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Tierärztliche Hochschule Hannover

Etablierung des Ovalbumin-induzierten Mausmodells

der atopischen Dermatitis zur Beurteilung

pharmakologischer Wirkstoffe

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Hanna Kathrin Köchling

Dortmund

Hannover 2015

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Manfred Kietzmann

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

1. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann

2. Gutachter: Prof. Dr. Beineke

Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2015

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert.

Für meine Familie

-In Liebe und Dankbarkeit-

I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .......................................................................................................................................... 1 2 Literaturübersicht .............................................................................................................................. 3

2.1 Tiermodelle der atopischen Dermatitis ...................................................................................... 3 2.1.1 Spontan atopische Dermatitis entwickelnde Mausmodelle ................................................. 3 2.1.2 Epikutane Sensibilisierung als Model der AD .................................................................... 4 2.1.3 Genetisch veränderte Mäuse als Model der AD .................................................................. 5

2.2 Histamin ..................................................................................................................................... 9 2.3 Histaminrezeptoren .................................................................................................................. 10

2.3.1 Histamin 1-Rezeptor .......................................................................................................... 10 2.3.2 Histamin 4-Rezeptor .......................................................................................................... 13

2.4 H1R- und H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der atopischen Dermatitis und Kontaktallergie .................................................................................................................................. 18

3 Material und Methoden ................................................................................................................... 24 3.1 Material .................................................................................................................................... 24

3.1.1 Material für In-vivo-Versuche ........................................................................................... 24 3.1.2 Material für Zellkultur-Versuche ...................................................................................... 25 3.1.3 Material für ELISA ........................................................................................................... 26 3.1.1 Material für Histologie ...................................................................................................... 26 3.1.2 Material für FACS ............................................................................................................. 27 3.1.3 Puffer und Lösungen ......................................................................................................... 28 3.1.4 Versuchstiere und Tierhaltung .......................................................................................... 29

3.2 Versuchsübersicht .................................................................................................................... 30 3.3 Methoden .................................................................................................................................. 31

3.3.1 Protokoll des OVA-Modells .............................................................................................. 31 3.3.2 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des OVA-induzierten Modells der atopischen Dermatitis .................................................................................................................... 32 3.3.3 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA-Modell .................................................................................................................................. 33 3.3.4 Untersuchte Parameter im OVA-Modell ........................................................................... 36

3.4 Statistische Auswertung ........................................................................................................... 41 4 Ergebnisse ....................................................................................................................................... 42

II

4.1 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des Ovalbumin-induzierten Modells der atopischen Dermatitis (OVA-Protokoll) ............................................................................................ 42

4.1.1 Klinischer Hautscore ......................................................................................................... 42 4.1.2 Histologie .......................................................................................................................... 44 4.1.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl ................................................................................. 46 4.1.4 Milzzellzahl ....................................................................................................................... 47 4.1.5 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum .......................................................................... 48

4.2 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA-Modell ................................................................................................................................................ 48

4.2.1 Klinischer Hautscore ......................................................................................................... 48 4.2.2 Histologie .......................................................................................................................... 51 4.2.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl ................................................................................. 55 4.2.4 Milzzellzahl ....................................................................................................................... 58 4.2.5 Zytokinsekretion Splenozyten ........................................................................................... 59 4.2.6 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum .......................................................................... 61 4.2.7 Juckreiz .............................................................................................................................. 62 4.2.8 Vergleich der Vehikelgruppen .......................................................................................... 63

5 Diskussion ....................................................................................................................................... 64 5.1 Das OVA-Modell als Mausmodell der AD .............................................................................. 65 5.2 Einfluss der zusätzlichen Störung der Hautbarriere auf das OVA-Modell .............................. 66 5.3 Stabilität des OVA-Modells ..................................................................................................... 67 5.4 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im OVA-Modell ................................................................................................................................................ 69

5.4.1 Effekt des Glukokortikoids Betamethason im OVA-Modell ............................................ 69 5.4.2 Effekte von Histaminrezeptor-Antagonisten im OVA-Modell ......................................... 71

5.5 Schlussfolgerung ...................................................................................................................... 74 6 Zusammenfassung ........................................................................................................................... 76 7 Summary ......................................................................................................................................... 78 8 Literaturverzeichnis ......................................................................................................................... 80 9 Anhang .......................................................................................................................................... 100

III

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

AD Atopische Dermatitis

Aqua ad inj. Aqua ad injectionem, Wasser für Injektionszwecke

BSA Bovines Serumalbumin

C Challenge, Provokationswoche

ca. circa

CD Cluster of differentiation

DC Dendritische Zellen

DNCB Dinitrochlorobenzol

D. farinae Dermatophagoides farinae

Dfb Hausstaubmilben

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

et al. und andere

FACS Fluorescense Activated Cell Sorting

FITC Fluoresceinisothiocyanat

GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

HE Hämatoxylin-Eosin

H1R Histamin 1 Rezeptor




IDEC Inflammatorische dendritische epidermale Zellen

IFN Interferon

IgE Immunglobulin E

IL Interleukin

i.p. intraperitoneal

JNJ 3975 JNJ 39758979

k.A. keine Angaben in der Literatur

kg Kilogramm

IV

MCP Monocyte chemotactic protein

mg Milligramm

min Minuten

MIP Macrophage inflammatory protein

ml Milliliter

mRNA messenger Ribonukleinsäure

NaCl Natriumchlorid

NGF Nerve growth factor

OVA Ovalbumin

OVA-Modell Ovalbumin-induziertes Mausmodell

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

p.o. per os

RANTES Regulation and activated normal T-cell expressed and secreted

SD Standardabweichung

SE Sensibilisierungswoche

Std. Stunden

TARC Thymus and activation-regulated chemokine

TDI Toluendiisocyanat

TH T-Helferzelle

TNCB Trinitrochlorobenzen

TNF Tumor necrosis factors

TSLP Thymic stromal lymphopoietin

µg Mikrogramm

µl Mikroliter ® Registered Trade Mark TM Unregistered Trade Mark

± Plus/Minus

% Prozent

Einleitung

1

1 Einleitung

Die atopische Dermatitis ist eine chronisch entzündliche Hauterkrankung, die mit starkem

Juckreiz einhergeht und sowohl beim Menschen als auch unterschiedlichen Tierarten, wie

z.B. dem Hund, auftritt.

Beim Menschen sind vor allem Säuglinge und Kleinkinder von der atopischen Dermatitis

betroffen, die Prävalenz in den Industriestaaten beträgt 10,2 % (SILVERBERG & HANIFIN

2013).

Die klinischen Symptome unterscheiden sich je nach Krankheitsphase: In der akuten Phase ist

die atopische Dermatitis durch starken Juckreiz und erythematöse Haut mit Papeln

gekennzeichnet. Es finden sich sowohl Exkorationen sowie Erosionen mit serösem Exsudat.

In der subakuten Phase leiden die Betroffenen unter erythematösen, schuppenden Pappeln mit

deutlichen Exkorationen. Die chronische Phase der atopischen Dermatitis ist durch verdickte

Haut, Lichenifikation sowie fibrösen Papeln charakterisiert. In diesem Stadium der atopischen

Dermatitis können Symptome aller drei Krankheitsphasen parallel auftreten (LEUNG 1999).

Auch beim Hund sind Hautläsionen und starker Juckreiz die klinischen Hauptsymptome. Die

Prävalenz beträgt ca. 10 % bis 20 % aller Hunde (NOLI et al. 2014).

Die frühere Annahme, dass die atopische Dermatitis eine klassische Typ 1-

Hypersensitivitätsreaktion mit Bildung von allergenspezifischen Immunglobulin E (IgE)-

Antikörpern sei, ist mittlerweile revidiert. Die atopische Dermatitis gilt heute als

multifaktorielle Erkrankung, bei der komplexe immunologische Vorgänge sowie genetische

Faktoren eine Rolle spielen (LEUNG 2000; NOVAK et al. 2003).

So ist die Beteiligung des im Jahr 2000 entdeckten Histamin 4 Rezeptors (H4R) an der

Entstehung der atopischen Dermatitis bisher noch nicht gänzlich verstanden. Es wird

angenommen, dass dieser vor allem für die Entstehung des Juckreizes eine wichtige Rolle

spielt, da erhöhte Histaminspiegel in atopischer Haut nachgewiesen werden können

(RUZICKA und GLÜCK 1983), eine Behandlung mit Histamin 1 Rezeptorantagonisten

(H1R-Antagonist) jedoch keine zufriedenstellende klinische Besserung hervorruft (HOARE

et al. 2001). Daher scheint der H4R ein neuer vielversprechender Ansatz zur Therapie der

atopischen Dermatitis sein.

Einleitung

2

Das Ziel dieser Arbeit ist es, zunächst ein Tiermodell der atopischen Dermatitis zu etablieren

um im Anschluss den Effekt von H1R- und H4R- Antagonisten in diesem Modell zu

untersuchen. Als Tiermodell wurde das Ovalbumin-induzierte Mausmodell der atopischen

Dermatitis nach SPERGEL et al. (1998) gewählt, da dieses viele Aspekte der humanen

atopischen Dermatitis widerspiegelt. Des Weiteren soll untersucht werden, ob die zusätzliche

Störung der Hautbarriere dieses Modell optimieren kann. Ebenso sollen die Effekte von

unterschiedlichen Wirkstoffgruppen (Glukokortikoid, H1R- und H4R-Antagonist) in diesem

Tiermodell untersucht werden. Auch werden unterschiedliche Behandlungszeiträume sowie

Applikationsarten miteinander verglichen.

Literaturübersicht

3

2 Literaturübersicht

2.1 Tiermodelle der atopischen Dermatitis

Um die pathophysiologischen Vorgänge besser zu verstehen und um neue Wirkstoffe

entwickeln und testen zu können, werden Tiermodelle der atopischen Dermatitis (AD)

eingesetzt.

Die Maus bietet als Versuchstier einige Vorteile: es sind kleine Tiere, die Haltungskosten sind

gering, sie haben eine hohe Anzahl an Nachkommen pro Jahr, die Physiologie und

Pathophysiologie der Maus sind bereits sehr gut erforscht. Des Weiteren sind Inzuchtstämme

sowie genetisch veränderte Tier erhältlich (z.B. Knockout-Mäuse) (GUTERMUTH et al.

2004).

Die bisher eingesetzten Mausmodelle der AD können zur besseren Übersicht in drei Gruppen

eingeteilt werden. Die erste Gruppe beinhaltet Mäuse, die spontan atopische Dermatitis

entwickeln, in der zweiten Gruppe wird die atopische Dermatitis durch eine epikutane

Sensibilisierung ausgelöst und in der dritten Gruppe werden genetisch veränderte Mäuse

verwendet (JIN et al. 2009).

2.1.1 Spontan atopische Dermatitis entwickelnde Mausmodelle

Die Inzuchtstämme NC/NgA, NOA und DS/Nh entwickeln unter normalen Haltungs-

bedingungen spontan AD.

2.1.1.1 NC/NgA-Mäuse

Mäuse des Inzuchtstamms NC/NgA entwickeln bei Kontakt mit Umweltallergenen spontan

Hautveränderungen, die in vielen Aspekten der humanen AD ähneln. Ab einem Alter von

acht Wochen können erste Läsionen im Gesicht, an den Ohren, im Nacken und auf dem

Rücken entstehen. Zu Beginn zeigen die Mäuse Juckreiz, Erytheme und Blutungen, gefolgt

von Ödemen, Errosionen, Exkorationen, Schuppen und trockener Haut. Auch bleiben diese

Tiere im Wachstum zurück. Histologische Veränderungen sind die Zunahme der

Epidermisdicke, Hyper- und Parakeratose sowie interzelluläre Ödeme. Zudem nimmt die

Anzahl an Mastzellen in der Haut deutlich zu, ein Teil dieser ist degranuliert. Die Anzahl an

Eosinophilen nimmt ebenso zu. Der totale IgE-Gehalt im Serum steigt mit Zunahme des

klinischen Schweregrads der AD an (MATSUDA et al. 1997).

Literaturübersicht

4

Eine Störung der Hautbarriere konnte in diesem Tiermodell nachgewiesen werden, so sind der

Gehalt an Ceramiden in der Haut von NC/NgA Mäusen deutlich reduziert und der Wasser-

verlust aus der Haut erhöht (AIOI et al. 2001). Werden die Tiere unter pathogenfreien

Bedingungen gehalten, entwickeln sie keinerlei Symptome, daher scheint der Kontakt zu

Umweltallergenen als Auslöser notwendig zu sein (MATSUDA et al. 1997).

2.1.1.2 NOA-Mäuse

Ein weiterer Inzucht-Stamm, der spontan AD entwickelt, ist die NOA-Maus. Bei diesen

Mäusen entsteht ab einem Alter von zehn Wochen spontan eine ulzerative Dermatitis, die mit

Juckreiz, Mastzell-Infiltration und erhöhten IgE-Serumspiegeln einhergeht. Jedoch fehlen die

für AD typischen histologischen Veränderungen der Haut (WATANABE et al. 1999).

2.1.1.3 DS/Nh-Mäuse

Auch bei DS/Nh-Mäusen entstehen unter konventionellen Haltungsbedingungen Juckreiz und

erythematöse und erosive Hautläsionen. Der erhöhte IgE-Gehalt im Serum korreliert mit dem

Schweregrad der Symptome. In der Haut finden sich vermehrt CD4+ T-Zellen, Eosinophile,

Mastzellen und CD11b+ Makrophagen. Die Hautläsionen sind mit Staphylococcus aureus (S.

aureus) besiedelt. Eine Beteiligung dieses Keims an der Entstehung der Läsionen gilt als sehr

wahrscheinlich (HIKITA et al. 2002).

2.1.2 Epikutane Sensibilisierung als Model der AD

Die epikutane Sensibilisierung zur Auslösung von AD-ähnlichen Hautläsionen kann mit

verschiedenen Allergenen erfolgen. Häufig verwendet werden das Hühnereiweiß Ovalbumin

(OVA) oder verschiedene Hausstaubmilben-Extrakte (GUTERMUTH et al. 2004).

2.1.2.1 Epikutane Sensibilisierung mit OVA

Die epikutane Sensibilisierung mit OVA ist sowohl für Balb/c- als auch C57BL/6- Mäuse

beschrieben (SPERGEL et al. 1999).

Die Sensibilisierung erfolgt über die dreimalige Applikation von OVA über 1 Woche auf die

rasierte Haut. Die Pause zwischen den einzelnen Sensibilisierungen beträgt 2 Wochen. Die

Mäuse entwickeln AD-ähnliche Hautläsionen, die histologisch durch epidermale

Hyperproliferation sowie Infiltration von Neutrophilen, Lymphozyten, Mastzellen und

Literaturübersicht

5

Eosinophilen gekennzeichnet sind. Die Expression von mRNA der Zytokine IL-4, IL-5 und

IFN-γ in der Haut ist gesteigert. Der Serumgehalt von totalem sowie allergenspezifischem IgE

ist erhöht. Die Inhalation von aerolisiertem OVA führt bei epikutan sensibilisierten Mäusen

zu asthmaähnlichen Symptomen (SPERGEL et al. 1998; JIN et al. 2009).

2.1.2.2 Epikutane Sensibilisierung mit Hausstaubmilben-Extrakten

Die Sensibilisierung mit Hausstaubmilben-Extrakten ist bisher für zwei verschiedene

Mausstämme beschrieben worden. Zum einen wird der Inzuchtstamm NC/NgA verwendet.

Die Mäuse werden unter sterilen, pathogenfreien Bedingungen gehalten und dreimal pro

Woche mit einem Extrakt aus der Hausstaubmilbe Dermatophagoides farinae (D. farinae) auf

dem Rücken behandelt. In der zweiten Woche entsteht trockene, juckende Haut, ab der

vierten Woche lassen sich Hautläsionen (Erosionen mit Blutungen, Schuppen) beobachten.

Der totale sowie D. farinae-spezifische IgE-Gehalt im Serum steigt an. Histologische Ver-

änderungen sind die Zunahme der Epidermisdicke sowie eine erhöhte Anzahl an Mastzellen

in der Haut (MATSUOKA et al. 2003).

Im zweiten Modell werden Balb/c-Mäuse mit dem rekombinantem Milbenallergen Der p 8

sensibilisiert. Die epikutane Sensibilisierung erfolgt insgesamt dreimal über jeweils vier Tage

in einem Abstand von 17 Tagen. Klinisch entsteht eine exkorative Dermatitis mit deutlicher

Lichenifikation. Histologisch fallen eine Verdickung der Epidermis, eine Infiltration von

CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie von Mastzellen auf. Eine Zunahme von Nervenendigungen

in der Nähe der Mastzellen sowie ein Anstieg von Neuropeptiden in der Dermis könnten

Hinweise auf eine neurogene Entzündung sein (HUANG et al. 2003).

2.1.3 Genetisch veränderte Mäuse als Model der AD

Zu dieser Gruppe zählen sowohl transgene als auch Knockout-Mäuse. Diese Modelle sind

besonders geeignet, um z.B. die Bedeutung einzelner Zytokine für die Pathogenese der AD zu

klären (GUTERMUTH et al. 2004).

2.1.3.1 Transgene Mäuse

Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-31 (IL-31), und Thymic stromal lymphopoietin (TSLP)

transgene Mäuse entwickeln AD-ähnliche Läsionen.

Literaturübersicht

6

IL-4 transgene Mäuse

Das Zytokin IL-4 ist in der Lage, die Differenzierung von TH0-Zellen zu TH2-Zellen

induzieren, als auch B-Zellen zur Produktion von IgE anzuregen.

IL-4 transgene Mäuse exprimieren das murine IL-4 Gen auf basalen Keratinozyten. Dies führt

zu einem erhöhten IL-4 Gehalt in der Haut. Ab einem Alter von 4 Monaten zeigen 43% der

Tiere trockene Haut, Juckreiz sowie erste Hautläsionen. Die Lokalisation dieser Läsionen

ähnelt denen von NC/NgA-Mäusen. Histologisch sind die chronischen Hautläsionen durch

Spongiosis, Hyper- und Parakeratose, Akanthose sowie Infiltration von T-Zellen, Eosino-

philen und z.T. degranulierten Mastzellen gekennzeichnet. Bei 47% der Mäuse mit Symp-

tomen kann eine sekundäre Infektion der Hautläsionen mit S. aureus nachgewiesen werden

(CHAN et al. 2001).

IL-31 transgene Mäuse

Das Zytokin IL-31 wird von TH2-Helferzellen produziert und trägt vermutlich zur Entstehung

von allergischen Erkrankung bei. IL-31 transgene Mäuse überexprimieren IL-31. Ab einem

Alter von vier bis acht Wochen entstehen Alopezie sowie starker Juckreiz, der zu

Hautläsionen führen kann. Die Haut am Ohr ist ebenfalls verdickt. 80 bis 100 Prozent der

sechs Monate alten transgenen Mäuse zeigen klinische Symptome (Alopezie und Juckreiz).

Die histologische Untersuchung der Hautläsionen zeigt Hyperkeratose, Akanthose,

Infiltration von Entzündungszellen und Mastzellen. IL-31 transgene Mäuse zeigen jedoch

keinen Anstieg des Serum-IgE-Gehalts (DILLON et al. 2004).

TSLP transgene Mäuse

Das Thymic stromal lymphopoietin (TSLP) ist ein Zytokin, das von epithelialen Zellen

gebildet wird und für die Aktivierung von dendritischen Zellen in der Haut verantwortlich ist.

TSLP transgene Mäuse exprimieren ein keratinozytenspezifisches, durch Tetrazykline

induzierbares TSLP-Gen. Unter Gabe von Doxycyclin kommt es nach zwei Wochen zur

Ausbildung von Erythemen. Nach drei bis vier wöchiger Doxycyclin-Behandlung entstehen

sichtbare AD-ähnliche Hautläsionen sowie Splenomegalie und Lymphadenopathie. Die

Histologie zeigt eine Akanthose, Spongiosis, Hyperkeratose und eine Infiltration von

Lymphozyten, Makrophagen, Mastzellen und Eosinophilen. Der Serumgehalt an IgE und

IgG1 ist erhöht, der Gehalt an IgE2a verringert (YOO et al. 2005).

Literaturübersicht

7

2.1.3.2 Knockout-Mäuse

RelB-Knockout-Mäuse sowie Cathepsin E-Knockout Mäuse entwickeln ebenfalls spontan

AD-ähnlich Läsionen.

RelB-Knockout-Mäuse

RelB ist ein Protein, das zur Familie des Transkriptionsfaktors NF-κB gehört und vor allem in

spezifischen Regionen von lymphoiden Organen expremiert wird.

RelB-Knockout-Mäuse zeigen neben hämatologischen Veränderungen und Entzündungs-

anzeichen in verschiedenen Organen auch spontan auftretende Hautläsionen (WEIH et al.

