bacillus cereus

Bacillus cereus

INTRODUCCION

Los miembros del genero bacillus son bacilos gran positivos formadores de esporas, pueden crecer en

condiciones de aerobiosis o anaerobiosis y la mayoría son mesofilos, con la presencia de miembros

termófilos o psicrofilos capaces de crecer a temperaturas tan altas como 75°C o tan bajas como 4°C.

Los miembros de este grupo pueden crecer saprofiticamente bajo condiciones de riqueza de

nutrientes casuales en el ambiente, encontrándose normalmente en suelo y presentando diversas

relaciones ecológicas con animales y plantas, entre ellas puede encontrarse como flora intestinal de

diferentes animales.

B .cereus es aislado frecuentemente en una gran variedad de alimentos procesados o crudos, la

importancia de su presencia radica en que puede llegar a desarrollarse y provocar cuadros y brotes

gastrointestinales si se dan las condiciones adecuadas. Esto ha adquirido más importancia en la

industria alimentaria con el hallazgo de cepas psicrotroficas y toxigenicas de B.cereus capaces de

crecer en alimentos almacenados en refrigeración.

Entre otros alimentos, este agente ha sido asociado a productos lácteos, productos deshidratados y

especias por lo que su prevalencia en estos alimentos es de suma importancia.

Microbiología general Página 1

Bacillus cereus

DETERMINACION DE LA BACTERIA BACILLUS CEREUS

I. OBJETIVOS:

I.1. OBJETIVO GENERAL:

Determinación de la bacteria bacillus cereus.

I.2. OBJETIVO ESPECIFICO:

Determinar los medios de cultivoConocer el análisis microbiológico para detectar el bacilo cereus en alimentos.Explicar el fundamento de cada etapa del análisis.Control de los bacillus cereus en la industria alimentaria.

II. MARCO TEORICO

II.1.DESCRIPCION DE LA BACTERIA.-

Los miembros del genero bacillus son bacilos gran positivos formadores de esporas, pueden crecer en condiciones de aerobiosis o anaerobiosis y la mayoría son mesofilos.

Dentro de este género es posible encontrar varias especies capaces de producir enfermedades en el ser humano como lo son bacillus anthracis, agente del ántrax, asociado a cuadros cutáneos, pulmonares y gastrointestinales y bacillus cereus, el cual puede producir tanto cuadros intestinales como infecciones oportunistas(Jackson et al, 1995; Mahon y Manuselis,2000). Este último es capaz de causar cuadros diarreicos y eméticos principalmente, que están adquiriendo importancia en el mundo industrializado, debiéndose su patogenicidad a su capacidad de elaborar toxinas, incluyendo entero toxinas y la toxina emética (Granun,2005).

B. Cereus es aislado frecuentemente en una gran variedad de alimentos procesados o crudos, la importancia de su presencia radica en que puede llegar a desarrollarse y provocar cuadros y brotes gastrointestinales si se dan las condiciones adecuadas (Kotiranta et al, 2000; Downes e Ito, 2001). Esto ha adquirido mas importancia en la industria alimentaria con el hallazgo de cepas psicrotroficas y toxigenicas de B. cereus capaces de crecer en alimentos almacenados en refrigeración (Downes e Ito,2001).


Bacillus cereus

II.2.CARACTERÍSTICAS DE CRECIMIENTO Y SOBREVIVENCIA

Crecimiento

La temperatura

La temperatura óptima de crecimiento de B. cereus es de 30°a 40 °C algunas cepas pueden crecer a temperaturas de 55 °C. De acuerdo con estudios realizados en arroz cocido por Finlay & Longan, las cepas responsables del síndrome emético tienen una temperatura mínima de I5˚C en alimentos. El rango para producción de la toxina va de I5-40˚C, dado que las cepas productoras de la toxina emética no germinan a temperaturas menores de I5˚C . Se reconoce que las cepas productoras de toxinas diarreicas son genéticamente heterogéneas e incluyen cepas mesófilas y psicrotolerantes, mientras que las cepas productoras de toxina emética son mesófilas. La mayoría de cepas diarreicas (72%) tienen como temperatura mínima de crecimiento 7°C.

