epidémiologie moléculaire des hépatites virales b, c et delta ...sont intéressées à...

UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU ---------------

UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE

SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE

(UFR/SVT)

Mémoire Présenté

Par : Folly ANYOVI

Pour l’obtention du Master II

de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées

de l’Université de Ouagadougou

SUR LE THEME:

Epidémiologie Moléculaire des Hépatites

Virales B, C et Delta au Togo

Soutenu le…………………. devant le jury composé de :

Président : Prof Yves TRAORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou

Membres : Prof Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou

Dr Serge DIAGBOUGA, Maître de Recherche,IRSS (Directeur de Mémoire)

Prof Stéphane CHEVALIEZ, Professeur, Université de Paris-Est (Co-Directeur)

LABORATOIRE DE BIOLOGIE

MOLECULAIRE ET DE GÉNÉTIQUE

MOLÉCULAIRE (LABIOGENE)

N° d’Ordre .............................../LABIOGENE

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page i

Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA

De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont

incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques.

Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine

du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la

justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays

membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de

recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie

moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources

financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence,

une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches

que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique

moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux

mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays

du Nord ont tendance à y rester.

Le master en Biologie Moléculaire et en Génétique Moléculaire Appliquées (BioGeMA) a pour

but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la

mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de

compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires.

Le master BioGeMA est :

Un Master à dimension sous-régionale

Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie

moléculaires

Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE

Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et

des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des

centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de

recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour

permettre la formation de chercheurs et d’enseignants-chercheurs afin d’assurer la

relève du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la

mise en place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité.

Professeur Jacques SIMPORE

Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire

et de Génétique Moléculaire UFR/SVT -

École Doctorale Sciences et Technologie

Université de Ouagadougou – Burkina Faso

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page ii

DEDICACE

Je dédie ce travail,

A la mémoire de mon Papa ANYOVI Théodore, que la terre te soit légère ;

A Madame Marie-Hélène VALERO, merci pour tout ce que vous avez fait pour moi. Encore

une fois, merci du fond de cœur ;

A la famille SOMBIE ;

A tous les techniciens du laboratoire de virologie d’Henri Mondor, spécialement à vous

Sandrine Rallier, Vincent P.;

Aux patients de l’ONG ASADH ;

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page iii

REMERCIEMENTS

Au Pr Jean Michel PAWLOTSKI, Professeur titulaire, Directeur du laboratoire de

Virologie, Bactériologie-Hygiène, Mycologie-Parasitologie Centre National de Référence des

Hépatites B, C et delta & Inserm U955 pour avoir accepté de nous accueillir dans son

laboratoire. Merci Professeur Jean Michel.

A Pr Stéphane CHEVALIEZ, Maître de Conférences des Universités-Praticien Hospitalier,

Directeur Adjoint du laboratoire de Virologie, Bactériologie-Hygiène, Mycologie

Parasitologie et du Centre National de Référence des Hépatites B, C et delta. C’est l’occasion

pour moi de vous remercier pour l’attention particulière que vous avez porté à ce travail. En

acceptant de diriger ce travail vous n’avez ménagé ni votre temps, ni vos ressources pour sa

bonne marche et vos conseils m’ont été très utiles. Votre amour du travail bien fait sont

louables. Veuillez accepter ma reconnaissance.

Au Pr Yves TRAORE, Professeur titulaire, Université de Ouagadougou. Malgré vos

multiples occupations, vous avez accepté de présider ce jury. Cette disponibilité pour la cause

scientifique que nous trouvons auprès de vous exalte notre admiration. Recevez l’expression

de notre profonde gratitude.

Au Dr Serge DIAGBOUGA, Le privilège que vous accordez aux étudiants de vous aborder

sans protocole et votre simplicité nous ont beaucoup marqué. En acceptant dirigé ce faire

travail, vous nous faites un grand honneur et nous vous en sommes extrêmement

reconnaissant.

Au Pr Jacques SIMPORE, Professeur titulaire, Coordonnateur du Master BIOGEMA,

Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin. Malgré vos multiples occupations, vous avez

accepté la direction de ce Master. Cette disponibilité pour la cause scientifique que nous

trouvons auprès de vous exalte notre admiration. Recevez l’expression de notre profonde

gratitude.

A Alexandre SOULIER et Lila POITEAU, merci pour tous ceux que vous m’avez appris

en seulement six mois, malgré vos emplois du temps chargés. Merci du fond de cœur.

Dr Simplice D. KAROU, Cyrille BISSEYE, DJIGMA W. F., D. OUERMI, REBECCA

W. COMPAORE et à la première et deuxième promotion du Master II de BioGeMA. Merci

A l’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine (UEMOA) pour le soutien financier

du master BioGeMa à travers le programme PACER2.

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page iv

RESUME

Introduction :

Les infections aux virus des hépatites B, C et D sont de réels problèmes de santé publique en

Afrique. L'infection persistante aux virus des hépatites B et C est un facteur de risque au

développement de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire (CHC). L’association des

facteurs viraux, tels que la charge virale et les génotypes se sont révélés être liés à la

pathogenèse du carcinome hépatocellulaire et à la réponse aux traitements. Peu d’études se

sont intéressées à l’épidémiologie moléculaire du VHB, VHC et VHD au Togo. L’objectif de

cette étude est de déterminer la prévalence et l’épidémiologie moléculaire des hépatites B, C

et D au Togo.

Méthodes : Cette étude menée à L’ONG ASADH (Association Sauvons l’Afrique Des

Hépatites) en collaboration avec le laboratoire African Institute of Molecular Biology and

Immunology Research (AIMBIR) à Lomé-Togo et L’Institut Mondor de Recherche

Biomédicale « IMRB » en France a concerné 573 sujets. Parmi ces derniers, 520 avaient un

TRD (Test Rapide d’Orientation du Diagnostic) positif pour la détection de l’AgHBs et 53

sujets avaient un TRD positif pour la détection des anticorps anti-VHC. Les techniques de la

sérologie automatisée, la RT-PCR, la PCR ont été utilisés respectivement pour comparer la

performance des TRD et la quantification des acides nucléiques (ARN et ADN) chez les

sujets positifs à la sérologie automatisée. Le séquençage et la phylogénie ont été utilisés pour

la détermination des génotypes.

Résultats : L'étude a montré une concordance des résultats pour la détection de l’AgHBs ou

des anticorps anti-VHC à partir de sang capillaire à l’aide de TRD (respectivement, ABON®

HBV et ABON® HCV) par comparaison à une méthode EIA (référence) à partir de sérum

prélevé au pli du coude. Pour la détection de l’AgHBs, 14 (2,4%) échantillons étaient

discordants : 6 patients étaient AgHBs-négatif en EIA avec un TRD positif et 8 patients

étaient AgHBs-positif en EIA avec un TRD négatif. Parmi les échantillons sérodiscordants, 6

avaient un ADN du VHB détectable : 1 parmi les EIA négatifs TRD positifs (2,0 Log UI/mL)

et 5 parmi les EIA positifs TROD négatifs (1,3 à 6,5 Log UI/mL). En ce qui concerne la

détection des anticorps anti-VHC, 50 (8,7%) échantillons étaient discordants : 7 patients

étaient séronégatifs en EIA avec un TRD positif et 43 patients étaient séropositifs en EIA

avec un TRD négatif. Parmi les échantillons sérodiscordants, 4 avaient un ARN détectable : 2

parmi les EIA négatifs TDR positifs (respectivement 2,5 et 5,1 Log UI/mL) et 2 parmi les

EIA positifs TDR négatifs (respectivement 1,1 et 6,6 Log UI/mL).

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page v

Parmi les 573 patients inclus, 523 (91,3%) étaient AgHBs-positifs (associés à la présence des

anticorps anti-HBc totaux). La majorité des patients (88,3%) avait un ADN du VHB

détectable, seuls un tiers avaient une charge virale supérieure à 2000 UI/mL (i.e ≥3,30 Log

UI/mL). Tous les patients étaient infectés par un génotype E.

