr. 15, 294-295

COHEN, F. E., K. M. PAN, Z. HUANG, M. BALDWIN, R. J. FLETTERICK u. S. B. PRUSINER (1994): Structural clues to prion replication. Science 264, 5158, 530-531

COLLINGE, J., K. C. SIDLE, J. MEADS, J. IRONSIDE u. A. F. HILL (1996): Molecular analysis of prion strain variation and the aetiology of 'new variant' CJD. Nature 383, 6602, 685-690

COLLINGE, J. (1999): Variant Creutzfeldt-Jakob disease. Lancet 354, 9175, 317-323


COLUSSI, S., G. VACCARI, C. MAURELLA, C. BONA, R. LORENZETTI, P. TROIANO, F. CASALINUOVO, A. DI SARNO, M. G. MANIACI, F. ZUCCON, R. NONNO, C. CASALONE, M. MAZZA, G. RU, M. CARAMELLI, U. AGRIMI u. P. L. ACUTIS (2008): Histidine at codon 154 of the prion protein gene is a risk factor for Nor98 scrapie in goats. J. Gen. Virol. 89, Pt 12, 3173-3176

CROZET, C., F. FLAMANT, A. BENCSIK, D. AUBERT, J. SAMARUT u. T. BARON (2001): Efficient transmission of two different sheep scrapie isolates in transgenic mice expressing the ovine PrP gene. J. Virol. 75, 11, 5328-5334

DE BOSSCHERE, H., S. ROELS, P. DECHAMPS u. E. VANOPDENBOSCH (2007): TSE detected in a Belgian ARR-homozygous sheep via active surveillance. Vet. J. 173, 2, 449-451

DICKINSON, A. G., u. G. W. OUTRAM (1988): Genetic aspects of unconventional virus infections: the basis of the virino hypothesis. Ciba Found. Symp. 135, 63-83

DIRINGER, H., M. BEEKES u. U. OBERDIECK (1994): The nature of the scrapie agent: the virus theory. Ann. N. Y. Acad. Sci. 724, 246-258

ELOIT, M., K. ADJOU, M. COULPIER, J. J. FONTAINE, R. HAMEL, T. LILIN, S. MESSIAEN, O. ANDREOLETTI, T. BARON, A. BENCSIK, A. G. BIACABE, V. BERINGUE, H. LAUDE, A. LE DUR, J. L. VILOTTE, E. COMOY, J. P. DESLYS, J. GRASSI, S. SIMON, F. LANTIER u. P. SARRADIN (2005): BSE agent signatures in a goat. Vet. Rec. 156, 16, 523-524

EPSTEIN, V., S. POINTING u. S. HALFACRE (2005): Atypical scrapie in the Falkland Islands. Vet. Rec. 157, 21, 667-668

ERSDAL, C., M. J. ULVUND, S. L. BENESTAD u. M. A. TRANULIS (2003): Accumulation of pathogenic prion protein (PrPSc) in nervous and lymphoid tissues of sheep with subclinical scrapie. Vet. Pathol. 40, 2, 164-174

ESPINOSA J. C., M. MORALES, J. CASTILLA, M. ROGERS u. J. M. TORRES (2007): Progression of prion infectivity in asymptomatic cattle after oral bovine spongiform encephalopathy challenge. J. Gen. Virol. 88, Pt 4, 1379-1383

EUROPÄISCHE UNION (2008): Report on the monitoring and testing of ruminants for the presence of transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in the EU in 2008.


[Internet: URL http://ec.europa.eu/food/food/biosafety/tse_bse/monitoring_annual_reports_ en.htm] (abgerufen am 05.05.2010)

EUROPEAN FOOD SAFETY AGENCY (2009): TSEs in sheep and goats. [Internet: URL http://ec.europa.eu/food/food/biosafety/tse_bse/index_en.print.htm] (abgeru-fen am 05.05.2010)

FISCHER, M., T. RÜLICKE, A. RAEBER, A. SAILER, M. MOSER, B. OESCH, S. BRANDNER, A. AGUZZI u. C. WEISSMANN (1996): Prion protein (PrP) with amino-proximal deletions restoring susceptibility of PrP knockout mice to scrapie. EMBO J. 15, 6, 1255-1264

FOOTE, W. C., W. CLARK, S. A. MACIULIS, J. W. CALL, J. HOURRIGAN, R. C. EVANS, M. R. MARSHALL u. M. DE CAMP (1993): Prevention of scrapie transmission in sheep, using embryo transfer. Am. J. Vet. Res. 54, 11, 1863-1868

FOSTER, J. D., J. HOPE u. H. FRASER (1993): Transmission of bovine spongiform encephalopathy to sheep and goats. Vet. Rec. 133, 14, 339-341

FOSTER, J. D., J. HOPE, I. MCCONNELL, M. BRUCE u. H. FRASER (1994): Transmission of bovine spongiform encephalopathy to sheep, goats, and mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 724, 300-303

FOSTER, J., W. MCKELVEY, H. FRASER, A. CHONG, A. ROSS, D. PARNHAM, W. GOLDMANN u. N. HUNTER (1999): Experimentally induced bovine spongiform encephalopathy did not transmit via goat embryos. J. Gen. Virol. 80, Pt 2, 517-524

FOSTER, J. D., D. PARNHAM, A. CHONG, W. GOLDMANN u. N. HUNTER (2001): Clinical signs, histopathology and genetics of experimental transmission of BSE and natural scrapie to sheep and goats. Vet. Rec. 148, 6, 165-171

FOSTER, J. D., M. WILSON u. N. HUNTER (1996): Immunolocalisation of the prion protein (PrP) in the brains of sheep with scrapie. Vet. Rec. 139, 21, 512-515

FRASER, H. (1976): The pathology of a natural and experimental scrapie. Front. Biol. 44, 267-305

FRASER, H., u. A. G. DICKINSON (1968): The sequential development of the brain lesion of scrapie in three strains of mice.


J. Comp. Pathol. 78, 3, 301-311

GAVIER-WIDEN, D., M. NÖRENMARK, S. BENESTAD, M. SIMMONS, L. RENSTRÖM, B. BRATBERG, M. ELVANDER u. CH. SEGERSTAD (2004): Recognition of the Nor98 variant of scrapie in the Swedish sheep population. J. Vet. Diagn. Invest. 16, 6, 562-567

GOLDMANN, W. (2008): PrP genetics in ruminant transmissible spongiform encephalopathies. Vet. Res. 39, 4, 30

GOLDMANN, W., N. HUNTER, G. BENSON, J. D. FOSTER u. J. HOPE (1991): Different scrapie-associated fibril proteins (PrP) are encoded by lines of sheep selected for different alleles of the Sip gene. J. Gen. Virol. 72, Pt 10, 2411-2417

GOLDMANN, W., N. HUNTER, J. D. FOSTER, J. M. SALBAUM, K. BEYREUTHER u. J. HOPE (1990): Two alleles of a neural protein gene linked to scrapie in sheep. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 7, 2476-2480

GOLDMANN, W., N. HUNTER, G. SMITH, J. FOSTER und J. HOPE (1994): PrP genotype and agent effects in scrapie: change in allelic interaction with different isolates of agent in sheep, a natural host of scrapie. J. Gen. Virol. 75, Pt 5, 989-995

GOLDMANN, W., T. MARTIN, J. FOSTER, S. HUGHES, G. SMITH, K. HUGHES, M. DAWSON u. N. HUNTER (1996): Novel polymorphisms in the caprine PrP gene: a codon 142 mutation associated with scrapie incubation period. J. Gen. Virol. 77, Pt 11, 2885-2891

GONZÁLEZ, L., M. P. DAGLEISH, S. J. BELLWORTHY, S. SISÓ, M. J. STACK, M. J. CHAPLIN, L. A. DAVIS, S. A. HAWKINS, J. HUGHES u. M. JEFFREY (2006): Postmortem diagnosis of preclinical and clinical scrapie in sheep by the detection of disease-associated PrP in their rectal mucosa. Vet. Rec. 158, 10, 325-331

GONZÁLEZ, L., M. P. DAGLEISH, S. MARTIN, G. DEXTER, P. STEELE, J. FINLAYSON u. M. JEFFREY (2008): Diagnosis of preclinical scrapie in live sheep by the immunohistochemical examination of rectal biopsies. Vet. Rec. 162, 13, 397-403

GONZÁLEZ, L., M. JEFFREY, S. SISÓ, S. MARTIN, S. J. BELLWORTHY, M. J. STACK, M. J. CHAPLIN, L. DAVIS, M. P. DAGLEISH u. H. W. REID (2005): Diagnosis of preclinical scrapie in samples of rectal mucosa. Vet. Rec. 156, 26, 846-847


GONZÁLEZ, L., S. MARTIN, I. BEGARA-MCGORUM, N. HUNTER, F. HOUSTON, M. SIMMONS u. M. JEFFREY (2002): Effects of agent strain and host genotype on PrP accumulationin in the brain of sheep naturally and experimentally affected with scrapie. J. Comp. Pathol. 126, 1, 17-29

GONZÁLEZ, L., S. MARTIN, S. A. HAWKINS, W. GOLDMANN, M. JEFFREY u. S. SISÓ (2010 a): Pathogenesis of natural goat scrapie: modulation by host PRNP genotype and effect of co-existent conditions. Vet. Res. 41, 4, 48

GONZÁLEZ, L., S. MARTIN u. M. JEFFREY (2003): Distinct profiles of PrP(d) immunoreactivity in the brain of scrapie- and BSE-infected sheep: implications for differential cell targeting and PrP processing. J. Gen. Virol. 84, Pt 5, 1339-1350

GONZÁLEZ, L., S. MARTIN, S. SISÓ, T. KONOLD, A. ORTIZ-PELÁEZ, L. PHELAN, W. GOLDMANN, P. STEWART, G. SAUNDERS, O. WINDL, M. JEFFREY, S. A. HAWKINS, M. DAWSON u. J. HOPE (2009): High prevalence of scrapie in a dairy goat herd: tissue distribution of disease-associated PrP and effect of PRNP genotype and age. Vet. Res. 40, 6, 65

GONZÁLEZ, L., S. SISÓ, E. MONLEÓN, C. CASALONE, L. J. VAN KEULEN, A. BALKEMA-BUSCHMANN, A. ORTIZ-PELÁEZ, B. IULINI, J. P. LANGEVELD, C. HOFFMANN, J. J. BADIOLA, M. JEFFREY u. C. ACÍN (2010 b): Variability in disease phenotypes within a single PRNP genotype suggests the existence of multiple natural sheep scrapie strains within Europe. J. Gen. Virol. 91, Pt 10, 2630-2641

GOVAERTS, C., H. WILLE, S. B. PRUSINER u. F. E. COHEN (2004): Evidence for assembly of prions with left-handed beta-helices into trimers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 22, 342-347

GRAVENOR, M. B., P. PAPASOZOMENOS, A. R. MCLEAN u. G. NEOPHYTOU (2004): A scrapie epidemic in Cyprus. Epidemiol. Infect. 132, 4, 751-760

GRETZSCHEL, A., A. BUSCHMANN, M. EIDEN, U. ZIEGLER, G. LÜHKEN, G. ERHARDT u. M. H. GROSCHUP (2005): Strain typing of German transmissible spongiform encephalopathies field cases in small ruminants by biochemical methods. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health 52, 2, 55-63

GRETZSCHEL, A., A. BUSCHMANN, J. LANGEVELD u. M. H. GROSCHUP (2006): Immunological characterization of abnormal prion protein from atypical scrapie cases in sheep using a panel of monoclonal antibodies.