1997; BARTON et al. 2000). Diese treten ab einem Alter von vier bis zehn Wochen auf. Erste

Symptome sind eine Verdickung der Haut sowie Haarverlust. Histologisch zeigen sich

Hyperkeratose, Akanthose und eine Infiltration von CD4+ T-Zellen, Eosinophilen und

einigen Mastzellen in der Haut. Der Serumspiegel an IgE ist erhöht (BARTON et al. 2000).

Cathepsin E-Knockout-Mäuse

Cathepsin E ist ein endolysosomale Protease, die vor allem in Zellen des Immunsystems zu

finden ist (YANAGAWA et al. 2007).

Cathepsin E-Knockout-Mäuse entwickeln unter normalen Haltungsbedingungen ab einem

Alter von zehn Wochen Juckreiz und Hautläsionen. Diese sind gekennzeichnet durch

Alopezie, Erytheme, Krusten, Erosionen sowie eine Verdickung der Haut. Der Schweregrad

der Läsionen nimmt mit dem Alter der Tiere zu. Histologisch weisen die Läsionen eine

epidermale Hyperproliferation wie auch eine Infiltration von Eosinophilen, Makrophagen,

Lymphozyten und Mastzellen in der Dermis auf. Der Gehalt an IgE im Blut ist, ebenso wie

der Gehalt an Eosinophilen, gesteigert. In vitro verursacht eine Stimulation von Splenozyten

von Cathepsin E-Knockout-Mäusen eine erhöhte Sekretion von IL-4 und IL-5, nicht jedoch

von IL-2 und IFN-γ (TSUKUBA et al. 2003).

Literaturübersicht

8

Tabelle 1: Übersicht über Befunde der jeweiligen Mausmodelle der atopischen Dermatitis, (k.A. = keine Angaben in

der Literatur) (MATSUDA et al. 1997; WEIH et al. 1997; SPERGEL et al. 1998; WATANABE et al. 1999; BARTON

et al. 2000; CHAN et al. 2001; HIKITA et al. 2002; HUANG et al. 2003; MATSUOKA et al. 2003; TSUKUBA 2003;

DILLON et al. 2004; YOO et al. 2005).

Mausstamm

AD-

ähnliche

Haut-

läsionen

Gen.

Defekt

der

Haut-

barriere

Histologie IgE-

Anstieg Juck-

reiz

Infiltration von Hyper-/

Para-

keratose Lympho-

zyten

Mast-

zellen total spezif.

NC/NgA + + + + + + - +

NOA + k.A. - + - + - +

DS/Nh + k.A. + + + + - +

IL-4

transgen + k.A. + + + + - +

IL-31

transgen + k.A. + + + - - +

TSLP

transgen + k.A. + + + + - k.A.

RelB

Knockout + k.A. + + + + - k.A.

Cathepsin E

Knockout + + + + + + - +

Allergen

OVA + - + + + + + +

D. farinae + + + + + + + +

Der p 8 + - + + + k.A. k.A. k.A.

Literaturübersicht

9

2.2 Histamin

Histamin ist ein biogenes Amin, das als Neurotransmitter im Nervensystem und als

Gewebshormon im Magen-Darm-Trakt, Immunsystem und in der Haut vorkommt. Die

chemische Bezeichnung lautet 2-(4-Imidazolyl)-Ethylamin.

Histamin wurde 1910 von G. Barger und Sir H. Dale als Bestandteil des Getreidepilzes

Mutterkorn entdeckt. Sie stellten fest, dass Histamin eine Konstriktion eines isolierten

Meerschweinchendarms hervorruft (BARGER und DALE 1910). Im selben Jahr zeigten Sir

H. Dale und P. P. Laidlaw in Tierversuchen, dass die Gabe von Histamin bei Säugetieren

schockähnliche Zustände verursacht. Symptome waren Bronchokonstriktion, Konstriktion

von Herz- und Lungenarterien sowie eine Stimulation der Herzkontraktion (DALE und

LAIDLAW 1910). Allerding gelang C. H. Best erst im Jahr 1927 der Nachweis von Histamin

im Körpergewebe, v.a. in der Lunge (BEST et al. 1927).

Histamin wird durch oxidative Decarboxylierung aus der Aminosäure L-Histidin gebildet

(WEISSBACH et al. 1961). In Mastzellen und basophilen Granulozyten liegt es in Granula

vor und ist dort mit Heparin assoziiert. Auch in enterochromaffinen Zellen im Magen, in den

Lymphknoten und im Thymus kommt Histamin in hohen Konzentrationen vor. In Leber,

Lunge und in Varikositäten von histaminergen Neuronen konnte es in geringen

Konzentrationen nachgewiesen werden (ZIMMERMANN et al. 2011).

Histamin hat unterschiedliche physiologische Wirkungen: im Magen fördert es die Säure-

produktion, am Herzen wirkt es positiv chronotrop und inotrop. Im zentralen Nervensystem

beeinflusst es den Schlaf-Wach-Rhythmus, den Appetit, das Lernverhalten und auch das

Gedächtnis. Des Weiteren spielt Histamin eine Rolle als Immunmodulator und als Mediator

Abbildung 1: Strukturformel von Histamin

Literaturübersicht

10

von Entzündungsreaktionen (HAAS und PANULA 2003; MÖSSNER und CACA 2005;

THURMOND et al. 2008).

Auch für pathophysiologische Vorgänge ist Histamin von Bedeutung. So konnten erhöhte

Histaminspiegel in der bronchoalveolären Lavage von Asthma-Patienten nachgewiesen

werden (BROIDE et al. 1991). In der Haut von Patienten mit AD, Psoriasis oder chronischer

Urtikaria wurde ein gesteigerter Gehalt an Histamin festgestellt (JOHNSON et al. 1960;

PETERSEN et al. 1998; KAPLAN et al. 1978). TUOMISTO et al. (1983) konnten im Liquor

von Patienten mit Multipler Sklerose einen Anstieg von Histamin nachweisen. Der Gehalt an

Histamin im Plasma sowie in der Gelenksflüssigkeit bei Rheumatoider Arthritis ist ebenfalls

erhöht (CRISP 1984).

2.3 Histaminrezeptoren

Histamin vermittelt seine Wirkung über vier verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.

Diese sind nach der zeitlichen Reihenfolge ihrer Entdeckung benannt: Histamin 1-Rezeptor

(H1R), Histamin 2-Rezeptor (H2R), Histamin 3-Rezeptor (H3R) und Histamin 4-Rezeptor

(H4R).

2.3.1 Histamin 1-Rezeptor

Der H1R wird von vielen Zellen und in vielen Geweben exprimiert, u.a. auf der glatten

Muskulatur von Atemwegen und Gefäßen, auf Neuronen, Hepatozyten, Chondrozyten,

Endothelzellen, Epithelzellen, Neutrophilen, Eosinophilen, Monozyten, Makrophagen,

dendritischen Zellen, T- und B-Zellen. Die Aktivierung des H1R ruft eine

Bronchokonstriktion sowie eine Kontraktion des Darms und eine Erhöhung der

Gefäßpermeabilität hervor (JUTEL et al. 2009). H1R-Knockout-Mäuse zeigen Auffälligkeiten

im Lernverhalten, der Lokomotion und Nozizeption ebenso wie im Gedächtnis (YANAI et al.

1998). T-Zellen dieser Mäuse produzieren weniger IFN γ bei einer gesteigerten Produktion

der TH2 Zytokine IL-4 und IL-13. Histamin scheint daher in der Lage zu sein, über den H1R

die T-Zell-vermittelte Immunantwort zu beeinflussen (JUTEL et al. 2001).

Literaturübersicht

11

2.3.1.1 Histamin 1-Rezeptor-Antagonisten

Nach BAKKER et al. (2000) wirken H1R-Antagonisten als inverse Agonisten, d.h. sie haben

eine hohe Affinität zur inaktiven Form des H1R und verschieben das Gleichgewicht zur

inaktiven Form.

H1R-Antagonisten, auch als Antihistaminika bekannt, werden in zwei Generationen

unterschieden. Zu den H1R-Antagonisten der ersten Generation zählen Diphenhydramin,

Doxylamin, Mepyramin (auch Pyrilamin genannt) und Dimetinden. Antihistaminika der

ersten Generation können leicht die Bluthirnschranke überwinden, so dass als

Nebenwirkungen Sedation und anticholinerge Effekte auftreten (HILL 1990; NICHOLSON et

al. 1991). Daher wurde eine zweite Generation Antihistaminika entwickelt, die nur in

geringen Maßen ins Gehirn gelangt und so weniger sedativ wirkt. Vertreter dieser „neuen“

Generation sind Cetirizin, Levocetirizin, Fexofenadin, Terfenadin, Loratadin und

Desloratadin.

In der Humanmedizin sind H1R-Antagonisten der zweiten Generation Therapie der Wahl bei

allergischer Rhinitis, allergischer Konjunktivitis und Urtikaria. Viele Studien belegen die

Wirksamkeit dieser Medikamente zur Behandlung dieser Krankheiten. H1R-Antagonisten

sind jedoch nur gering wirksam bei AD, Asthma, Anaphylaxie, Erkältungen, Otitis media,

Sinusitis, unspezifischem Husten sowie nicht allergisch-bedingtem Juckreiz. H1R-

Antagonisten der ersten Generation werden auch zur Behandlung von Schlaf- und

Angststörungen, Akathisie, Migräne, Schwindel und zur Sedation eingesetzt. Ein großer

Nachteil ist jedoch das Auftreten von starken Nebenwirkungen, wie z.B. Sinustachykardie,

Mydriasis, trockener Mund und Augen, Gewichtszunahme als auch unerwünschter Sedation

(SIMONS und SIMONS 2011).

Die Abbildungen 2 und 3 zeigen die Strukturformeln der erwähnten H1R-Antagonisten.

Literaturübersicht

12

Doxylamin Diphenhydramin

Dimetinden Mepyramin (Pyrilamin)

Abbildung 2: Strukturformeln von H1R-Antagonisten der ersten Generation.

Literaturübersicht

13

2.3.2 Histamin 4-Rezeptor

Der H4R wurde im Jahr 2000 zunächst von ODA et al. (2000) beschrieben. In den folgenden

Jahren gelang die Klonierung des H4R von Mensch, Ratte, Maus, Meerschweinchen,

Schwein, Affe und Hund (NAKAMURA et al. 2000; LIU et al. 2001; LIU et al. 2001;

MORSE et al. 2001; Zhu et al. 2001; NGUYEN et al. 2001; ODA et al. 2002; ODA et al.

2005; JIANG et al. 2008). Der H4R wurde bisher auf hämatopoetischen Zellen nachgewiesen,

u.a. auf dendritischen Zellen, Eosinophilen, Mastzellen, Monozyten, Neutrophilen sowie T-

und B-Zellen (ODA et al. 2000; MORSE et al. 2001; ZHU et al. 2001; O’REILLY et al.

2002; HOFSTRA et al. 2003; LING et al. 2004; GUTZMER et al. 2005; GUTZMER et al.

2009). H4R-mRNA konnte auch im Knochenmark, im Gewebe von Milz, Lymphknoten,

Thymus, Skelettmuskel, Hoden, Prostata, Dünndarm, Leber, Pankreas, Lunge, Herz und

Abbildung 3: Strukturformeln von H1R-Antagonisten der zweiten Generation.

Fexofenadin Levocetirizin

Terfenadin Loratadin Desloratadin

Literaturübersicht

14

Niere nachgewiesen werden (NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000; MORSE et al.

2001; NGUYEN et al. 2001; ZHU et al. 2001). Eine tatsächliche Expression des H4R in

diesen Geweben wird jedoch noch diskutiert, eine mögliche Ursache für den Nachweis von

H4R-mRNA in diesen Geweben könnten eine Verunreinigung mit hämatopoetischen Zellen

sein (ZHANG et al. 2007).

Der H4R hat eine bedeutende Funktion bei der Regulation der Immunantwort. Er hat Einfluss

auf die Chemotaxis von verschiedenen Zellen und die Zytokinfreisetzung aus diesen. So

verursacht Histamin über den H4R die Migration von Mastzellen ohne jedoch die

Degranulation dieser zu beeinflussen. Eine Aktivierung des H4R auf Mastzellen führt zu einer

Calciumfreisetzung aus intrazellulären Speichern (HOFSTRA et al. 2003).

Bei Eosinophilen ruft die Bindung von Histamin an den H4R eine Änderung der Zellform, die

Polymerisation von Aktin und eine gesteigerte Expression von Oberflächenmolekülen wie

z.B. CD11b und CD54 hervor. Auch ist die Chemotaxis in Richtung des Chemokins Eotaxin

erhöht (BUCKLAND et al. 2003; LING et al. 2004). O’REILLY et al. (2002) zeigten, dass

auch Histamin selbst über den H4R chemotaktisch auf Eosinophile wirkt. Bereits 1992

publizierten RAIBLE et al. (1992), dass Histamin einen Calciumanstieg in Eosinophilen

verursacht und dieser über den H3R/H4R-Antagonisten Thioperamid zu blocken ist. Da

LING et al. (2004) nachweisen konnten, dass Eosinophile keinen H3R exprimieren, scheint

der Calciumanstieg allein über den H4R vermittelt zu werden.

Dendritische Zellen (DC) werden über den H1R und den H4R zur Migration angeregt. Dies

kann durch den H1R-Antagonisten Diphenhydramin oder den H4R-Antagonisten JNJ

7777120 geblockt werden (BÄUMER et al. 2008). GUTZMER et al. (2005) zeigten, dass die

Stimulation des H4R auf DC zu Chemotaxis und Aktinpolymerisation sowie einer

verringerten Produktion des TH1-Zytokins IL-12p70 führt. Des Weiteren sind DC in der

Lage, selbst Histamin zu produzieren, welches dann autokrin wirken kann. DC, deren H4R

stimuliert wurde, fördern die TH2-Antwort von T-Zellen, so dass die TH2-Zytokine IL-4 und

IL-5 sowie die inflammatorisch wirkenden Zytokine IL-6 und IL-17 vermehrt produziert

werden (DUNFORD et al. 2006).

Inflammatorische dendritische epidermale Zellen (IDEC) exprimieren ebenfalls den H4R. Das

Zytokin IFN-γ führt zu einer erhöhten Expression des H4R auf IDEC. Eine Stimulation des

Literaturübersicht

15

H4R vermindert die Produktion des TH2-Chemokins CCL2 und des TH1-Zytokins IL-12

(DIJKSTRA et al. 2008).

Langerhans-Zellen exprimieren ebenfalls den H4R. GSCHWANDTNER et al. (2010) zeigten,

dass die Migration von Langerhans-Zellen über den H4R vermittelt wird. Ebenso führt die

Stimulation des H4R zu einer Abnahme der Sekretion des Chemokins CCL2.

GLATZER et al. (2013) zeigten, dass der H4R auf humanen Keratinozyten nachweisbar ist.

Eine Aktivierung mit Histamin oder dem H4R-Antagonisten 4-Methylhistamin induziert die

Proliferation der Keratinozyten. Dies lässt sich durch den H4R-Antagonisten JNJ 7777120

blocken. Auf Keratinozyten von gesunden Mäusen konnte erst nach einer Stimulation mit

Lipopolysaccharid und Peptidoglykan mRNA des H4R nachgewiesen werden. H4R-

Knockout-Mäuse haben eine geringere Epidermisdicke. In vitro zeigen neonatale

Keratinozyten dieser Mäuse eine geringere Proliferation als bei Wildtyp-Mäusen.

Keratinozyten von Wildtyp- oder H4R-Knockout-Mäusen zeigten keinen Unterschied in der

Proliferation nach der Stimulation mit Histamin.

CD8+ T-Zellen werden sowohl über den H4R als auch über den H2R zur Produktion von IL-

16 angeregt. IL-16 wirkt chemotaktisch auf CD4+ T-Zellen und führt zur Migration dieser

(GANTNER et al. 2002).

GUTZMER et al. (2009) publizierten, dass der H4R auch auf CD4+ T-Zellen vorhanden ist

und durch das TH2-Zytokin IL-4 hochreguliert werden kann. TH2-Zellen zeigen eine höhere

Expression des H4R als TH1- oder naive T-Zellen. Eine Stimulation des H4R auf TH2-Zellen

führt zu einem gesteigerten Gehalt an IL-31-mRNA in diesen. Auch auf TH17-Zellen ist der

H4R vorhanden. Wird dieser mit Histamin oder dem H4R-Antagonisten 4-Methylhistamin

stimuliert, kommt es zu einer vermehrten Produktion des proinflammatorischen Zytokins IL-

17. Dies lässt sich durch den H4R-Antagonisten JNJ 7777120 blocken (MOMMERT et al.

2012). ROSSBACH et al. (2011) zeigten zudem, dass sensorische Neurone in der Haut

sowohl den H1R, den H3R als auch den H4R exprimieren. Eine kombinierte Behandlung mit

H1R- und H4R-Antagonisten ist in der Lage H3R-induzierten Juckreiz zu hemmen.

2.3.2.1 Histamin 4-Rezeptor-Antagonisten

Seit der Entdeckung des vierten Histamin-Rezeptors und der Annahme, dass er eine Rolle in

der Regulation des Immunsystems spielt, sind einige Antagonisten entwickelt worden. Der in

Literaturübersicht

16

der Forschung bisher am häufigsten verwendete, erste selektive H4R-Antagonist ist das

Carboxamid JNJ 7777120. Dies hat eine sehr hohe Affinität zum humanen sowie murinen

H4R und eine tausendfache Selektivität gegenüber dem H1R und dem H3R. Da JNJ 7777120

bei oraler Gabe in der Maus eine maximale Plasmakonzentration von 0,8 ± 0,2 µmol/l sowie

eine kurze Halbwertszeit von 1,0 ± 0,04 Stunden hat, ist die Verwendbarkeit für In-vivo-

Versuche jedoch eingeschränkt. In In-vitro-Versuchen hat sich JNJ 7777120 jedoch als sehr

nützliches Hilfsmittel erwiesen (THURMOND et al. 2004; LIM et al. 2010).

Das Benzimidazolyl-Piperazin VUF 6002 (auch als JNJ 10191584 bezeichnet) ist ein

Analogon des Carboxamids JNJ 7777120 und hat eine zehnfach geringere Affinität für den

H4R im Vergleich zu diesem (TERZIOGLU et al. 2004; LIM et al. 2010).

Ein weiterer H4R-Antagonist, welcher für In-vivo-Studien benutzt wird, ist das Benzimidazol

JNJ 28307474. Dieses zeigt ebenfalls eine hohe Affinität zum humanen H4R, jedoch nur eine

geringere Affinität zum murinen H4R (COWDEN et al. 2010).

Der H4R-Antagonist JNJ 40279486 wurde von SAVALL et al. (2011) beschrieben. Chemisch

zählt dieser zu der Gruppe der trizyklischen Aminopyrimidinen. Bisher sind jedoch keine

weiteren Daten über den Einsatz dieses Antagonisten vorhanden.

Der 2014 zum ersten Mal beschriebene H4R Antagonist JNJ 39758979, ein 6-Alkyl-2,4-

Diaminopyrimidin, hat eine sehr hohe Affinität für den murinen H4R mit einer geringen

Affinität für den H3R. Dieser Antagonist wurde bereits in Phase-II klinischen Studien als

Wirkstoff gegen Asthma sowie AD getestet. Da jedoch bei zwei Studienteilnehmern eine

Agranulozytose auftrat, wurden die Studien abgebrochen. Jedoch zeigte sich, dass JNJ

39758979 in der Lage ist, Juckreiz bei Patienten mit AD zu lindern (KOLLMEIER et al.

2014; SAVALL et al. 2014; THURMOND et al. 2014; MURATA et al. 2015).

In Tabelle 2 sind die Affinitäten der H4R-Antagonisten zum humanen, murinen und caninen

H4R aufgeführt. Abbildung 4 zeigt die Strukturformeln der genannten H4R-Antagonisten.

Literaturübersicht

17

VUF 6002

Abbildung 4: Strukturformeln von H4R-Antagonisten

Tabelle 2: Affinitäten verschiedener H4R-Antagonisten für den humanen, den murinen und den caninen H4R

(k.A. = keine Angaben in der Literatur)

Antagonist pKi H4R (nmol/l, Mittelwert ± Standardfehler)

Mensch Maus Hund

JNJ 7777120 8,3 ± 0,1 8,4 ± 0,1 7,1 ± 0,1

VUF 6002 7,5 ± 0,1 6,9 ± 0,1 6,2 ± 0,1

JNJ 28307474 4,9 ± 1,1 109 ± 8 62 ± 31

JNJ 40279486 9,4 k.A. k.A.