Parmi les 523 patients AgHBs-positif, 98 (18,7%) patients avaient des anticorps dirigés contre

le VHD. Environ un tiers des individus séropositifs pour le VHD avait un ARN du VHD

détectable. La charge virale moyenne était de 3,40±1,60 Copies/mL. Le génotype viral a été

déterminé chez 53 des 55 patients ayant un ARN détectable. Tous les sujets sauf 3 étaient

infectés par un génotype 1. Les trois autres patients (5,7%) étaient infectés par un génotype 5.

Parmi les patients avec un ratio compris entre 1 et 8, tous sauf un avaient un ARN

indétectable.

La majorité des patients (83,9%) avait un ARN du VHC détectable avec une charge virale

moyenne de 5,30±1,00Log UI/mL. Une charge virale ≥800 000 UI/mL était observée chez

environ un tiers des patients. Le génotype viral a été déterminé chez 41 des 50 patients avec

un ARN du VHC ≥3 Log UI/mL. Les génotypes 2 et 1 étaient les plus fréquemment isolés et

représentaient respectivement, 73,2% et 17,1%. Le sous-type n’a pu être déterminé chez 20

des souches de génotypes 2, suggérant l’existence de nouveaux sous-types non encore décrits

dans la littérature.

Conclusion : Dans cette étude nous confirmons la prédominance des génotypes E du VHB,

génotype 2 du VHC et du génotype 1 et 5 du VHD au Togo mais mettons aussi en évidence

pour la première fois au Togo à notre connaissance l’existence d’un nouveau sous-type du

génotype 2 du VHC au Togo.

Mots clés : VHB, VHD, VHC, RT-PCR, Génotype, Phylogénie, Population, Togo.

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page vi

ABSTRACT

Introduction: Infections with hepatitis B, C and D are real public health issues in Africa. The

persistent infection with hepatitis Band C is a risk factor for the development of cirrhosis and

hepatocellular carcinoma (HCC). The association of viral factors, such as viral load and

genotypes were found to be linked to the pathogenesis of hepatocellular carcinoma and

response to treatment. Few studies have investigated the molecular epidemiology of HBV,

HCV and HDV in Togo. The objective of this study was to determine the prevalence and

molecular epidemiology of hepatitis B, C and D in Togo.

Methods: This study has happened in NGOs ASADH (Association Of Hepatitis Saving

Africa) with collaboration with Laboratory African Institute of Molecular Biology and

Immunology Research (AIMBIR) in Lome-Togo and the Mondor Institute of Biomedical

Research "IMRB" in France. 573subjects has involved, of these, 520 were positive TRD for

detection of HBsAg and 53 subjects had a positive TRD for the detection of anti-HCV

antibodies. Techniques of automated serology, RT-PCR, the PCR were respectively used to

compare the performance of TRD and quantification of nucleic acids (RNA and DNA) in

positive subjects automated serology. The sequencing and phylogeny were used for the

determination of genotypes.

Results : The study showed a concordance of results for the detection of HBsAg or anti-HCV

antibodies from capillary blood using TRD (respectively ABON® HBV and HCV ABON®)

compared to an EIA method (reference) from serum collected at the elbow crease. For the

detection of HBsAg, 14 (2.4%) were discordant samples: 6 patients were HBsAg-negative in

EIA with a positive TRD and 8 patients were HBsAg-positive in EIA with a negative TRD.

Among discordant samples, 6 had a detectable HBV DNA: 1 within Positive Negative TRD

EIA (log 2.0 IU/mL) and 5 among the EIA positive negative TRD (1.3 to 6.5 log IU/mL). As

regards the detection of anti-HCV antibodies, 50 (8.7%) were discordant samples: 7 patients

were negative in EIA with a positive TRD and 43 patients were positive in EIA with a

negative TRD. Among the discordant samples had detectable RNA 4 2 TDR positive from

negative EIA (respectively 2.5 and 5.1 log IU/mL) and 2 among the EIA positive negative

TDR (respectively 1.1 and 6.6 Log IU/mL). Among the 573 patients enrolled 523 (91.3%)

were HBsAg-positive (associated with the presence of total anti-HBc). The majority of

patients (88.3%) had a detectable HBV DNA, only a third had a viral load greater than 2000

IU/ml (ie ≥3,30 Log IU/mL). All patients were infected with a genotype E.

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page vii

Among the 523 HBsAg-positive patients, 98 (18.7%) patients had antibodies against HDV.

About a third of seropositive individuals HDV had a detectable HDV RNA. The average viral

load was 3,40 ±1,60 log copies/ml. The viral genotype was determined in 53 patients of 55

patients with detectable RNA. All subjects except 3 were infected with genotype 1. The other

three patients (5.7%) were infected with genotype 5. Among patients with a ratio of between1

and 8, all but one had undetectable RNA. The majority of patients(83.9%) had detectable

HCV RNA with a mean viral load of 3,40±1,60 logIU/ml. A viral load ≥800000IU/ml was

observed in approximately one third of patients. The viral genotype was determined in 41

patients of 50 patients with an HCV RNA≥3 LogIU/ml. Genotypes 2 and 1 were the most

frequently isolated and represented respectively 73.2% and 17.1%. The subtype could not be

determined in 20 genotypes 2 strains, suggesting the existence of new subtypes not yet

described in the literature.

Conclusion: In this study we confirm the prevalence of HBV genotypes E, HCV genotype 2

and genotype 1 and 5 of VHD in Togo but also high light for the first time in Togo to our

knowledge the existence of a new subtype genotype 2 HCV in Togo.

Key words: HBV, HDV, HCV, RT-PCR, Genotyping, Phylogenic, Population, Togo.

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page viii

Table des matières

PREFACE DU COORDONNATEUR DU MASTER BIOGEMA ............................................ i

DEDICACE ................................................................................................................................ ii

REMERCIEMENTS ................................................................................................................. iii

RESUME ................................................................................................................................... iv

TABLE DES MATIERES ......................................................................................................... v

SOMMAIRE ............................................................................................................................. vi

LISTE DES FIGURES………………………………………………………………….……vii

LISTE DES TABLEAUX……….………………………………………………………..…viii

LISTE DES ABREVIATIONS….………………………………………………………..…xiv

INTRODUCTION………………...………….………………………………………………xv

1.REVUE BIBLIOGRAPHIQUE……… ..……………………………………….…………...4

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE……...… ..……………………………………….…………...4

1.1VIRUS DE L’HEPATITE B…..………………………………………………..…………..4

1.1.1 Le virus……………………………….…………………………….……………………4

1.1.2 Structure et organisation génétique du virus….……………………..…………………...4

1.1.3 Protéines virales…………………………………………………..……………………...5

1.1.3.1 Polymérase…………………………….………………………..……………………...5

1.1.3.2 AgHBc et AgHBe.…….…………………......……………...…..…………….……….5

1.1.3.3 Protéines de surface.……………………………...………...…………….……………6

1.1.3.4 Protéines de l'AgHBx…….……………………………………...……….……………6

1.1.4 Cycle viral..…………………………………………………….………………..……….6

1.1.5 Variabilité génétique..…………………………………………………….....…………...7

1.1.5.1 Génotypes.……………………………………………………………….…...………...7

1.1.5.2 Distribution en quasi espèces…………………………………………………………..9

1.1.6 Epidémiologie...…………………………...……………………………….……….......10

1.1.7 Différents mode de transmission……………………………………………..………....11

1.1.8 Diagnostic……………...……………………………………………………………….12

1.1.8.1 Marqueurs virologiques de l'hépatite B……………………………………………....12

1.1.8.2Utilisation pratique des TRD pour le dépistage, le diagnostic des hépatites virales