J. Gen. Virol. 87, Pt 12, 3715-3722

GROSCHUP, M. H., F. JUNGHANS, M. EIDEN u. T. KUCZIUS (2001): Characterization of Bovine Spongiform Encephalopathy and Scrapie Strains/Isolates by Immunochemical Analysis of PrPSc. In: H. F. BAKER (Hrsg.): Molecular Pathology of the Prion. Methods of Molecular Medicine. Verlag Humana Press Inc, Totowa, NJ, S. 71-83

GROSCHUP, M. H., T. KUCZIUS, F. JUNGHANS, T. SWEENEY, W. BODEMER u. A. BUSCHMANN (2000): Characterization of BSE and scrapie strains/isolates. Arch. Virol. Suppl. 16, 217-226

GROSCHUP, M. H., u. A. STOLZE (2002): BSE and scrapie diagnosis in Germany. Berl. Münch. tierärztl. Wochenschr. 115, 3-4, 106-110

HADLOW, W. J. (1961): The pathology of experimental scrapie in the dairy goat. Res. Vet. Sci. 2, 289

HADLOW, W. J., C. M. EKLUND, R. C. KENNEDY, T. A. JACKSON, H. W. WHITFORD u. C. C. BOYLE (1974): Course of experimental scrapie virus infection in the goat. J. Infect. Dis. 129, 5, 559-567

HADLOW, W. J., R. C. KENNEDY u. R. E. RACE (1982): Natural infection of Suffolk sheep with scrapie virus. J. Infect. Dis. 146, 5, 657-664

HARDT, M., T. BARON u. M. H. GROSCHUP (2000): A comparative study of immunohistochemical methods for detecting abnormal prion protein with monoclonal and polyclonal antibodies. J. Comp. Pathol. 122, 1, 43-53

HARMEYER, S., E. PFAFF u. M. H. GROSCHUP (1998): Synthetic peptide vaccines yield monoclonal antibodies to cellular and pathological prion proteins of ruminants. J. Gen. Virol. 79, Pt 4, 937-945

HAYASHI, H. K., T. YOKOYAMA, M. TAKATA, Y. IWAMARU, M. IMAMURA, Y. K. USHIKI u. M. SHINAGAWA (2005): The N-terminal cleavage site of PrPSc from BSE differs from that of PrPSc from scrapie. Biochem. Biophys. Res. Commun. 328, 4, 1024-1027

HEGGEBØ, R., L. GONZÁLEZ, C. M. PRESS, G. GUNNES, A. ESPENES u. M. JEFFREY (2003): Disease-associated PrP in the enteric nervous system of scrapie-affected Suffolk sheep.


J. Gen. Virol. 84, Pt 5, 1327-1338

HILL, A. F., u. J. COLLINGE (2004): Prion strains and species barriers. Contrib. Microbiol. 11, 33-49

HILL, A. F., M. DESBRUSLAIS, S. JOINER, K. C. SIDLE, I. GOWLAND, J. COLLINGE, L. J. DOEY u. P. LANTOS (1997): The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature 389, 6650, 448-450, 526

HILL, A. F., K. C. SIDLE, S. JOINER, P. KEYES, T. C. MARTIN, M. DAWSON u. J. COLLINGE (1998): Molecular screening of sheep for bovine spongiform encephalopathy. Neurosci. Lett. 255, 3, 159-162

HOFFMANN, C., M. EIDEN, M. KAATZ, M. KELLER, U. ZIEGLER, R. ROGERS, B. HILLS, A. BALKEMA-BUSCHMANN, L. VAN KEULEN, J. G. JACOBS u. M. H. GROSCHUP (2011): BSE infectivity in jejunum, ileum and ileocaecal junction of incubating cattle. Vet. Res. 42, 1, 21

HOFFMANN, C., U. ZIEGLER, A. BUSCHMANN, A. WEBER, L. KUPFER, A. OELSCHLEGEL, B. HAMMERSCHMIDT u. M. H. GROSCHUP (2007): Prions spread via the autonomic nervous system from the gut to the central nervous system in cattle incubating bovine spongiform encephalopathy. J. Gen. Virol. 88, Pt 3, 1048-1055

HOPE, J., S. C. WOOD, C. R. BIRKETT, A. CHONG, M. E. BRUCE, D. CAIRNS, W. GOLDMANN, N. HUNTER u. C. J. BOSTOCK (1999): Molecular analysis of ovine prion protein identifies similarities between BSE and an experimental isolate of natural scrapie, CH1641. J. Gen. Virol. 80, Pt 1, 1-4

HORNSHAW, M. P., J. R. MCDERMOTT u. J. M. CANDY (1995 a): Copper binding to the N-terminal tandem repeat regions of mammalian and avian prion protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 207, 2, 621-629

HORNSHAW, M. P., J. R. MCDERMOTT, J. M. CANDY u. J. H. LAKEY (1995 b): Copper binding to the N-terminal tandem repeat region of mammalian and avian prion protein: structural studies using synthetic peptides. Biochem. Biophys. Res. Commun. 214, 3, 993-999

HOURRIGAN, J. L., A. L. KLINGSPORN, H. A. MCDANIEL u. M. N. RIEMENSCHNEIDER (1969): Natural scrapie in a goat. J. Am. Vet. Med. Assoc. 154, 5, 538-539


HOURRIGAN, J. L., u. A. L. KLINGSPORN (1996): Scrapie: studies on vertical and horizontal transmission. In: C. J. GIBBS (Hrsg.): Bovine Spongiform Encephalopathy. The BSE Dilemma. Verlag Springer, New York, S. 59-83

HOUSTON, F., J. D. FOSTER, A. CHONG, N. HUNTER u. C. J BOSTOCK (2000): Transmission of BSE by blood transfusion in sheep. Lancet 356, 9234, 999-1000

HOUSTON, F., W. GOLDMANN, A. CHONG, M. JEFFREY, L. GONZÁLEZ, J. FOSTER, D. PARNHAM u. N. HUNTER (2003): Prion diseases: BSE in sheep bred for resistance to infection. Nature 423, 6939, 498

HUANG, Z., J. M. GABRIEL, M. A. BALDWIN, R. J. FLETTERICK, S. B. PRUSINER, u. F. E. COHEN (1994): Proposed three-dimensional structure for the cellular prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 15, 7139-7143

HUNTER, N., J. FOSTER, A. CHONG, S. MCCUTCHEON, D. PARNHAM, S. EATON, C. MACKENZIE u. F. HOUSTON (2002): Transmission of prion diseases by blood transfusion. J. Gen. Virol. 83, Pt 11, 2897-2905

HUNTER, N., J. D. FOSTER, W. GOLDMANN, M. J. STEAR, J. HOPE u. C. BOSTOCK (1996): Natural scrapie in a closed flock of Cheviot sheep occurs only in specific PrP genotypes. Arch. Virol. 141, 5, 809-824

IANNUZZI, L., R. PALOMBA, G. P. DIMEO, A. PERUCATTI u. L. FERRARA (1998): Comparative FISH-mapping of the prion protein gene (PRNP) on cattle, river buffalo, sheep and goat chromosome. Cytogenet. Cell Genet. 81, 3-4, 202-204

JEFFREY, M., I. BEGARA-MCGORUM, S. CLARK, S. MARTIN, J. CLARK, M. CHAPLIN u. L. GONZÁLEZ (2002): Occurrence and distribution of infection-specific PrP in tissues of clinical scrapie cases and cull sheep from scrapie-affected farms in Shetland. J. Comp. Pathol. 127, 4, 264-273

JEFFREY, M., L. GONZÁLEZ, A. ESPENES, C. M. PRESS, S. MARTIN, M. CHAPLIN, L. DAVIS, T. LANDSVERK, C. MACALDOWIE, S. EATON u. G. MCGOVERN (2006 a): Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapie-susceptible and scrapie-resistant sheep. J. Pathol. 209, 1, 4-14

JEFFREY, M., C. M. GOODSIR, A. HOLLIMAN, R. J. HIGGINS, M. E. BRUCE, P. A. MCBRIDE u. J. R. FRASER (1998):


Determination of the frequency and distribution of vascular and parenchymal amyloid with polyclonal and N-terminal-specific PrP antibodies in scrapie-affected sheep and mice. Vet. Rec. 142, 20, 534-537

JEFFREY, M., S. MARTIN u. L. GONZÁLEZ (2003): Cell-associated variants of disease-specific prion protein immunolabelling are found in different sources of sheep transmissible spongiform encephalopathy. J. Gen. Virol. 84, Pt 4, 1033-1045

JEFFREY, M., S. MARTIN, L. GONZÁLEZ, J. FOSTER, J. P. LANGEVELD, F. G. VAN ZIJDERVELD, J. GRASSI u. N. HUNTER (2006 b): Immunohistochemical features of PrP(d) accumulation in natural and experimental goat transmissible spongiform encephalopathies. J. Comp. Pathol. 134, 2-3, 171-181

JEFFREY, M., S. MARTIN, L. GONZÁLEZ, S. J. RYDER, S. J. BELLWORTHY u. R. JACKMAN (2001 a): Differential diagnosis of infections with the bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie agents in sheep. J. Comp. Pathol. 125, 4, 271-284

JEFFREY M., S. MARTIN, J. R. THOMSON, W. S. DINGWALL, I. BEGARA-MCGORUM u. L. GONZÁLEZ (2001 b): Onset and distribution of tissue prp accumulation in scrapie-affected suffolk sheep as demonstrated by sequential necropsies and tonsillar biopsies. J. Comp. Pathol. 125, 1, 48-57

JEFFREY, M., S. RYDER, S. MARTIN, S. A. HAWKINS, L. TERRY, C. BERTHELIN-BAKER u. S. J. BELLWORTHY (2001 c): Oral inoculation of sheep with the agent of bovine spongiform encephalopathy (BSE). 1. Onset and distribution of disease-specific PrP accumulation in brain and viscera. J. Comp. Pathol. 124, 4, 280-289

KAATZ, M., C. HOFFMANN, U. ZIEGLER, A. BALKEMA-BUSCHMANN, B. HAMMERSCHMIDT, M. KELLER, A. OELSCHLEGEL, L. MCINTYRE, M. H. GROSCHUP (2011): Spread of classiscal BSE prions from the gut via the peripheral nervous system to the brain. Am. J. Path.: submitted

KARIV-INBAL, Z., T. BEN-HUR, N. C. GRIGORIADIS, R. ENGELSTEIN u. R. GABIZON (2006): Urine from scrapie-infected hamsters comprises low levels of prion infectivity. Neurodegener. Dis. 3, 3, 123-128

KASCSAK, R. J., R. RUBENSTEIN, P. A. MERZ, R. I. CARP, H. M. WISNIEWSKI u. H. DIRINGER (1985): Biochemical differences among scrapie-associated fibrils support the biological diversity of scrapie agents.


J. Gen. Virol. 66, Pt 8, 1715-1722

KESSELS, H. W., L. N. NGUYEN, S. NABAVI u. R. MALINOW (2010): The prion protein as a receptor for amyloid-beta. Nature 466, 7308, E3-4

KLAMT, F., F. DAL-PIZZOL, M. L. J. R. CONTE DA FROTA, R. WALZ, M. E. ANDRADES, E. G. DA SILVA, R. R. BRENTANI, I. IZQUIERDO u. J. C. FONSECA MOREIRA (2001): Imbalance of antioxidant defense in mice lacking cellular prion protein. Free Radic. Biol. Med. 30, 10, 1137-1144

KLINGEBORN, M., L. WIK, M. SIMONSSON, L. H. RENSTRÖM, T. OTTINGER u. T. LINNÉ (2006): Characterization of proteinase K-resistant N- and C-terminally truncated PrP in Nor98 atypical scrapie. J. Gen. Virol. 87, Pt 6, 1751-1760

KOCISKO, D. A., J. H. COME, S. A. PRIOLA, B. CHESEBRO, G. J. RAYMOND, P. T. LANSBURY u. B. CAUGHEY (1994): Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature 370, 6439, 471-474

KONOLD, T., G. BONE, A. VIDAL-DIEZ, R. TORTOSA, A. DAVIS, G. DEXTER, P. HILL, M. JEFFREY, M. M. SIMMONS, M. J. CHAPLIN, S. J. BELLWORTHY u. C. BERTHELIN-BAKER (2008 a): Pruritus is a common feature in sheep infected with the BSE agent. BMC Vet. Res. 4, 16

KONOLD, T., A. DAVIS, G. BONE, J. BRACEGIRDLE, S. EVERITT, M. CHAPLIN, G. C. SAUNDERS, S. CAWTHRAW u. M. M. SIMMONS (2007): Clinical findings in two cases of atypical scrapie in sheep: a case report. BMC Vet. Res. 3, 2

KONOLD, T., S. J. MOORE, S. J. BELLWORTHY u. H. A. SIMMONS (2008 b): Evidence of scrapie transmission via milk. BMC Vet. Res. 4, 14