Algunas cepas muestran tolerancia a temperaturas bajas, siendo consideradas como psicrótrofas o psicrotolerantes, crecen a temperaturas de 4 a 7˚C, estudios realizados sugieren que las cepas aisladas de B. cereus de productos lácteos se han adaptado a las condiciones ambientales.

pH

El rango de pH para el crecimiento de B. cereus es de 4,5 a 9,5 con un pH óptimo de 6 a 7. Se ha señalado que B. cereus es más resistente a condiciones de estrés como pH ácido, sales biliares y altas temperaturas en condiciones aeróbicas.

Condiciones atmosféricas

Es un organismo anaerobio facultativo, el cual requiere oxígeno para la producción de la toxina emética, crece mejor en condiciones de aerobiosis. Un estudio reciente estableció que la tasa de crecimiento se ve reducida en ausencia de oxígeno y en condiciones de microaerofilia.

Actividad del agua (AW)

El rango mínimo de AW de las células vegetativas es de 0,912-0,950.

Sobrevivencia


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Temperatura

-Células vegetativas: se destruyen rápidamente por el calor, pero las esporas se clasifican como moderadamente resistentes al calor, la resistencia se ve incrementada en alimentos con alto contenido de grasa. Se ha observado una alta resistencia en alimentos con baja actividad de agua.

-Esporas: son resistentes a la sequedad y resisten más en alimentos con alto contenido de grasa. Cocciones por debajo de los I00˚C pueden permitir la sobrevivencia de esporas.

-Toxina emética: se ha demostrado que la toxina del síndrome emético permanece activa después de un tratamiento térmico a I00˚C por I5 minutos (rangos de pH 8,7 a I0,6), y a I26˚C por 90 minutos; es más resistente en alimentos con baja humedad. El arroz recalentado en el momento de consumo puede reducir el número de células vegetativas viables, pero esto no inactiva la toxina emética, la cual es estable al calor.

- Toxinas diarreicas: las toxinas son termolábiles, se destruyen a 56˚C en 5Minutos.

pH

B. cereus se ve inhibido por pH inferiores a 4.3. Las células vegetativas mueren rápidamente por ácidos del estómago; sin embargo, algunas pueden sobrevivir en los alimentos y protegerse de dichos ácidos. Se ha demostrado que las esporas son más resistentes a la acidez gástrica (pH entre 1 a 5,2) que las células vegetativas; así mismo, se ha identificado la estabilidad de la toxina emética con pH entre 2 y 9. La tolerancia al pH se da mejor en cepas que se han expuesto previamente a pH ácidos y se relaciona con el estado fisiológico de la bacteria.

Actividad del agua

Las esporas pueden sobrevivir por largos períodos en alimentos con bajo contenido de agua.


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II.3.BACILLUS CEREUS COMO AGENTE PATOGENO

El interés en este agente como causante en enfermedades ha venido en aumento debido a los crecimientos de padecimientos relacionados con él, especialmente en brotes alimentarios siendo también capaz de producir infecciones oportunistas en hospederos susceptibles.

Bscillus cereus cuenta con una cantidad importante de factores de virulencia como los son las entero toxinas, toxina emética (cereulida), hemolisina, fosfalipasa C ,proteasas,colagenasas y la estructura de superficie llamada capa S lo que contribuye a aumentar el rango de enfermedades que puede ocasionar ,sin embargo ,debido a la ubicuidad de esta bacteria , su aislamiento en el ambiente no siempre permite relacionarlo como agente etiológico de muchas infecciones , por lo que es importante verificar su capacidad toxigenica si se quiere asociar una cepa a un cuadro o brote.

Estudios han encontrado un factor de virulencia adicional en algunas cepas esta bacteria. Se trata de la habilidad de producir esporas capaces de adherirse a células epiteliales, lo cual ha sido asociado a brotes con cuadros clínicos mas severos y prolongados debido a que se da una mayor permanencia de la bacteria en el intestino , lo que permite la germinación y producción de toxinas directamente sobre su sitio blanco.