B…………………………………………………………………………………………...….13

1.1.9 Traitement et Prévention……………………..…………..…………...…………….….14

1.2 VIRUS DE L’HEPATITE D…..…….…………………………………………………....14

1.2.1 Le Virus….…………………………………….……………………………..………....14

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page ix

1.2.2 Structure du virus et organisation génétique…………………………………………....15

1.2.3 Antigène delta…………………………………………………………………..…...….15

1.2.4 Cycle viral du VHD..……………………………………………………………...……16

1.2.5 Epidémiologie.……………………………………………………………………….....16

1.2.6 Variabilité génétique....………………………………………………....…………...….17

1.2.7 Diagnostic ………………………………………………...…………..……………..…17

1.2.7.1 Diagnostic de l’hépatite D aiguë……………….……………………………………..17

1.2.7.2 Co-infection VHB-VHD……………………………..……………………………….17

1.2.7.3 Surinfection VHB-VHD…………………………………..………………………….18

1.2.7.4 Diagnostic de l’hépatite chronique D………………………..……………………….18

1.2.8 Traitement….……………………………………………..…………………………….18

1.3 VIRUS DE L’HEPATITE C….……………………………………….………..…...……19

1.3.1 Le virus…………………………………………………………….……………….…..19

1.3.2 Structure et organisation génétique…….………………………….….………………...19

1.3.3 Organisation génome et protéines structurales .………………….…………………….19

1.3.4 Cycle viral…………………………………….…………...……….……...……………20

1.3.5 Variabilité génétique…………………………….……………….……………………..21

1.3.5.1 Génotypes et sous-type du VHC………………………………….………………..…22

1.3.5.2 Distribution en quasi-espèce du VHC………….…………………...…………….…..23

1.3.6 Epidémiologie…………………………………….…………………………..………...23

1.3.7 Modes de transmission………………………………………..…..…….………………24

1.3.8 Diagnostic……………………………………………………..……..…………………24

1.3.8.1 Diagnostic sérologique…………………………………………….………..………...24

1.3.8.2 Test de détection et de quantification de l'ARN……………….…….……….………25

1.3.8.3 Détermination du génotype du VHC……………………………….………………...25

1.3.8.4 Détection et quantification de l’antigène de capside……………….…….……….….26

1.3.8.5 Détermination du profil de résistance génotypique………………….………….……26

1.3.9 Traitement…………………………………………………………...….………..……..27

1.3.10 Prévention………………………………………………………………...….………..27

2. OBJECTIF DU MEMOIRE……………………………………………….……….………27

3. MATERIELS ET METHODES……………………………………………………………29

3.1 Cadre d’étude…………………………………………………………………....………..31

3.2 Type et période d’étude…………………………………………..…….…………………31

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page x

3.3 Matériels et réactifs de Laboratoire………………………………………...….…………31

3.4 Méthodes d’études……………………………………………………….……………….31

3.4.1 Population étude…………………….……………………………..……….…………...31

3.4.2 Critère d'inclusion………………………….………………………….………………..32

3.4.3 Critère d'exclusion………………………………………………………..……………..32

3.4.4 Paramètre d'études et recueil des données…………………………………………..….32

3.5 Méthodes virologiques…..……………………………………………………...………...32

3.5.1 Marqueurs sérologiques du VHB, VHD et VHC……………………...….…………….32

3.5.2 Principe des Tests Rapide d'Orientation de Diagnostic (TROD) ABON.………….…..33

3.5.3 Principe des tests qualitatifs sur VITROS Immunodiagnosticpour la quantification de

l'AgHBs et de l'antigène de capside du VHC…………………….………….…………….….34

3.5.4 Principe de la sérologie sur ARCHITECT i* System……………………..……………35

3.5.5 Principe de méthode ELISA pour la détection des anticorps anti-VHD.………….……35

3.6 Marqueurs Moléculaire du VHB, VHD et du VHC………………………………………36

3.6.1 Technique de quantification des acides nucléiques………………………………….…36

3.6.2 Principe de la technique de détection-quantification de l’ADN du VHB à l’aide de la

plate-forme de PCR en temps réel CAP/CTM (Roche)………………………...………….…36

3.6.3 Principe de la détection-quantification de l’ARN du VHC à l’aide de la plate-forme de

PCR en temps réel m2000 (Abbott)…………………..……………………...……………….37

3.6.4 Principe de la détection-quantification de l’ARN du VHD à l’aide de la plate-forme de

PCR en temps réel m2000 (Abbott)………………………………………..………………....37

3.7 Détermination des génotypes viraux…………………………….………………………..38

3.7.1 Principes………………………………………………………………………………...38

3.7.2 Principe de l’extraction des acides nucléiques……......…………………………..…….38

3.7.3 Principe de la RT-PCR one step.…..………………...………………..…………..……39

3.7.4 Principe de la PCR nichée…..………………………...………………………..…….…39

3.8 Visualisation des produits d’amplification…………..………………………….………..39

3.9 Purification des acides nucléiques……..………………………………...……….………39

3.10 Principe du séquençage par la méthode de SANGER…..………………………………39

3.11 Analyse des séquences nucléotidiques...………………………………………………...40

3.12 Détermination des génotypes du VHB………...………….………………….………….40

3.13 Détermination des génotypes du VHD….…………..……..……………………………40

3.14 Détermination des génotypes du VHC……….………….…..………………………….41

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page xi

4. RESULTATS………………………………………………………………………………43

4.1 Caractéristiques démographiques de la population……………………………………….43

4.2 Performances des tests rapides d’orientation diagnostique (TROD)……………………..44

4.3 Hépatite B…………………………………………………………………………...……45

4.4 Hépatite D...……………………………………………………………………………....46

4.5 Hépatite C…………………………………………………………………...……………46

4.6 Coïnfections……………………………………….………………..………...…………..48

5. DISCUSSION ……………………………………………………………………………..51

6. CONCLUSION ET PERSPECTIVE………………………………………………………54

7. REFERENCE …………………………………………………………………...…………56

8. ANNEXES……………………………………………………………………………..…..62

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page xii

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Représentation schématique du génome du VHB……..……………...……………..5

Figure 2: Cycle cellulaire du VHB……………………………..……………..……………….7

Figure 3 : Arbre phylogénique du VHB montrant les principaux génotypes du VHB notés de

A à H…………………………………………………………………………………………...9

Figure 4 : Prévalence de l’infection de VHB dans le monde……..……………..……………10

Figure 5 : Les domaines fonctionnels de S-HDAg et L-HDAg……..………….…………….16

Figure 6 : L'hépatite D virus cycle de vie dans les hépatocytes en présence du virus de

l'hépatite B……………………………...………………………………….………………….17

Figure 7 : Organisation du génome du virus de l'hépatite C…………..….…………………..20

Figure 8 : Cycle de multiplication du VHC……………………………..……….…………..22

Figure 9 : Epidémiologie du VHC…….…………………………………...…………………24

Figure 10 : Exemple du test ABON® HCV………………………………..…….…………..34

Figure 11 : Analyse phylogénique du gène codant la polymérase de 167 souches du VHB

isolées des patients Togolais avec des souches de référence des différents génotypes du VHB

disponibles dans les banques………………………………………………………………………………………………47

Figure 12 : Analyse phylogénique des séquences nucléotidiques de la région R0 du VHD

isolés dans la population Togolaise par comparaison à des séquences de référence disponibles

dans les banques………………………………………………………………………………52

Figure 13 : Titre de l’antigène de capside du VHC (AgC, Log fmol/L) en fonction de

génotypes……………………………..………………………………………………………48

Figure 14 : Analyse phylogénique d’une portion du gène NS5B codant l’ARN polymérase

ARN dépendante de 30 souches par comparaison avec des souches de génotype 2 des

différentes sous types disponibles dans les banques…………………………………………………………………49

Figure 15 : Corrélation des titres de l’AgHBs mesurés par la plate-forme Architect (Abbott)

avec les valeurs mesurées sur les mêmes échantillons avec la plate-forme de PCR en temps

réel CAP/CTM96 (Roche) chez 462 patients………………………………………………...49

Figure 16 : Corrélation des valeurs d’antigène de capside du VHC (AgC) mesurées par la

plate-forme Architect (Abbott) avec les valeurs mesurées sur les mêmes échantillons avec la

plate-forme de PCR en temps réel m2000 (Abbott) chez 49 patients………………………...49

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page xiii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Fonction des différentes protéines structurales (C, E1, E2) et non structurales (p7,