KUCZIUS, T., u. M. H. GROSCHUP (1999): Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Mol. Med. 5, 6, 406-418

KUCZIUS, T., I. HAIST u. M. H. GROSCHUP (1998): Molecular analysis of bovine spongiform encephalopathy and scrapie strain variation. J. Infect. Dis. 178, 3, 693-699

KUROSAKI, Y., N. ISHIGURO, M. HORIUCHI u. M. SHINAGAWA (2004):


Polymorphisms of caprine PrP gene detected in Japan. J. Vet. Med. Sci. 67, 3, 321-323

LACROUX, C., F. CORBIÈRE, G. TABOURET, S. LUGAN, P. COSTES, J. MATHEY, J. M. DELMAS, J. L. WEISBECKER, G. FOUCRAS, H. CASSARD, J. M. ELSEN, F. SCHELCHER u. O. ANDRÉOLETTI (2007): Dynamics and genetics of PrPSc placental accumulation in sheep. J. Gen. Virol. 88, Pt 3, 1056-1061

LACROUX, C., S. SIMON, S. L. BENESTAD, S. MAILLET, J. MATHEY, S. LUGAN, F. CORBIÈRE, H. CASSARD, P. COSTES, D. BERGONIER, J. L. WEISBECKER, T. MOLDAL, H. SIMMONS, F. LANTIER, C. FERAUDET-TARISSE, N. MOREL, F. SCHELCHER, J. GRASSI u. O. ANDRÉOLETTI (2008): Prions in milk from ewes incubating natural scrapie. PLoS Pathog. 4, 12, e1000238

LANTIER, F., C. HOFFMANN, P. BERTHON, S. FREYSE, I. LANTIER, A. BALKEMA-BUSCHMANN, C. ROSSIGNOL, K. TAUSCHER, H. LE ROUX, F. BARILLET, O. ANDRÉOLETTI u. M. H. GROSCHUP (2010): Nervous dissemination of BSE in orally infected goats. in: Prion, Sept 8-11, Salzburg, 2010 Preliminary Conference Program and Abstracts, S. 155

LASMÉZAS C. I., J. P. DESLEY, O. ROBAIN, A. JAEGLY, V. BERINGUE, J. M. PEYRIN, J. G. FOURNIER, J. J. HAUW, J. ROSSIER u. D. DORMONT (1997): Transmission of the BSE agent to mice in the absence of detectable abnormal prion protein. Science 275, 5298, 402-405

LAURÉN, J., D. A. GIMBEL, H. B. NYGAARD, J. W. GILBERT u. S. M. STRITTMATTER (2009): Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plastiicity by amyloid-beta oligomers. Nature 457, 7233, 1128-1132

LE DUR, A., V. BÉRINGUE, O. ANDRÉOLETTI, F. REINE, T. L. LAÏ, T. BARON, B. BRATBERG, J. L. VILOTTE, P. SARRADIN, S. L. BENESTAD u. H. LAUDE (2005): A newly identified type of scrapie agent can naturally infect sheep with resistant PrP genotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 44, 16031-16036

LEZMI, S., S. MARTIN, S. SIMON, E. COMOY, A. BENCSIK, J. P. DESLYS, J. GRASSI, M. JEFFREY u. T. BARON (2004): Comparative molecular analysis of the abnormal prion protein in field scrapie cases and experimental bovine spongiform encephalopathy in sheep by use of Western blotting and immunohistochemical methods. J. Virol. 78, 7, 3654-3662

LIGIOS, C., G. M. CANCEDDA, I. MARGALITH, C. SANTUCCIU, L. MADAU, C. MAESTRALE, M. BASAGNI, M. SABA u. M. HEIKENWALDER (2007):


Intraepithelial and interstitial deposition of pathological prion protein in kidneys of scrapie-affected sheep. PLoS ONE 2, 9, e859

LIGIOS, C., M. JEFFREY, S. J. RYDER, S. J. BELLWORTHY u. M. M. SIMMONS (2002): Distinction of scrapie phenotypes in sheep by lesion profiling. J. Comp. Pathol. 127, 1, 45-57

LIGIOS, C., C. J. SIGURDSON, C. SANTUCCIU, G. CARCASSOLA, G. MANCO, M. BASAGNI, C. MAESTRALE, M. G. CANCEDDA, L. MADAU u. A. AGUZZI (2005): PrPSc in mammary glands of sheep affected by scrapie and mastitis. Nat. Med. 11, 11, 1137-1138

MADDISON, B. C., C. A. BAKER, H. C. REES, L. A. TERRY, L. THORNE, S. J. BELLWORTHY, G. C. WHITELAM u. K. C. GOUGH (2009): Prions are secreted in milk from clinically normal scrapie-exposed sheep. J. Virol. 83, 16, 8293-8296

MADDISON, B. C., H. C. REES, C. A. BAKER, M. TAEMA, S. J. BELLWORTHY, L. THORNE, L. A. TERRY u. K. C. GOUGH (2010): Prions are secreted into the oral cavity in sheep with preclinical scrapie. J. Infect. Dis. 201, 11, 1672-1676

MANSON, J. C., A. R. CLARKE, M. L. HOOPER, L. AITCHISON, I. MCCONNELL u. J. HOPE (1994): 129/Ola mice carrying a null mutation in PrP that abolishes mRNA production are developmentally normal. Mol. Neurobiol. 8, 2-3, 121-127

MANSON, J. C., J. HOPE, A. R. CLARKE, A. JOHNSTON, C. BLACK u. N. MACLEOD (1995): PrP gene dosage and long term potentiation. Neurodegeneration 4, 1, 113-114

MANUELIDIS, L. (1994): Dementias, neurodegeneration, and viral mechanisms of disease from the perspective of human transmissible encephalopathies. Ann. N. Y. Acad. Sci. 724, 259-281

MANUELIDIS, L., T. SKLAVIADIS, A. AKOWITZ u. W. FRITCH (1995): Viral particles are required for infection in neurodegenerative Creutzfeldt-Jakob disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11, 5124-5128

MARSH, R. F., u. R. H. KIMBERLIN (1975): Comparison of scrapie and transmissible mink encephalopathy in hamsters. II. Clinical signs, pathology, and pathogenesis. J. Infect. Dis. 131, 2, 104-110


MARTIN, S., L. GONZÁLEZ, A. CHONG, F. E. HOUSTON, N. HUNTER u. M. JEFFREY (2005): Immunohistochemical characteristics of disease-associated PrP are not altered by host genotype or route of inoculation following infection of sheep with bovine spongiform encephalopathy. J. Gen. Virol. 86, Pt 3, 839-848

MCGOWAN, J. P. (1922): Scrapie in sheep. Scottish J. Agric. 5, 365-375

MILLER, J. M., A. L. JENNY, W. D. TAYLOR, R. F. MARSH, R. RUBENSTEIN u. R. E. RACE (1993): Immunohistochemical detection of prion protein in sheep with scrapie. J. Vet. Diagn. Invest. 5, 3, 309-316

NENTWIG, A., A. OEVERMANN, D. HEIM, C. BOTTERON, K. ZELLWEGER, C. DRÖGEMÜLLER, A. ZURBRIGGEN u. T. SEUBERLICH (2007): Diversity in neuroanatomical distribution of abnormal prion protein in atypical scrapie. PLoS Pathog. 3, 6, e82

NONNO, R., E. ESPOSITO, G. VACCARI, M. CONTE, S. MARCON, M. DI BARI, C. LIGIOS, G. DI GUARDO u. U. AGRIMI (2003): Molecular analysis of cases of Italian sheep scrapie and comparison with cases of bovine spongiform encephalopathy (BSE) and experimental BSE in sheep. J. Clin. Microbiol. 41, 9, 4127-4133

OESCH, B., D. WESTAWAY, M. WALCHLI, M. P. MCKINLEY, S. B. KENT, R. AEBERSOLD, R. A. BARRY, P. TEMPST, D. B. TEPLOW, L. E. HOOD, S. B. PRUSINER u. C. WEISSMANN (1985): A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell 40, 4, 735-746

ONNASCH, H., H. M. GUNN, B. J. BRADSHAW, S. L. BENESTAD u. H. F. BASSETT (2004): Two Irish cases of scrapie resembling Nor98. Vet. Rec. 155, 20, 636-637

ORGE, L., A. GALO, C. MACHADO, C. LIMA, C. OCHOA, J. SILVA, M. RAMOS u. J. P. SIMAS (2004): Identification of putative atypical scrapie in sheep in Portugal. J. Gen. Virol. 85, Pt 11, 3487-3491

O'ROURKE, K. I., T. V. BASZLER, T. E. BESSER, J. M. MILLER, R. C. CUTLIP, G. A. WELLS, S. J. RYDER, S. M. PARISH, A. N. HAMIR, N. E. COCKETT, A. JENNY u. D. P. KNOWLES (2000): Preclinical diagnosis of scrapie by immunohistochemistry of third eyelid lymphoid tissue. J. Clin. Microbiol. 38, 9, 3254-3259


O'ROURKE, K. I., T. V. BASZLER, S. M. PARISH u. D. P. KNOWLES (1998): Preclinical detection of PrPSc in nictitating membrane lymphoid tissue of sheep. Vet. Rec. 142, 18, 489-491

PAN, K. M., M. BALDWIN, J. NGUYEN, M. GASSET, A. SERBAN, D. GROTH, I. MEHLHORN, Z. HUANG, R. J. FLETTERICK, F. E. COHEN u. A. L. ET (1993): Conversion of alpha-helices into beta-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 23, 10962-10966

PAPASAVVA-STYLIANOU, P., M. KLEANTHOUS, P. TOUMAZOS, P. MAVRIKIOU u. P. LOUCAIDES (2007): Novel polymorphisms at codons 146 and 151 in the prion protein gene of Cyprus goats, and their association with natural scrapie. Vet. J. 173, 2, 459-462

PAPASAVVA-STYLIANOU, P., O. WINDL, G. SAUNDERS, P. MAVRIKIOU, P. TOUMAZOS u. C. KAKOYIANNIS (2010): PrP gene polymorphisms in Cyprus goats and their association with resistance or susceptibility to natural scrapie. Vet. J. 187, 2, 245-250

PARRY, H. B. (1983): Scrapie disease in sheep Verlag Academic Press Inc., London

PATTISON, I. H. (1965): Experiments with scrapie with special refrence to the nature of the agent and pathology of the disease. In GADJUSEK, C. J., C. J. GIBBS u. M. P. ALPERS (Hrsg.): Slow, Latent ad Temperate Virus Infections. Verlag US Government Printing, Washington, NINDB Monograph 2, S. 249-257

PATTISON, I. H., u. G. C. MILLSON (1960): Further observations on the experimental production of scrapie in goats and sheep. J. Comp. Pathol. 70, 182-193

PATTISSON, I. H., u. G. C. MILLSON (1961): Scrapie produced experimentally in goats with special reference to the clinical syndrome. J. Comp. Pathol. 71, 101-109

PATTISON, I. H., u. G. C. MILLSON (1962): Distribution of the scrapie agent in the tissues of experimentally inoculated goats. J. Comp. Pathol. 72, 233-244

PATTISON, I. H., M. N. HOARE, J. N. JEBBETT u. W. A. WATSON (1972): Spread of scrapie to sheep and goats by oral dosing with foetal membranes from scrapie-affected sheep.