JNJ 39758979 12,5 ± 02,6 5,3 ± 0,4 > 10.000

Literaturübersicht

18

2.4 H1R- und H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der atopischen

Dermatitis und Kontaktallergie

H4R-exprimierende Zellen spielen eine Rolle in der Entstehung von allergischen Reaktionen.

Der H4R stellt daher eine mögliche neue Zielstruktur zur Behandlung allergisch bedingter

Erkrankungen. Aus diesem Grund sind bereits verschiedene H4R-Antagonisten in

Tiermodellen getestet worden. Abbildung 5 zeigt mögliche Angriffspunkte dieser

Antagonisten an Zellen, die in der Pathogenese von allergischen Reaktionen eine Rolle

spielen.

Abbildung 5: Rolle von H4R-exprimierenden Zellen bei allergischen Reaktionen, modifiziert nach ZHANG et al.

(2007).

A: Sensibilisierunsphase: Dendritische Zellen prägen und polarisieren naive CD4+ T-Zellen unter

Mitwirkung von Mastzellen.

B: Provokationsphase: Aktivierte T-Zellen produzieren unterschiedliche Zytokine, die zum einen Mastzellen

und Eosinophile zur Migration in das entzündliche Gewebe anregen als auch B-Zellen zur Produktion von

IgE.

Literaturübersicht

19

Die Wirkung von H1R- und H4R-Antagonisten wurde in unterschiedlichen Mausmodellen

der Kontaktallergie sowie einem Mausmodell der AD untersucht.

MATSUSHITA et al. (2012) zeigten, dass die Gabe des H1R-Antagonisten Olopatadin (10

mg/kg p.o.) als auch des H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (100 mg/kg p.o.) die klinischen

Symptome (Ekzem-ähnliche Läsionen auf der dorsalen Haut) in einem Mausmodell der

chronischen Kontaktallergie, hervorgerufen durch das Hapten Trinitrochlorobenzen (TNCB),

verbessert. Auch die Kombination der beiden Antagonisten konnte eine Linderung

hervorrufen. Die histologische Untersuchung der betroffenen Hautstellen zeigte eine

geringere Epidermisdicke bei Tieren, die mit JNJ 7777120 oder der Kombination behandelt

worden waren. Die Migration von Eosinophilen in die Haut wurde durch alle drei

Behandlungen verringert. Die Kombination der zwei Antagonisten zeigte jedoch keinen

zusätzlichen Nutzen im Vergleich zu einer Monotherapie mit JNJ 7777120. Die Infiltration

der Haut mit Mastzellen wurde durch JNJ 7777120 gehemmt. Auch hier zeigte die

Kombination des H1R-Antagonisten mit dem H4R-Antagonisten keinen weiteren Effekt. Alle

Behandlungen senkten den IgE-Gehalt im Serum, die Kombination war dabei am effektivsten.

MATSUSHITA et al. (2012) bestimmten auch den Gehalt verschiedener Zytokine in der

Haut: JNJ 7777120 sowie die Kombination senkten die TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-6,

während Olopatadin nur den Gehalt an IL-5 reduzierte. Die TH1-Zytokine IFN-γ und IL-12

wurden bei Tieren, die mit JNJ 7777120 behandelt worden waren, vermehrt in der Haut

nachgewiesen. Eine Behandlung mit Olopatadin senkte hingegen den Gehalt dieser Zytokine.

Die Kombination der beiden Wirkstoffe konnte die Einzeleffekte gegeneinander aufheben.

SUWA et al. (2011) untersuchten ebenfalls im TNCB-induzierten Modell der chronischen

Dermatitis die Wirkung eines H1R- und eines H4R-Antagonisten sowie eines

Glukokortikoids. Der H4R-Antagonist JNJ 7777120 (10 mg/kg p.o.; 30 mg/kg p.o.) zeigte

eine dosisabhängige Reduzierung der Hautläsionen auf dem Rücken, während der H1R-

Antagonist Fexofenadin (60 mg/kg p.o.) und das Glukokortikoid Dexamethason (3 mg/kg

p.o.) keine Besserung hervorriefen. Alle drei Wirkstoffe verringerten den IgE-Serumspiegel.

Die Anzahl an Mastzellen in der Haut konnte nur durch JNJ 7777120 gesenkt werden. Der

mRNA-Gehalt des Zytokins IL-4 wurde sowohl durch JNJ 7777120 als auch Dexamethason

gesenkt.

Literaturübersicht

20

Auch SEIKE et al. (2010) zeigten, dass der H4R-Antagonist JNJ 7777120 (10 mg/kg) die

klinischen Symptome (Hautläsionen auf dem Rücken) im TNCB-vermittelten Modell der

chronischen Kontaktdermatitis lindert. Ebenso reduzierte er die Migration von Mastzellen und

Eosinophilen in die Haut sowie den IgE-Serumspiegel. Der Gehalt an den TH2-Zytokinen IL-

4, IL-5 und IL-6 in der Haut wurde durch JNJ 7777120 verringert. Die TH1-Zytokine IFN-γ

und IL-12 waren hingegen erhöht.

In einem weiteren TH2-abhängigen Mausmodell der Dermatitis wurden Effekte des H1R-

Antagonisten Mepyramin (2 mg/kg s.c.; 10 mg/kg s.c.; 20 mg/kg s.c.), des H4R-Antagonisten

JNJ 7777120 (2 mg/kg s.c.; 10 mg/kg s.c.; 20 mg/kg s.c.) sowie deren Kombination bestimmt.

Eine Bewertung der klinischen Symptome in diesem Modell erfolgte nicht. Die histologische

Untersuchung ergab, dass keine der Behandlung einen Effekt auf die Infiltration der Haut mit

Mastzellen hat. Die Ex-vivo-Restimulation der aus den drainierenden Lymphknoten

gewonnenen Zellpopulation mit dem zuvor benutzten Antigen zeigte keine Unterschiede in

der Produktion von Zytokinen durch die Monotherapie. Die kombinierte Behandlung

reduzierte die Produktion der Zytokine IL-4 und IL-13, die Produktion von IFN-γ wurde nicht

beeinflusst (MAHAPATRA et al. 2014).

ROSSBACH et al. (2009) untersuchten den Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (15

mg/kg i.p.) und des Glukokortikoids Dexamethason (5 mg/kg i.p.) in zwei unterschiedlichen

Mausmodellen der Kontaktallergie. Im TH1-vermittelten Allergiemodell wurde das Hapten

Dinitrochlorobenzen (DNCB) benutzt, im TH2-vermittelten Allergiemodell das Hapten

Toluendiisocyanat (TDI). In beiden Modellen zeigte JNJ 7777120 keine Verringerung der

Ohrschwellung; Dexamethason reduzierte diese hingegen signifikant. Dies spiegelte sich auch

in der histologischen Untersuchung des Zellinfluxes in die Haut sowie der Ödematisierung

dieser wider. Die Behandlung der Tiere mit dem H4R-Antagonisten bereits während der

Sensibilisierungsphase gegen DNCB konnte ebenfalls keine Linderung der Symptome

bringen. Auch die Blockade aller vier Histaminrezeptoren mit den Antagonisten

Diphenhydramin, Ranitidin und Thioperamid brachte keine Verbesserung.

Die H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (20 mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.) und JNJ 28307474 (20

mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.) wurden von COWDEN et al. (2010) in einem TH2-vermittelten

Kontaktallergiemodell, ausgelöst durch Fluoresceinisothiocyanat (FITC), untersucht. Beide

Antagonisten konnten die Ohrdicke als klinisches Anzeichen einer Entzündung reduzieren.

Literaturübersicht

21

Histologisch waren sowohl der Gesamtzellinflux als auch die Anzahl an Mastzellen und

Eosinophilen in der Haut verringert. Die Untersuchung des Homogenisats aus den betroffenen

Hautstellen auf den Gehalt verschiedener Zytokine ergab eine Reduktion von MIP-1α,

RANTES, IL-4, MCP-1, IL-1ß, IL-6, GM-CSF ebenso wie TNF-α. Die Ex-vivo-

Restimulation der aus den drainierenden Lymphknoten gewonnenen Zellpopulation führte zu

einer verringerten Produktion der TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-17.

Im gleichen Model wurde auch der Einfluss des H4R-Antagonisten JNJ 39758979 (20 m/kg

p.o.; 50 mg/kg p.o.) auf die Entstehung von klinischen Symptomen bestimmt. Auch dieser

konnte die Ohrdicke verringern (THURMOND et al. 2014).

OHSAWA und HIRASAWA (2012) untersuchten die Wirkung des H4R-Antagonist JNJ

7777120 (30 mg/kg p.o.) sowie dessen Kombination mit dem H1R-Antagonisten Olopatadin

(3 mg/kg p.o.) in einem Mausmodell, das durch die Verwendung von NC/NgA-Mäusen und

dem Hapten Picrylchlorid, sowohl Teilaspekte der AD sowie einer Kontaktallergie

widerspiegelt. Die klinischen Symptome (Hautläsionen auf dem Rücken sowie an den Ohren)

konnten durch beide Behandlungen reduziert werden. Olopatadin als Monotherapie hingegen

zeigte keinen Effekt. Die Kombination der beiden Antagonisten war genauso effektiv wie das

Glukokortikoid Prednisolon (3 mg/kg p.o.). Die kombinierte Behandlung reduzierte die

Epidermisdicke, die Einzelbehandlung mit JNJ 7777120 verringerte die Anzahl an Mastzellen

in der Haut. Der IgE-Gehalt im Plasma wurde nur durch die Kombination der Antagonisten

signifikant gesenkt. Die Bestimmung der Zytokine in der Haut zeigte eine Abnahme von

NGF, IL-4, IL-5, TSLP und TARC durch JNJ 7777120 sowie durch die Kombination mit

Olopatadin.

Der Effekt von H4R-Antagonisten in einem Mausmodell der AD wurde bisher nur von

KAMO et al. (2014) getestet. Dazu wurden die H4R-Antagonisten JNJ 7777120 (10 mg/kg

i.p.; 30 mg/kg i.p.) und JNJ 28307474 (10 mg/kg i.p.; 30 mg/kg i.p.) in NC/NgA-Mäusen, die

zusätzlich gegen Hausstaubmilben (Dfb) sensibilisiert wurden, auf ihre Wirksamkeit

untersucht. Es konnten jedoch keine Linderung der klinischen Symptome beobachtet werden

(KAMO et al. 2014).

In einigen dieser Modelle wurde auch der Einfluss von H1R- und H4R-Antagonisten auf den

allergisch bedingten Juckreiz bestimmt. So publizierten ROSSBACH et al. (2009), COWDEN

et al. (2010), SUWA et al. (2011) als auch OHSAWA und HIRASAWA (2012), dass der

Literaturübersicht

22

H4R-Antagonist JNJ 7777120 in der Lage ist, den Juckreiz in den jeweiligen Tiermodellen zu

hemmen. Lediglich KAMO et al. (2014) stellten fest, dass JNJ 7777120 keinen Einfluss auf

den allergiebedingten Juckreiz hat. Die Kombination eines H4R-Antagonisten mit einem

H1R-Antagonisten scheint zur Linderung des Juckreizes am effektivsten zu sein

(ROSSBACH et al. 2009; OHSAWA und HIRASAWA 2012).

Tabelle 3 gibt einen Überblick über die beschriebenen Modelle und den Effekt von H4R-

Antagonisten in diesen.

Literaturübersicht

23

Tabelle 3: Übersicht über die Effekte von H1R- und H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der

atopischen Dermatitis und Kontaktallergie (↓ = Reduktion, - = kein Einfluss, k.A. = keine Angaben)

Antagonist Maus-stamm

Hapten/ Allergen

Klinische Symptome

Mast-zellen

IgE-Gehalt

TH2-Zytokine Autor

JNJ 7777120

C57BL/6 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Matsushita et al. (2012)

HR-1 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Suwa et al. (2011)

C57BL/6 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Seike et al. (2010)

Balb/c OVA k.A. - k.A. - Mahapatra et al. (2014)

NMRI DNCB - k.A. k.A. k.A. Rossbach et al. (2009)

NMRI TDI - k.A. k.A. k.A. Rossbach et al. (2009)

Balb/c FITC ↓ ↓ k.A. ↓ Cowden et al. (2010)

NC/Nga Picryl-chlorid ↓ ↓ - ↓

Ohsawa und Hirasawa

(2012)

NC/Nga Dfb - k.A. k.A. k.A. Kamo et al. (2014)

JNJ 28307474

Balb/c FITC ↓ ↓ k.A. ↓ Cowden et al. (2010)

NC/Nga Dfb - k.A. k.A. k.A. Kamo et al. (2014)

JNJ 39758979 Balb/c FITC ↓ k.A. k.A. k.A. Thurmond et

al. (2014)

Kombination H1R-

Antagonist +

H4R-Antagonist

C57BL/6 TNCB ↓ ↓ ↓ ↓ Matsushita et al. (2012)

Balb/c OVA k.A. - k.A. ↓ Mahapatra et al. (2014)

NC/Nga Picryl-chlorid ↓ - ↓ ↓

Ohsawa und Hirasawa

(2012)

Material und Methoden

24

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Material für In-vivo-Versuche

Baumwollgaze 20 x 20 cm Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG, Neuwied

BlendermTM 3M Medica, Neuss

Combifix Adapter Luer B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Einmalspritzen 1 ml Henry Schein, Hamburg

Eppendorfgefäße 1,5 ml Eppendorf, Hamburg

Eppendorfgefäße 2 ml Eppendorf, Hamburg

Isotone Kochsalz-Lösung 0,9% B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Kanülen 26G Henke-Sass, Wolf GmbH, Tuttlingen

Knopfkanüle WDT, Garbsen

Peha Haft Color Paul Hartmann AG, Heidenheim

Pipetten Eppendorf, Hamburg

Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg

Polypropylen-Röhrchen 15 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Schermaschine Moser Elektrogeräte GmbH, Unterkirnach

Serum-Gel Röhrchen Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

Skalpellklingen Bayha, Tuttlingen

Tesafilm Beiersdorf, Hamburg

Videokamera Legria HF S21 Canon Deutschland GmbH, Krefeld

Aceton Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Aqua ad inj. B. Braun Melsungen AG, Melsungen

ß-Cyclodextrin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Betamethason-17-valerat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Celestan ® MSD Sharp & Dohme GmbH, Haar

JNJ 39758979 Janssen PRD, USA

Mepyraminmaleat Abcam, Cambridge, UK

Methylcellulose Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim


25

Ovalbumin Grade V Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Ovalbumin Grade VI Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Veet®-Enthaarungscreme Reckitt Benckiser Deutschland GmbH, Mannheim

4-Methylhistamindihydrochlorid Tocris Bioscience, UK

3.1.2 Material für Zellkultur-Versuche

Brutschrank Thermo Fisher Scientific, Braunschweig


Eppendorfgefäße 2 ml Eppendorf, Hamburg

Homogenisator DUALL® 1 ml Omnilab, Gehrden

Mikroskop Axiovert 25 Carl Zeiss AG, Jena

Neubauer-Zählkammer VWR International GmbH, Darmstadt






Sterilbank Heraeus Lamin Air H. Jürgens GmbH & Co. KG, Bremen

Sterilfilter Minisart Sartorius, Göttingen

Wasserbad Memmert, Schwabach

Zentrifuge Thermo Fisher Scientific, Braunschweig

6-,12-,24-,24,48-Well-Platten Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Ethanol CG Chemikalien, Laatzen

Fetales Kälberserum 10 % Biochrom, Berlin

Ovalbumin Grade VI Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Penicillin Invitrogen GmbH, Karlsruhe

RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin

Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Trypan-Blau Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim


26

3.1.3 Material für ELISA


Multipipette Eppendorf, Hamburg

Nunc-Immuno-Platten Thermo Fisher Scientific, Braunschweig

Photometer Dynatech, Denkendorf



Rundschüttler Reax 2000 Heidolph, Kelheim

Waschpipette Eppendorf, Hamburg

LEGEND MAX™ Mouse BioLegend, San Diego, USA

OVA Specific IgE ELISA Kit

Mouse IL-4 ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA



Mouse IFN-γ ELISA Kit R&D Systems, Minnesota, USA

TMB Liquid-Substrat-System Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

3.1.1 Material für Histologie

Deckgläser 24x50 mm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe

Einbettkassetten Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe

Färbeküvetten Glas Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe

Heiztisch Vogel GmbH, Giesen

Mikrotom 2035 Reichert-Jung, Nusstoch

Objektträger Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe

Paraffin-Streckbad TFB45 Medite, Burgdorf

Schwämme für Einbettkassetten Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe


Paraffin-Einbettsystem MEDITE, Burgdorf

Wasserbad GFL, Burgwedel

Ethanol 70, 80, 96, 100 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Entellan Merck KGaA, Darmstadt


27

Eosin Merck KGaA, Darmstadt

Essigsäure AppliChem GmbH, Darmstadt

Giemsa-Lösung Merck KGaA, Darmstadt

Hämalaun Merck KGaA, Darmstadt

Isopropanol Otto-Fischer GmbH, Saarbrücken

Paraffin Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe

Pikrinsäure VWR International GmbH, Darmstadt

Xylol Otto-Fischer GmbH, Saarbrücken

3.1.2 Material für FACS

FACS-Gerät BD Biosciences, Belgien



Zentrifuge Thermo Fisher Scientific, Braunschweig

96-Well-Platten, round-bottom Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Bovines Serum Albumin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

APC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend, San Diego, USA

FITC anti-mouse CD3ε BioLegend, San Diego, USA

PE anti-mouse CD11c Antibody BioLegend, San Diego, USA

PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend, San Diego, USA

PE/Cy7 anti-mouse CD19 BioLegend, San Diego, USA

Antibody

Pacific Blue anti-mouse CD8a BioLegend, San Diego, USA

Antibody


28

3.1.3 Puffer und Lösungen

PBS Puffer

NaCl 8 g

KCl 0,2 g

Na2PO4 1,44 g

KH2PO4 0,2 g

Aqua bidest ad 1000 ml

Einstellung von pH 7,2 (1 mol/l HCl)

Trypanblau-Lösung

Trypanblau 4 mg

PBS 1 ml

RPMI++-Medium

RPMI 500 ml

FKS 10 %

Penicillin/Streptomycin 1 %

Hämolyse-Puffer

NH4Cl 8,29 g

Na2EDTA 0,037 g

NaHCO3 0,839 g

Aqua bidest ad 1000 ml

Einstellung von pH 7,3 (1 mol/l HCl)


29

3.1.4 Versuchstiere und Tierhaltung

Für die Versuche wurden weibliche Balb/c Mäuse in einem Alter von 4 bis 8 Wochen von der

Firma Charles River (Sulzfeld) bezogen.

Die Mäuse wurden in Makrolonkäfigen Typ III mit „Häuschen“ bei 22°C und einem Licht/

Dunkel-Rhythmus von je 12 Stunden gehalten. Die Einstreu bestand aus Weichholzgranulat

(Altromin, Lage/Lippe). Wasser und Pelletfutter (Altromin 1324, Lage/Lippe) standen ad

libitum zur Verfügung. Die Mäuse wurden jeweils 14 Tage vor Versuchsbeginn eingestallt

und zweimal täglich an den Umgang gewöhnt.


30

3.2 Versuchsübersicht

Ziel dieser Arbeit war die Optimierung des OVA-induzierten Mausmodell der atopischen

Dermatitis nach SPERGEL et al. (1998) sowie die Beurteilung verschiedener Wirkstoffe in

diesem Modell. Zunächst wurde untersucht, ob eine Störung der Hautbarriere die Ausprägung

AD- ähnlicher Hautläsionen im OVA-Modell beeinflussen kann. Dazu wurden drei Varianten

des Protokolls miteinander verglichen (s. Tabelle 4). Es wurden jeweils folgende Parameter

erfasst: die Ausprägung der Hautläsionen (Hautscore), die Epidermisdicke, die Anzahl an

Entzündungs- und Mastzellen in der Haut, der Allergen-spezifische IgE-Gehalt im Serum, das

Gewicht und die Zellzahl der Lnn. axillares sowie die Milzzellzahl.

Im Anschluss wurde die Wirkung eines H1R-Antagonisten, eines H4R-Antagonisten sowie

eines Glukokortikoids und deren Kombinationen im OVA-Modell untersucht. Um den

Behandlungserfolg beurteilen zu können, wurden zusätzlich zu den bereits genannten

Parametern das Zellprofil der Lnn. axillares sowie die OVA-induzierte Zytokinproduktion

(IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-10) der aus der Milz isolierten Zellen bestimmt. Als Kriterium für

allergischen Juckreiz wurde das Kratzverhalten bewertet.


31

3.3 Methoden

3.3.1 Protokoll des OVA-Modells

Das OVA-Standardprotokoll (modifiziert nach SPERGEL et al. (1998)) besteht aus insgesamt

drei epikutanen Sensibilisierungswochen (SE) sowie zwei Wochen Provokationsphase

(Challenge; C). Zwischen diesen Phasen liegen jeweils 14 Tage Pause.