NS2, NS3-4A, NS4B, NS5A, NS5B)…………...…………………………………………....20

Tableau II: Caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude………..……....43

Tableau III : Performance du test rapide ABON® HBV pour la détection de l’AgHBs par

comparaison à la méthode EIA (référence)……………………………………………..…....44

Tableau IV : Performance du test rapide ABON® HCV pour la détection des anticorps anti-

VHC par comparaison à la méthode EIA (référence)………………………………………...45

Tableau V : Caractéristiques virologiques des patients AgHBs-positif…………………...….45

Tableau VI : Caractéristiques virologiques des patients séropositifs pour le VHD………..…46

Tableau VII : Caractéristiques virologiques des patients séropositifs pour le VHC…….…...47

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page xiv

LISTE DES ABREVIATIONS

aa : Acide aminé

Ac: Anticorps

Anti-HBs : Anticorps dirigé contre la protéine de la surface

Anti-HBc : Anticorps dirigé contre la protéine du core

ALT : Alanine amino-transférase

AgHBs: Antigène de Surface

ADN: Acide désoxyribonucléique

ADNc: complémentaire

ADNccc: covalently closed circular

ADN-RC : relâché circulaire

Ag: Antigène

ARN: Acide ribonucléique

ARNm : Acide ribonucléique messager

CHC : Carcinome Hépatocellulaire

DHBV : Duck Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B du canard)

ELISA: Enzyme linke dimmunosorbent assay

IgG: Immunoglobuline G

IgM: Immunoglobuline M

Kda: Kilodalton

MEIA : Micro particle Enzymo-Immuno-Assay

ONG ASADH : Organisation Non Gouvernementale Association Sauvons l’Afrique Des

Hépatites

PCR: Polymerase chain reaction

VHB : Virus de l’Hépatite B

VHC : Virus de l’Hépatite C

VHD : Virus de l’hépatite D

γ-GT : Gamma glutamyl-transférase

RIA : Radio Immunology Assay

RT-PCR : Reverse transcription polymérase chaine réaction

CNR : Centre national de référence

TDR: Test d'Orientation de Diagnostic

YMDD: Tyrosine-Methionine-Aspartate-Aspartate

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page xv

INTRODUCTION

Master II BioGeMA 2013-2014 Folly ANYOVI Page 1

INTRODUCTION

Les hépatites virales infectent plusieurs centaines de millions d’individus à travers le monde

et constituent un problème majeur de santé publique (Escobedo-Melendez et al., 2014). Les

hépatites virales sont une cause importante de morbi-mortalité à travers les infections aiguës

mais surtout les infections chroniques. Les infections chroniques sont une cause de cirrhose et

de carcinome hépatocellulaire, entrainant chaque année plus d’un million de décès (Parkin et

al., 2006). Il existe aujourd’hui cinq virus qui peuvent être responsables d’hépatites virales,

dont la propriété commune est d’infecter les hépatocytes : virus de l’hépatite A (VHA), virus

de l’hépatite B (VHB), virus de l’hépatite C (VHC), virus de l’hépatite D (VHD) et virus de

l’hépatite E (VHE).

Selon les données de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), le Togo fait partie des

zones de fortes endémicités avec des séroprévalence de 2% pour le VHC et entre 8% et 20%

pour le VHB (OMS, 2010). Très peu d’études ont été consacrées aux hépatites virales au

Togo (Agbenu et al., 2008). Lorsqu’elles existent, ces études concernent des groupes

d’individus spécifiques et sont basées uniquement sur le sérodiagnostic. Chez les donneurs

de sang par exemple, la prévalence de l’AgHBs est de 3,90% et celle des anticorps anti-VHC

est de 2,30% (Rapport CNTS, 2010) ; aucune étude d’épidémiologie moléculaire n’est

disponible. C’est la raison pour laquelle l’objectif principal de ce travail était d’évaluer la

distribution des génotypes des hépatites B, C et delta au Togo au sein de la population

générale.


REVUE

BIBLIOGRAPHIE


1. REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

1.1 VIRUS DE L’HEPATITE B

1.1.1 Le Virus

L’antigène Australia dénommé également l’antigène de surface (AgHBs) a été découvert dans

les années 60 par Baruch S. Blumberg. La caractérisation et le clonage du génome ont permis

l’identification du virus de l’hépatite B (VHB) comme un prototype de la famille des

hepadnaviridae (Howard et al., 2014). Le VHB est le plus petit virus à ADN capable

d’infecter l’homme. C’est un virus enveloppé, avec un génome d’environ 3200 paire de bases.

Le génome est composé d'ADN circulaire partiellement double brin, qui est formé de quatre

phases ouvertes de lecture (ORF) partiellement chevauchantes : les phases préS/S, préC/C, P

et le gêne X qui code respectivement les protéines de surface, la protéine de capside et la

protéine HBe, l’ADN polymérase virale et la protéine X (Chevaliez et Pawlotsky, 2008).

1.1.2 Structure et organisation génétique du virus

La particule infectieuse mature d’un diamètre d’environ 40 nm connue sous le nom de

particule de Dane, a une structure isocaédrique formée par l’antigène de capside (AgHBc).

L’enveloppe est le lieu d’ancrage des glycoprotéines de surface qui se présentent sous trois

formes (Figure 1): L pour large, M pour medium et S pour small qui partagent un domaine C-

terminal commun, l’antigène de surface du VHB (AgHBs). Ce polypeptide, de 24 kDa est

intimement lié à un lipide ayant quatre ou cinq hélices transmembranaires qui se trouve sous

deux formes, glycosylées et non glycosylées (Gilbert et al.,2005). Le génome du VHB a

structurellement évolué en une organisation génétique compacte minimale avec un ADN

circulaire partiellement double brin composé d'un brin (-) complet et un brin (+) incomplet,

maintenus dans la configuration circulaire par leurs régions d'extrémités cohésives contenant

deux séquences de 11 nucléotides répétées (DR1 et DR2). Les DR sont essentiels à la

réplication virale. L’autre caractéristique est la présence de la polymérase virale, liée de façon

covalente à l’extrémité 5’ du brin de polarité négative. On note également la présence d’une

redondance “r“ de 9 nucléotides qui permet de former un triplex avec une séquence courte

d’ARN de 17 nucléotides (Howard et al., 2014).


Figure 1: Représentation schématique du génome du VHB (Deny et Zoulim, 2010).

1.1.3 Protéines virales

1.1.3.1 Polymérase (Pol)

Le gène P est le plus grand gène du VHB, il chevauche entièrement l’ORF S mais aussi une

partie des ORFs C et X. Ce chevauchement est très important car une simple modification

nucléotidique dans cette région pourra avoir un impact sur un ou deux gènes. La polymérase

virale est une protéine d'environ 850 acides aminés (aa) qui possède les activités suivantes:

polymérase ARN-dépendante (reverse transcriptase), polymérase ADN-dépendante

(réplication) et RNase H (Radziwill et al., 1990). La polymérase est la principale cible des

antiviraux directs que sont les analogues nucléos(t)idiques (tenofovir et entecavir). Le motif

YMDD est le site catalytique de la polymérase. L'ORF P contient quatre domaines distincts :

la protéine terminale, l’espaceur, la transcriptase inverse et le domaine RNAse H (Howard et

al., 2014).

1.1.3.2 AgHBc et AgHBe

Le gène C code 2 protéines : la protéine de capside (ou AgHBc) et la protéine précore,

précurseur de l’antigène sécrété HBe. L’antigène de capside est la protéine structurale de la

capside. Cette phosphoprotéine possède une extrémité C-terminale basique riche en résidus

arginine permettant sa liaison à l’ADN viral. De plus, l’initiation de la traduction en 5’ de la


séquence préC située en amont du gène C aboutit à la synthèse d’une protéine précore. La

présence de cette séquence supplémentaire en position N-terminale de la protéine HBc,

correspondant à un peptide signal, permettant l’adressage de la protéine vers le réticulum

endoplasmique (RE). Le clivage co-traductionnel du peptide signal libère la protéine précore

dans le RE. Cette protéine subit ensuite un processus de maturation dans le Golgi, ce qui va

donner naissance à l’antigène HBe, qui est sécrété (Locarnini, 2004).