Vet. Rec. 90, 17, 465-468

PATTISON, I. H., M. N. HOARE, J. N. JEBBETT u. W. A. WATSON (1974): Further observations on the production of scrapie in sheep by oral dosing with foetal membranes from scrapie-affected sheep. Br. Vet. J. 130, 4, IXV-IXVII

PICCARDO, P., J. C. MANSON, D. KING, B. GHETTI u. R. M. BARRON (2007): Accumulation of prion protein in the brain that is not associated with transmissible disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11, 4712-4717

POLAK, M. P., W. ROZEK, J. ROLA u. J. F. ZMUDZINSKI (2004): Prion protein glycoforms from BSE cases in Poland. Bull. Vet. Inst. Pulawy 48, 204-205

PRUSINER, S. B. (1982): Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science 216, 4542, 136-144

PRUSINER, S. B. (1989): Scrapie prions. Annu. Rev. Microbiol. 43, 345-374

PRUSINER, S. B., M. P. MCKINLEY, K. A. BOWMAN, D. C. BOLTON, P. E. BENDHEIM, D. F. GROTH u. G. G. GLENNER (1983): Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell 35, 2 Pt 1, 349-358

PRUSINER, S. B., u. M. R. SCOTT (1997): Genetics of prions. Annu. Rev. Genet. 31, 139-175

PRUSINER, S. B., M. SCOTT, D. FOSTER, K. M. PAN, D. GROTH, C. MIRENDA, M. TORCHIA, S. L. YANG, D. SERBAN u. G. A. CARLSON (1990): Transgenetic studies implicate interactions between homologous PrP isoforms in scrapie prion replication. Cell 63, 4, 673-686

R DEVELOPMENT CORE TEAM (2008): R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, ISBN 3-900051-07-0 [Internet: URL http://www.R-project.org] (abgerufen 31.12.2008)

RACE, R., A. JENNY u. D. SUTTON (1998): Scrapie infectivity and proteinase K-resistant prion protein in sheep placenta, brain, spleen, and lymph node: implications for transmission and ante mortem diagnosis. J. Infect. Dis. 178, 4, 949-953


RACE, R., M. OLDSTONE u. B. CHESEBRO (2000): Entry versus blockade of brain infection following oral or intraperitoneal scrapie administration: role of prion protein expression in peripheral nerves and spleen. J. Virol. 74, 2, 828-833

RECKZEH, C., C. HOFFMANN, A. BUSCHMANN, S. BUDA, K. D. BUDRAS, K. F. RECKLING, S. BELLMANN, H: KNOBLOCH, G. ERHARDT, R. FRIES u. M. H. GROSCHUP (2007): Rapid testing leads to the underestimation of the scrapie prevalence in an affected sheep and goat flock. Vet. Microbiol. 123, 4, 320-327

RIEK, R., S. HORNEMANN, G. WIDER, M. BILLETER, R. GLOCKSHUBER u. K. WUTHRICH (1996): NMR structure of the mouse prion protein domain PrP(121-321). Nature 382, 6587, 180-182

RIEK, R., S. HORNEMANN, G. WIDER, R. GLOCKSHUBER u. K. WUTHRICH (1997): NMR characterization of the full-length recombinant murine prion protein, mPrP(23-231). FEBS Lett. 413, 2, 282-288

RIGTER, A., J. P. LANGEVELD, D. TIMMERS-PAROHI, J. G. JACOBS, P. L. MOONEN u. A. BOSSERS (2007): Mapping of possible prion protein self-interaction domains using peptide arrays. BMC Biochem. 8, 6

ROMEIS, B. (1989): Mikroskopische Technik. 17. Aufl. Verlag Urban und Schwarzenberg, München

RUBENSTEIN, R., P. A: MERZ, R. J. KASCSAK, C. L. SCALICI, M. C. PAPINI, R. I. CARP u. R. H. KIMBERLIN (1991): Scrapie-infected spleens: analysis of infectivity, scrapie-associated fibrils, and protease-resistant proteins. J. Infect. Dis. 164, 1, 29-35

RYDER, S. J., Y. I. SPENCER, P. J. BELLERBY u. S. A. MARCH (2001): Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: the spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. Vet. Rec. 148, 1, 7-13

RYDER, S., G. DEXTER, S. BELLWORTHY u. S. TONGUE (2004): Demonstration of lateral transmission of scrapie between sheep kept under natural conditions using lymphoid tissue biopsy. Res. Vet. Sci. 76, 3, 211-217

RYDER, S. J., G. E. DEXTER, L. HEASMAN, R. WARNER u. S. J. MOORE (2009): Accumulation and dissemination of prion protein in experimental sheep scrapie in the natural


host. BMC Vet. Res. 5, 9

SAÁ, P., J. CASTILLA u. C. SOTO (2006): Presymptomatic detection of prions in blood. Science 313, 5783, 92-94

SABORIO, G. P., B. PERMANNE u. C. SOTO (2001): Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature 411, 6839, 810-813

SAFAR, J., H. WILLE, V. ITRI, D. GROTH, H. SERBAN, M. TORCHIA, F. E. COHEN u. S. B. PRUSINER (1998): Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat. Med. 4, 10, 1157-1165

SCHREUDER, B. E., L. J. VAN KEULEN, M. E. VROMANS, J. P. LANGEVELD u. M. A. SMITS (1996): Preclinical test for prion diseases. Nature 381, 6583, 563

SCHREUDER B. E., L. J. VAN KEULEN, M. E. VROMANS, J. P. LANGEVELD u. M. A. SMITS (1998): Tonsillar biopsy and PrPSc detection in the preclinical diagnosis of scrapie. Vet. Rec. 142, 21, 564-568

SCOTT, M. R., J. SAFAR, G. TELLING, O. NGUYEN, D. GROTH, M. TORCHIA, R. KOEHLER, P. TREMBLAY, D. WALTHER, F. E. COHEN, S. J. DEARMOND u. S. B. PRUSINER (1997): Identification of a prion protein epitope modulating transmission of bovine spongiform encephalopathy prions to transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 26, 14279-14284

SEUBERLICH, T., C. BOTTERON, S. L. BENESTAD, H. BRÜNISHOLZ, R. WYSS, U. KIHM, H. SCHWERMER, M. FRIESS, A. NICOLIER, D. HEIM u. A. ZURBRIGGEN (2007): Atypical scrapie in a Swiss goat and implications for transmissible spongiform encephalopathy surveillance. J. Vet. Diagn. Invest. 19, 1, 2-8

SIMMONS, M. M., P. HARRIS, M. JEFFREY, S. C. MEEK, I. W. BLAMIRE u. G. A. WELLS (1996): BSE in Great Britain: consistency of the neurohistopathological findings in two random annual samples of clinically suspect cases. Vet. Rec. 138, 8, 175-177

SISÓ S., L. GONZÁLEZ, M. JEFFREY, S. MARTIN, F. CHIANINI u. P. STEELE (2006): Prion protein in kidneys of scrapie-infected sheep.


Vet. Rec. 159, 10, 327-328

SOFIANIDIS, G., V. PSYCHAS , C. BILLINIS, V. SPYROU, S. ARGYROUDIS u. I. VLEMMAS (2008): Atypical PrPsc distribution in goats naturally affected with scrapie. J. Comp. Pathol. 138, 2-3, 90-101

SOMERVILLE, R. A (1999): Host and transmissible spongiform encephalopathy agent strain control glycosylation of PrP. J. Gen. Virol. 80, Pt 7, 1865-1872

SOMERVILLE, R. A., A. CHONG, O. U. MULQUEEN, C. R. BIRKETT, S. C. WOOD u. J. HOPE (1997): Biochemical typing of scrapie strains. Nature 386, 6625, 564

SOMERVILLE, R. A., S. HAMILTON u. K. FERNIE (2005): Transmissible spongiform encephalopathy strain, PrP genotype and brain region all affect the degree of glycosylation of PrPSc. J. Gen. Virol. 86, Pt 1, 241-246

SPRAKER, T. R., K. I. O'ROURKE, A. BALACHANDRAN, R. R. ZINK, B. A. CUMMINGS, M. W. MILLER u. B. E. POWERS (2002): Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J. Vet. Diagn. Invest. 14, 1, 3-7

STACK, M. J., M. J. CHAPLIN u. J. CLARK (2002): Differentiation of prion protein glycoforms from naturally occurring sheep scrapie, sheep-passaged scrapie strains (CH1641 and SSBP1), bovine spongiform encephalopathy (BSE) cases and Romney and Cheviot breed sheep experimentally inoculated with BSE using two monoclonal antibodies. Acta Neuropathol. 104, 3, 279-286

STEELE, A. D., J. G. EMSLEY, P. H. OZDINLER, S. LINDQUIST u. J. D. MACKLIS (2006): Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 9, 3416-3421

SWEENEY, T., T. KUCZIUS, M. MCELROY, M. G. PARADA u. M. H. GROSCHUP (2000): Molecular analysis of Irish sheep scrapie cases. J. Gen. Virol. 81, Pt 8, 2121

THORGEIRSDOTTIR, S., G. GEORGSSON, E. REYNISSON, S. SIGURDARSON u. A. PALSDOTTIR (2002): Search for healthy carriers of scrapie: an assessment of subclinical infection of sheep in an


Icelandic scrapie flock by three diagnostic methods and correlation with PrP genotypes. Arch. Virol. 147, 4, 709-722

THORNE, L., u. L. A. TERRY (2008): In vitro amplification of PrPSc derived from the brain and blood of sheep infected with scrapie. J. Gen. Virol. 89, Pt 12, 3177-3184

THURING, C. M., J. H. ERKENS, J. G. JACOBS, A. BOSSERS, L. J. VAN KEULEN, G. J. GARSSEN, F. G. VAN ZIJDERVELD, S. J. RYDER, M. H. GROSCHUP, T. SWEENEY u. J. P. LANGEVELD (2004): Discrimination between scrapie and bovine spongiform encephalopathy in sheep by molecular size, immunoreactivity, and glycoprofile of prion protein. J. Clin. Microbiol. 42, 3, 972-980

THURING, C. M., M. C. MCELROY, T. SWEENEY u. E. WEAVERS (2000): Suitability of protuberances on the third eyelids of sheep as a biopsy site for lymphoid follicles. Vet. Rec. 147, 22, 631-632

TOBLER, I., S. E. GAUS, T. DEBOER, P. ACHERMANN, M. FISCHER, T. RÜLICKE, M. MOSER, B. OESCH, P. A. MCBRIDE u. J. C. MANSON (1996): Altered circadian activity rhythms and sleep in mice devoid of prion protein. Nature 380, 6575, 639-642

TOUMAZOS, P. (1988): First report of ovine scrapie in Cyprus. Br. Vet. J. 144, 1, 98-100

TOUMAZOS, P. (1991): Scrapie in Cyprus. Br. Vet. J. 147, 2, 147-154

TUO, W., K. I. O'ROURKE, D. ZHUANG, W. P. CHEEVERS, T. R. SPRAKER u. D. P. KNOWLES (2002): Pregnancy status and fetal prion genetics determine PrPSc accumulation in placentomes of scrapie-infected sheep. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9, 6310-6315

TUO, W., D. ZHUANG, D. P. KNOWLES, W. P. CHEEVERS, M. S. SY u. K. I. O'ROURKE (2001): Prp-c and Prp-Sc at the fetal-maternal interface. J. Biol. Chem. 276, 21, 18229-18234

VACCARI, G., M. A. DI BARI, L. MORELLI, R. NONNO, B. CHIAPPINI, G. ANTONUCCI, S. MARCON, E. ESPOSITO, P. FAZZI, N. PALAZZINI, P. TROIANO, A. PETRELLA, G. DI GUARDO u. U. AGRIMI (2006): Identification of an allelic variant of the goat PrP gene associated with resistance to scrapie.