An Tag 1 wurden je Gruppe sieben Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen mittels Veet®-

Enthaarungscreme im Brustbereich enthaart. Nach 1 Std. Ruhezeit wurde den Mäusen ein

Patch mit OVA Grade V (100 µg/100 µl PBS) auf die enthaarte Brust gelegt. Das Patch

bestand aus drei Lagen Baumwollgaze (1,5 cm x 1,5 cm) und wurde mittels einer selbst-

haftenden Bandage (Peha Haft Color®) und chirurgischem, okklusivem Klebeband

(Blenderm®) fixiert. An Tag 4 wurde der Verband entfernt und nach 4 Stunden Wartezeit

wurden die Mäuse mit frisch angesetzter OVA Grade V-Lösung neu verbunden. Die erste

Sensibilisierungswoche endete an Tag 8 mit dem Entfernen des Verbandes. An Tag 22

begann Sensibilisierungswoche 2, diese verlief identisch zur Sensibilisierungswoche 1. Nach

dem gleichen Schema wurde Sensibilisierungswoche 3 ab Tag 43 durchgeführt. Im Rahmen

der ersten Challenge wurden die Mäuse an Tag 64 erneut mit Veet®-Enthaarungscreme

enthaart und nach einer Stunde wurde ein Patch mit OVA Grade VI (100 µg/100 µl PBS) auf

die gleiche Art und Weise wie in den Sensibilisierungswochen auf der Brust fixiert. An Tag

67 wurden der Verband und das OVA-Patch erneuert, dazu wurde frische OVA Grade VI-

Lösung benutzt. Der Verband wurde an Tag 71 morgens entfernt.

Abbildung 6: Zeitachse OVA-Standardprotokoll


32

Eine weitere Challenge wurde ab Tag 85 durchgeführt. An Tag 93 erfolgte die Tötung der

Mäuse mit anschließender Probenentnahme für weitere Untersuchungen. Die Tötung erfolgte

unter Inhalation von 5 % Isofluran und nachfolgendem Entbluten unter Narkose durch

Punktion des Herzens zur Blutentnahme.

3.3.2 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des OVA-induzierten Modells der

atopischen Dermatitis

Es wurden drei Protokolle sowie eine Kontrolle miteinander verglichen (siehe Tabelle 4).

Tabelle 4: Übersicht über die miteinander verglichenen OVA-Protokolle

Protokoll Angewandtes Protokoll 1 PBS-Kontrolle 2 OVA-Standardprotokoll 3 OVA-Standardprotokoll + Aceton 4 OVA-Standardprotokoll + Tesa-Strippen

3.3.2.1 PBS-Kontrolle

Als Kontrolle wurden die Mäuse gemäß dem OVA-Standardprotokoll behandelt, allerdings

wurde auf die Patches keine OVA-Lösung sondern lediglich PBS (100 µl) gegeben.

3.3.2.2 OVA-Standardprotokoll

Das bereits beschriebene OVA-Protokoll wurde in diesem Durchgang als OVA-

Standardprotokoll bezeichnet und unverändert angewandt.

3.3.2.3 OVA-Protokoll mit Aceton

Auch dieses Protokoll basiert auf dem OVA-Standardprotokoll, die Haut an der Brust wurde

zusätzlich vor jedem Auflegen des OVA-Patches dreimal mit einem in Aceton getränktem

Tuch abgewischt. Ziel war es, die Hautbarriere zu stören (RISSMANN et al. 2009).

3.3.2.4 OVA-Protokoll mit Tesa-Strippen

Dieses Protokoll basiert ebenso auf dem OVA-Standardprotokoll, jedoch wurde vor dem

Auflegen des OVA-Patches ein Tesafilmstreifen zehnmal auf die enthaarte Brust geklebt und

schnell abgerissen. Dies erfolgte bei jeder Erneuerung des Verbandes um eine Störung der

Hautbarriere zu verursachen (RISSMANN et al. 2009).


33

Abweichend vom eigentlichen OVA-Standardprotokoll hatte dieser Versuch nur eine

Provokationswoche. Daher wurden die Mäuse bereits an Tag 72 getötet und Proben

entnommen. Es wurden folgende Parameter untersucht: der klinische Hautscore, Gewicht und

Zellzahl der Lnn. axillares, Milzzellzahl, OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum,

Epidermisdicke sowie die Anzahl der Entzündungs- und Mastzellen in der Haut.

3.3.3 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen

Dermatitis im OVA-Modell

Es wurden mehrere Durchgänge des OVA-Standardprotokolls mit unterschiedlichen

Behandlungen durchgeführt (s. Tabelle 5). Je Durchgang wurde immer eine Kontrollgruppe

mit einem Vehikel (Lösungsmittel der Testsubstanzen) behandelt.

Es wurden folgende Parameter untersucht: Klinischer Hautscore, Kratzverhalten,

Lymphknotengewicht und –zellzahl, Zellprofil der drainierenden Lymphknoten, Milzzellzahl,

OVA-induzierte Zytokinproduktion der Splenozyten, OVA-spezifischer IgE-Gehalt im

Serum, epidermale Hyperproliferation, Anzahl der Entzündungs- und Mastzellen in der Haut.

Tabelle 5: Verwendete Wirkstoffe und Dosierungen im OVA-Modell

Wirkstoff Dosierung

Mepyramin

(H1R-Antagonist) 20 mg/kg i.p.

JNJ 39758979

(H4R-Antagonist)

20 mg/kg p.o.

50 mg/kg p.o.

20 mg/kg i.p.

Betamethason

(Glukokortikoid)

1 mg/kg p.o.

2 mg/kg i.p.

Mepyramin + JNJ 39758979 20 mg/kg i.p. + 20 mg/kg i.p.

JNJ 39758979 + Betamethason 20 mg/kg i.p. + 2 mg/kg i.p.


34

3.3.3.1 H4R-Antagonist JNJ 39758979

Der H4R-Antagonist JNJ 39758979, im folgenden JNJ 3975 genannt, wurde in zwei

unterschiedlichen Dosierungen und zwei Applikationsarten verabreicht. Zur oralen Gabe

wurde JNJ in 20% ß-Cyclodextrin gelöst und mittels einer Knopfsonde zwei- bzw. dreimal

täglich verabreicht (THURMOND et al. 2014). Für die i.p. Behandlung wurde JNJ in Aqua ad

inj. gelöst.

Die jeweiligen Zeitpunkte der Behandlungen sowie die Dosierungen sind in Tabelle 6

aufgeführt.

Tabelle 6: Behandlungsschema JNJ 39758979

Sensibilisierung (SE) Challenge (C) Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C

20 mg/kg p.o. - - - 2 x tgl. 3 x tgl.

50 mg/kg p.o. - - - 2 x tgl. 3 x tgl.

20 mg/kg i.p. - - - 2 x tgl. 2 x tgl.

3.3.3.2 H1R-Antagonist Mepyramin

Die Behandlung mit dem H1R-Antagonisten Mepyramin erfolgte zweimal täglich in einer

Dosierung von 20 mg/kg i.p.. Dafür wurde Mepyramin in Aqua ad inj. gelöst. Zeitpunkt

sowie Dosierung sind in Tabelle 7 aufgeführt.

Tabelle 7: Behandlungsschema Mepyramin


20 mg/kg i.p. - - - 2 x tgl. 2 x tgl.


35

3.3.3.3 Glukokortikoid Betamethason

Betamethason wurde sowohl als Betamethasonvalerat (oral) als auch als Betamethason-

phosphat (i.p.) einmal täglich morgens verabreicht. Für die orale Gabe wurde Betamethason

in 0,5% Methylcellulose, für die i.p. Gabe in Aqua ad inj. gelöst (MAEKAWA et al. 2006).

Tabelle 8 zeigt das Behandlungsschema.

Tabelle 8: Behandlungsschema Betamethason


1 mg/kg p.o. - - - 1 x tgl. 1 x tgl.

2 mg/kg i.p. - - - 1 x tgl. 1 x tgl.

3.3.3.4 Kombination Mepyramin und JNJ 39758979

Beide Substanzen wurden in Aqua ad inj. gelöst und i.p. injiziert. Zeitpunkt sowie Dosierung

sind in Tabelle 9 dargestellt.

Tabelle 9: Behandlungsschema Kombination Mepyramin und JNJ 39758979

Sensibilisierung (SE) Challenge (C) Dosierung 1. SE 2. SE 3. SE 1. C 2. C Mepyramin

20 mg/kg i.p. +

JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

- - - 2 x tgl.

+ 2 x tgl.

2 x tgl. +

2 x tgl.


36

3.3.3.5 Kombination JNJ 39758979 und Betamethason

Beide Substanzen wurden in Aqua ad inj. gelöst und i.p. injiziert. Betamethasonphosphat

wurde einmal täglich verabreicht, JNJ 3975 zweimal täglich (s. Tabelle 10).

Tabelle 10: Behandlungsschema Kombination JNJ 39758979 und Betamethason


JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

+ Betamethason 2 mg/kg i.p.

- - - 2 x tgl.

+ 1 x tgl.

2 x tgl. +

1 x tgl.

3.3.4 Untersuchte Parameter im OVA-Modell

3.3.4.1 Bewertung der Hautläsionen

An Tag 91 erfolgte die Bewertung der Hautläsionen verblindet 8 Stunden nach Entfernung

des Verbandes. Es wurde ein Score-System benutzt. Bewertet wurden drei Parameter:

Schuppung, Erosion/Exkoration und Erythem. Dafür wurde die in Tabelle 11 beschriebene

Skala benutzt:

Tabelle 11: Einteilung Hautscore (Schuppung, Erosion/Exkoration und Erythem)

Score Definition Schweregrad 0 Keine Veränderungen 1 Leichte Veränderungen 2 Moderate Veränderungen 3 Schwere Veränderungen 4 Sehr schwere Veränderungen

Aus der Summe der Einzelparameter ergab sich der Gesamtscore (0-12).


37

3.3.4.2 Bewertung des Allergen-induzierten Juckreizes

Am Ende der zweiten Provokationswoche wurden die Mäuse direkt nach dem Entfernen des

Verbandes in Acrylglaskäfige gesetzt und 30 Minuten gefilmt. Bei der Auswertung des

Videomaterials wurde die Anzahl der Kratzattacken (Kratzen mit dem Hinterbein an der

seitlichen Brustwand sowie ventral an Brust und Bauch ohne Absetzen der Gliedmaße)

gezählt.

3.3.4.3 Histologie

Aus dem ventralen Thoraxbereich wurde nach Tötung der Tiere ein ca. 1,5 x 1 cm großes

Hautstück entnommen und in Bouin´scher Lösung fixiert. Nach 48 Stunden wurden die

Hautstücke in Paraffin gebettet, geschnitten und auf Objektträger gezogen. Dazu wurde

folgendes Protokoll angewandt:

Die Hautstücke wurden in Kassetten mit Schaumstoff gebettet und zur Entwässerung in eine

aufsteigende Alkoholreihe gegeben. Danach wurden die Proben für 4 Stunden in Xylol und

über Nacht in Paraffin inkubiert und anschließend in Paraffinblöcke gegossen.

Mittels eines Mikrotoms wurden 7 µm dicke Schnitte angefertigt, in ein Streckbad gegeben

und auf einen Objektträger gezogen. Diese wurden zum Trocknen auf einen 50°C warmen

Strecktisch gelegt. Nachdem die Schnitte über Nacht im Trockenschrank bei 60°C weiter

getrocknet wurden, erfolgte die Färbung der Schnitte (Hämatoxylin-Eosin (HE) oder Giemsa).

3.3.4.4 Bestimmung der Epidermisdicke und Anzahl der Entzündungszellen in der

Haut mittels HE-Färbung

Um die Epidermisdicke sowie die Anzahl der Entzündungszellen in der Haut zu bestimmen,

wurden die Hautschnitte nach folgendem Protokoll gefärbt:

• Xylol 2 Minuten

• Xylol 2 Minuten

• Absteigende Alkoholreihe je 2 Minuten

• Destilliertes Wasser 5 Minuten

• Hämalaun 8 Minuten

• Salzsaurer Alkohol 2 Sekunden


38

• Fließendes Leitungswasser 5 Minuten

• Eosin 2 Minuten

• Leitungswasser 30 Sekunden

• Aufsteigende Alkoholreihe je 20 Sekunden

• Xylol 20 Sekunden

• Xylol 20 Sekunden

Direkt nach der Färbung wurden die feuchten Schnitte mit Entellan eingedeckt.

Die histologische Auswertung erfolgte verblindet. Die Epidermisdicke (Distanz von der

Basalmembran bis zum Stratum corneum) wurde an 10 zufällig gewählten Stellen mittels

Axiovision-Software bei zwanzigfacher Vergrößerung gemessen und der Mittelwert pro Maus

berechnet. Die Anzahl der Entzündungszellen wurde mittels eines Scoresystems bewertet:

Dieses reichte von 0 (kein Zellinflux) bis 4 (hochgradiger Zellinflux).

3.3.4.5 Bestimmung der Anzahl an Mastzellen in der Haut mittels Giemsa-Färbung

Zur Bestimmung der Anzahl an Mastzellen in der Haut, wurden die Paraffinschnitte nach

folgendem Protokoll Giemsa gefärbt:

• Xylol 2 Minuten

• Xylol 2 Minuten

• Absteigende Alkoholreihe je 2 Minuten

• Destilliertes Wasser 5 Minuten

• Giemsa-Lösung filtriert 5 Minuten

• Essigsäure 0,1% 20 Sekunden

• Essigsäure 0,1% (Schwenken bis sich keine Farbwolken mehr ablösen)

• Destilliertes Wasser 10 Sekunden

• Isopropanol 20 Sekunden

• Isopropanol 20 Sekunden

• Isopropanol (Schwenken bis sich keine Farbwolken mehr ablösen)

• Xylol 5 Minuten

• Xylol 5 Minuten


39

Direkt nach der Färbung wurden die noch feuchten Schnitte mit Entellan eingedeckt. Die

Auswertung erfolgte verblindet. Die Anzahl an Mastzellen wurde in zehn zufällig

ausgesuchten Arealen gezählt und der Mittelwert pro Maus berechnet.

3.3.4.6 Bestimmung des Gewichts und der Gesamtzellzahl der Lnn. axillares

Die axillären Lymphknoten wurden beidseits freipräpariert und gewogen. Jeder Lymphknoten

wurde einzeln mittels einem Homogenisator und Glaspistill in 1ml sterilem PBS manuell

homogenisiert und die Zellzahl mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Dazu

wurden 10 µl der Zellsuspension mit 90 µl Trypanblau-Lösung gemischt und die angefärbten

Zellen unter einem Invertmikroskop bei vierzigfacher Vergrößerung in der Neubauer-

Zählkammer gezählt.

3.3.4.7 Bestimmung der Zellpopulationen in den Lnn. axillares

Die Zellpopulationen in den drainierenden Lymphknoten (Lnn. axillares) wurde mittels

Durchflusszytometrie (Fluorescense Activated Cell Sorting, FACS-Analyse) bestimmt. Pro

Maus wurden 500.000 Zellen/Well auf einer 96-Well-Platte mit rundem Boden ausgesät. Um

die Zellen mit den in Tabelle 12 aufgeführten Antikörper zu färben, wurde ein Mastermix

(2 µl/ Antikörper/Probe) hergestellt und von diesem 12 µl auf jede Probe gegeben. Nach 20

Minuten Inkubationszeit bei 4 °C wurden die Zellen gewaschen. Dazu wurden 100 µl PBS +

5 % BSA auf jede Probe gegeben, bei 300G für 7 Minuten zentrifugiert, der Überstand

verworfen und das Zellpellet in 200 µl PBS + 5% BSA aufgenommen. Im FACS-Gerät wurde

der Gehalt an T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, B-Zellen, dendritischen Zellen und

Makrophagen in der Zellsuspension bestimmt.


40

Tabelle 12: Für FACS-Analyse benutzte Antikörper

Antikörper Gefärbte Zellpopulation

FITC anti-mouse CD3ε Antibody T-Zellen

Pacific Blue™ anti-mouse CD8a Antibody CD8+ T-Zellen

PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody CD4+ T-Zellen

PE/Cy7 anti-mouse CD19 Antibody B-Zellen

PE anti-mouse CD11c Antibody dendritische Zellen

APC anti-mouse F4/80 Antibody Makrophagen

3.3.4.8 Bestimmung der Milzzellzahl

Zur Bestimmung der Milzzellzahl wurden zwei unterschiedliche Methoden angewandt:

In den ersten zwei Versuchsdurchgängen wurden beide Milzpole entfernt und die Milz mit 10

ml sterilem PBS durchgespült. Die so gewonnene Zellsuspension wurde zentrifugiert (1000G,

10 Minuten) und das entstandene Zellpellet in 5 ml Hämolysepuffer aufgenommen. Die

Hämolysereaktion wurde nach 5 Minuten durch die Zugabe von 45 ml sterilem PBS gestoppt.

Nach erneutem Zentrifugieren (1000G, 10 min.) wurde das Zellpellet in 5 ml RPMI++

resuspendiert. Die vorhandenen Splenozyten konnten in einer Neubauer-Zählkammer mittels

Trypanblau (Verdünnung 1:10) unter einem Invertmikroskop bei vierzigfacher Vergrößerung

gezählt werden. Da mit dieser Methode nur eine geringe Anzahl an Splenozyten gewonnen

werden konnte, wurde in den folgenden Versuchsdurchgängen die Methode geändert:

Die Milz wurde zunächst in vier Teile zerschnitten und durch ein Sieb mit einer

Maschengröße von 70 µm gerieben. Das Sieb wurde im Anschluss mit PBS gespült und die

entstandene Zellsuspension wurde wie bei der bereits beschriebenen Methode weiter

verarbeitet.


41

3.3.4.9 Bestimmung der OVA-induzierten Zytokinproduktion der Splenozyten

Die Splenozyten wurden in einer 24-Well-Platte (3 Mio. Zellen/ml RPMI++ /Well) ausgesät.

Drei Wells pro Maus wurde OVA Grade VI (100 µg/100 µl PBS) zugesetzt, weiteren drei

Wells wurde PBS (100 µl) zugesetzt. Die Zellen wurden im Brutschrank inkubiert (37 °C; 5%

CO2), nach 4 Tagen wurden die Überstände genommen und bei -20°C gelagert. Mittels

ELISA wurde der Gehalt an IFN-γ, IL-4, IL-10 und IL-6 bestimmt.

3.3.4.10 Bestimmung des OVA-spezifischen IgE-Gehaltes im Serum

Zur Blutgewinnung wurde das Herz mittels einer 25G-Kanüle punktiert, ca. 500 µl Blut

entnommen und in Serumröhrchen überführt. Nach 20 Minuten Standzeit bei Raum-

temperatur wurde das Serum bei 10.000G für 5 Minuten abzentrifugiert und bis zur Messung

bei -20°C gelagert. Der OVA-spezifische IgE-Gehalt im Serum wurde mittels ELISA

bestimmt. Dieser wurde nach Herstellerangaben durchgeführt.

3.4 Statistische Auswertung

Die Ergebnisse wurden mittels Boxplot (Median, oberes und unteres Quartil, Minimum und

Maximum) oder Streudiagramm mit Mittelwert dargestellt. Die Auswertung der Daten

erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism® (Version 6, GraphPad Software, Inc.).

Für die Auswertung der untersuchten Parameter wurden die behandelten Gruppen mit der

jeweils entsprechenden Vehikelgruppe auf signifikante Unterschiede verglichen. Dazu wurde

der Kruskal-Wallis-Test verwendet und Irrtumswahrscheinlichkeiten von 0,1 %, 1 % und 5 %

bestimmt. Wurde lediglich eine behandelte Gruppe mit einer Vehikelgruppe verglichen, so

wurde der Mann-Whitney-Test angewendet.

Ergebnisse

42

4 Ergebnisse

4.1 Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des Ovalbumin-induzierten Modells

der atopischen Dermatitis (OVA-Protokoll)

Es wurden drei Varianten des OVA-Standardprotokolls mit unterschiedlichen Methoden zur

Störung der Hautbarriere mit einer PBS-Kontrollgruppe verglichen. Variante 1 entsprach dem

OVA-Protokoll nach SPERGEL et al. (1998) und wird als OVA-Standardprotokoll

bezeichnet. Um die Hautbarriere zu stören, wurden zwei Methoden angewandt: das

Abwischen der Haut mit Aceton sowie das Tesa-Strippen der Haut. Die Ergebnisse der

untersuchten Parameter sind im Folgenden aufgeführt. Die Einzelwerte der jeweiligen

Parameter finden sich im Anhang.