1.1.3.3 Protéines d’enveloppe

La région S code les 3 protéines d’enveloppe du VHB : L, M et S. Ces protéines ont la même

extrémité C-terminale, mais diffèrent par leur extrémité amino-terminale. La protéine S est le

produit de la traduction du gène S, la protéine M, celui de la traduction du gène S et de la

région pré-S2 et la protéine L, celui de la traduction des régions préS1, préS2 et du gène S.

1.1.3.4 Protéine HBx

La région X code la protéine HBx. IL s’agit d’une protéine de 17kDa qui possède de

multiples fonctions dont des propriétés transactivatrices (i.e module l’expression de nombreux

gènes). A ce jour, le rôle de la protéine HBx dans le cycle viral n’est pas encore élucidé. Il a

été montré in vivo dans le modèle de la marmotte qu’HBx est essentielle pour l’infection

virale et la réplication (Zoulim et al., 1994).

1.1.4 Cycle viral du VHB

Le cycle cellulaire du VHB est complexe. L’une des particularités du cycle du VHB est une

étape de transcription inverse au cours de la phase de réplication (Figure 2) à partir de l’ARN

prégénomique (ARNpg) encapsidé par la transcriptase inverse (activité ADN polymérase

dépendante de l’ARN) (Beck et Nassal, 2007). L’infection par le VHB débute par

l’interaction de la particule virale par l’intermédiaire de la région PreS1 localisée au niveau de

la protéine L avec le récepteur exprimé à la surface des hépatocytes, le transporteur d’acides

biliaires NTCP (Na+-taurocholate cotransporting polypeptide) (YAN et al., 2014). Il s’ensuit

une pénétration de la nucléocapside dans le cytoplasme. Cette dernière rejoint le noyau

cellulaire via les microtubules grâce à des séquences de localisation nucléaire (NLS pour

nuclear localization sequence) présentes en C-terminal de la protéine de capside.


Cet ADN partiellement bicentenaire devient complètement bicaténaire avec complétion du

brin de polarité positive. L’ADN proviral super enroulé ou cccDNA (covalently closed

circular DNA) est la forme épisomale de persistance du VHB dans les cellules. Il sert de

matrice pour la synthèse de l’ARN prégénomique, intermédiaire indispensable de la

réplication du génome viral. Il sert également de matrice pour la synthèse des différents

ARNm viraux. Après encapsidation de l’ARN prégénomique, la première étape de la

réplication est sa transcription inverse par la transcriptase inverse (activité ADN polymérase

dépendante de l’ARN) qui permet la synthèse du brin d’ADN génomique de polarité négative.

L’ARN prégénomique est ensuite dégradé par l’activité RNAse H de l’ADN polymérase

virale. L’activité ADN polymérase ADN-dépendante synthétise le brin génomique

complémentaire, de polarité positive. Enfin le mécanisme d’acquisition de l’enveloppe est

original puisque cette étape se déroule au niveau du réticulum endoplasmique et/ou du

compartiment pré-golgien. Les virions sortent de la cellule par exocytose.

Figure 2: Cycle de multiplication du VHB (Gerlich et al., 2013)

1.1.5 La variabilité génétique

L’origine du VHB n’est pas connue mais le virus est probablement très ancien. L’arbre

phylogénique du VHB comprend des virus apparentés dont les hôtes sont aviaires et

mammifères.


1.1.5.1 Les Génotypes

Initialement classées en sérotypes selon les propriétés antigéniques de l’AgHBs, les souches

de VHB sont désormais classées en génotypes, voire en sous-génotypes. Les souches de VHB

se répartissent en 8 génotypes majeurs (A à H) (Figure 3), qui se distinguent les uns des autres

par une différence de séquence nucléotidique d’au moins 8% sur la totalité du génome.

Néanmoins, 2 nouveaux génotypes, I et J, ont été récemment identifiés. Au sein de certains

génotypes (A, D et F), il exits des sous-génotypes qui se distinguent par l’existence de 4% à

8% de différence nucléotidique. A ce jour, une trentaine de sous-génotypes ont été identifiés.

Les propriétés biologiques des différents génotypes pourraient influencer la progression de la

maladie hépatique vers la cirrhose et le CHC, et la réponse virologique au traitement par

l’interféron alpha (Zhou et al., 2012). Une cartographie de la distribution mondiale des

génotypes montre que les génotypes A, D et E sont largement distribués, tandis que les autres

génotypes sont généralement confinés à certaines régions. Le génotype A représente le

génotype le plus fréquemment isolé en Afrique Subsaharienne, Europe du Nord, Amérique du

Nord et en Afrique de l’Ouest. Les génotypes B et C sont majoritairement présents en Asie.

Le génotype D est dominant en Afrique, Europe et en Inde. Le génotype E est fréquemment

isolé en Afrique et en Europe du Nord. Le génotype G est présent en France, Allemagne et

aux Etats Unis. Le génotype H est commun en Amérique Centrale et du Sud. L’utilité de la

détermination du génotype viral avant la mise sous traitement est actuellement discutée. En

effet, la valeur prédictive individuelle du génotype sur la réponse au traitement est faible du

fait, entre autres, d’une relation très étroite entre les génotypes, l’ethnie et la zone

géographique de diffusion, qui sont des facteurs confondants (Raimondi et al., 2010 ; Buster

et al., 2011).


Figure 3 : Arbre phylogénique du VHB montrant les principaux génotypes du VHB notés de

A à H. Les valeurs au niveau des nœuds représentent les valeurs de re-échantillonages (Anna

et al., 2005).

1.1.5.2 Distribution en quasi-espèces

La variabilité du VHB a été initialement mise en évidence selon les propriétés antigéniques de

l'AgHBs. Dix sérotypes ont été définis: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4q-,

adw4q+, adrq+ et adrq-. La base moléculaire des sérotypes et des sous-sérotypes dépend

largement mais non-seulement des résidus Lys/Arg aux positions 122 et 160 qui forment des

couples de déterminants antigéniques "d/y", "r/w" mutuellement exclusifs. Le résidu à la

position 127 est important pour définir le statut w1 à w4, les souches w1/w2, w3 et w4 codent

respectivement les aa Pro, Thr et Leu. Le statut w1 dépend en plus des résidus Arg 122, Phe

134 et/ ou Ala 159. Quant au déterminant ‘q’ il est exprimé chez la quasi-totalité des souches

VHB excepté chez les souches adw4 et quelques souches de sérotypes adr. Les résidus

importants pour l’identification du déterminant ‘q’ sont aux positions 177 et 178 (Norder et

al. 2004).


1.1.6 Epidémiologie

L’infection par le VHB est largement répandue dans le monde. On estime à plus de 240

millions le nombre de porteurs chroniques inégalement répartis à la surface du globe (Ott et

al., 2012). On distingue trois niveaux d’endémicité :

Région de faible endémicité avec une prévalence <2% de portage l’AgHBs : il s’agit

du pourtour méditerranéen Ouest, Europe Occidentale et Nord, Amérique du Nord et

l’Océanie.

Régions de moyenne endémicité avec une prévalence de l’AgHBs comprise entre 2%

et 7% : il s’agit du pourtour méditerranéen Est, Europe de l’Est et Amérique latine,

Régions de forte endémicité avec une prévalence de l’AgHBs ≥8% : il s’agit de

l’Afrique, Chine, Asie du Sud-Est (Lesmana et al., 2006)

Figure 4 : Prévalence de l’infection VHB dans le monde (Gerlich et al., 2013).

1.1.7 Les différents modes de transmission

Les particules virales sont produites en grande quantité par les hépatocytes et circulent à des

fortes concentrations chez les individus infectés. Il existe 4 principaux modes de transmission

de l’infection VHB. La principale cause de transmission VHB dans les régions de forte

endémicité est la transmission de la mère à l’enfant. Le VHB est rarement transmis in utéro,

mais la transmission à lieu à la naissance ou dans les jours semaines qui suivent du fait d’un

contact avec les sécrétions ou le sang maternel.