J. Gen. Virol. 87, Pt 5, 1395-1402

VACCARI, G., C. H. PANAGIOTIDIS, C. ACIN, S. PELETTO, F. BARILLET, P. ACUTIS, A. BOSSERS, J. LANGEVELD, L. VAN KEULEN, T. SKLAVIADIS, J. J. BADIOLA, O. ANDRÉOLETTI, M. H. GROSCHUP, U. AGRIMI, J. FOSTER u. W. GOLDMANN (2009): State-of-the-art review of goat TSE in the European Union, with special emphasis on PRNP genetics and epidemiology. Vet. Res. 40, 5, 48

VALDEZ, R. A., M. J. ROCK, A. K. ANDERSON u. K. I. O'ROURKE (2003): Immunohistochemical detection and distribution of prion protein in a goat with natural scrapie. J. Vet. Diagn. Invest. 15, 2, 157-162

VAN KEULEN, L. J., B. E. SCHREUDER, R. H. MELOEN, G. MOOIJ-HARKES, M. E. VROMANS u. J. P. LANGEVELD (1996): Immunohistochemical detection of prion protein in lymphoid tissues of sheep with natural scrapie. J. Clin. Microbiol. 34, 5, 1228-1231

VAN KEULEN, L. J., B. E. SCHREUDER, R. H. MELOEN, M. POELEN-VAN DEN BERG, G. MOOIJ-HARKES, M. E. VROMANS u. J. P. LANGEVELD (1995): Immunohistochemical detection and localization of prion protein in brain tissue of sheep with natural scrapie. Vet. Pathol. 32, 3, 299-308

VAN KEULEN, L. J., B. E. SCHREUDER, M. E. VROMANS, J. P. LANGEVELD u. M. A. SMITS (1999): Scrapie-associated prion protein in the gastrointestinal tract of sheep with natural scrapie. J. Comp. Pathol. 121, 1, 55-63

VAN KEULEN, L. J., B. E. SCHREUDER, M. E. VROMANS, J. P. LANGEVELD u. M. A. SMITS (2000): Pathogenesis of natural scrapie in sheep. Arch. Virol. Suppl. 16, 57-71

VAN KEULEN, L. J., M. E. VROMANS, C. H. DOLSTRA, A. BOSSERS u. F. G. VAN ZIJDERVELD (2008): Pathogenesis of bovine spongiform encephalopathy in sheep. Arch. Virol. 153, 445-453

VAN KEULEN, L. J., M. E. VROMANS u. F. G. VAN ZIJDERVELD (2002): Early and late pathogenesis of natural scrapie infection in sheep. APMIS 110, 1, 23-32

VASCELLARI, M., G. M. AUFIERO, R. NONNO, U. AGRIMI, G. VACCARI, L. BASILICATA, C. FALCARO, M. MANCIN, S. MARCON u. F. MUTINELLI (2005): Diagnosis and PrP genotype target of scrapie in clinically healthy sheep of Massese breed in


the framework of a scrapie eradication programme. Arch. Virol. 150, 10, 1959-1976

VASCELLARI, M., R. NONNO, F. MUTINELLI, M. BIGOLARO, M. A. DI BARI, E. MELCHIOTTI, S. MARCON, C. D'AGOSTINO, G. VACCARI, M. CONTE, L. De GROSSI, F. ROSONE, F. GIORDANI u. U. AGRIMI (2007): PrPSc in salivary glands of scrapie-affected sheep. J. Virol. 81, 9, 4872-4876

VILOTTE, J. L., S. SOULIER, R. ESSALMANI, M. G. STINNAKRE, D. VAIMAN, L. LEPOURRY, J. C. DA SILVA, N. BESNARD, M. DAWSON, A. BUSCHMANN, M. GROSCHUP, S. PETIT, M. F. MADELAINE, S. RAKATOBE, A. LE DUR, D. VILETTE u. H. LAUDE (2001): Markedly increased susceptibility to natural sheep scrapie of transgenic mice expressing ovine prp. J. Virol. 75, 13, 5977-5984

WANG, S., W. C. FOOTE, D. L. SUTTON, A. MACIULIS, J. M. MILLER, R. C. EVANS, G. R. HOLYOAK, J. W. CALL, T. D. BUNCH, W. D. TAYLOR u. M. R. MARSHALL (2001): Preventing experimental vertical transmission of scrapie by embryo transfer. Theriogenology 56, 2, 315-327

WELLS, G. A., R. D. HANCOCK, W. A. COOLEY, M. S. RICHARDS, R. J. HIGGINS u. G. P. DAVID (1989): Bovine spongiform encephalopathy: diagnostic significance of vacuolar changes in selected nuclei of the medulla oblongata. Vet. Rec. 125, 21, 521-524

WELLS G. A., J. SPIROPOULOS, S. A. HAWKINS u. S. J. RYDER (2005): Pathogenesis of experimental bovine spongiform encephalopathy: preclinical infectivity in tonsil and observations on the distribution of lingual tonsil in slaughtered cattle. Vet. Rec. 156, 13, 401-407

WELLS, G. A., A. C. SCOTT, C. T. JOHNSON, R. F. GUNNING, R. D. HANCOCK, M. JEFFREY, M. DAWSON u. R. BRADLEY (1987): A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. Vet. Rec. 121, 18, 419-420

WELLS, G. A., Y. I. SPENCER u. M. HARITANI (1994): Configurations and topographic distribution of PrP in the central nervous system in bovine spongiform encephalopathy: an immunohistochemical study. Ann. N. Y. Acad. Sci. 724, 350-352

WIGGINS, R. C. (2009): Prion stability and infectivity in the environment. Neurochem. Res. 34, 1, 158-168


WILESMITH, J. W., J. B. RYAN u. M. J. ATKINSON (1991): Bovine spongiform encephalopathy: epidemiological studies on the origin. Vet. Rec. 128, 9, 199-203

WOOD, J. N., S. H. DONE, G. C. PRITCHARD u. M. J. WOOLDRIDGE (1992): Natural scrapie in goats: case histories and clinical signs. Vet. Rec. 131, 4, 66-68

WOOD, J. L., I. S. MCGILL, S. H. DONE u. R. BRADLEY (1997): Neuropathology of scrapie: a study of the distribution patterns of brain lesions in 222 cases of natural scrapie in sheep, 1982-1991. Vet. Rec. 140, 7, 167-174

ZAHN, R., A. LIU, T. LUHRS, R. RIEK, C. VON SCHROETTER u. F. LOPEZ GARCIA (2000): NMR solution structure of the human prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 145-150

ZHANG, L., N. LI, B. FAN, M. FANG u. W. XU (2004): PRNP polymorphisms in Chinese ovine, caprine and bovine breeds. Anim. Genet. 35, 6, 457-461

ZLOTNIK, I. (1958): The histopathology of the brain stem of sheep affected with natural scrapie. J. Comp. Pathol. 68, 2, 148-166

8.1 Gesetze und Verordnungen

2001

Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des europäischen Parlaments und des Rates vom 22.Mai 2001 mit Vorschriften zur Verhütung, Kontrolle und Tilgung bestimmter transmissibler spongifor-mer Enzephalopathien (zuletzt geändert durch Verordnung (EU) #r. 189/2011 der Kommissi-

on vom 25. Februar 2011, L53/56)

(Amtsblatt L147/1 vom 31.05.2001)

2002

Verordnung zur fleischhygienerechtlichen Untersuchung von geschlachteten Rindern auf BSE (BSE-Untersuchungsverordnung - BSEUntersV) vom 18. September 2002 (zuletzt geändert

durch Artikel 1 der Verordnung vom 13. Juli 2011, BGBl. I S. 1390) (BGBl. I S. 3730; 2004 I S. 1405)


2005

Verordnung (EG) Nr. 36/2005 der Kommission vom 12. Januar 2005 zur Änderung der An-hänge III und X der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der epidemiologischen Überwachung auf transmissible spongiforme En-zephalopathien bei Rindern, Schafen und Ziegen

(Amtsblatt L10/9 vom 13.1.2005)

2006

Verordnung (EG) Nr. 1041/2006 der Kommission vom 7. Juli 2006 zur Änderung des An-hangs III der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Überwachung transmissibler spongiformer Enzephalopathien bei Schafen

(Amtsblatt L187/10 vom 8.7.2006)

2010

Verordnung (EU) Nr. 956/2010 der Kommission vom 22. Oktober 2010 zur Änderung des Anhangs X der Verordnung (EG) Nr. 999/2001 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Liste der Schnelltests

(Amtsblatt der Europäischen Union L279/10 vom 23.10.2010)

132 Anhang

9 Anhang

9.1 Material

9.1.1 Antikörper gegen das Prion-Protein

Tab. 21 Übersicht über die in der Immunhistochemie und im Westernblot verwendeten Erstantikör-per

Antikörper Epitop Tierart Verdünnung Bezugsquelle Literatur

Immunhistochemie

6C2 114-120 bov

Schaf, Rind 1:50 – 1:150 (chargen-abhängig)

Jan Langeveld, CIDC-Lelystad Wageningen UR, Niederlande

Rigter et al. 2007 Hoffmann et al. 2011

F99 220-225 shp

Schaf, Rind, Wildwieder-käuer

1:10000 VMRD, Pullmann, USA

O’Rourke et al. 2000 Spraker et al. 2002

L42 145-163 shp

Rind, Schaf, Mensch, Nerz, Ziege

1:250 FLI, Insel Riems Harmeyer et al. 1998 Hardt et al. 2000

Westernblot

P4 89-104 shp

Schaf, Rind 1:2000 R-Biopharm AG, Darmstadt

Harmeyer et al. 1998 Hardt et al. 2000 Thuring et al. 2004

L42 145-163 shp

Rind, Schaf, Mensch, Nerz, Ziege

1:2000 R-Biopharm AG, Darmstadt

Harmeyer et al. 1998 Hardt et al. 2000

bov = bovine, shp = sheep

9.1.1.1 Konjugate

Konjugate für die immunhistochemischen Untersuchungen:

• EnVisionTM–System-HorseRadish Peroxidase Labelled Polymer Anti-mouse (Dako,

Hamburg)

Konjugate für die Untersuchungen im Westernblot:

• Ziege-Anti-Maus IgG, spezifisch für die H + L-Ketten, mit alkalischer Phosphatase

gekoppelt (115-035-062, Dianova, Hamburg)

Anhang 133

• Anti-Histidin-Antikörper, RGS – His, zur Detektion des mit einem Histidin-Tag ver-

sehenen FLI-Markers (Qiagen, Hilden).

9.1.1.2 Vorbehandlung für die in der Immunhistologie verwendeten Antikörper

Tab. 22 Übersicht über die Vorbehandlungen der in der Immunhistologie verwendeten monoklonalen Antikörper mittels Ameisensäurebad, Blockierung der endogenen Peroxidase durch Was-serstoffperoxid (H2O2), Hitzebehandlung im Autoklaven, verschiedener Puffermedien oder Proteinase K (PK)-Verdau

Antikörper Ameisensäure Methanol

+H2O2 Autoklav

(121 °C, 3 bar) Puffer PK-Verdau

6C2 30 min 30 min 20 min Zitratpuffer,

(pH 6,0)

F99 30 min 30 min 20 min Zitratpuffer,

(pH 6,0)

L42 15 min 30 min PK-Puffer

5 min PK-Puffer, 15 min PK-Gebrauchslösung bei 37 °C

min = Minute, grau hinterlegt = Leerfeld

9.2 Histologische Methoden

9.2.1 Protokolle

9.2.1.1 Gewebeinfiltrationsautomat, Standardprotokoll

Formalin (NBF) 30 Minuten 37°C

Ethanol 70 %-ig 1 Stunde 37°C

Ethanol 80 %-ig 1 Stunde 37°C

Ethanol 96 %-ig I u. II je 1 Stunde 37°C

Isopropanol 96 %-ig I u. II je 1 Stunde 37°C

Xylol I u. II je 1 Stunde 37°C

Paraffin I, II u. III je 1 Stunde 60°C

9.2.1.2 Entparaffinisierung und Rehydrierung der histologischen Schnitte

Xylol I u. II je 5 Minuten

Isopropanol 96 %-ig I u. II je 3 Minuten

Ethanol 96 %-ig 2 Minuten

134 Anhang



9.2.1.3 Dehydrierung der histologischen Schnitte




Isopropanol 96 %-ig I u. II je 2 Minuten

Xylol I u. II je 3 Minuten

9.3 Schemata zur Auswertung von histologisch untersuchten Schnitten

Tab. 23 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Ausprägungsgrades vakuolärer Verände-rungen (Vakuolisierungen, spongiforme Veränderungen) in den Kerngebieten der Obexregi-on (nach Färbung mit Hämatoxylin-Eosin)

geringgradig ≤ 5 Vakuolen (10- er Objektiv)

mittelgradig 5-10 Vakuolen (10- er Objektiv)

hochgradig > 10 Vakuolen (10- er Objektiv)

Tab. 24 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils PrPSc-exprimierender Folli-kel/Ganglien an der Gesamtanzahl der untersuchten Follikel/Ganglien in der immunhisto-chemischen Untersuchung des lymphoretikulären Systems/enterischen Nervensystems

geringgradig weniger als 30 % der untersuchten Follikel/Ganglien positiv

mittelgradig weniger als 50 % der untersuchten Follikel/Ganglien positiv

hochgradig mehr oder gleich 50 % untersuchten der Follikel/Ganglien positiv

Tab. 25 Bewertungsschema zur graduellen Einteilung des Anteils PrPSc-exprimierender Zellen an der Gesamtzellzahl der Gewebestruktur für die immunhistologischen Untersuchungen der Obex-region