La interpretación de la presencia de esta bacteria en muestras clínicas s difícil, ya es que frecuente encontrarlo en cultivos mixtos , lo cual introduce la incertidumbre de si es el agente causal de la patología o es un contaminante, sin embargo, siempre debe sospecharse del como agente etiológico cuando se observa en este tipo de muestras .

II.4.FUENTES DE CONTAMINACIÓN

El suelo puede contener concentraciones entre 103 y 105 esporas por gramo y es la fuente primaria de contaminación de los alimentos. Se considera inevitable la presencia de Bacillus cereus en las materias primas e incluso se ha detectado en materiales de envasado. Además, esta bacteria es capaz de contaminar alimentos transformados gracias, por un lado, a la gran resistencia de sus esporas a los tratamientos térmicos (pasteurización, cocción, secado, pulverización) y, por otro lado, a la capacidad de dichas esporas para adherirse fuertemente a las superficies de acero inoxidable y acumularse en los equipos, especialmente de los sistemas cerrados, como los intercambiadores de calor. De esta manera, los equipos pueden transformarse en reservorio de esporas.


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II.4.1. Alimentos que pueden estar implicados:

Pasteles con crema

Carnes y verduras

Sopas

Salsas

Ensaladas

Arroz hervido

Condimentos

leche

Alimentos en General

II.5.EL CONTROL DE BACILLUS CEREUS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

La industria alimentaria debe tener una especial atención a mantener la cadena del frío durante todo el proceso de elaboración de los alimentos, particularmente de los alimentos listos para consumir. Por ello, se han de manipular los ingredientes fríos, incluso aquellos que se han sometido a tratamiento térmico, como arroz o pasta cocidos; la cocción de los alimentos no garantiza en general la ausencia de esporas. También es importante que los condimentos y las especies tengan un bajo nivel de contaminación, dado que pueden añadirse a los alimentos al final del proceso de elaboración.

Las industrias pueden aplicar las siguientes medidas para prevenir la contaminación y el crecimiento de Bacillus cereus en sus productos:

Conservar y manipular las materias primas, las semielaboradas y productos

elaborados por debajo de 7 °C.

Refrigerar lo más rápido posible los alimentos cocinados y por eso hay que tener

en cuenta el tamaño del alimento o la del recipiente que los contiene.

Bajar el pH y la actividad de agua del alimento elaborado. El crecimiento se ve

limitado a un pH inferior a 5,5 y no es posible en condiciones normales a pH por

debajo de 5, ni a una actividad de agua inferior a 0,93.


Bacillus cereus

Limpiar los equipos con tratamientos que eliminen los biofilms para disminuir el

riesgo de contaminación.

Controlar las rotaciones de los almacenes para evitar tiempos prolongados de

almacenamiento de las materias primas y los productos elaborados.

Seleccionar materias primas y elaborar productos que contengan

concentraciones de Bacillus cererus inferiores a 103/g.

II.6.CUADROS CLINICOS ASOCIADOS A ALIMENTOS

Bacillus cereus es frecuentemente agente causas de enfermedades asociadas alimentos provocando dos tipos de cuadros el diarreico y emético.

II.6.1. SINDROME DIARREICO

Se debe a entero toxinas, que pueden estar preformadas en el alimento o pueden ser producidas en el intestino. Es usualmente asociada la ingesta de alimento proteínico, como carne roja o pollo, se caracteriza por tener un periodo de incubación de 8 a 16 horas, manifestándose con el dolor abdominal, diarrea sin presencia de fiebre puede estar acompañado por nauseas, aunque rara vez ocurre vómito, la mayoría de los casos los siontomas persisten por 24 horas.

II.6.2. SINDROME EMETICO

Es producido por la toxina emética termostable preformada en el alimento, presenta un periodo de incubación de 1 a 5 horas, luego del cual se manifiesta predominantemente con vómito y calambres intestinales, puede presentar diarrea en un tercio de los casos. Ha sido asociado a la ingestión de arroz frito, especialmente al preparado en restaurantes orientales, y pastas, teniendo este cuadro una duración promedio de 9 horas.