L’infection à la naissance est associée à une forte probabilité d’évolution vers une infection

chronique (>90%). Dans les régions de faible endémicité, le principal mode de transmission

de l’infection est sexuel. Le risque d’infection est plus élevé chez certaines populations à

risque telles que les sujets ayant des partenaires multiples, les hommes ayant des relations

sexuelles avec des hommes et les individus ayant des antécédents d’infections sexuellement

transmissibles. Le troisième mode de transmission est une transmission percutanée à partir de

produits sanguins, de matériels médicaux ou chirurgicaux souillés ou d’injection de drogues.

Bien que le dépistage systématique de l’AgHBs (voire de l’ADN du VHB) dans les produits

sanguins ait considérablement réduit le risque de transmission, ce risque est encore présent

dans les pays en développement. La transmission horizontale, c’est-à-dire à travers des

contacts non sexuels entre les individus est fréquent en particulier chez les enfants en Afrique

et est associé à un risque d’évolution vers une infection chronique de 15% (Lesmana et al.,

2006).

1.1.8 Diagnostic

1.1.8.1 Les marqueurs virologiques de l’hépatite B

Détection de l'AgHBs

L'AgHBs est le principal marqueur diagnostique de l'infection par le VHB. La sensibilité des

trousses de détection de l'AgHBs a été considérablement améliorée, puisqu'elle est aujourd'hui

au moins égale à 0,13 8/ml d'AgHBs circulant. Cette amélioration a permis une réduction de

la « fenêtre sérologique », période de l'infection aiguë au cours de laquelle l'AgHBs n'est pas

encore détectable, de neuf jours en moyenne par rapport aux précédentes générations de tests.

Par ailleurs, la capacité des troussesà détecter les mutants de l'AgHBs portant des

substitutions aminoacidiques pouvant modifier les propriétés antigéniques de l'AgHBs, a été

améliorée par rapport aux précédentes générations de tests, La spécificité des trousses de

dernière génération est supérieureà 99,5 %. Les résultats faussement positifs sont donc

exceptionnels, peuvent être observés chez des femmes enceintes ou des patients atteints de

maladies auto-immunes ou d'hépatopathies chroniques d'autres causes. Des résultats

faussement négatifs peuvent également être observés lorsque les échantillons sanguins,

recueillis sur héparine, sont hémolysés (hémoglobine>1,4 g/dl) ou fortement ictériques

(bilirubine 500mol/l).


Neutralisation de l'Ag+Bs

Le test de neutralisation est une méthode robuste et indispensable de confirmation de la

présence de l'AgHBs. Le principe est de saturer les déterminants antigéniques de l'AgHBs de

l'échantillon par les anticorps anti-HBs en excès du réactif. L'AgHBs ne pourra donc plus se

lier à l'anticorps immobilise sur une phase solide. Une diminution d'au moins 50 % du signal

est habituellement considérée comme étant nécessaire pour confirmer la présence de l'AgHBs,

La neutralisation peut être problématique pour les sérums dont le titre d'AgHBs est faible. Le

test est alors considéré comme non valide. Le test de neutralisation n'est pas obligatoire sur

un plan légal, mais il est fortement recommandé.

Quantification des antigènes et des anticorps de l'AgHBs

La quantification de l'AgHBs est aujourd'hui possible à l'aide de trousses commerciales

standardisées. Trois trousses sont disponibles en France : (a) HBsAg assay sur l'automate

Architect (Abbott), (b) HBsAg II Quant assay sur l'automate Elecsys ou Cobas (Roche), (c)

Liaison XL HBsAg Quant assay sur l'automate Liaison XL (Diasorin). Le niveau d'AgHBs

semble corrélé au contenu intra hépatique en ADNccc (covalently closed circular DNA, forme

épisomale de persistance du VHB dans les cellules) transcriptionnellement actif dans le foie.

Le niveau d'AgHBs est donc considéré comme un marqueur indirect du réservoir de cellules

infectées par le VHB. De nombreuses études ont suggéré un intérêt de la quantification de

l'AgHBs dans l'évaluation de la réponse au traitement des hépatites chroniques B et dans

l'identification des porteurs inactifs en association a d'autres paramètres tels que la mesure de

la charge virale et de l'activité sérique des transaminases.

Détection de l'Ag+Be et des anticorps anti-HBe

La protéine HBe, qui porte le déterminant antigénique HBe, est un produit du gène pré-C/C

(dont le gène C code la protéine de capside du VHB portant le déterminant antigénique HBc).

Elle est excrétée dans le sang périphérique. Son rôle dans la physio- pathologie de l'infection

n'est pas clairement défini. Elle pourrait favoriser la tolérance immunitaire et serait

indispensable au passage à la chronicité. La présence d'AgHBe dans le sang indique une

réplication active du VHB, associée à une infectiosite élevée du sang. L'AgHBe est détecté

précocement au cours de l'infection aiguë, entre 6 et 12 semaines après la contamination, Au

cours de l'évolution de l'hépatite B, l'AgHBe peut disparaitre et cela est suivi de l'apparition

d'anticorps anti-HBe. La disparition de l'AgHBe s'associe à une diminution importante du


niveau sérique d'AD1 du VHB, La persistance de l'AgHBe dans le sérum, trois à quatre mois

après la contamination, indique généralement une évolution vers une infection chronique.

Deux types d'hépatites chroniques B peuvent être observés : les hépatites chroniques à

AgHBe positif et les hépatites chroniques à AgHBe négatif, L'infection chronique à AgHBe

négatif est aujourd'hui majoritaire en France : elle touche près de 90 % des patients pris en

charge pour une hépatite B dans les pôles de référence et réseaux « hépatites ». L'absence de

production de la protéine HBe résulte de la présence de substitutions nucléotidiques dans la

région pécore du gène pré-C/C et/ou dans la région promotrice du core. Les mécanismes qui

conduisent, après séroconversion HBe spontanée, certains patients vers une résolution de

l'hépatite ou un portage chronique inactif et d'autres vers une hépatite chronique active à

AgHBe négatif, ne sont pas connus.

Quantification de l'AgHBe

Des études récentes ont suggère un intérêt de la quantification de l'AgHBe dans le suivi de la

réponse aux traitements antiviraux, en tant que facteur prédictif de la séroconversion HBe,

titre pre-therapeutique de l'AgHBe inferieur a 360 U PEI/ml (Paul Ehrlich Institute Units) et

une diminution précoce de l'AgHBe sont des facteurs prédictifs de séroconversion HBe chez

des patients naïfs de traitement traites par entecavir. Des résultats identiques ont été observés

chez des patients traités par interferon α pégylé. L'utilisation de ce marqueur en pratique

clinique est limitée par l'absence de trousses commerciales standardisées et par l'expression

des résultats en unités PEI (Rapport Dhumeaux, 2014).

1.1.8.2 Utilisation pratique des tests standards pour le dépistage, le

diagnostic des hépatites virales B

De nombreux TROD ont été développés pour la détection des marqueurs du VHB tels que

l’AgHBs, les anticorps anti-HBc et les anticorps anti-HBs. La plupart utilisent des matrices

biologiques telles que le sérum, le plasma ou le sang total prélevé au pli du coude. A ce jour,

trois TROD disposent d’un marquage CE pour la détection de l’AgHBs : les tests VIKIA®

HBsAg test (Biomérieux), DRW-HBsAg v2.0 assay (Diagnostics for the Real WorldTM et

TOYO HBsAg test (Turklab). Deux de ces trois dispositifs acceptent le sérum, le plasma et le

sang total comme matrices biologiques. Le TROD DRW-HBsAg n’est pas validé pour le sang

total.Les performances analytiques de ces tests varient selon la matrice biologique.