+ geringgradig einzelne positive Zellen, maximal 20 % der Gesamtzellzahl

++ mittelgradig viele positive Zellen, maximal 60 % der Gesamtzellzahl

+++ hochgradig (fast) alle Zellen positiv, 80-100 % der Gesamtzellzahl

Anhang 135

9.4 Tabellarische Übersichten über die in den Sektionen entnommenen Proben

Tab. 26 Übersicht über die bei den Sektionen der Damaskusziegen aus Zypern und der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Proben des Kopfes und des Magen-Darm-Trakts

Proben des Kopfes Proben des Magen-Darm-Trakts

Gl. mandibularis Lnn. ruminales

Ln. mandibularis Lnn. lienales

Ggl. cervicale craniale* Rumen*

Ggl. nodosum* Reticulum*

N. facialis* Abomasum*

M. masseter Omasum*

Gl. parotis Lnn. jejunales* (kranial)

Ln. retropharyngealis medialis* Lnn. jejunales* (kaudal/nahe Ileum)

Maulschleimhaut Duodenum*

Lingua* Jejunum proximalis

Nasenschleimhaut Jejunum distalis

Tonsillae Ileum*

Palpebra III* Jejunale Peyer` Platte*

N. opticus* Ileale Peyer` Platte*

Gl. lacrimalis Ileozäkaleingang

Retina/Bulbus oculi* Colon proximalis

M. retractor bulbi Colon medialis

Chiasma opticum* Lnn. colici*

Hypophyse* Rectum*

Ggl. trigeminale* Plexus pelvinus

Respiratorisches Epithel Faeces

*Proben auch bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; Ggl. = Ganglion, Gl. = Glandula, Ln./Lnn. = Lymphonodus/Lymphonodi, M. = Musculus, N. = Nervus

136 Anhang

Tab. 27 Übersicht über die bei den Sektionen der Damaskusziegen aus Zypern und der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Proben des Tierkörpers

Proben des Tierkörpers

Vesica urinaria* M. supraspinatus

Pancreas M. biceps brachii

Lien* N. radialis

Ren* N. medianus

Gl. suprarenalis* Plexus brachialis*

Ggl. coeliacum* Ln. subiliacus*

Ggl. mesentericum craniale* Lnn. cervicales superficiales*

M. psoas major* Thymus

Lnn. iliaci mediales* Thyreoidea

Hepar* N. sympaticus

Vesica fellea N. vagus*

Lnn. hepatici Oesophagusschleimhaut

Aorta Pulmones*

N. phrenicus Ggl. stellatum*

N. splanchnicus major* Lnn. bronchomediastinales

M. longissimus dorsi* Cor*

N. ischiadicus* Septum cordis

N. fibularis communis Medulla ossium femoralis

N. saphenus Penis/Prostata

M. semitendinosus* Mamma/Ovar

M. quadriceps vastus lateralis* Placenta*

Lnn. poplitei Uterus*

M. triceps brachii* Lnn. mammarii1

*Proben auch bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; 1Proben nur bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; Ggl. = Ganglion, Gl. = Glandula, Ln./Lnn. = Lymphonodus/Lymphonodi, M. = Musculus, N. = Nervus

Anhang 137

Tab. 28 Übersicht über die bei den Sektionen der Damaskusziegen aus Zypern und der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie entnommenen Proben des Zentralen Nervensystems

Proben des Zentralen &ervensystems

C 1 – 2* L 5 – L 6

C 2 – 3 Cauda equina

C 3 – 4 Cerebellum

C 4 – 5 Mesencephalon

C 5 – 6 Pons

C 6 – 7 Medulla cranialis

C 7 – T 2 Obex

T 2 – T 4 Medulla caudalis

T 4 – T 6 Gehirn1 (Anteile cranial der Pons)*

T 6 – T 8* Rhinencephalon

Dorsale Wurzelganglien C1 – C6 Cerebrum frontalis

T 9 – 10 Cerebrum parietalis

T 10 – 11 Cerebrum occipitalis

T 12 – L 1 Basalkerne

L 2 – L 3* Thalamus

L 3 – L 4

*Proben auch bei den Damaskusziegen aus Zypern entnommen; 1bei zwei Dritteln der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie und bei allen Damaskusziegen aus Zypern wurde das Gehirn paramedian ge-teilt und konserviert, bei einem Drittel der Ziegen der BSE-Pathogenesestudie wurde das Gehirn in Einzelproben zerteilt und konserviert; C = Nervi cervicales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae cervica-les, L = Nervi lumbales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae lumbales, T = Nervi thoracales auf Höhe der jeweiligen Vertebrae thoracales, grau hinterlegt = Leerfeld

138 Anhang

9.5 Protokolle zur Fraktionierung der in der BSE-Pathogenesestudie entnommenen

Blut- und Milchproben

9.5.1 Protokoll zur Fraktionierung von caprinem Citrat-Vollblut

Die Proben sind TSE-steril zu entnehmen. Das Mischungsverhältnis von Citratpuffer und Blut

beträgt 1 ml : 9 ml.

1. Gewinnung von Thrombozyten und Plasma aus Citratvollblut:

- entnommene Blutproben für 30 min bei 200 g und Raumtemperatur (RT) ohne Bremse

zentrifugieren

- thrombozytenreiches Plasma (Überstand) sehr vorsichtig Abnehmen (Einmalpasteurpipette)

- thrombozytenreiches Plasma und verbliebene Erythrozyten für 10 min bei 2000 g und RT

ohne Bremse zentrifugieren (Weiterbearbeitung der roten Blutzellen erfolgt unter Punkt 2.

und Punkt 3.)

- Plasma über dem Thrombozytenpellet verwerfen und das Thrombozytenpellet ohne Luftin-

sufflation in 2 ml 1 x PBS resuspendieren, auf zwei 1,5 ml-Reaktionsgefäße verteilen und

diese für 5 min bei 700 g und RT zentrifugieren

- Überstand verwerfen und Pellets bei -70 °C einfrieren

2. Gewinnung der Leukozyten (buffy coat-Zellen) aus Citratvollblut:

Fortsetzung von Punkt 1.:

- Plasma über Erythrozyten abnehmen und 10 min bei 2000 g und RT zentrifugieren

- zellfreies Plasma vorsichtig abnehmen, alliquotieren und bei –70 °C lagern

- buffy coat-Zellen über Erythrozyten abnehmen und Erythozyten-Lysispuffer zugeben (fünf-

faches Volumen an Erythrozyten-Lysispuffer zur hypotonen Lyse der Erythrozyten zugeben)

invertieren und 5 min bei RT inkubieren

- mit 1 x PBS auf 50 ml auffüllen und für 10 min bei 300 g und RT mit Bremse zentrifugieren

- Überstand verwerfen, Leukozytenpellet erneut in 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer resuspendie-

ren dann 5 min bei RT inkubieren, mit 1 x PBS auf 50 ml auffüllen und für 10 min bei 300 g

und RT mit halber Bremse zentrifugieren

Anhang 139

- Überstand verwerfen, Pellet in 10 ml 1 x PBS resuspendieren auf 50 ml mit 1 x PBS auffül-

len und 10 min bei 300 g und RT zentrifugieren

- den Überstand verwerfen das Pellet in 6 ml 1 x PBS resuspendieren, in drei 2 ml-

Reaktionsgefäße alliquotieren dann 5 min bei 300 g abzentrifugieren

- Überstand verwerfen und Leukozytenpellet bei –70 °C einfrieren

3. Gewinnung der Erythrozyten aus Citratvollblut

Fortsetzung von Punkt 1.:

- Erythrozyten invertieren, alliquotieren und bei -70 °C einfrieren

9.5.2 Protokoll zur Verarbeitung von Serumproben

Die Proben sind TSE-steril zu entnehmen.

- Serumröhrchen nach Abnahme bei RT für 3-4 h stehen lassen

- Röhrchen für 5 min bei 300 g und RT ohne Bremse zentrifugieren

- Serumüberstand abnehmen für 10 min bei 2000 g bei RT zentrifugieren

- gereinigten Serumüberstand abnehmen, alliquotieren und bei -70 °C lagern

9.5.3 Protokoll zur Fraktionierung von capriner Vollmilch

Die Proben sind TSE- steril zu entnehmen.

- Milch- und Kolostrumproben in PBS mit 10 mM EDTA 1 : 2 bzw. 1 : 5 verdünnen

- bei 780 g und 4 °C für 5 min zentrifugieren

- Rahm mit Einwegteelöffel abnehmen und bei -70 °C einfrieren

- Rest der Probe schwenken bis die Zellen vom Boden vollständig aufgewirbelt sind, dann

durch ein 100 µm Zellsieb geben, erneut bei 780 g und 4 °C für 5 min zentrifugieren

- entrahmte Milch über Zellpellet abnehmen, alliquotieren bei –70 °C einfrieren

- Zellpellet dreimal in PBS mit 10 mM EDTA waschen, zwischen den Waschschritten jeweils

bei 1900 g und 4 °C für 5 min zentrifugieren, danach das Zellpellet bei -70 °C einfrieren

- Zellen vor dem Einfrieren in einer Zählkammer zählen

140 Anhang

9.6 Ergebnistabellen

9.6.1 Damaskusziegen aus Zypern

9.6.1.1 Ergebnisse des FLI-Tests

Tab. 29 Vergleich der klassischen caprinen und ovinen Scrapie-Isolate und der caprinen, ovinen und bovinen BSE-Isolate nach den Glykosylierungsverhältnissen (4 Gelläufe), dem Antikörper-bindungsverhältnis (2 Gelläufe), der molekularen Masse der unglykosylierten Form des PrPSc sowie deren Differenz zur unglykosylierten Form des PrPSc der internen Scrapie-Referenz (4 Gelläufe)

Glykosylierung (%) MM (kDa) Isolat diglyk.

PrPSc monoglyk.

PrPSc unglyk. PrPSc

P4/L42- Verhält-

nis unglyk. PrPSc

Diff. (kDa)