4.1.1 Klinischer Hautscore

Die entstandenen Hautläsionen wurden mittels eines Scoresystems bewertet und aus den

einzelnen Werten wurde ein Gesamtscore berechnet (siehe Methodenteil 4.). Eine zusätzliche

Störung der Hautbarriere durch Aceton oder Tesa-Strippen war nicht in der Lage, den

gleichen Schweregrad der Hautläsionen wie das OVA-Standardprotokoll hervorzurufen. Der

Score des OVA-Standardprotokolls war bei allen Einzelparametern am höchsten. Sowohl der

Score für die Beurteilung des Erythems als auch der Gesamtscore waren bei diesem Protokoll

signifikant erhöht gegenüber der PBS-Kontrollgruppe (Tabelle 13 und Abbildung 8).

Abbildung 7: Bauchhaut einer nach dem OVA-Standardprotokoll behandelten Maus; zu sehen sind Schuppen,

Erosionen und Erythem.

Ergebnisse

43

Tabelle 13: Übersicht über die Einzelparameter des klinischen Hautscores der verglichenen Protokolle; angegeben ist

der Median der jeweiligen Einzelparameter Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem sowie deren Summe als

Gesamtscore; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-Standardprotokoll mit

Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.

Angewandtes

Protokoll Schuppen

Erosion/

Exkoration Erythem Gesamtscore

PBS 1,5 0,5 1 3

OVA 3 2 2 7

OVA

+

Aceton

2 1 1 4

OVA

+

Tesa

1 1 1 3

Abbildung 8: Klinischer Hautscore der miteinander verglichenen Protokolle, dargestellt ist der Gesamtscore aus den

Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-

Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit

Tesa-Strippen.

Ergebnisse

44

4.1.2 Histologie

Die Epidermisdicke sowie die Anzahl an Entzündungszellen in der Haut wurden verblindet

bei zwanzigfacher Vergrößerung an HE-gefärbten Hautschnitten beurteilt. Haut von Mäusen,

die nach dem OVA-Standardprotokoll oder dem OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen

behandelt wurden, zeigte eine signifikante Zunahme der Epidermisdicke sowie eine

gesteigerte Anzahl an Entzündungszellen im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe. Auch die

Behandlung nach dem OVA-Standardprotokoll mit Aceton verursachte einen Anstieg der

Epidermisdicke und des inflammatorischen Zellinfluxes, allerdings war dieser nicht

signifikant (Abbildung 9, Abbildung 10, Abbildung 11).

Abbildung 9: Epidermisdicke und Anzahl an Entzündungszellen in der Haut; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-


Tesa-Strippen; Darstellung als Boxplot.

Ergebnisse

45

Abbildung 10: HE-gefärbter Hautschnitt einer Maus aus der PBS-Kontrollgruppe.

Abbildung 11: HE-gefärbter Hautschnitt einer Maus aus der OVA-Standardprotokoll-Gruppe; man sieht eine

deutliche Zunahme der Epidermisdicke sowie einen erhöhten inflammatorischen Zellinflux im Vergleich zur PBS-

Kontrollgruppe (Abbildung 10).

Die Anzahl an Mastzellen wurde mittels Giemsa-Färbung bestimmt und pro Schnitt die

Mastzellen in 5 Gesichtsfeldern bei vierzigfacher Vergrößerung gezählt und der Mittelwert

berechnet. Die Anzahl an Mastzellen war bei Mäusen, die nach dem OVA-Standardprotokoll

sowie nach dem OVA-Standardprotokoll mit Aceton sensibilisiert wurden, signifikant erhöht

(Abbildung 12).

Ergebnisse

46

Abbildung 12: Anzahl an Mastzellen pro Gesichtsfeld (40fache Vergrößerung); PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-



4.1.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl

Der rechte und linke axilläre Lymphknoten wurde entnommen und das Gesamtgewicht sowie

die Gesamtzellzahl beider Lymphknoten zusammen bestimmt. Abbildung 13 zeigt, dass

Mäuse, die nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt wurden, ein signifikant höheres

Lymphknotengewicht als die PBS-Kontrollgruppe aufwiesen. Ein Unterschied in der

Gesamtzellzahl der Lymphknoten war zwischen den einzelnen Gruppen nicht zu erkennen.

Ergebnisse

47

Abbildung 13: Gesamtgewicht und Gesamtzellzahl der Lnn. axillares; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-



4.1.4 Milzzellzahl

Als weiterer Indikator für die Aktivierung des Immunsystems wurde die Milzzellzahl

bestimmt. Dabei zeigte sich ein geringerer Anstieg der Milzzellzahl bei Mäusen, die nach

dem OVA-Standardprotokoll mit Aceton behandelt wurden (Abbildung 14).

Abbildung 14: Milzzellzahl, PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-

Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen; Darstellung als Boxplot.

Ergebnisse

48

4.1.5 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum

Der OVA-spezifische IgE-Gehalt im Serum wurde mittels ELISA bestimmt. Bei Mäusen, die

nicht mit OVA sensibilisiert wurden, konnte kein OVA-spezifisches IgE nachgewiesen

werden. Die Behandlung mit OVA führte bei allen Gruppen zu einer Produktion von OVA-

spezifischem IgE im Serum (14,19 ± 10,77 ng/ml).

4.2 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis

im OVA-Modell

Zur Untersuchung des Effekts verschiedener Wirkstoffe im OVA-Modell wurden Mäuse nach

dem OVA-Standardprotokoll behandelt und während der zwei Challengephasen mit den

verschiedenen Wirkstoffen behandelt. Untersucht wurde die Wirkung eines H1R-

Antagonisten (Mepyramin), eines H4R-Antagonisten (JNJ 3975), eines Glukokortikoids

(orale Gabe: Betamethason-17-valerat, intraperitoneale Gabe: Betamethasonphosphat) sowie

deren Kombinationen. Alle Wirkstoffe wurden während den zwei Challengephasen

verabreicht. Im Folgenden sind die Ergebnisse, gegliedert nach den untersuchten

Einzelparametern, gezeigt. Die Einzelwerte sind im Anhang aufgeführt.

4.2.1 Klinischer Hautscore

Die Hautläsionen wurden wie zuvor nach einem Scoresystem bewertet und dabei die

Entstehung von Schuppen, Erosionen/Exkorationen und Erythemen beurteilt. Die Summe der

Einzelparameter ergab den Gesamtscore. Eine Behandlung mit JNJ 3975, unabhängig vom

Applikationsweg und Dosierung, oder Mepyramin allein war nicht in der Lage, die einzelnen

Parameter und somit auch den Gesamtscore im Vergleich zur Vehikelgruppe zu senken

(Abbildung 15 und Abbildung 16). Die intraperitoneale Behandlung mit Betamethason-

phosphat (2 mg/kg) zeigt eine Tendenz zur Verbesserung des Gesamtscores (Abbildung 17).

Ergebnisse

49

Abbildung 15: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von JNJ 3975 (20 mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.; 20 mg/kg i.p.)

behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der

Gesamtscore aus den Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; der Gesamtscore einer

unbehandelten Kontrolle in allen durchgeführten Versuchsdurchgängen betrug im Median 3.

Abbildung 16: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle

Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der Gesamtscore aus den

Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; der Gesamtscore einer unbehandelten Kontrolle in

allen durchgeführten Versuchsdurchgängen betrug im Median 3.

Ergebnisse

50

Abbildung 17: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Betamethason (1 mg/kg p.o.; 2 mg/kg i.p.) behandelten

Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der Gesamtscore aus den

Einzelparametern Schuppen, Erosion/Exkoration und Erythem; der Gesamtscore einer unbehandelten Kontrolle in

allen durchgeführten Versuchsdurchgängen betrug im Median 3.

Die kombinierte Behandlung mit Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20

mg/kg i.p.) führte zu einer signifikant reduzierten Bildung von Erosionen/Exkorationen und

zu einer Abnahme des Gesamtscores (Abbildung 18).

Abbildung 18: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Betamethason (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg

i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der



Ergebnisse

51

Auch die Behandlung mit der Kombination des H1R-Antagonisten Mepyramin (20 mg/kg

i.p.) und dem H4R-Antagonisten JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) reduzierte die Entstehung von

Erosionen/Exkorationen, Erythem und den Gesamtscore signifikant (Abbildung 19).

Abbildung 19: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg

i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; dargestellt ist der



4.2.2 Histologie

Die intraperitoneale Behandlung mit dem Glukokortikoid Betamethasonphosphat (2 mg/kg

i.p.) senkte die Anzahl an Entzündungszellen in der Haut signifikant, beeinflusste jedoch

nicht die Epidermisdicke (Abbildung 20). Die Kombination von Betamethasonphosphat (2

mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) sowie auch die Kombination von Mepyramin (20

mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) reduzierte die Epidermisdicke als auch die Anzahl

an Entzündungszellen in der Haut signifikant (Abbildung 21 und Abbildung 22).

Ergebnisse

52

Abbildung 20: Epidermisdicke und Anzahl an Entzündungszellen in der Haut von Mäusen, die mit Betamethason

(2 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als

Boxplot.

Abbildung 21: Epidermisdicke und Anzahl an Entzündungszellen in der Haut von Mäusen, die mit einer

Kombination aus Betamethason (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden

nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

Ergebnisse

53

Abbildung 22: Epidermisdicke und Anzahl an Entzündungszellen in der Haut von Mäusen, die mit einer

Kombination aus Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden

nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

Die Anzahl an Mastzellen war bei Mäusen, die mit JNJ 3975 (50 mg/kg p.o.), mit

Betamethason (1 mg/kg p.o.) oder mit der Kombination aus Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und

JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden, signifikant reduziert (Abbildung 23, Abbildung

24, Abbildung 25). Alle anderen Behandlungen zeigten keinen Einfluss auf die

Mastzellanzahl.

Abbildung 23: Anzahl an Mastzellen pro Gesichtsfeld (40fache Vergrößerung) in der Haut von Mäusen, die mit JNJ

3975 20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o. behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll

behandelt; Darstellung als Boxplot.

Ergebnisse

54

Abbildung 24: Anzahl an Mastzellen pro Gesichtsfeld (40fache Vergrößerung) in der Haut von Mäusen, die mit

Betamethason 1 mg/kg p.o. behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll; Darstellung

als Boxplot.

Abbildung 25: Anzahl an Mastzellen pro Gesichtsfeld (40fache Vergrößerung) in der Haut von Mäusen, die mit

Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-

Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

Ergebnisse

55

4.2.3 Lymphknotengewicht und –zellzahl

Eine Abnahme des Gewichts und der Zellzahl wurde durch die Behandlung mit Mepyramin

(30 mg/kg i.p.), Betamethason (2 mg/kg i.p.) und der Kombination aus

Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) erreicht (Abbildung 26,

Abbildung 27, Abbildung 28). Alle anderen Behandlungen zeigten keinen signifikanten

Einfluss auf das Lymphknotengewicht sowie die Zellzahl.

Abbildung 26: Gesamtgewicht und Gesamtzellzahl der Lnn. axillares nach Behandlung der Mäuse mit Mepyramin

(30 mg/kg i.p.); alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

Abbildung 27: Gesamtgewicht und Gesamtzellzahl der Lnn. axillares nach Behandlung der Mäuse mit Betamethason

(2 mg/kg i.p.); alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

Ergebnisse

56

Abbildung 28: Gesamtgewicht und Gesamtzellzahl der Lnn. axillares nach Behandlung der Mäuse mit Betamethason

(2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.); alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt;

Darstellung als Boxplot.

Zellpopulation der Lnn. axillares

Die Bestimmung der Zellpopulation in den Lnn. axillares erfolgte per FACS-Analyse. Dazu

wurden der rechte und der linke Ln. axillaris gepoolt. Tabelle 14 gibt eine Übersicht über die

veränderte Zellanzahl gegenüber der jeweiligen Vehikelgruppe.

Ergebnisse

57

Tabelle 14: Übersicht über die Änderungen der Zellzusammensetzung der Lnn. axillares gegenüber der

jeweiligenVehikelgruppe; - = keine signifikanten Änderungen gegenüber der Vehikelgruppe, ↑ = signifikante

Zunahme der Zellpopulation, ↓ = signifikante Abnahme der Zellpopulation; alle Gruppen wurden nach dem OVA-

Standardprotokoll behandelt.

Behandlung B-Zellen Makro-

phagen DC T-Zellen

CD4+

T-Zellen

CD8+

T-Zellen

JNJ 3975

20 mg/kg p.o. - - - - - -

JNJ 3975

50 mg/kg p.o. - ↑ - - - -

JNJ 3975

20 mg/kg i.p. - - - - - -

Mepyramin

30 mg/kg i.p. ↓ - - ↓ ↓ ↓

Betamethason

1 mg/kg p.o. - - ↓ - - -

Betamethason

2 mg/kg i.p. - - - - - -

Betamethason

+

JNJ 3975

↓ - ↓ ↓ ↓ ↓

Mepyramin

+

JNJ 3975

- - - - - -

Ergebnisse

58

4.2.4 Milzzellzahl

Die Milzzellzahl wurde durch die Behandlung der Mäuse mit JNJ 3975 (20 mg/kg p.o.) und

auch durch die kombinierte Behandlung mit Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20

mg/kg i.p.) gegenüber der jeweiligen Vehikelgruppe signifikant reduziert (Abbildung 29 und

Abbildung 30). Alle weiteren Behandlungen zeigten keinen Effekt.

Abbildung 30: Milzzellzahl nach der Behandlung der Mäuse mit Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg

i.p.); alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

Abbildung 29: Milzzellzahl nach der Behandlung der Mäuse mit JNJ 3975 (20 mg/kg p.o.; 50 mg/kg p.o.); alle Gruppen

wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

Ergebnisse

59

4.2.5 Zytokinsekretion Splenozyten

Die Stimulation der zuvor isolierten Splenozyten mit OVA führte zu einer Sekretion aller

untersuchten Zytokine. Splenozyten von Mäusen, die mit JNJ 3975 (50 mg/kg p.o.) behandelt

wurden, produzierten signifikant mehr IL-4 als die Vehikelgruppe. Die Behandlung mit

Betamethasonphosphat (1 mg/kg p.o.) hingegen führte zu einer Reduktion von IL-4 im

Überstand (Abbildung 31). Diese Behandlung führte ebenfalls zu einer signifikanten

Abnahme der Zytokine IL-6 und IL-10. Eine verringerte Produktion des Zytokins IL-6 im

Vergleich zur Vehikelgruppe lag auch bei Splenozyten von Mäusen vor, die mit Mepyramin

(30 mg/kg i.p.) behandelt worden waren (Abbildung 32). Die Kombination von Mepyramin

(20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) führte zu einer signifikanten Reduktion von IL-

10 (Abbildung 33). Das Zytokin IFN-γ konnte im Überstand von stimulierten Splenozyten

nachgewiesen werden (406,39 ± 498,81 pg/ml), eine Beeinflussung durch die verschiedenen

Wirkstoffe fand jedoch nicht statt. Die Stimulation der Splenozyten von Mäusen, die mit

Betamethason (2 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) oder dem entsprechenden Vehikel

behandelt worden waren, gelang aus unbekannter Ursache nicht. Wider Erwarten produzierten

die Splenozyten der Vehikelgruppe trotz Stimulation mit OVA keine Zytokine.

Abbildung 31: IL-4-Produktion von OVA stimulierten Splenozyten, A: die Mäuse wurden mit JNJ 3975 (20 mg/kg

p.o.; 50 mg/kg p.o.) behandelt; B: die Mäuse wurden mit Betamethasonphosphat (1 mg/kg p.o.) behandelt; alle

Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

A: B:

Ergebnisse

60

Abbildung 32: IL-6-Produktion von OVA stimulierten Splenozyten, A: die Mäuse wurden mit Betamethason (1 mg/kg

p.o.) behandelt; B: die Mäuse wurden mit Mepyramin (30 mg/kg i.p.) behandelt ; alle Gruppen wurden nach dem

OVA-Standardprotokoll behandelt ; Darstellung als Boxplot.

Abbildung 33: IL-10-Produktion von OVA stimulierten Splenozyten, A: die Mäuse wurden mit Betamethason

(1 mg/kg p.o.) behandelt; B: die Mäuse wurden mit Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.)

behandelt ; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

A: B:

A: B:

Ergebnisse

61

4.2.6 OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum

Der OVA-spezifische IgE-Gehalt im Serum wurde mittels ELISA bestimmt. Nur die

kombinierte Behandlung mit Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) konnte

den IgE-Gehalt gegenüber der Vehikelgruppe signifikant senken (Abbildung 34). Alle

anderen Behandlungen zeigten keinen Unterschied zur Vehikelgruppe.

Abbildung 34: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum von Mäusen, die mit einer Kombination aus Mepyramin (20

mg/kg i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) behandelt wurden; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll

behandelt; Darstellung als Boxplot.

Ergebnisse

62

4.2.7 Juckreiz

Die Mäuse wurden direkt nach dem Entfernen des Verbandes für 30 min gefilmt und die

Kratzattacken gezählt. Mäuse, deren Patch mit PBS anstatt mit OVA getränkt war, zeigten 15

± 2 Kratzattacken in 30 min. OVA-behandelte Mäuse zeigten 45 ± 24 Kratzattacken in 30

min. Eine signifikante Abnahme des Juckreizes wurde durch die Behandlung mit

Betamethason (1 mg/kg p.o.) und durch die Kombination von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und

JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) erreicht (Abbildung 35). Die Behandlung der Mäuse mit

Betamethason (2 mg/kg i.p.) und die kombinierte Behandlung mit Betamethason (2 mg/kg

i.p.) und JNJ 3975 (20 mg/kg i.p.) zeigten eine Tendenz zur Reduktion des Juckreizes. JNJ

3975 und Mepyramin als Monotherapie hatten keinen Einfluss auf den Juckreiz.

Abbildung 35: Anzahl an Kratzattacken/30 min direkt nach Entfernen des Verbandes in der 2. Challenge, alle

Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Boxplot.

Ergebnisse

63

4.2.8 Vergleich der Vehikelgruppen

Um die Stabilität des OVA-Modells beurteilen zu können, wurden der Gesamtscore der

Hautläsionen sowie der OVA-spezifische IgE-Gehalt der verschiedenen Vehikelgruppen mit-

einander verglichen. Dabei zeigte sich, dass kein Gesamtscore der einzelnen Vehikelgruppen

signifikant voneinander abwich (Abbildung 36). Der OVA-spezifische IgE-Gehalt hingegen

war in den letzten beiden Durchgängen signifikant gegenüber der ersten drei

Versuchsdurchgängen erhöht. Es musste jedoch ein neues ELISA-Kit für die Auswertung

dieser zwei Durchgänge benutzt werden (Abbildung 37).

Abbildung 36: Übersicht über den Gesamtscore der Hautläsionen aller Vehikelgruppen; alle Gruppen wurden nach

dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Streudiagramm mit Median.

Abbildung 37: Übersicht über den OVA-spezifischen IgE-Gehalt im Serum aller Vehikelgruppen; alle Gruppen

wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; Darstellung als Streudiagramm mit Mittelwert.

Diskussion

64

5 Diskussion

Die AD ist eine chronisch entzündliche Hauterkrankung, die mit einer relativ hohen Prävalenz

bei Menschen und Hunden auftritt (HILLIER und GRIFFIN 2001; SILVERBERG und

HANIFIN 2013). Die klinischen Symptome, vor allem jedoch der starke Juckreiz, schränken

die Lebensqualität der Betroffenen deutlich ein (SPERGEL und PALLER 2003). Bisherige

Therapien beim Menschen sind die Gabe von Glukokortikoiden, H1R-Antagonisten und

Immunmodulatoren wie Cyclosporin und Tacrolimus. Diese haben jedoch nicht bei allen

Patienten zufriedenstellenden Erfolg oder verursachen Nebenwirkungen (RUZICKA und

GLÜCK 1983; LEUNG 2000; MATSUOKA et al. 2003; LEUNG et al. 2004). Auch für die

Behandlung der caninen AD werden Glukokortikoide, H1R-Antagonisten und

Immunmodulatoren eingesetzt (OLIVRY und SOUSA 2001). Seit einiger Zeit ist der Janus-

Kinase-Hemmer Oclacitinib zur Behandlung der caninen AD zugelasssen. Dieser zeigt gute

Behandlungserfolge, allerdings können noch keine Aussagen über mögliche Nebenwirkung

durch eine Langzeitgabe getroffen werden (COSGROVE et al. 2013a; COSGROVE et al.

2013b).

Daher besteht weiterer Bedarf an der Entwicklung neuer Wirkstoffe zur Behandlung der AD.