Deux études récentes ont montré que le test VIKIA® avait des valeurs prédictives positive et

négative très satisfaisantes (97,6% et 99,9%) à partir de sang total veineux prélevé au pli du

coude (Bottero et al, J Hepatol. 2013), tandis le test DRW-HBsAg v2.0 réalisé à partir de

sérum ou plasma pouvait être utilisé avec confiance pour la détection de l’AgHBs dans les

populations de forte ou de faible endémicité pour le VHB (spécificité : 97,8% à 98,8% ;

sensibilité 95,2% à 100%) (Chevaliez et al., 2014).

1.1.9 Traitement et prévention

L’objectif principal du traitement de l’hépatite chronique B est l’amélioration de la qualité de

vie et de la survie en empêchant la progression de la maladie vers la cirrhose, la cirrhose

décompensée, l’insuffisance hépatique terminale, l’hépatocarcinome et le décès (EASL,

2012). Ceci peut être atteint si la réplication du VHB est drastiquement inhibée de façon

soutenue. La conséquence est une diminution de l’activité histologique avec régression de la

fibrose et une diminution du risque de CHC en particulier chez les patients non cirrhotiques.

L’églibilité au traitement repose sur l’association de 3 critères que sont un ADN du VHB

>2000 UI/mL, une augmentation de l’activité de l’ALAT (alanine aminotransférase) et une

sévérité de l’atteinte hépatique (≥A2F2). Deux stratégies de traitements sont désormais

disponibles pour les patients et ce quel que soit leur statut HBe : traitement par interféron

pégylé pendant une durée fixe ou un traitement au long cours par analogues.

Le développement d’inhibiteurs sélectifs et puissants de la transcriptase inverse de l’ADN

polymérase du VHB a représenté une avancée majeure dans le traitement de l’hépatite

chronique B. Ces molécules sont des analogues de nucléosides ou de nucléotides. Elles ont

l’avantage d’être administrées par voie orale et sont généralement bien tolérées. Les

molécules de première intention sont le tenofovir et l’entecavir. La principale limitation de

l’utilisation à long terme des analogues est la survenue possible d’une résistance. Cette

résistance est responsable d’échappements virologiques et cliniques qui caractérisent l’échec

thérapeutique et s’associent à une reprise de la progression de la maladie hépatique.

L’hépatite B est une infection à prévention vaccinale. L’OMS a recommandé la mise en place

de programmes de vaccination généralisée contre l’hépatite B avant 1995 dans les pays de

fore endémie et avant 1997 dans les pays de faible endémie.


1.2 VIRUS DE L’HEPATITE D

1.2.1 Le Virus

Le virus de l’hépatite delta ou VHD est un agent infectieux satellite du VHB, qui se transmet

exclusivement dans le contexte d’une infection par le VHB : le VHD peut être ainsi transmis

seulement chez les individus qui ont simultanément ou antérieurement acquis le VHB. La

transmission peut survenir au cours d’une infection simultanée avec le VHB ou d’une

surinfection par le VHD chez un sujet porteur chronique de l’AgHBs. En raison de ses

caractéristiques qui le distinguent de tous les virus du règne animal, le comité international de

taxonomie virale a proposé de classer le VHD dans le genre des Deltavirus.

1.2.2 Structure du virus et organisation génétique

Le VHD est un virus à ARN simple brin de polarité négative, d’une taille de 1700

nucléotides, qui code une seule protéine structurale, l’antigène de l’hépatite delta (AgHD).

Une autre spécificité du VHD est le fait que c’est le seul virus à posséder un génome à ARN

circulaire. Cependant, l’aspect le plus fascinant de la biologie de ce virus concerne sa

réplication. Le VHD se réplique selon le mécanisme du cercle roulant. Tandis que la plupart

des virus à ARN (excepté les rétrovirus) répliquent leur génome en utilisant une ARN

polymérase ARN dépendante virale, obtenue à partir de leur propre génome, le VHD utilise

une polymérase contenue dans les cellules de l’hôte, vraisemblablement l’ARN polymérase

de type II. De plus, le VHD contient des séquences d’ARN capables d’exercer une activité

catalytique (ribozyme) nécessaire pour produire des copies unitaires de fragments d’ARN

viral avant leur assemblage.

1.2.3 Antigène delta

Le génome du VHD code une seule protéine appelée AgHD. L’AgHD contient plusieurs

éléments essentiels pour la biologie du virus : un motif qui permet sa dimérisation, un signal

de localisation nucléaire qui dirige l’AgHD vers le noyau, un domaine de liaison à l’ARN

(Figure 5). Il existe 2 isoformes de l’AgHD, une protéine de 194-195 amino acides (forme S

pour small) de 24 kDa (SHD) et une protéine de 241 amino acides (forme L pour large) de 27

kDa (LHD), la dernière différant de la première par la présence de 19 amino acides

supplémentaires en position C-terminale, résultant d’un mécanisme d’édition de l’ARN viral.


Cette modification post-traductionnelle est réalisée par une adénosine désaminase dépendant

de l’ARN double brin cellulaire, et permet au VHD de synthétiser, en plus de la protéine

SHD, une grande protéine (LHD) essentielle à l’assemblage et à la sécrétion des particules

virales.

Figure 5: Les domaines fonctionnels de S-HDAg et L-HDAg (Alves et al., 2013). Y figurent

les domaines suivants : domaine à enroulement en spirale (CCD), un signal de localisation

nucléaire (NLS), un domaine de liaison à l'ARN (RBD) et le signal d’exportation nucléaire

(NES).

1.2.4 Cycle viral du VHD

L’infection par le VHD débute par la fixation de la particule virale par l’intermédiaire de la

région PreS1 localisée au niveau de la protéine L avec le récepteur exprimé à la surface des

hépatocytes, le transporteur d’acides biliaires NTCP. Les étapes suivantes de décapsidation et

de transport vers le noyau ne sont pas totalement comprises. La réplication du génome a lieu

dans le noyau selon le modèle du cercle roulant mettant en jeu des ARN polymérases ADN

dépendante cellulaires (ARN polymérase II). Ce modèle repose sur la formation de transcrits

multimériques (dimères et trimères) linéaires. Pour la réplication du VHD, 3 activités

enzymatiques sont nécessaires : une polymérase qui synthétise les brins oligomériques à partir

des formes circulaires, une activité ribozyme ARN dépendante permettant leurs clivages en

brins unitaires et une ligase afin de circulariser les monomères. La ribonucléoprotéine VHD

est enveloppée dans l’appareil de Golgi par l’AgHBs. La sécrétion est supposée avoir leur au

niveau du Golgi (Alfaita et al., 2015).


La prévalence de l’infection à VHD reste élevée dans beaucoup de régions du monde malgré

la mise en œuvre de programmes de vaccin contre le VHB. Parmi les 240 millions d’individus

qui sont des porteurs chroniques de l’AgHBs, environ 5%, soit 10 à 15 millions seraient

coinfectés par le VHD (Figure 7) (HE et al., 2015). Bien que l'infection au VHD ait été


rapportée dans le monde entier, sa fréquence n'est pas uniforme. Le taux d’infection par le

VHD est généralement plus élevé dans les régions où le VHB est endémique. Les plus fortes

prévalences ont été rapportées en Afrique Centrale, dans le Bassin amazonien, en Europe de

l’Est et Europe méditerranéenne, dans le Moyen-Orient et dans certaines régions d’Asie.

Figure 6 : Représentation schématique des principales zones de distribution du VHD dans le

monde. En gras, sont représentés les génotypes majoritaires du VHD pour chaque région

géographique (Negro, 2011).

1.2.6 Variabilité génétique

Huit génotypes du VHD, diversement répartis, ont été identifiés. Le génotype 1 est distribué

dans le monde entier, tandis que des infections due au 2 et 4 sont présents au Japon et Taïwan.

Le génotype 3 en Amazonie et les génotypes 5, 6, 7 et 8 en Afrique. Quelques études ont

montré que les génotypes 3 et 4 pouvaient être associés à des formes cliniques

particulièrement sévères (hépatites fulminantes) (Gomes-Gouvea et al., 2009).


1.2.7 Diagnostic

1.2.7.1 Diagnostic de l’hépatite D aiguë

Distinction entre les deux situations est importante pour le pronostic et pour la prise en

charge.