La presencia de un alto número de B. cereus (mayor a 106ufc/g) en un alimento es un indicador de su crecimiento activo y proliferación, y además constituye un peligro potencial para la salud.


Bacillus cereus

II.7.TOXINAS

Bacillus cereus es capaz de producir una gran cantidad de toxinas, entre ellas varias entero toxinas, la toxina emética, fosfolipasas, proteasas hemolisinas. A continuación se describen las toxinas encargadas de producir los cuadros clínicos asociados alimentos.

II.7.1. TOXINA EMETICA (forma emética)

También conocida como Cereulida, es un dodecadepsipeptido cíclico con masa molecular de 1.2 kDa, altamente estable al calor, resistente más de una hora a 150 grados, y a la degradación proteolítica. Su producción es mínima por debajo de los 8 grados o por enzima de los 40 grados centígrados, con una temperatura optima entre 25 y 30 grados centígrados y se da durante la etapa tardía de la fase de crecimiento logarítmico independientemente de la esporulación.

La estabilidad de esta toxina se ve influenciada por el ph, disminuyendo a Ph superiores a 10 concentración de toxinas, entre menos cantidad de toxina exista va a presentar menor resistencia y sustancias protectoras, como l aceita. La particularidad de resistir todos los tratamientos utilizados en la industria alimenticia, por lo que la seguridad de los alimentos en los que se podría producir recae en la prevención de la contaminación y del crecimiento de B. cereus.

La codificación de esta toxina se da plásmidos tipo Px01, ya que presentan un alto grado de similitud con la secuencia del plásmido Px01 que codifica para la producción de toxina de Bacillus cereus, sin embargo carece de la isla de patogenocidad que si tiene el Px01. Estos plásmidos codificantes para la toxina emética son frecuentemente encontrados en aislamientos clínicos lo que demuestra la asociación entre su presencia y la capacidad patógena de la bacteria.

Para detectar y cuantificar esta toxinas se han implementado varias técnicas como pruebas de alimentación de monos, ensayos cito tóxicos, bioensayos de inhibición de la movilidad sobre espermatozoides, cuantificación mediante HPLC y espectrometría de masas y recientemente se ha evaluado la utilidad de PCR en tiempo real como método diagnóstico.

II.7.2. FORMA DIARRERICA

Es producida por la toxina diarreogénica, que es liberada en la fase logarítmica de

crecimiento. La toxina se destruye al someterla a 60 °C.


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III. IDENTIFICACION DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS

III.1. IDENTIFICACION DE B. CEREUS EN QUESO Y LECHE EN POLVO

3.1.2. MUESTREOLas muestras a analizar fueron queso y leche en polvo.Cada producto se analizó por triplicado en total se analizó 12 muestras de queso y 12 muestras de leche en polvo.

3.1.2. AISLAMIENTO.- Debido a que se analizaron alimentos procesados, se incluye un paso de pre enriquecimiento para recuperar las bacterias deterioradas y aumentar la sensibilidad del aislamiento (la metodología utilizada se basa en la descrita por el compendium de métodos para el examen microbiológico de alimentos – Downes e Ito, 2001).

El método consiste en:

Pesar 25gr del alimento analizado

Mezclar con 225ml de agua peptonada estéril

De esta suspensión se hicieron diluciones decimales hasta 10−3.

De cada dilución se inocula 1 ml en tubos de caldo tripticase de soya con

polimixina.

Incubar a 35°C por 24 horas.

Los tubos que presentas turbidez se hace la siembra en agar manitol- yema de

huevo- polimixina (MYP).

Incubar a 35° por 24 horas

3.1.3. PRUBAS DE IDENTIFICACION:

A las colonias que presentaron la morfología característica de B. cereus en agar MYP

(colonias grandes, planas, secas, rosadas de halo de precipitación por la degradación

de yema de huevo) se le puede realiza tinción de gran, pruebas de catalasa, oxidasa,

fermentación de glucosa, indol, movilidad, hidrolisis del almidon, hidrolisis de gelatina

y utilización de nitratos como se describe en el Compendium de métodos para el

examen microbiológico de alimentos con el fin de hacer la identificación B. cereus.