Um diese Wirkstoffe auf ihren Nutzen testen zu können, werden Tiermodelle der AD

benötigt. Dabei sollten diese Modelle folgende Kriterien erfüllen: die klinischen

Hauptsymptome der Krankheit sollten gezeigt werden, sie sollten reproduzierbar sein,

genetische Homogenität der Tiere und detailliertes Wissen über den Organismus dieser Tiere

sollten vorhanden sein und die gewonnenen Daten sollten auf den Menschen übertragbar sein

(GUTERMUTH et al. 2004). Ziel dieser Arbeit war es daher, ein bereits beschriebenes

Mausmodell der AD (SPERGEL et al. 1998; SPERGEL et al. 1999; YOO et al. 2005; WANG

et al. 2007; YATSUZUKA et al. 2007; ZHU et al. 2015) näher zu charakterisieren und zu

untersuchen, ob die Störung der Hautbarriere durch Abwischen mit Aceton oder Tesa-

Strippen die Entwicklung der Symptome beeinflusst. Weiterhin wurde an diesem Mausmodell

der AD der Effekt von verschiedenen Wirkstoffen untersucht. Dabei wurde besonderes

Augenmerk auf den H4R als möglichen neuen Ansatzpunkt zur Behandlung der AD gelegt.

Die Wirkung eines Glukokortikoids wurde als häufig genutzte Standardtherapie bei AD als

Diskussion

65

Positivkontrolle im untersuchtem Tiermodell eingesetzt (DRAKE 1992; LEUNG et al. 1997;

OLIVRY und SOUSA 2001).

5.1 Das OVA-Modell als Mausmodell der AD

Das OVA-induzierte Mausmodell der AD nach SPERGEL et al. (1998) spiegelt die

Hauptsymptome der AD wider: Schuppen, Erosionen/Exkorationen, Erythem, Juckreiz,

Anstieg des Allergen-spezifischen IgEs, epidermale Hyperproliferation, gesteigerter

inflammatorischer Zellinflux in die Haut sowie ein Zunahme der Mastzellen in der Haut

(GUTERMUTH et al. 2004). Des Weiteren können bei epikutan mit OVA sensibilisierten

Mäusen durch die Inhalation von OVA asthma-ähnliche Symptome ausgelöst werden

(SPERGEL et al. 1998).

Auch in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die epikutane Sensibilisierung mit OVA

die genannten Symptome der AD hervorruft. So wurde ein Anstieg des Gesamtscores der

klinischen Hautläsionen gegenüber einer PBS-Kontrollgruppe festgestellt. Eine Zunahme des

Juckreizes sowie des OVA-spezifischen IgEs lagen vor. Die histologischen Untersuchungen

zeigten eine epidermale Hyperproliferation, einen Anstieg des inflammatorischen Zellinfluxes

und der Mastzellzahl. Ebenso wurde die Zunahme der Zellzahl der drainierenden

Lymphknoten als Anzeichen für eine gesteigerte T-Zell-Proliferation und Differenzierung

nach Präsentation des Antigens durch DC festgestellt.

Die nach GUTERMUTH et al. (2004) genannten Anforderungen an Tiermodelle werden in

diesem Modell erfüllt: das OVA-Modell ist reproduzierbar, durch die Verwendung des

Inzuchtstamms Balb/c ist eine genetische Homogenität gegeben ebenso wie das Wissen über

den Organismus dieser Tiere. Jedoch fehlt bei Verwendung von Balb/c-Mäusen im OVA-

Modells die genetische Störung der Hautbarriere, von der angenommen wird, dass sie eine

wichtige Rolle für die Entstehung von AD spielt (MORAR et al. 2006). PALMER et al.

(2006) zeigten, dass besonders ein Defekt des Fillagrin-Gens eine Prädisposition für AD

hervorruft. Ein interessanter Ansatz könnte daher die Verwendung eines Mausstamms, bei

denen dieses Gen ausgeschaltet ist, im OVA-Modell sein. Auch bei NC/NgA-Mäusen ist eine

genetische Komponente vorhanden, diese ist jedoch bisher noch nicht näher beschrieben

worden (JIN et al. 2009). Trotzdem scheint die NC-NgA-Maus, wenn sie noch zusätzlich

epikutan mit Hausstaubmilbenextrakt sensibilisiert wird, zur Zeit das Tiermodell zu sein, das

Diskussion

66

der AD am nächsten kommt (GUTERMUTH et al. 2004). So spiegelt dieses Modell alle oben

genannten Aspekte wider, im Gegensatz zum OVA-Modell ist jedoch auch eine genetische

Komponente beteiligt. Nachteil der NC/NgA-Mäuse ist jedoch eine eingeschränkte

Verfügbarkeit sowie ein hoher Anschaffungspreis. Auch stehen für die Beantwortung von

detaillierte Fragestellungen zur Pathogenese der AD keine transgenen oder Knockout-Mäusen

in diesem Modell zur Verfügung. Daher wird für die Entstehung von AD bei transgenen oder

Knockout-Mäuse häufig das OVA-Modell verwendet (GUTERMUTH et al. 2004).

5.2 Einfluss der zusätzlichen Störung der Hautbarriere auf das OVA-Modell

Eine defekte Hautbarriere scheint ein wichtiger Faktor für die Entwicklung von AD zu sein.

Sie ermöglicht das Eindringen von Antigenen in die Haut. Diese werden dort von

Langerhans-Zellen aufgenommen und zu den drainierenden Lymphknoten transportiert um

dort den T-Zellen präsentiert zu werden. Auch das OVA-Modell benötigt eine Störung der

Hautbarriere zur Auslösung von Hautläsionen. So stellten JIN et al. (2009) fest, dass die

epikutane Sensibilisierung mit OVA bei haarlosen Mäusen, die weder rasiert noch chemisch

enthaart wurden, keinerlei Immunantwort hervorrief. Auch in einem eigenen Versuch, in dem

Mäuse bereits 24 Stunden vor Applikation des OVA-Patches mit Veet® chemisch enthaart

wurden, entwickelten die Mäuse trotz der Durchführung von drei Challengephasen keine

Hautläsionen. JIN et al. (2009) stellten weiterhin fest, dass die mechanische Störung der

Hautbarriere nicht nur das Eindringen von Antigenen ermöglicht, sondern auch die

Freisetzung von Zytokinen in die Haut hervorruft. Diese Zytokine scheinen die Polarisation

von naiven T-Zellen zu TH2-Zellen zu fördern.

In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob eine zusätzliche Störung der Hautbarriere durch

Abwischen der Haut mit Aceton oder Tesa-Strippen vor Applikation des OVA-Patches

verstärkte Symptome im Vergleich zum OVA-Standardprotokoll verursachen kann. Alle

Mäuse dieses Versuchsdurchgangs wurden jedoch zuvor auch chemisch mit Veet® enthaart.

Der klinische Hautscore von Mäusen, deren Hautbarriere nicht zusätzlich durch Abwischen

mit Aceton oder Tesa-Strippen beeinflusst wurde, war signifikant erhöht gegenüber den PBS-

Kontrolltieren. Das Abwischen mit Aceton oder das Strippen mit Tesafilm brachte keine

zusätzliche Verstärkung der Symptome. Eine mögliche Erklärung ist, dass durch beide

Methoden die obersten Korneozytenschichten der Epidermis entfernt werden (RISSMANN et

Diskussion

67

al. 2009). Daher könnte die Entstehung von Schuppen eingeschränkt sein. Da die

Epidermisdicke in den durchgeführten Versuchen nur bis zum Beginn Stratum corneums

gemessen wurde, zeigten sich wie erwartet keine Unterschiede zwischen dem OVA-

Standardprotokoll und der zusätzlichen Störung der Hautbarriere. Auch die weiteren

untersuchten sekundären Parameter zeigten keinen Vorteil durch die Störung der Hautbarriere

gegenüber dem OVA-Standardprotokoll. Die Milzzellzahl war bei Mäusen, die zusätzlich mit

Aceton behandelt worden waren, verringert. Möglicherweise denaturiert Aceton das Protein

OVA, so dass nur ein geringer Teil des OVAs durch die Haut dringt und von DC

aufgenommen wird. Dies erklärt auch, warum das Abwischen der Haut mit Aceton den

geringsten Gesamtscore der Hautläsionen sowie auch die geringste Epidermisdicke und den

niedrigsten inflammatorischen Zellinflux verglichen mit dem OVA-Standardprotokoll und

dem zusätzlichen Tesa-Strippen verursachte.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass eine zusätzliche Störung der Hautbarriere durch

Abwischen der Haut mit Aceton oder Tesa-Strippen keine zusätzliche Verstärkung der

Symptome hervorruft. Die Hautläsionen waren nach der Sensibilisierung nach dem OVA-

Standardprotokoll am stärksten, so dass dieses für die nachfolgenden Versuche zum

Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe gewählt wurde. Weiterhin konnte festgestellt werden,

dass eine grundsätzliche Störung der Hautbarriere durch chemisches Enthaaren kurz vor der

Applikation des OVA-Patches für die Entwicklung von AD-ähnlichen Hautläsionen zwingend

notwendig ist.

5.3 Stabilität des OVA-Modells

Ein wichtiges Kriterium zur Wahl eines bestimmten Tiermodells ist die Reproduzierbarkeit.

Für diese Arbeit wurden insgesamt fünf vergleichbare Durchgänge des OVA-

Standardprotokolls durchgeführt. Der Vergleich des Gesamtscores der Hautläsionen der

Vehikelgruppen dieser Durchgänge zeigte lediglich in Versuchsdurchgang 2 eine Abnahme.

Eine mögliche Ursache ist, dass das angewendete OVA Grade VI bereits seit ca. drei Jahren

verwendet wurde. Für die nachfolgenden Durchgänge wurde neues OVA Grade VI

verwendet. Ein weiterer Faktor, der den Grad der Hautläsionen möglicherweise beeinflusste,

ist die Unruhe im Stall. Während Versuchsdurchgang 3 fanden weitere Versuche im gleichen

Stall statt, so dass tagsüber häufig Unruhe herrschte. Dies könnte den leichten Anstieg des

Diskussion

68

Gesamtscores von Vehikelgruppe 3 erklären. Für Patienten mit AD ist bekannt, dass Stress

den Schweregrad der AD verstärken kann (SPERGEL und PALLER 2003). Zur Abklärung

des Einflusses von Stress auf die Symptome im OVA-Modell sollten weitere Versuche

durchgeführt werden, z.B. mit Lärmbelastung der Mäuse oder einem geänderten Tag/Nacht-

Rhythmus. Ein weiterer Faktor, der die Stabilität des OVA-Modells beeinflussen könnte, ist

der korrekte Sitz der Verbände mit dem OVA-Patch. Besonders nach der Erneuerung der

Verbände an Tag 4 der jeweiligen Sensibilisierungs- oder Challengewoche verrutschten diese

häufiger, da eine Fixierung des Verbandes am Nackenfell schlechter möglich war. Somit lag

das OVA-Patch nicht bei allen Mäusen über sieben Tage auf der gleichen Stelle. Eine

zusätzliche Fixierung des OVA-Patches mit okklusivem Tape verursachte zusätzliche, nicht-

Allergie bedingte und somit unerwünschte Hautläsionen.

Ein Einfluss der Jahreszeit auf die Stabilität des OVA-Modells war nicht zu erkennen.

Als weiterer Parameter für die Stabilität des OVA-Modells wurde der OVA-spezifische IgE-

Gehalt im Serum zwischen den Vehikelgruppen verglichen. Es zeigte sich, dass alle Mäuse

OVA-spezifisches IgE produzierten und somit die Sensibilisierung gegen OVA erfolgreich

war. Der deutliche Anstieg des IgE-Gehalts der Vehikelgruppen vier und fünf lässt sich durch

die Verwendung eines neuen ELISA-Kits erklären. Eine Korrelation zwischen dem

Gesamtscore der Hautläsionen und dem OVA-spezifischem IgE-Gehalt im Serum konnte

nicht festgestellt werden. Dies wurde bereits von SPERGEL et al. (1999) gezeigt. Auch beim

Hund konnte kein Zusammenhang zwischen dem IgE-Gehalt und dem Schweregrad der AD

nachgewiesen werden (DEBOER & HILLIER 2001). Im Gegensatz dazu ist bei der humanen

AD ein Zusammenhang zwischen dem IgE-Gehalt und dem Schweregrad der AD bekannt

(OGAWA 1971; LASKE und NIGGEMANN 2004).

Im OVA-Modell wurden bisher nur Balb/c-Mäusen verwendet (SPERGEL et al. 1998;

SPERGEL et al. 1999; YOO et al. 2005; WANG et al. 2007; YATSUZUKA et al. 2007; ZHU

et al. 2015). Ob das OVA-Modell auf andere Mausstämme übertragbar ist, ist daher zu

prüfen.

Generell lässt sich sagen, dass die epikutane Sensibilisierung nach dem OVA-

Standardprotokoll bei Balb/c-Mäusen reproduzierbar ist. Jedoch sind Schwankungen

innerhalb der Versuchsdurchgänge möglich. Da es bereits bei unbehandelten Kontrolltieren

durch das Tragen des Verbandes zu einer geringen Erhöhung des Gesamtscores der

Diskussion

69

Hautläsionen (Median 3) kommt, sollte eine epikutane Sensibilisierung erst als erfolgreich

angesehen werden, wenn der Gesamtscore im Median über 3 liegt. Die Haut von PBS-

Kontolltieren (Mittelwert 24 µm) zeigte keine Zunahme im Vergleich zu Haut von

unbehandelten Balb/c-Mäusen (Mittelwert 21 µm) (GLATZER et al. 2013). Daher könnte der

Anstieg der Epidermisdicke auf über 30 µm als weiteres Kriterium zur Bewertung des

Erfolges der Sensibilisierung gesehen werden. Auch der Nachweis von OVA-spezifischem

IgE im Serum sollte möglich sein, um den jeweiligen Durchgang als erfolgreich ansehen zu

können.

5.4 Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis

im OVA-Modell

5.4.1 Effekt des Glukokortikoids Betamethason im OVA-Modell

Glukokortikoide werden auf Grund ihrer antiinflammatorischen, antiproliferativen und

immunsuppressiven Wirkung als Standardtherapie bei AD eingesetzt. Dabei wird beim

Menschen häufig die topische beim Hund jedoch oft die systemische Applikation gewählt

(DRAKE 1992; LEUNG et al. 1997; OLIVRY und SOUSA 2001). Da in dem von uns

gewählten OVA-Modell eine tägliche topische Applikation von Wirkstoffen nicht möglich ist,

wurde die Wirkung der systemischen Gabe eines Glukokortikoids untersucht. Die Wahl des

Glukokortikoids fiel auf Betamethason, da für dieses die Langzeitgabe bei der Maus

beschrieben ist (MAEKAWA et al. 2006). Betamethason gilt als lang wirksames

Glukokortikoid mit einer 30 - 40fachen glukokortikoiden Wirkung im Vergleich zu Cortisol

(FREY und LÖSCHER 2002).

Verschiedene Glukokortikoide sind bereits in unterschiedlichen Mausmodellen der AD

eingesetzt worden. MAEKAWA et al. (2006) untersuchten den Effekt von Betamethason-17-

valerat (1 mg/kg p.o.) in NC/Jic-Mäusen, die spontan Hautläsionen sowie Juckreiz

entwickeln. Die Behandlung mit Betamethason konnte den Juckreiz hemmen, verstärkte

jedoch die Hautläsionen. MAEKAWA et al. (2006) zeigten weiterhin, dass Betamethason die

Nervenaktivität in der Haut im Vergleich zu Vehikel behandelten Tieren senkt. Die Abnahme

des Juckreizes könnte daher durch die Beeinflussung der Nerven durch Betamethason

entstanden sein.

Diskussion

70

Dies zeigte sich auch in den eigenen Versuchen: der Gesamtscore der Hautläsionen konnte

weder durch die intraperitoneale noch die orale Gabe von Betamethason signifkant

vermindert werden. Der Juckreiz hingegen wurde durch die orale Gabe signifikant gehemmt,

Betamethason i.p. zeigte eine Tendenz zur Abnahme des Juckreizes.

In einem weiteren beschriebenen Modell wurden NC/Jic-Mäuse verwendet um den Effekt von

Dexamethason zu untersuchen. Zur Auslösung von Juckreiz wurden die Mäuse mit 2,4,6-

Trinitrochlorobenzen behandelt. Die intraperitoneale Gabe von Dexamethason (1 und 3

mg/kg) minderte den Juckreiz. Eine Untersuchung der Hautläsionen erfolgte nicht

(YAMASHITA et al. 2007). KIM et al. (2012) zeigten jedoch, dass die Behandlung mit

Dexamethason (5 mg/kg p.o.) die Hautläsionen von NC/NgA-Mäusen verringert. Auch die

epidermalen Hyperproliferation sowie der IgE-Gehalt nahmen durch Dexamethason ab. In

den eigenen Versuchen konnte der Einfluss eines Glukokortikoids auf den IgE-Gehalt jedoch

nicht gezeigt werden. Die Abnahme der epidermalen Hyperproliferation durch die

intraperitoneale Behandlung mit Betamethasonphosphat (2 mg/kg) konnte bestätigt werden,

die orale Behandlung mit Betamethason-17-valerat (1 mg/kg) zeigte lediglich eine Tendenz

zur Reduktion der Epidermisdicke.

YATSUZUKA et al. (2007) untersuchten die topische Gabe von Dexamethason. Dazu

wurden Balb/c-Mäuse intraperitoneal mit OVA sensibilisiert und dann täglich mit einem

OVA-Patch behandelt. Durch den täglichen Wechsel des Patches wurde eine topische

Behandlung möglich. Die wiederholte topische Gabe reduzierte den Juckreiz sowie den

Hautscore.

Die Diskrepanz in dem Effekt von Glukokortikoiden auf den Schweregrad der Hautläsionen

lässt sich vielleicht durch die unterschiedlichen Applikationsarten erklären. MCCLAIN et al.

(2009) stellten die Vermutung auf, dass nach systemischer Applikation von Glukokortikoiden

kein ausreichend hoher Wirkstoffspiegel in der Haut erreicht wird. Lediglich die systemische

Verabreichung einer sehr hohen Dosis von Dexamethason (5 mg/kg p.o.) zeigte eine

Reduktion der Hautläsionen (KIM et al. 2012).

Ein antiinflammatorischer Effekt von Betamethason konnte in den eigenen Versuchen durch

die Gabe von 2 mg/kg Betamethasonphosphat gezeigt werden. Sowohl das Lymphknoten-

gewicht als auch die Zellzahl waren signifikant reduziert.

Diskussion

71

Abschließend lässt sich feststellen, dass die Gabe eines Glukokortikoids in den eigenen

Versuchen nicht den erhofften Effekt der Linderung der klinischen Symptome hatte. Eine

zusätzliche topische Behandlung könnte eine Abnahme der Hautläsionen hervorrufen. Auch

die Erhöhung der Dosis könnte versucht werden, da die Mäuse keine offensichtlichen

Nebenwirkungen durch die Gabe von Betamethason während des Versuches zeigten.

5.4.2 Effekte von Histaminrezeptor-Antagonisten im OVA-Modell

5.4.2.1 H1R-Antagonist Mepyramin

H1R-Antagonisten werden schon seit langem zur Behandlung der AD, insbesondere zur

Linderung des Juckreizes, eingesetzt (LEUNG et al. 1997; DEBOER und GRIFFIN 2001).

Allerdings fehlen in der Literatur bisher klare Hinweise auf den positiven Effekt von H1R-

Antagonisten zur Behandlung von AD (HOARE et al. 2001). Die aktuellen Leitlinien zur

Behandlung der caninen AD empfehlen einen Einsatz von H1R-Antagonisten zur Therapie

von Rötungen und durch den sedativen Effekt von Antihistaminika der ersten Generation zur

Linderung des Juckreizes (OLIVRY et al. 2015).

In verschiedenen Mausmodellen der Kontaktallergie sowie der AD ist bisher der Effekt von

systemisch verabreichten H1R-Antagonisten auf Juckreiz untersucht worden (HOSSEN et al.

2005; YAMASHITA et al. 2007; YATSUZUKA et al. 2007; MATSUSHITA et al. 2012;

ZHU et al. 2015). In allen Studien wurde der Juckreiz signifikant reduziert. Die eigenen

Ergebnisse zeigten keinen Einfluss des H1R-Antagonisten Mepyramin auf den Juckreiz. Die

Bewertung des Juckreizes erfolgte nach der zweiten Challengephase und somit in der späten

Phase der Entwicklung der AD. YATSUZUKA et al. (2007) zeigten in einem OVA-Modell

mit intraperitonealer Sensibilisierung, dass die H1R-Antagonisten Chlorphenamin und

Epinastin den Juckreiz nur in der frühen Phase der Entstehung der AD hemmen konnten.

Möglicherweise hemmt Mepyramin den Juckreiz nur in der ersten Challengephase des OVA-

Modells. Dies sollte in eigenen Versuchen durch die Bewertung des Juckreizes bereits nach

der ersten Challengewoche untersucht werden.