caprine BSE ZG 01 62,1 ±3,7 25,0 ±1,9 13,0 ±2,3 0,16 ±0,03 18,8 ±0,6 -0,56 ±0,1 ovine BSE 468 58,6 ±2,3 25,8 ±1,8 15,6 ±1,3 0,16 ±0 18,7 ±0,7 -0,6 ±0,3 bovine BSE R 8/07 60,6 ±5,3 25,0 ±2,5 14,4 ±3,1 0,03 ±0,01 18,5 ±0,3 -0,67 ±0,4 ovine Scrapie Stdl 171 46,4 ±1,4 30,3 ±2,6 23,3 ±2,4 1,43 ±0,01 19,2 ±0,4 0,29 ±0,3 ZYP 3 48,1 ±4,1 28,0 ±1,8 23,9 ±5,2 0,96 ±0,3 18,8 ±0,3 0,1 ±0,4 ZYP 8 46,9 ±4,1 30,8 ±0,8 22,4 ±4,2 0,94 ±0,02 18,5 ±0,8 0,02 ±0,4 ZYP 9 45,5 ±2,9 28,3 ±2,5 26,3 ±4,2 0,82 ±0,1 18,3 ±0,4 0,3 ±0,3 ZYP 10 44,3 ±4,3 28,3 ±1,9 27,4 ±5,4 0,78 ±0,03 18,0 ±0,5 0,04 ±0,5 ZYP 11 44,4 ±5,4 28,4 ±1,0 27,3 ±5,9 0,91 ±0,1 18,0 ±0,3 0,04 ±0,4 ZYP 12 47,2 ±2,2 27,4 ±1,8 25,2 ±1,1 0,84 ±0,1 18,6 ±0,3 -0,1 ±0,3 ZYP 13 50,1 ±1,4 28,1 ±3,0 21,9 ±1,5 0,81 ±0,3 18,7 ±0,6 0,09 ±0,2 ZYP 14 49,4 ±1,4 27,3 ±1,4 23,0 ±0,7 0,69 ±0,01 18,8 ±0,1 0,09 ±0,4 ZYP 16 47,0 ±2,7 28,0 ±2,4 24,9 ±1,3 0,85 ±0,2 18,7 ±0,2 0,02 ±0,3 ZYP 17 50,6 ±2,7 29,3 ±2,1 20,1 ±1,8 1,23 ±0,2 19,1 ±0,2 0,47 ±0,4 ZYP 19 50,1 ±4,8 31,1 ±2,9 18,8 ±2,0 1,17 ±0,03 18,9 ±0,7 0,37 ±0,4 ZYP 20 48,7 ±6,7 26,7 ±1,5 24,6 ±7,2 1,76 ±0,4 19,4 ±0,3 0,35 ±0,1 ZYP 21 45,2 ±5,2 32,4 ±6,4 22,4 ±5,8 1,49 ±0,3 19,3 ±0,2 0,29 ±0,2 ZYP 22* 49,4 ±9,4* 28,6 ±3,4* 22,0 ±8,4* 1,38 ±0,1 19,2 ±0,2* 0,28 ±0,3* ZYP 25* 50,6 ±7,1* 28,4 ±2,6* 20,9 ±8,0* 1,74 ±0,2 19,4 ±0,1* 0,44 ±0,3* ZYP 26 49,0 ±5,2 27,2 ±1,4 23,8 ±5,7 1,5 ±0,1 19,1 ±0,2 0,04 ±0,3 ZYP 27 51,7 ±2,7 29,2 ±3,7 19,2 ±1,3 1,68 ±0,1 19,1 ±0,1 0,38 ±0,3 ZYP 29 50,7 ±1,7 29,9 ±1,7 19,5 ±1,0 1,47 ±0,03 18,8 ±0,2 0,16 ±0,3 ZYP 30 51,4 ±1,6 29,9 ±0,7 18,7 ±1,1 1,23 ±0,1 19,0 ±0,2 0,24 ±0,3 ZYP 31 49,1 ±4,7 29,2 ±0,6 21,8 ±4,3 1,29 ±0,1 19,0 ±0,2 0,3 ±0,2 ZYP 33 50,9 ±1,9 30,3 ±2,2 18,8 ±1,5 1,18 ±0,4 19,1 ±0,5 0,01 ±0,3 ZYP 34 42,8 ±3,9 31,1 ±1,8 26,1 ±2,2 0,87 ±0,1 19,0 ±0,6 0,49 ±0,4 ZYP 35 46,5 ±3,2 27,4 ±3,5 26,1 ±1,4 0,77 ±0,02 18,8 ±0,7 0,31 ±0,4 ZYP 40 48,3 ±2,4 26,3 ±1,8 25,5 ±1,4 0,75 ±0,2 18,5 ±0,7 -0,07 ±0,3 ZYP 41 47,2 ±2,3 28,5 ±2,0 24,3 ±1,8 1,1 ±0,2 19,0 ±0,3 -0,01 ±0,1 diglyk., monoglyk. und unglyk. PrPSc = di-, mono- und unglykosylierte Form des PrPSc, MM = mole-kulare Masse, Diff. = Differenz der unglykosylierten Form des PrPSc der Probe zur unglykosylierten Form des PrPSc der internen Scrapie-Referenz, ± = Standardabweichung,*5 Gelläufe, um Abweichun-gen zu reduzieren

Anhang

141

9.6.1.2

Ergeb

nisse d

es Lan

gzeit Protein

ase K-V

erdau

s

Tab

. 30 G

lykosylierungsverhältnisse der di-, mono- und unglykosylierten F

orm des P

rPS

c, molekula-

re Masse der unglykosylierten PrP

Sc-F

orm, L

angzeit-Proteinase K

-Verdau und A

ntikörper-bindungsverhalten von einem

caprinen und ovinen BS

E-Isolat und fünf ausgesuchten capri-

nen Scrapie-Isolaten der Z

ypernziegen

AK-

Bindungs-

verhältnis

P4/ L42

0,16

0,16

0,81

1,17

1,49

1,68

1,23

48 h

38,7 ±2,1

32,7 ±7,3

27,6 ± 4,5

19,7 ± 1,9

20,5 ± 3,4

19,5 ± 2,0

23,3 ± 3,4

24 h

62,8 ±5,2

52,9 ±3,2

42,1 ±3,1

32,9 ±3,0

34,3 ±3,6

33,8 ±2,7

32,6 ±4,8

6 h

79,2 ± 4,3

74,6 ± 6,3

60,7 ± 6,1

68,0 ± 2,5

66,1 ± 2,5

72,4 ± 5,8

61,1 ± 5,0

Langzeit-Proteinase K-Verdau (%)

1 h

100

100

100

100

100

100

100

MM (kDa)

unglyk. PrPSc

18,8 ±0,6

18,7 ±0,7

18,7 ±0,6

18,9 ±0,7

19,3 ±0,2

19,1 ±0,1

19,0 ±0,2

unglyk. PrPSc

13,0 ±2,3

15,6 ±1,3

21,9 ±1,5

18,8 ±2,0

22,4 ±5,8

19,2 ±1,3

18,7 ±1,1

monoglyk. PrPSc

25,0 ±1,9

25,8 ±1,8

28,1 ±3,0

31,1 ±2,9

32,4 ±6,4

29,2 ±3,7

29,9 ±0,7

Glykosylierungsverhältnisse (%)

diglyk. PrPSc

62,1 ±3,7

58,6 ±2,3

50,1 ±1,4

50,1 ±4,8

45,2 ±5,2

51,7 ±2,7

51,4 ±1,6

Isolat

caprine BSE ZG 01

ovine BSE 486

ZYP 13

ZYP 19

ZYP 21*

ZYP 27

ZYP 30

diglyk., monoglyk. und unglyk. PrPSc = di-, mono- und unglykosylierte Form des PrPSc, MM = molekuare Masse, AK = Antikörper, *Aus Mangel an Material wurde der Mittelwert für den Langzeit-Proteinase K-Verdau der ZYP 21 aus nur drei statt der üblichen 4 Gelläufen ermittelt

142 Anhang

9.7 Puffer und Lösungen

Alle Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben in A. bidest angesetzt und

bei RT gelagert.

APS-Lösung (10 %-ig)

Ammoniumpersulfat 1 g

A. bidest. 10 ml

Assay Puffer (10x, pH 9,8)

Tris 24,2 g

MgCl2 2,03 g

A. bidest. ad 1 l

Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentrati-on verdünnt.

Blotting Puffer

Tris 3,03 g

Glycin 14,4 g

Methanol 200 ml

SDS 2 g

A. bidest. ad 1 l

Bromphenolblaulösung (1 %-ig)

Bromphenolblau 1 g

A. bidest. ad 100 ml

Citratpuffer (pH 7,2; Citratblut)

Trinatrium-Citrat-Dihydrat 19 g

NaCl 4,5 g

A. dest. ad 500 ml

Der pH-Wert wurde mit Zitronensäure eingestellt, die Lösung anschließend steril filtriert. Lagerung bei 4 °C.

Citratpuffer (1 M, pH 6,0; Methanol-Fällung)

Zitronensäuremonohydrat 21,01 g


Der pH-Wert wurde mit Natronlauge eingestellt.

Citratpuffer (0,01 M, pH 6,0; Immunhistologie)

Trinatriumzitrat-dihydrat 2,94 g

Anhang 143

A. bidest. ad 1 l

Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) vorsichtig eingestellt.

CVL-Puffer (10x, pH 6,8)

SDS 2 g

Tris/HCl-Lösung (1 M, pH 7,4) 5 ml

Mercaptoethanol 5 ml

Sucrose 3 g

1 %-ige Bromphenolblau-Lösung 5 Tropfen

A. bidest. ad 20 ml


DAB-Lösung

Diaminobenzidintetrahydrochlorid 100 mg

Imidazol/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,1) ad 200 ml

Vor Gebrauch filtrieren.

H2O2 (kurz vor Gebrauch zufügen) 70 µl

Denaturierungspuffer

SDS 5 g

Mercaptoethanol 10 ml


Eosin

Eosin G 10 g

Eisessig 10 Tropfen

Ethanol (50 % v/v) ad 1 l

E-Puffer (10x)

Tris 150 g

Glycin 720 g

SDS 50 g

A. bidest. ad 5 l

Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentration verdünnt.

Erythrozyten-Lysispuffer (pH 7,2-7,3)

NH4Cl 8,0 g

KHCO3 1,0 g

144 Anhang

Na2-EDTA 37,2 mg

A. dest. ad 1000 ml

Nach Sterilfiltrierung Lagerung bei 4 °C bis zu 3 Wochen.

Formalin (4 %-ig, neutral gepuffert)

A. bidest. 900 ml

Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat 4 g

Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei 8,15 g

komplett mit Magnetrührstäbchen lösen

37 %-iges Formalin 100 ml

Hämatoxylin-Lösung

Hämatoxylin 1 g

A. bidest. ad 1 l

vollständig lösen

Natrium-Iodat 0,2 g

Kalium-Aluminiumsulfat 50 g

dazugeben und vollständig lösen

Chloralhydrat 50 g

Zitronensäure-Monohydrat 50 g

Mindestens 4 Wochen reifen lassen. Vor Gebrauch filtrieren.

Imidazol/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,1)

Imidazol 1,36 g


Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt.

Kaliumchlorid (3 M)

Kaliumchlorid 7,46 g


Lysispuffer (Methanolfällung)

Kaliumchlorid 3 M 667 µl

Citratpuffer (pH 6) 1M 500 µl

Magnesiumchlorid 1 M 50 µl

Sarkosin 0,125 g

A. bidest. ad 10 ml

Anhang 145

Magermilch (5 %-ig)

Magermilchpulver 5 g

PBS-Tween ad 100 ml

Methanol mit 3 % H2O2

Wasserstoffperoxid, 30 %-ig 20 ml

Methanol 180 ml

Magnesiumchloridlösung (0,1 M)

Magnesiumchloridhexahydrat 2,03 g


Magnesiumchloridlösung (1 M)

Magnesiumchloridhexahydrat 20,33 g


&atriumazidlösung (10 %-ig)

Natriumazid 0,65 g

A. bidest ad 100 ml

&atronlauge (2 M)

Natriumhydroxid 80 g

A. bidest. ad 1 l

PBS (10x)

Natriumchlorid 400 g

Kaliumchlorid 10 g

Kaliumdihydrogenphosphat 10 g

Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat 57,5 g

A. bidest. ad 5 l

Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentration verdünnt.

PBS mit 10 mM EDTA

EDTA (x2H2O) 3,27g

PBS ad 1 l

PBS mit 4 % Sarkosyl (pH 7,4)

Sarkosyl 10 g

PBS ad 250 ml

Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt.

146 Anhang

PBS-Tween

Tween 20 1 ml

PBS ad 1 l

Pefabloc (0,1 M)

Pefabloc 100 mg

A. bidest. ad 4,17 ml

Lagerung bei –20 °C.

PK-Gebrauchslösung (Histologie, 4 µg/ml PK))

PK-Stammlösung 760 µl

PK-Puffer (1x) 190 ml

PK-Puffer (10x, pH 8,3)

Tris 60,56 g

EDTA 2,92 g

Tween 20 10 ml

A. bidest. ad 1 l

Der pH-Wert wurde mit Salzsäure (HCl) eingestellt. Mit A. bidest. wurde auf 1x Konzentrati-on verdünnt. Lagerung bei 4-8 °C.

PK-Stammlösung (1 mg/ml)

Proteinase K 100 mg

A. bidest. 100 ml

Lagerung bei – 20 °C.

4 %-ige PTA mit 34 mM MgCl2 (pH 7,4)

PTA 4 g

Magnesiumchloridhexahydrat 691 mg


Der pH-Wert wurde mit Natronlauge (NaOH) eingestellt.

SDS-Lösung (10 %-ig)

SDS 1 g

A. bidest. ad 10 ml

Sucrose-DOC-&P40-Lysis-Puffer

Sucrose 10,95 g

NP40 0,5 ml

DOC 0,5 g

Anhang 147


TBS (10x, pH 7,6)

Tris 60,57 g

Natriumchlorid 80 g

A. bidest. ad 1 l


TBS mit 10 % Ziegenserum und 0,03 % &atriumazid

Ziegenserum (hitzeinaktiviert 3 h, 56 °C Wasserbad) 10 ml

Natriumazid (30 %-ig) 300 µl

1x TBS ad 100 ml

Lagerung bei 4-8 °C.

Tris-Puffer

Tris/HCl 0,5 M, pH 6,8

Tris 60,57 g

A. bidest. ad 1 l

Tris/HCl 1,5 M, pH 8,8

Tris 181,71 g

A. bidest. ad 1 l

Der pH-Wert wurde jeweils mit Salzsäure (HCl) eingestellt.