Bacillus cereus

La frecuencia de B. cereus en leche en polvo puede verse afectada por la calidad de la

materia prima utilizada en su fabricación y por la capacidad de las esporas de soportar

tratamientos térmicos fuertes, ya que aunque el alimento contenga una baja actividad

del agua, las esporas no se ven afectadas por esto y se encuentran en la latencia a la

espera de condiciones adecuadas (Granum,2005).

El B. Cereus afecta mayormente a los quesos debido a su alto contenido de agua , lo

que es favorable para la eventual germinación de esporas y aumentar la posibilidad de

detección (Granum,2005), a su vez, estos productos presentan un alto contenido de

grasa, lo que confiere un mayor grado de protección a las bacterias frente a los

tratamientos reductores de la carga microbiana

III.2. IDENTIFICACION DE B.CEREUS EN HARINA DE TRIGO AGRANEL:

Se pesó 3 gr de la muestra (harina de trigo)

Se realizó las diluciones

Con un asa de siembra se puso una muestra en agar yema de huevo rojo fenol

Se Incubo a 35-37 °C por 24-48horas

Pasado el tiempo de incubación se leyo las placas

Se seleccionó las colonias que presentaron un halo color grosella (colonias

sospechosas)

A las colonias sospechosas se le realiza tinción gran si se observan bacterias

bacilares, de bordes rectos, esporas centrales, elípticas se les tomara como prueba

presuntivo para B .Cereus.

Se realizó el conteo en placa.


Bacillus cereus

Luego de las colonias seleccionadas se realizo las pruebas bioquímicas

características dando como resultado:

Con las pruebas bioquímicas realizadas no se pudo identificar B.Cereus pero por la tinción gran

realizada en la que se observó la morfología característica bacilar, la espora de forma oval y de

posición central, su característica anaerobia facultativa, su capacidad para hidrolizar el almidón y

la capacidad de las colonias aisladas en placa de agar yema de huevo con rojo de fenol (con su

característico halo grosella), aseguraron que la cepa aislada pertenece al género bacillus.

IV. CONCLUSIONES

Los miembros del genero bacillus son bacilos gran positivos formadores de esporas, pueden

crecer en condiciones de aerobiosis o anaerobiosis y la mayoría son mesofilos.

La presencia de un alto número de B. cereus (mayor a 106ufc/g) en un alimento es un

indicador de su crecimiento activo y proliferación, y además constituye un peligro potencial

para la salud.

Bacillus cereus es capaz de producir una gran cantidad de toxinas, entre ellas toxina emética.


Catalasa positiva

Utilización almidon Positiva

Gelatinasa Negativa

Reducción de nitratos Negativa

Rojo de metilo Negativa

TSI K/K

Bacillus cereus

La industria alimentaria debe tener una especial atención a mantener la cadena del frío

durante todo el proceso de elaboración de los alimentos, particularmente de los alimentos

listos para consumir.

V. BIBLIOGRAFIA

Código Alimentario Argentino. Tomo 1 y 2. Resoluciones del MERCOSUR anexas. Distribuidor

de la Canal y Asociados. 1994.

Martino T.K; Leyva, V; Puig, Y; Machin, M; Aportela, N; Ferrer, Y. Bacillus cereus y su

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ISSN 0864-3466. Scielo. Parte I. 2010.

Rey, Ana M. Y Silvestre, A. A. "Comer sin Riesgos 2". Las Enfermedades Transmitidas por

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Seguridad alimentaria: una responsabilidad compartida. Consejo Europeo de Información

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L. ORTIZ; M(2003) material didáctico de microbiología de alimentos investigación y recuento

de B.Cereus.

Beaottie,S.H y Williams, A, G (1991) determinación de toxinas en bacillus cereus,

microbiología de alimentos


Bacillus cereus

VI. ANEXOS


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