Bisher durchgeführte Studien zum Effekt von H1R-Antagonisten auf allergie-bedingte

Hautläsionen zeigen widersprüchliche Effekte (MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA &

HIRASAWA 2012). In den eigenen Versuchen wurde der klinische Hautscore durch

Mepyramin nicht beeinflusst. Dies stimmt mit einer Studie von OHSAWA und HIRASAWA

Diskussion

72

(2012) an NC/NgA-Mäusen überein. MATSUSHITA et al. 2012 stellten jedoch fest, dass der

H1R-Antagonist Olopatadin in einem Modell der murinen Kontaktallergie die Hautläsionen

mindern konnte. Möglicherweis könnte die zusätzliche topische Applikation von Mepyramin

zu einer Verbesserung der Hautläsionen führen. Dies wurde bereits für die topische

Applikation von Diphenhydramin in einem Hapten-induzierten Mausmodell der AD gezeigt

(LIN et al. 2012).

5.4.2.2 H4R-Antagonist JNJ 3975

Die Gabe des H4R-Antagonisten JNJ 3975 konnte in keiner der untersuchten

Applikationsarten und Dosierungen die Entstehung von Hautläsionen reduzieren. Auch in der

bisher einzig publizierten Studie, die den Einfluss von H4R-Antagonisten in einem Modell

der AD untersucht hat, wurde keine Abnahme der klinischen Symptome festgestellt (KAMO

et al. 2014). Untersuchungen von H4R-Antagonisten in verschiedenen Mausmodellen der

Kontaktallergie zeigten widersprüchliche Ergebnisse. Die H4R-Antagonisten JNJ 7777120

und JNJ 28307474 konnten nicht in allen Modellen die Symptome reduzieren (siehe

Literaturübersicht, Tabelle 3). Der in dieser Arbeit verwendete H4R-Antagonist JNJ 3975

verringerte im FITC-Modell die Ohrdicke (THURMOND et al. 2014). Die Mastzellanzahl in

der Haut wurde durch die orale Gabe der hohen Dosis JNJ 3975 (50 mg/kg) reduziert. Auch

für diesen Parameter zeigen die bisherigen Publikationen kein einheitliches Bild (siehe

Literaturübersicht, Tabelle 3). Die Milzzellzahl als Indikator für die T-Zellproliferation wurde

durch die orale Gabe von JNJ 3975 (20 mg/kg) verringert. Die orale Gabe der hohen Dosis

(50 mg/kg) hatte keinen signifikanten Effekt auf die Milzzellzahl. Auch THURMOND et al.

(2014) konnten durch die Gabe eine höheren Dosis JNJ 3975 nicht die gleichen Effekte im

FITC-Modell erreichen. Die Applikationsart scheint ebenfalls einen Einfluss auf die Wirkung

von JNJ 3975 zu haben, da die intraperitoneale Gabe der gleichen Dosis (20 mg/kg) nicht die

Ergebnisse der oralen Gabe widerspiegelt. Ein nicht zu erklärender Effekt von JNJ 3975 ist

der Anstieg der Sekretion des TH2-Zytokins IL-4 durch OVA-stimulierte Splenozyten.

MAHAPATRA et al. (2014) zeigten eine Reduktion von IL-4 durch die Gabe von JNJ

7777120. Auch die Bestimmung der TH2 -Zytokine in der Haut zeigte in den bisherigen

Studien immer eine Reduktion von IL-4 (COWDEN et al. 2010; SEIKE et al. 2010; SUWA et

al. 2011; MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA und HIRASAWA 2012). Lediglich eine

Diskussion

73

Studie, in der eine Variante des OVA-Modells verwendet wurde, zeigte JNJ 7777120 keinen

Effekt auf die Produktion von TH2-Zytokinen (MAHAPATRA et al. 2014).

Die Verwendung von H4R-Knockout-Mäusen im OVA-Modell zeigte eine deutliche

Minderung der klinischen Symptome, eine Abnahme der epidermalen Hyperproliferation, des

inflammatorischen Zellinfluxes, der Mastzellzahl, des OVA-spezifischen IgEs und der

Milzzellzahl (Rossbach et al. 2015). Die Hypothese, dass der Einsatz eines H4R-Antagonisten

im OVA-Modell dieses ebenfalls zeigen würde, konnte in dieser Arbeit nicht bestätigt

werden. Mögliche Gründe hierfür sind zum einen die pharmakokinetischen und

pharmakodynamischen Eigenschaften des verwendeten H4R-Antagonisten als auch der

Zeitpunkt der Behandlung. ROSSBACH et al. (2015) zeigten, dass durch eine Behandlung

mit dem H4R-Antagonisten JNJ 28307474 im OVA-Modell während der Sensibilisierung und

Challenge kein Effekt auf die klinischen Symptome gesehen werden kann.

5.4.2.3 Kombination des H1R-Antagonisten Mepyramin und des H4R-Antagonisten

JNJ 3975

Die Kombination eines H1R-Antagonisten und eines H4R-Antagonisten konnte bereits in

zwei Studien die klinischen Symptome reduzieren (MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA

und HIRASAWA 2012). Die eigenen Ergebnisse zeigten ebenfalls eine signifikante

Reduktion der Hautläsionen durch die Verabreichung von Mepyramin und JNJ 3975. Auch

die weiteren Hauptsymptome der AD (epidermale Hyperproliferation, inflammatorischer

Zellinflux in die Haut, Mastzellzahl, OVA-spezifisches IgE und Juckreiz) konnten durch die

Behandlung mit Mepyramin und JNJ 3975 verringert werden.

Der allergen-induzierte Juckreiz wurde in zwei Modellen der Dermatitis (TDI-Modell,

DNCB-Modell) durch die Kombination von Cetirizin und JNJ 7777120 stärker reduziert als

durch die jeweilige Einzelgabe (ROSSBACH et al. 2009).

Der Gehalt des antiinflammatorisch wirkenden Zytokins IL-10 wurde in der Literatur bisher

nicht untersucht (MATSUSHITA et al. 2012; OHSAWA und HIRASAWA 2012;

MAHAPATRA et al. 2014). In dieser Arbeit wurde ein Anstieg der Produktion von IL-10

durch OVA-stimulierte Splenozyten nach der Behandlung mit Mepyramin und JNJ 3975

gesehen.

Diskussion

74

Da sowohl JNJ 3975 und auch Mepyramin als Monotherapie im OVA-Modell keine

eindeutige Reduktion der klinischen Symptome hervorrief, scheint die kombinierte

Behandlung ein interessanter Therapieansatz zu sein.

5.4.2.4 Kombination des Glukokortikoids Betametathason und des H4R-Antagonisten

JNJ 3975

Die kombinierte Behandlung mit Betamethason und JNJ 3975 wurde im OVA-Modell

getestet, um zu untersuchen, ob die Gabe eines H4R-Antagonisten einen zusätzlichen Effekt

zur Gabe eines Glukokortikoids hat. In der Literatur konnten keine Studien zur Wirkung der

kombinierten Behandlung mit einem Glukokortikoid und einem H4R-Antagonisten gefunden

werden. Lediglich PARADIS et al. (1991) beschrieben einen Glukokortikoid-sparenden

Effekt durch die Kombination mit einem H1R-Antagonisten bei der Behandlung des caninen

Juckreizes. In den eigenen Versuchen hatte die alleinige Gabe des Glukokortikoids keinen

signifikanten Effekt auf die Entstehung von Hautläsionen, sondern zeigte lediglich eine

Tendenz zur Reduktion dieser. Die kombinierte Behandlung reduzierte den klinischen

Hautscore signifikant. In fast allen weiteren untersuchten Parametern konnte die Kombination

die Ergebnisse der Monotherapie mit Betamethason widerspiegeln. Jedoch zeigte sich im

Gegensatz zur Einzelgabe von Betamethason keine Beeinflussung der Zytokinsekretion durch

die kombinierte Behandlung, aber eine deutliche Änderung des Zellprofils der Lnn. axillares

(siehe Ergebnisse, Tabelle 14).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination eines Glukokortikoids mit einem

H4R-Antagonisten vielversprechend erscheint. Möglicherweise lässt sich durch die Gabe des

H4R-Antagonisten die Dosis des Glukokortikoids reduzieren, so dass auch das Risiko für

Nebenwirkungen sinkt.

5.5 Schlussfolgerung

Das OVA-Modell scheint als Mausmodell der AD gut geeignet. Es zeigt die Hauptaspekte der

humanen und caninen AD. Besonders der mögliche Einsatz von transgenen und Knockout-

Mäusen zur Beantwortung spezieller Fragestellungen ist ein großer Vorteil (GUTERMUTH

et al. 2004). Die Reproduzierbarkeit des OVA-Modells konnte in den durchgeführten

Diskussion

75

Versuchen bestätigt werden. Eine zusätzliche Störung der Hautbarriere durch Abwischen der

Haut mit Aceton oder Tesa-Strippen brachte keine Verstärkung der Hautläsionen. Ein

Nachteil des OVA-Modells ist das Fehlen der genetischen Störung der Hautbarriere. Der

Einsatz von Knockout-Mäusen im OVA-Modell, die einen genetischen Effekt der

Hautbarriere haben, scheint ein interessanter Ansatz zu sein.

Die Untersuchung von Betamethason im OVA-Modell zeigte nicht den erwarteten Effekt der

Minderung der klinischen Symptome. Möglicherweise wird in der Haut durch die

systemische Gabe kein ausreichender Wirkstoffspiegel erreicht (MCCLAIN et al. 2009). Eine

zusätzliche topische Behandlung könnte daher notwendig sein. Der Effekt einer topische

Behandlung mit Dexamethason wurde bereits von YATSUZUKA et al. (2007) in einem

OVA-Modell mit intraperitonealer Sensibilisierung gezeigt. Falls die topische Behandlung im

hier verwendeten OVA-Modell keinen Effekt hat, sollte dieses als Tiermodell der AD neu

bewertet werden.

Die Behandlung mit dem H1R-Antagonisten Mepyramin zeigte keine Reduktion des

Juckreizes wie in der Literatur beschrieben. Möglicherweise wurde der Juckreiz durch

Mepyramin nur in der frühen Challengephase gehemmt, beobachtet wurde er jedoch in der

zweiten späten Challengephase. Daher sollte der Juckreiz während der ersten Challenge noch

untersucht werden.

Die Gabe des H4R-Antagonisten JNJ 3975 zeigte im Gegensatz zu H4R-Knockout-Mäusen

keine Reduktion der klinischen Symptome (ROSSBACH et al. 2015). Da auch eine Blockade

des H4R während der Sensibilisierungs- und Challengephase im OVA-Modell keinen Effekt

auf die Hautläsionen zeigte (ROSSBACH et al. 2015), muss überlegt werden, ob

pharmakokinetische und pharmakodynamische Eigenschaften der H4R-Antagonisten eine

mögliche Ursache sein könnten.

Die kombinierte Behandlung mit Mepyramin und JNJ 3975 lieferte vielversprechende

Ergebnisse (Reduktion der Hauptsymptome der AD). Dies sollte jedoch nochmals bestätigt

werden, evtl. in einem weiteren Mausmodell der AD (z.B. NC/NgA-Mäuse).

Auch die Kombination von Betamethason mit JNJ 3975 könnte ein interessanter neuer Aspekt

zur Behandlung der AD sein, da durch die Gabe des H4R-Antagonisten eventuell eine

Reduktion der Dosis des Glukokortikoids möglich ist und somit ein geringeres Risiko für

Nebenwirkungen besteht.

Zusammenfassung

76

6 Zusammenfassung


Etablierung des Ovalbumin-induzierten Mausmodells der atopischen Dermatitis zur

Beurteilung pharmakologischer Wirkstoffe

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, dass Ovalbumin-induzierte Mausmodell (OVA-

Modell) der atopischen Dermatitis (AD) zu etablieren und im Anschluss die Wirkung

verschiedener pharmakologischer Wirkstoffe in diesem zu untersuchen.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das OVA-Modell auf den Einfluss der zusätzlichen

Störung der Hautbarriere durch Abwischen der Haut mit Aceton oder Tesa-Strippen auf die

Entwicklung der klinischen Symptome untersucht. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich

mit dem Effekt von verschiedenen pharmakologischen Wirkstoffen und deren Kombinationen

im OVA-Modell. Getestet wurden der Effekt des Glukokortikoids Betamethason, des

Histamin-1-Rezeptor-Antagonisten (H1R-Antagonist) Mepyramin und des Histamin-4-

Rezeptor-Antagonisten (H4R-Antagonist) JNJ 39758979.

Zunächst wurden weibliche Balb/c-Mäuse nach einem modifizierten Protokoll von SPERGEL

et al. (1998) gegen das Protein Ovalbumin (OVA) sensibilisiert. Dabei wurde bei einer

Mausgruppe die Hautbarriere durch das mehrfache Abwischen der Haut mit Aceton gestört,

bei einer weiteren Gruppe durch das Strippen der Haut mit Tesafilm. Eine andere Mausgruppe

wurde nach dem Standardprotokoll behandelt. Als Kontrolle dienten nach dem gleichen

Protokoll nur mit PBS behandelte Mäuse. Bei allen Tieren, die mit OVA behandelt wurden,

zeigten sich klinische Symptome der allergisch-bedingten Deramtitis. Die zusätzliche Störung

der Hautbarriere führte zu keiner weiteren Verstärkung der Symptome. Daher wurde in den

folgenden Versuchen zur Untersuchung verschiedener pharmakologischer Wirkstoffe auf eine

zusätzliche Störung der Hautbarriere verzichtet.

Das Glukokortikoid Betamethason wurde oral als Betamethasonvalerat (1mg/kg) und

intraperitoneal als Betamethasonphosphat (2 mg/kg) verabreicht. Es brachte jedoch nicht den

erwarteten Effekt der deutlichen Linderung der Symptome, sondern zeigte lediglich eine

Tendenz. Sowohl die Monotherapie mit dem H1R-Antagonisten Mepyramin (30 mg/kg i.p.)

Zusammenfassung

77

als auch mit dem H4R-Antagonisten JNJ 39758979, der auf verschiedenen

Applikationswegen und in unterschiedlichen Dosierungen gegeben wurde, zeigte keinen

Effekt auf die klinischen Symptome. Die Kombination dieser beiden Wirkstoffe könnte

jedoch ein vielversprechender neuer Ansatz zur Behandlung der AD sein, da diese zu einer

Reduktion der Symptome im OVA-Modell führte. Die Kombination des Glukokortikoids

Betamethason mit dem H4R-Antagonisten JNJ 39758979 konnte die Symptome ebenfalls

mindern. Auch dies könnte ein interessanter Therapieansatz zur Behandlung der AD sein, da

so eine Dosisreduktion des Glukokortikoids möglich sein könnte.

Summary

78

7 Summary


Establishing the murine ovalbumin-induced model of atopic dermatitis to evaluate

different pharmacological drugs

Aim of this study was to establish the murine ovalbumin-induced model (OVA-model) of

atopic dermatitis (AD) in order to test different pharmacological drugs.

In the first part of this study the influence of additional skin barrier disruption on the clinical

symptoms of the OVA-model was examined. The skin barrier was disrupted by wiping the

skin with acetone or tape-stripping. In the second part of this study the effects of different

pharmacological drugs, namely the glucocorticoid betamethasone, the histamine H1 receptor

(H1R) antagonist mepyramine and the histamine H4 receptor (H4R) antagonist JNJ 39758979

and their combinations, were determined in the OVA-model.

First female Balb/c-mice were sensitised against the protein ovalbumin according to a

modified protocol of SPERGEL et al. (1998). The mice were either treated according to the

standard protocol of the OVA-model or the skin barrier was additionally disrupted by wiping

the skin several times with acetone or tape-stripping. As a control mice were sensitised with

PBS according to the standard protocol. The sensitisation against OVA induced clinical

symptoms of AD, just as skin lesions and elevated IgE levels. Furthermore additional

disrupting of the skin barrier had no influence on the severity of the clinical symptoms.

Therefore the following trials were done without additional disruption.

The glucocorticoid betamethasone, given orally as betamethasonvalerate (1 mg/kg) or

intraperitoneally as betamethasonphosphate (2 mg/kg), did not ameliorate clinical symptoms

in the OVA-model significantly as expected, it just showed a slight tendency. Either the

monotherapy with the H1R antagonist mepyramine (30 mg/kg i.p.) nor the monotherapy with

the H4R antagonist JNJ 39758979, given at different dosages and administration routes, had

an effect in the OVA-model. Though the combination of these drugs could be a promising

new treatment approach for AD as it reduced clinical symptoms significantly. The

combination of the glucocorticoid betamethasone and the H4R antagonist JNJ 39758979

Summary

79

ameliorated clinical symptoms in the OVA-model as well. Therefore it could also be a

promising treatment approach for AD, leading to a dose reduction of the glucocorticoid.

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80

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Anhang

100

9 Anhang

Vergleich von unterschiedlichen Protokollen des OVA-Modells

Tabelle 15: Klinischer Hautscore; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-

Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.

Protokoll Maus Schuppen Erosion/ Exkoration Erythem Gesamtscore

PBS

1 0 0 1 1 2 2 1 1 4 3 2 2 1 5 4 0 0 1 1 5 1 0 1 2 6 2 1 1 4

OVA

1 3 2 2 7 2 4 3 1 8 3 3 2 2 7 4 1 1 1 3 5 3 2 2 7 6 3 4 2 9 7 3 3 2 8

OVA +

Aceton

1 2 2 1 5 2 0 0 1 1 3 2 2 2 6 4 1 1 1 3 5 3 2 1 6 6 2 1 1 4 7 1 0 1 2

OVA +

Tesa

1 1 1 1 3 2 1 0 1 2 3 4 4 2 10 4 3 3 1 7 5 1 0 1 2 6 1 0 1 2 7 2 1 1 4

Anhang

101

Tabelle 16: Histologie; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-


Protokoll Maus Epidermisdicke (µm)

Infiltration Entzündungszellen Anzahl Mastzellen

PBS

1 21,25 1 1,6 2 31,33 2 0,8 3 26,58 1 1,6 4 21,97 1 2,2 5 19,42 1 1,6 6 23,6 1 2,6

OVA

1 60,48 4 7,4 2 50,82 4 7,6 3 42,63 4 7,4 4 33,62 3 7,8 5 48,2 3 8 6 52,23 4 10 7 46,13 4 -

OVA +

Aceton

1 46,71 3 6,4 2 35,7 3 5,2 3 38,61 2 5,4 4 31,47 2 4,4 5 42,88 4 8,4 6 35,61 2 7,6 7 36,7 3 9,6

OVA +

Tesa

1 47,35 4 4 2 45,5 3 9,4 3 48,35 3 7,2 4 55,13 3 6,8 5 52,49 4 6,2 6 46,47 2 5,2 7 54,38 4 6,2

Anhang

102

Tabelle 17: Lymphknotengewicht und –zellzahl; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA +

Aceton = OVA-Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.

Protokoll Maus Gewicht (mg) Zellzahl (Mio)

PBS

1 11,5 6,3 2 16,3 22,2 3 10,7 17,1 4 10,4 5,7 5 12 8,4 6 14,3 10

OVA

1 21,9 10,3 2 24 11,8 3 21,3 12,3 4 17,9 9,6 5 19,5 11,4 6 19,8 10,1 7 25,3 11,9

OVA +

Aceton

1 20,5 14,4 2 10,8 6,8 3 12,8 18,1 4 13,6 9,1 5 16,1 15,7 6 11,5 8,3 7 11,2 9,9

OVA +

Tesa

1 23,6 7,4 2 20,5 8,7 3 24,7 12,5 4 17,7 11 5 19,1 12,8 6 14,7 9,6 7 20,8 11,2

Anhang

103

Tabelle 18: Milzzellzahl; PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll, OVA + Aceton = OVA-


Protokoll Maus Zellzahl (Mio)

PBS

1 16,65 2 25,95 3 14,1 4 21,75 5 20,55 6 15

OVA

1 43, 95 2 30,6 3 22,65 4 18,6 5 31,2 6 15,6 7 10,2

Aceton

1 9,9 2 3,45 3 6,75 4 7,5 5 7,2 6 0,9 7 8,7

Tesa

1 25,5 2 22,95 3 30,3 4 13,95 5 18,9 6 7,65 7 7,95

Anhang

104

Tabelle 19: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml); PBS = PBS-Kontrolle, OVA = OVA-Standardprotokoll,

OVA + Aceton = OVA-Standardprotokoll mit Aceton, OVA + Tesa = OVA-Standardprotokoll mit Tesa-Strippen.