Thyroglobulin

Thyroglobulin 50 mg

A. bidest. ad 10 ml

9.8 Rezepte

SDS-Polyacrylamid-Gele

Trenngel, 16 %-ig (zwei Gele) Sammelgel (zwei Gele)

Aqua dest 3,0 ml Aqua dest 6 ml

1,5 M TrisHCl (pH 8,8) 3,75 ml 0,5 M TrisHCl (pH 6,8) 2,5 ml

30 %-ig Bis-Acrylamid 8,0 ml 30 %-ig Bis-Acrylamid 1,3 ml

10 %-ig SDS 750 µl 10 %-ig SDS 500 µl

10 %-ig APS 100 µl 10 %-ig APS 200 µl

TEMED 10 µl TEMED 20 µl

148 Anhang

9.9 Arzneimittel

Ketaminhydrochlorid 10% Bremer Pharma GmbH, Warburg

Lidocainhydrochlorid 2 % B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Paraffinum perliquidum WdT eG, Garbsen

Rompun (Xylazinhydrochlorid) 2 % Bayer, Leverkusen

T61 Injektionslösung Intervet Deutschland GmbH, Unterschleißheim

9.10 Chemikalien

Acrylamid – Stammlösung (30 %-ig) mit Bisacrylamid Roth, Karlsruhe

(Rotiphorese Gel 30)

Ameisensäure 98 – 100 %-ig Merck, Darmstadt

Ammoniumpersulfat (APS) Merck, Darmstadt

Benzonase Sigma-Aldrich, Steinheim

Bromphenolblau Riedel de Häen, Sigma-Aldrich,

Steinheim

CDP – Star Tropix, Perkin Elmer, Foster City, USA

Chloralhydrat Merck, Darmstadt

Desoxycholat (DOC) Fluka, Sigma-Aldrich, Steinheim

Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) Fluka, Sigma-Aldrich, Steinheim

Dinatriumdihydrogenphosphatmonohydrat Roth, Karlsruhe

Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei Roth, Karlsruhe

Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat Roth, Karlsruhe

Dodecylsulfat-Natriumsalz (SDS) AppliChem, Darmstadt

Entellan® Merck, Darmstadt

Eosin G Sigma-Aldrich, Steinheim

Essigsäure, 100 %-ig, p. a. (Eisessig) Roth, Karlsruhe

Ethanol pro analysi (p. a.) Roth, Karlsruhe

Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) Serva, Heidelberg

Formalin, 37 %-ig Roth, Karlsruhe

Hämatoxylin Merck, Darmstadt

Imidazol Sigma-Aldrich, Steinheim

Isopropanol p. a. (2-Propanol) Roth, Karlsruhe

Anhang 149

Kalium-Aluminiumsulfat Merck, Darmstadt

Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt

Kaliumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt

Kochsalzlösung, isotonisch, 0,9 %-ig Braun, Melsungen

Magermilchpulver Humana Milchunion, Herford

Magnesiumchloridhexahydrat Roth, Karlsruhe

Methanol, 99,8 %-ig Roth, Karlsruhe

Mercapthoethanol Merck, Darmstadt

Natrium-Azid, > 99 %-ig p. a. Roth, Karlsruhe

Natrium-Chlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe

Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat Roth, Karlsruhe

Natrium-Iodat Merck, Darmstadt

Natronlauge (NaOH) Roth, Karlsruhe

N-Lauryl-Sarkosin (Sarkosyl) Sigma, Steinheim

N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (Temed) Roth, Karlsruhe

Nonidet P40 (NP-40) Roche, Mannheim

Pefabloc SC® Roche, Mannheim

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma-Aldrich, Steinheim

Phosphorwolframsäure (PTA) Sigma-Aldrich, Steinheim

Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat (Tween 20) Merck, Darmstadt

Proteinase K Roche, Mannheim

Salzsäure konz. (37 %-ig) (HCl) Riedel de Häen, Sigma-Aldrich,

Steinheim

Sucrose Roth, Karlsruhe

Thyroglobulin Sigma, Steinheim

Trinatriumzitrat-dihydrat Roth, Karlsruhe

Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan (Tris) Invitrogen, Karlsruhe

Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck, Darmstadt

Xylol Roth, Karlsruhe

Ziegenserum INNT, FLI

Zitronensäure-Monohydrat Fluka, Sigma-Aldrich, Steinheim

150 Anhang

9.11 Geräte und Verbrauchsmaterialien

Abzugstisch (TAZ 19) Medite, Burgdorf

Baumschere Gardena, Ulm

Bestecke (Klemmen, Pinzetten, Scheren, u. a.) Heiland, Hamburg; Lenecke, Schortens

Bijoux-Röhrchen ( 7 ml, 30 ml) Sarstedt, Nümbrecht

Biopsiezange (Bronchoskopiezange), Chevalier-Jackson Leihgabe, TiHo Hannover

Blotting-Apparatur Trans-Blot, Semi Dry BioRad, München

Braunüle (Vasofix 17 G) Heiland, Hamburg

Cover-Plates Life Science Int. GmbH, Frank-furt/Main

Dampfsterilisator Varioklav Thermo Scientific

Deckgläser Menzel-Gläser, Braunschweig

Dounce Tissue Grinder (7ml) Wheaton, USA

Einbettautomat EG 1140H Leica, Wetzlar

Einbettkassetten, Kunststoff Roth, Karlsruhe

Eindeckautomat CV5030 Leica, Wetzlar

Einwegteelöffel Marktkauf, Greifswald

Einwegkanülen (18G, 20G, 23G) Terumo, Leuven, Belgien

Einweglaryngoskopspatel, Heine XP Miller 4 Heine Optotechnik, Herrsching

Einwegpetrischalen, quadratisch Sarstedt, Nümbrecht

Einwegpinzetten Lenecke, Schortens

Einwegrektalspekulum Eickmeyer, Tuttlingen

Einwegskalpelle Cutfix Lenecke, Schortens

Einwegspritzen (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 50ml) Heiland, Hamburg

Elektrophoreseapparatur, Mini Protean II BioRad, München

Gewebeinfiltrationsautomaten ASP 300 Leica, Wetzlar

Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml) Eppendorf, Hamburg

Faltenfilter Schleicher & Schuell, Dassel

Feinwaage Ohaus, Giessen

Glaskästen mit Färbegestell für Histologie Roth, Karlsruhe

Immobilon-P Transfermembran Millipore, Bedford, USA

Kamera für Lichtmikroskop Zeiss AxioCam HRc Carl Zeiss Jena GmbH, Jena

Anhang 151

Knopfkanüle NOVA-SCB, Sollentuna, Schwe-den

Laryngoskop, Heine F. O. NT 3,5 V Heine Optotechnik, Herrsching

Lichtmikroskop Axiostar Carl-Zeiss Jena GmbH, Jena

Lichtmikroskop Axioskop 2 plus Carl-Zeiss Jena GmbH, Jena

Magnetrührer mit Heizung CB162, Stuart VWR, Darmstadt

Maulgatter Heiland, Hamburg

Metalleinbettschälchen Medite, Burgdorf

Mikrotomklingen S 35 Produkte für die Medizin AG, Köln

Monovetten für Serum (10 ml) Sarstedt, Nümbrecht

Netzteil, Power Pac (200 V, 300 V) BioRad, München

Objektträger (Super Frost, Super Frost Plus) Menzel-Gläser, Braunschweig

pH-Meter MP220 Mettler-Toledo GmbH, Giessen

Pipetten Eppendorf, Hamburg

Pipettenspitzen normal (10 µl, 100 µl, 1000 µl) Roth, Karlsruhe

Pipettenspitzen mit Filter (10 µl, 100 µl, 1000 µl) Roth, Karlsruhe

Pasteurpipetten (5 ml) Roth, Karlsruhe

Probenbeutel, Rotilabo (unterschiedliche Größen) Roth, Karlsruhe

Ribolyser-Röhrchen (7 ml) BioRad, München

Ribolyser-Stahlkugeln, Precellys-Stahl-Kit 2,8 mm peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen

Ribolyser TeSeE Precess 48 BioRad, München

Röhrchen (15 ml, 50 ml) Sarstedt, Nümbrecht

Rotationsmikrotom RM 2145 Leica, Wetzlar

Sagitalsäge incl. Sternumsägeblatt (Acculan) Krauth u. Timmermann, Hamburg

Schlachtmesser (Dick) Lehrich, Brühl

Schraubdeckeldose (Speichel) Roth, Karlsruhe

Schnelltest HerdChek BSE-Scrapie Antigen (FLI-B 409) IDEXX, Hoofddorp, Niederlande

Skalpellklingen Lenecke, Schortens

Software Quantity One BioRad, München

Spinalkanülen Yale BD-Medical, Heidelberg

Sterilbank (LaminAir 1.8) Heto-Holten, Alleröd, Dänemark

Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg

152 Anhang

Tischwaage (EW 150-JM) Kern, Balingen-Frommern

Tischzentrifuge 5804 R Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge 5415 D Eppendorf, Hamburg

Trimmmessergriff und -klingen Medite, Burgdorf

Versa Doc 5000, Imaging System BioRad, München

Vortex Genie 2 Roth, Karlsruhe

Wägeschalen Merck, Darmstadt

Wärmeschrank (T6030) Heraeus, Hanau

Wasserbad HI 1210 Leica, Wetzlar

Whatman-Chromatographiepapier Whatman, Maldstone, England

Zählkammer nach Neubauer VWR, Darmstadt

Zellsieb (100 µm) BD Biosciences, Heidelberg

Zuchtfutterpellets M-Z Ssniff, Soest

Zusatzfuttermittel für Ziegen Vilomix Tierernährung GmbH, Neuenkirchen Vörden

Danksagung

Zum Gelingen dieser Arbeit hat eine Vielzahl an Personen beigetragen.

Prof. Dr. Dr. h. c. T. C. Mettenleiter möchte ich für die Möglichkeit danken, am Friedrich-

Loeffler-Institut Insel Riems meine Dissertation anfertigen zu können.

Prof. Dr. M. H. Groschup möchte ich danken für die Bereitstellung des Themas, die wissen-

schaftliche Betreuung und die Schaffung der Voraussetzungen für die umfassende Realisie-

rung des Projektes.

Dr. A. Balkema-Buschmann danke ich für die fachliche Beratung und Dr. C. Fast für die wis-

senschaftliche Betreuung der Arbeit sowie beiden für Ihre praktische Unterstützung der Pro-

jekte.

Dr. M. Eiden gilt mein besonderer Dank, die engagierte Zusammenarbeit hat die Arbeit an

dem Thema stets interessant gestaltet.

Für die tatkräftige Unterstützung vor allem bei den aufwendigen Sektionen möchte ich Dr. U.

Ziegler, Dr. M. Keller, M. Kaatz, B. Hammerschmidt, G. Kreplin, J. Herger, U. Duve, D.

Windolph, I. Nedow und allen anderen beteiligten Mitarbeitern des INNT danken. Dank gilt

außerdem R. Ogonowski für die verwaltungsseitige Hilfe, B. Schiller, M. Brinckmann und V.

Netz für die Versorgung der Tiere, Dr. M. Ziller für die statistische Beratung, den Mitarbeite-

rinnen der Bibliothek B. Riebe und M. Naß sowie den Kollegen des Friedrich-Loeffler-

Instituts aller Standorte für die vielseitige Unterstützung.

Weiterhin danke ich den Europäischen Kooperationspartnern des Projektes GoatBSE und in

Zypern für die fachliche Unterstützung und die kollegiale Aufnahme, Dr. T. Kuczius vom

Universitätsklinikum in Münster für die methodische Beratung und Prof. M. Ganter von der

Tierärztlichen Hochschule in Hannover für die praktische Einführung in die Bioptatentnahme

beim Schaf.

B. Strohmeier und K. Tauscher danke ich neben ihrer praktischen Mithilfe für rege fachliche

Diskussionen und Ihre freundschaftliche Unterstützung.

Mein ganz persönlicher Dank gilt abschließend meinem Vater und meiner ganzen Familie,

insbesondere dem Mann meines Herzens C. Niedermeyer und meiner Tochter Martha.

tierärztliche hochschule hannover · tierärztliche hochschule hannover studien zur pathogenese...

Documents