Protokoll Maus OVA-spezifisches IgE (ng/ml)

PBS

1 1,84 2 0 3 0,41 4 0 5 0 6 0

OVA

1 5,65 2 8,56 3 29,46 4 8,80 5 5,40 6 7,60

OVA +

Aceton

1 8,21 2 18,64 3 34,65 4 13,72 5 14,67 6 29,96

OVA +

Tesa

1 7,37 2 4,41 3 5,45 4 7,48 5 9,40 6 35,98

Anhang

105

Vergleich unterschiedlicher Wirkstoffe zur Behandlung der atopischen Dermatitis im

OVA-Modell

Klinischer Hautscore Tabelle 20: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o)

behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 3,5 1 2 6,5 2 0 1 0 1 3 4 3,5 2 9,5 4 1,5 3 2 6,5 5 3 2 1 6 6 1 3 1 5

JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.

1 3,5 3,5 2 9 2 4 2 2 8 3 3 2,5 1 6,5 4 2 2 1 5 5 3,5 1,5 1 6 6 3 1 1 5 7 3 2 1 6

JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.

1 1 0 0 1 2 4 1 2 7 3 1 2 1 4 4 2 3 1 6 5 3,5 3 2 8,5 6 2,5 1,5 1 5

Anhang

106

Tabelle 21: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1

mg/kg p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 1 1 1 3 2 1 2 1 4 3 2 1 1 4 4 2 1 1 4 5 1 0 1 2 6 2 1 1 4

Mepyramin 30 mg/kg i.p.

1 1 1 1 3 2 1 1 1 3 3 1 1 1 3 4 2 1 1 4 5 1 0 1 2 6 2 2 1 5 7 1 0 1 2

Betamethason 1 mg/kg p.o.

1 2 1 1 4 2 2 1 1 4 3 1 1 1 3 4 2 1 1 4 5 1 1 1 3 6 1 0 1 2

Tabelle 22: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder

Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll

behandelt.


Vehikel

1 1 1 1 3 2 2 2 1 5 3 3 4 2 9 4 4 4 3 11 5 1 2 1 4 6 4 4 2 10

JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 3 2 2 7 2 3 3 1 7 3 3 2 1 6 4 2 2 1 5 5 2 1 1 4 6 4 3 2 9

Betamethason 2 mg/kg i.p.

1 2 3 1 6 2 2 2 1 5 3 1 1 1 3 4 3 4 2 9 5 1 1 1 3 6 2 2 1 5 7 0 0 2 2

Anhang

107

Tabelle 23: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979

(20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 2 3 2 7 2 2 2 2 6 3 1 2 2 5 4 2 3 2 7 5 2 1 2 5 6 3 2 2 7


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p

1 2 1 2 5 2 2 1 2 5 3 2 1 2 5 4 1 1 1 3 5 1 0 2 3

Tabelle 24: Klinischer Hautscore nach der 2. Challenge von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg

i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 2 2 2 6 2 2 2 2 6 3 2 2 2 6 4 2 1 2 5 5 1 1 1 3 6 3 2 2 7 7 2 3 2 7


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p

1 1 0 1 2 2 1 0 1 2 3 2 0 1 3 4 1 0 1 2 5 1 1 1 3 6 2 0 2 4 7 1 0 1 2

Anhang

108

Histologie Tabelle 25: Histologie von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten Mäusen; alle Gruppen

wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.



Vehikel

1 22,87 2 4,4 2 27,14 2 4,4 3 24,84 2 6,8 4 35,95 3 4,2 5 31,15 3 5,2 6 23,28 2 7,4

Vehikel JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.

1 25,41 2 4,6 2 23,35 2 3,0 3 27,60 2 3,4 4 34,68 3 4,0 5 21,69 2 4,6

OVA JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.

1 24,47 3 5,2 2 29,01 2 3,2 3 22,15 3 2,8 4 27,44 3 2,6 5 32,93 1 3,8 6 30,74 2 3,0

Tabelle 26: Histologie von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1 mg/kg p.o.) behandelten Mäusen;

alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.



Vehikel

1 25,75 2 8,8 2 23,34 3 4,4 3 25,24 3 5,6 4 18,41 2 5,0 5 25,47 3 4,6 6 22,63 3 4,2 7 29,01 2 -


1 24,26 2 4,6 2 19,21 2 2,8 3 26,31 2 2,6 4 18,79 2 3,8 5 22,29 2 3,2 6 32,23 3 2,8 7 16,41 2 4,2


1 23,81 3 3,0 2 20,41 2 5,6 3 20,95 3 4,8 4 25,12 2 5,0 5 21,37 2 4,6 6 28,14 3 3,8

Anhang

109

Tabelle 27: Histologie von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten

Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.



Vehikel

1 28,94 2 3,4 2 19,51 2 3,4 3 31,52 3 5,2 4 42,01 3 9,4 5 22,04 2 2,8 6 44,52 3 2,8

JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 21,55 3 4 2 25,68 3 2 3 30,63 3 4,6 4 26,90 2 3,8 5 31,80 2 3,0


1 30,77 2 3,2 2 27,69 2 3,2 3 26,16 2 3,4 4 22,49 2 4,4 5 19,72 1 1,6 6 24,40 2 4,0 7 17,30 1 5,8

Tabelle 28: Histologie von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten




Vehikel

1 51,79 3 5,2 2 47,62 3 6,4 3 40,53 2 6,0 4 50,54 4 5,4 5 46,91 3 5,0


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 29,4 2 5,8 2 26,76 1 4,8 3 27,58 2 7,0 4 26,14 1 4,4 5 27,29 1 6,0

Anhang

110

Tabelle 29: Histologie von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle

Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.



Vehikel

1 42,31 3 8,2 2 49,0 3 4,0 3 47,8 3 6,2 4 45,13 2 4,0 5 57,78 4 6,4 6 48,96 4 9,0 7 46,05 3 3,8


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 29,51 2 3,8 2 26,41 2 5,2 3 29,0 2 2,4 4 26,68 3 4,2 5 23,63 1 3,0 6 25,51 1 3,2 7 22,03 2 3,8

Lymphknotengewicht und –zellzahl Tabelle 30: Lymphknotengewicht und –zellzahl von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten



Vehikel

1 9,1 13,3 2 10,1 15,55 3 12,6 19,25 4 11,1 19,25 5 7,4 11,3 6 9,4 9,05

JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.

1 10,1 12,25 2 11 10,8 3 6,7 9,2 4 10,2 14,5 5 9,2 9,7 6 5,7 4 7 14,4 21,75

JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.

1 13,1 11,6 2 9,7 12,9 3 9,8 14,45 4 10,6 18,8 5 8,5 13,65 6 13,5 18

Anhang

111

Tabelle 31: Lymphknotengewicht und –zellzahl von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1 mg/kg

p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 8,7 9,2 2 6,7 7,85 3 9,1 12,7 4 12,2 16,95 5 7,9 11,45 6 9,1 11,3


1 7,2 7,45 2 4,8 5,05 3 10,7 10,05 4 7,9 5,65 5 8,2 8,55 6 11,3 9,95 7 3,9 5,05


1 6,4 8,65 2 7,3 9,95 3 7 8,75 4 7,2 8,75 5 7,1 7,5 6 7,1 7,7

Tabelle 32: Lymphknotengewicht und –zellzahl von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder Betamethasonphosphat (2

mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 10,1 8,35 2 2,2 2,55 3 12,4 9,95 4 8,7 16,05 5 9,6 10,3 6 10,6 16,65

JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 8 11,15 2 14,6 22,15 3 7,5 5,05 4 6,9 10,6 5 7,3 12,75 6 7,5 9,4


1 4,4 5,3 2 6,1 8,05 3 4,6 6,3 4 2 3,45 5 3,9 4 6 3,8 4,3

Anhang

112

Tabelle 33: Lymphknotengewicht und –zellzahl von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20



Vehikel

1 10,9 10,05 2 8,6 6,05 3 10 6,25 4 9,9 16,55 5 5,3 3,7 6 7,1 8,85


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 5,3 3,35 2 4,3 2,55 3 4,3 2,55 4 5,1 2,55 5 4,6 1,8

Tabelle 34: Lymphknotengewicht und –zellzahl von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.)



Vehikel

1 6,6 7,5 2 6,4 4,75 3 12,8 12,55 4 12,4 14,25 5 11,1 11,3 6 7,2 9,05 7 8,8 8,75


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 7,1 7,4 2 9,9 12,35 3 7,9 7,25 4 3,9 2,2 5 3,1 1,75 6 7,9 13,3 7 4,3 3,9

Anhang

113

Milzzellzahl Tabelle 35: Milzzellzahl von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten Mäusen; alle Gruppen

wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 54 2 44,75 3 61,25 4 54,75 5 28,25 6 45,75

JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.

1 36,75 2 14,5 3 31,5 4 24 5 33,75 6 28,25 7 47

JNJ 39758979 50 mg/kg p.o.

1 36,75 2 32,5 3 34,5 4 46,5 5 34,5 6 45,25 7 36,75

Tabelle 36: Milzzellzahl von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1 mg/kg p.o.) behandelten



Vehikel

1 40,25 2 44 3 27 4 24 5 28,25 6 41,5


1 36 2 33,75 3 11,5 4 27,75 5 44,25 6 63 7 10


1 33,5 2 29,75 3 37 4 27,75 5 24 6 27

Anhang

114

Tabelle 37: Milzzellzahl von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten



Vehikel

1 13,75 2 24,125 3 29,125 4 21,125 5 12,625 6 17,25

JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 1,375 2 46 3 19,625 4 16,25 5 14,875 6 8,875


1 14,5 2 1,875 3 1,375 4 15,125 5 7,75 6 14 7 8,5

Tabelle 38: Milzzellzahl von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten



Vehikel

1 75,5 2 65,5 3 27,5 4 84 5 73,5 6 66,5


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p

1 39,5 2 33,5 3 48 4 43,5 5 43

Anhang

115

Tabelle 39: Milzzellzahl von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle

Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 60 2 81,6 3 68,1 4 58,8 5 54 6 63,9 7 55,5


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p

1 50,1 2 41,1 3 42,3 4 51,3 5 48,9 52,8

6 55,5

Zytokinsekretion Splenozyten Tabelle 40: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von JNJ 39758979 (20

mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll

behandelt; angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.

Zytokin Vehikel

JNJ 39758979

20 mg/kg p.o.

JNJ 39758979

50 mg/kg p.o.

unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert

IL-4 6,15 ± 2,47

43,34 ± 34,03

3,39 ± 2,60

101,53 ± 133,49

5,60 ± 2,86

201,77 ± 72,92

IL-10 25,33 ± 14,61

928,67 ± 566,74

17,33 ± 25,57

717,57 ± 869,83

31,35 ± 34,37

1796,50 ± 1058,38

IL-6 0,00 ± 0,00

209,76 ± 76,22

0,00 ± 0,00

164,87 ± 126,34

1,38 ± 3,38

253,09 ± 58,21

IFN-γ 0,00 ± 0,00

896,30 ± 382,94

0,00 ± 0,00

707,22 ± 837,98

18,05 ± 44,21

1318,13 ± 446,17

Anhang

116

Tabelle 41: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von JNJ 39758979 (20

mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; angegeben ist

der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.

Zytokin Vehikel

JNJ 39758979

20 mg/kg i.p.

unstimuliert stimuliert unstimuliert stimuliert

IL-4 1,45 ± 3,55

49,06 ± 48,17

0,00 ± 0,00

66,03 ± 54,83

IL-10 63,78 ± 136,37

1652,03 ± 1636,43

156,00 ± 116,85

2724,47 ± 1781,67

IL-6 39,21 ± 71,31

311,79 ± 282,97

150,87 ± 174,07

752,18 ± 804,78

IFN-γ 185,12 ± 400,61

225,64 ± 325,22

361,41 ± 410,75

320,36 ± 219,25

Tabelle 42: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von Mepyramin (30

mg/kg i.p) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; angegeben ist

der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.

Zytokin Vehikel

Mepyramin

20 mg/kg i.p.


IL-4 11,09 ± 2,32

100,16 ± 34,74

3,77 ± 3,12

89,99 ± 72,44

IL-10 70,89 ± 28,02

914,78 ± 342,41

34,86 ± 34,07

782,00 ± 607,58

IL-6 70,10 ± 65,09

320,10 ± 62,64

2,96 ± 4,51

166,16 ± 67,68

IFN-γ 373,33 ± 430,51

404,45 ± 275,85

0,00 ± 0,00

170,18 ± 189,79

Anhang

117

Tabelle 43: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von Betamethasonvalerat

(1 mg/kg p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt; angegeben

ist der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.

Zytokin Vehikel

Betamethason

1 mg/kg p.o.


IL-4 11,09 ± 2,32

100,16 ± 34,74

0,00 ± 0,00

16,37 ± 11,59

IL-10 70,89 ± 28,02

914,78 ± 342,41

25,89 ± 35,27

363,33 ± 137,07

IL-6 70,10 ± 65,09

320,10 ± 62,64

0,00 ± 0,00

147,15 ± 33,24

IFN-γ 373,33 ± 430,51

404,45 ± 275,85

0,00 ± 0,00

198,64 ± 198,62

Tabelle 44: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von Betamethason-

phosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt;

angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.

Zytokin Vehikel

Betamethason

2 mg/kg i.p.


IL-4 1,45 ± 3,55

49,06 ± 48,17

3,12 ± 7,68

12,72 ± 10,28

IL-10 63,78 ± 136,37

1652,03 ± 1636,43

421,11 ± 630,44

1727,31 ± 1655,07

IL-6 39,21 ± 71,31

311,79 ± 282,97

141,64 ± 203,79

294,27 ± 265,29

IFN-γ 185,12 ± 400,61

225,64 ± 325,22

788,47 ± 1030,99

576,11 ± 522,87

Anhang

118

Tabelle 45: Zytokinsekretion von OVA stimulierten Splenozyten; die Splenozyten stammen von Mepyramin (20

mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-

Standardprotokoll behandelt; angegeben ist der Mittelwert ± Standardabweichung in pg/ml.

Zytokin Vehikel

Mepyramin

+

JNJ 39758979


IL-4 1,04 ± 1,79

16,76 ± 19,28

1,86 ± 3,67

36,24 ± 19,26

IL-10 24,29 ± 17,71

162,86 ± 163,45

19,76 ± 6,12

505,24 ± 277,79

IL-6 36,85 ± 13,42

108,84 ± 43,21

7,22 ± 8,03

139,71 ± 58,44

IFN-γ 0,00 ± 0,00

0,00 ± 0,00

0,00 ± 0,00

37,56 ± 73,79

OVA-spezifischer IgE-Gehalt Tabelle 46: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o)



Vehikel

1 2569,19 2 2794,90 3 3795,88 4 1842,98 5 5238,47 6 7407,26

JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.

1 8427,87 2 3118,74 3 3442,59 4 11263,98 5 4482,83 6 1165,85 7 4453,39


1 3982,34 2 13226,69 3 1558,39 4 4551,52 5 4021,59 6 6573,11

Anhang

119

Tabelle 47: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder

Betamethasonvalerat (1 mg/kg p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll

behandelt.


Vehikel

1 3214,48 2 4897,74 3 5458,82 4 4047,06 5 2825,34 6 3024,43


1 2771,04 2 8318,55 3 2463,35 4 9268,78 5 4789,14 6 10798,19 7 4246,15


1 3657,92 2 5875,11 3 6246,15 4 2581,00 5 6237,10 6 3395,48

Tabelle 48: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder

Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll

behandelt.


Vehikel

1 1757,25 2 1824,68 3 7151,72 4 1831,42 5 5142,28 6 2498,99

JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 11197,57 2 2606,88 3 6153,74 4 2397,84 5 3436,28 6 2856,37


1 1480,78 2 2917,06 3 637,90 4 981,79 5 1514,50 6 2849,63 7 1332,43

Anhang

120

Tabelle 49: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ

39758979 (20 mg/kg i.p.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 11444,44 2 11722,22 3 5174,60 4 8904,76 5 6603,17 6 9142,86


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p

1 1523,81 2 7198,41 3 7277,78 4 2992,06 5 5571,43

Tabelle 50: OVA-spezifischer IgE-Gehalt im Serum (ng/ml) von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20



Vehikel

1 12336,77 2 11821,31 3 10171,82 4 10515,46 5 8247,42 6 12508,59 7 7079,04


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p

1 4123,71 2 5704,47 3 6391,75 4 6391,75 5 7903,78 6 6941,58 7 8178,69

Anhang

121

Juckreiz Tabelle 51: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von JNJ 39758979 (20 mg/kg p.o. oder 50 mg/kg p.o) behandelten


Protokoll Maus Kratzattacken / 30 min

Vehikel

1 36 2 42 3 76 4 54 5 56 6 67

JNJ 39758979 20 mg/kg p.o.

1 39 2 15 3 66 4 71 5 50 6 46 7 43


1 49 2 61 3 33 4 55 5 71 6 52

Tabelle 52: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von Mepyramin (30 mg/kg i.p.) oder Betamethasonvalerat (1 mg/kg

p.o.) behandelten Mäusen; alle Gruppen wurden nach dem OVA-Standardprotokoll behandelt.


Vehikel

1 54 2 71 3 45 4 49 5 60 6 57


1 52 2 77 3 55 4 50 5 24 6 92 7 64


1 39 2 32 3 30 4 29 5 46 6 46

Anhang

122

Tabelle 53: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.) oder Betamethasonphosphat (2



Vehikel

1 49 2 36 3 26 4 55 5 68 6 44

JNJ 39758979 20 mg/kg i.p.

1 25 2 23 3 41 4 46 5 60 6 25


1 38 2 33 3 16 4 40 5 24 6 34 7 17

Tabelle 54: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von Betamethasonphosphat (2 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20



Vehikel

1 24 2 13 3 126 4 58 5 56 6 54


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p

1 28 2 27 3 38 4 30 5 23

Anhang

123

Tabelle 55: Anzahl an Kratzattacken in 30 min von Mepyramin (20 mg/kg i.p.) und JNJ 39758979 (20 mg/kg i.p.)



Vehikel

1 12 2 25 3 25 4 16 5 21 6 11 7 23


+ JNJ 39758979 20 mg/kg i.p

1 7 2 17 3 2 4 5 5 11 6 11 7 9

Anhang

124

Danksagung

Ein besonderer Dank geht an meinen Doktorvater Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für die

Überlassung des spannenden Themas, die freundliche und engagierte Betreuung bei der

Entstehung dieser Arbeit sowie die sehr netten, schwarzgelben Gespräche.

Herrn Prof. Dr. Bäumer danke ich für seine hilfreichen Ratschläge und die freundliche

Unterstützung trotz der großen Entfernung.

Ein sehr großer Dank geht an Kristine für das stets offene Ohr, egal zu welcher Zeit, die

geduldige Betreuung und die sehr schnelle Korrektur.

Katrin möchte ich für die freundliche Betreuung, vor allem während meiner ersten Zeit in der

Toxi, und der großen Hilfe am FACS-Gerät sowie die netten Gesprächen danken.

Prof. Dr. Thomas Werfel, Prof. Dr. Ralf Gutzmer und Dr. Susanne Mommert danke ich für

die angeregten Diskussionen und Ratschläge während der Histamintreffen.

Bei Gesine und Jessi möchte ich mich für die vielen netten Gespräche und Ratschläge sowie

die schönen Mittags-Gassi-Runden bedanken.

Viki, Alina und Sonja danke ich für die große Hilfe im Labor und während der Versuche.

Ein großer Dank geht an Caro für ihre unermüdliche Hilfe beim Mäuse einpacken und den

Juckreiz-Videos sowie der tollen Zeit auch außerhalb der Toxi.

Meinen Mitdoktoranden Kim, Kathy, Ellie, Paula und Jenny danke ich für die lustigen

Gespräche und ihre Hilfe an den Probeentnahmetagen.

Anhang

125

Carmen und Steffi danke ich für die lustige gemeinsame Zeit als Bewohner des Schlauches,

für die vielen Gespräche und die Geduld, wenn mal etwas nicht so funktionierte. Auch

möchte ich mich für die vielen schönen Unternehmungen bedanken.

Carmen: Tanze dein Leben! #1

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich für die finanzielle Unterstützung dieser

Arbeit.

Ein großer Dank geht an alle meine Freunde für die Unterstützung während der Entstehung

dieser Arbeit. Es ist schön, Freunde wie euch zu haben.

Ein großes Dankeschön geht an Sebastian für die liebevolle Untertützung und Geduld

während der stressigen Schreibphase.

Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie. Meiner Schwester möchte ich für ihre

Unterstützung und die tolle gemeinsame Zeit in Kalifornien danken. Meinen Eltern möchte

ich für ihre Liebe, Geduld und ihren stetigen Glauben an mich danken. Ihr habt mir dies alles

erst ermöglicht. Ohne euch wäre ich jetzt nicht da, wo ich bin.

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