1.2.7.2Co-infection VHB-VHD

La co-infection B-D est responsable d’une hépatite modérée évoluant le plus souvent vers

l’élimination du VHB et du VHD. La présence des acides nucléiques (ADN du VHB, ARN

du VHD) et celle des antigènes (AgHBs et Ag-HD) sont contemporaines du pic de

transaminases. Il s’ensuit une augmentation rapide du titre des anticorps anti-HD totaux et de

type IgM, les anticorps IgM anti-HBc associés à l’ADN du VHB témoignant de l’infection

aiguë B. En cas de co-infection peu sévère, la virémie VHD est faible et la réponse anticorps

IgM et IgG est rapide mais de faible ampleur, suggérant la résolution de l’infection VHB-

VHD. Les anticorps IgG anti-HD peuvent persister, témoignant d’une infection ancienne

résolutive (Rapport Dhumeaux, 2014).

1.2.7.3 Surinfection VHB-VHD

La surinfection par le VHD est caractérisée par une hépatite aiguë sévère avec des niveaux de

virémie VHD et de transaminases (suivant le pic de virémie) très élevés. Elle est caractérisée

par une augmentation rapide et importante des taux des anticorps anti-HD IgM et IgG. En

revanche, les anticorps IgM anti-HBc et l’ADN du VHB sont habituellement indétectables.

Plus de 70% des cas de surinfection aiguë évoluent vers une hépatite D chronique dont le

pronostic est sévère (Rapport Dhumeaux, 2014)

1.2.7.4 Diagnostic de l’hépatite chronique D

L’hépatite chronique D se caractérise par la persistance de la virémie ainsi que des anticorps

IgM et IgG anti-HD. On observe en général une inhibition de la réplication du VHB.

1.2.8 Traitement

Il n’existe pas d’antiviraux spécifiques du VHD. Ceci s’explique par le fait que le virus ne

code pas de protéines avec une activité enzymatique. Une meilleure compréhension du cycle

de multiplication est nécessaire afin d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles.


L’interféron alpha (standard et forme pégylée) reste le seul médicalement recommandé par les

sociétés savantes internationales pour le traitement de l’hépatite chronique delta. Une réponse

virologique soutenue est observée environ 15 à 50% des patients. Les mécanismes

moléculaires de l’action antivirale de l’interféron sur le VHD restent méconnus. L’intérêt des

analogues nucléos(t)idiques anti-VHB en association avec l’interféron est largement discuté.

Néanmoins, des nouvelles molécules sont actuellement en développement. Il s’agit des

inhibiteurs d’entrée, des inhibiteurs de l’assemblage et des agents capables de moduler

l’immunité.

1.3 VIRUS DE L’HEPATITE C

1.3.1 Le virus

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un virus hépatotrope, capable d’établir des infections

chroniques chez l’homme. Il appartient à la famille des Flaviviridae, et au genre des

hepacivirus (Hafez et al., 2014)

1.3.2 Structure et organisation génétique

Le VHC est un virus enveloppé. Les particules infectieuses sphériques sont d’une taille

comprise entre 40 et 100 nm de diamètre. Elles sont associées à des apolipoprotéines et du

cholestérol. Le VHC circule dans le sang sous forme de lipoviroparticules. L’enveloppe est le

lieu d’ancrage des glycoprotéines E1 et E2. La capside icosaédrique résulte de l’assemblage

de nombreuses copies de la protéine de capside. Le génome du VHC est formé d’une

molécule d’ARN de polarité positive d’environ 9600 nucléotides qui code des protéines

structurales et non structurales (NS).

1.3.3 Organisation du génome et fonction des protéines virales

L’ARN comporte une unique phase ouverte de lecture, flanquée à ses 2 extrémités par des

séquences non codantes (NC) de longueurs variables. Les régions 5’NC et 3’NC jouent un

rôle majeur dans la réplication du génome viral et dans l’initiation de la traduction pour la

région 5’NC par l’intermédiaire de l’IRES (internal ribosome entry site). La phase ouverte de

lecture code une polyprotéine précurseur qui donne naissance aux protéines virales

structurales (C, E1 et E2), et non structurales (p7, NS2, NS3-4A, NS4B, NS5A et NS5B).


Ces dernières sont dotées de multiples fonctions importantes pour la biologie du virus et

résumées dans le Tableau I.

Tableau I : Fonction des différentes protéines structurales (C, E1, E2) et non structurales (p7,

NS2, NS3-4A, NS4B, NS5A, NS5B).

Protéines Fonction(s)

C (protéine de capside) Interaction avec l’ARN viral

E1 (glycoprotéine d’enveloppe) Rôle majeur dans le processus d’entrée du

VHC E2 (glycoprotéine d’enveloppe)

p7 (viroporine) Rôle dans l’entrée et l’assemblage des

nouvelles particules virales

NS2 Autoprotéase

NS3 Protéase et hélicase

NS4A (cofacteur de NS3) Nécessaire à l’activité protéasique de NS3

NS4B Rôle dans la réplication du génome viral

NS5A (phosphoprotéine) Rôle dans la réplication du génome viral

NS5B (ARN polymérase ARN-dépendante) Elongation des ARN viraux

Figure 7: Organisation du génome du VHC (Piñeiro et Martinez-salas, 2012).


1.3.4 Cycle viral

Le cycle de multiplication du VHC se déroule exclusivement dans le cytoplasme des

hépatocytes (Figure 9). Le cycle du VHC est intimement associé au métabolisme des lipides,

en particulier avec les lipoprotéines de type VLDL (very low density lipoprotein). L’infection

virale débute par l’attachement de la particule à la surface des hépatocytes, et ce, grâce à

l’interaction avec de nombreuses molécules exprimées à leur surface (glycosylaminoglycanes,

récepteur aux LDL (low density lipoprotein), CD81, SR-B1 (scavenger receptor B1), claudin-

1, occludine, le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR) et le récepteur à

l’éphrine A2 EphA2) (Lupberger et al., 2011). L’entrée du VHC est dépendante du pH, ce qui

suggère qu’elle a lieu par endocytose à partir d’endosomes. Au cours de ce processus, la

nucléocapside est libérée dans le cytoplasme, ce qui permet secondairement la libération de

l’ARN viral. L’ARN viral est ensuite reconnu par les ribosomes cellulaires. Sa traduction

permettra la formation d’une polyprotéine précurseur d’environ 3000 amino acides. Cette

polyprotéine est clivée de manière co- et post-traductionnelle par l’action de protéases

cellulaires (signalase et signal peptide peptidase) et virales (NS2/NS3 et NS3/4A), afin de

générer les différentes protéines. La réplication du génome viral s’effectue au sein d’un

complexe de réplication (aussi appelé “membranous web“) formé par les membranes du

réticulum endoplasmique (RE), les protéines virales non structurales (NS3/4A, NS4B, NS5A),

l’ARN polymérase (RdRp) ainsi que des protéines cellulaires. La réplication virale implique

une première étape de synthèse d’ARN simple brin de polarité négative, de séquence

complémentaire à l’ARN génomique. Au cours d’une deuxième étape, ce brin de polarité

négative sert de matrice pour la synthèse de nombreuses molécules d’ARN viral génomique

de polarité positive (rapport 10:1). Les brins d’ARN de polarité positive nouvellement

synthétisés vont servir de matrices pour la traduction et la réplication du génome ou seront

encapsidés pour former de nouvelles particules virales. L’encapsidation du génome viral

pourrait être facilitée par la protéine NS5A, dont le niveau de phosphorylation régule

l’équilibre entre la réplication de l’ARN et l’encapsidation, ainsi que la protéine de capside

qui est capable d’interagir avec les gouttelettes lipidiques. En effet, l’assemblage et la

libération de nouvelles particules virales sont des processus finement régulés, qui sont couplés

avec le métabolisme des VLDL. Les nucléocapsides acquièrent l’enveloppe par

bourgeonnement à travers la lumière du RE et sont sécrétées à l’extérieur de la cellule par

l’appareil de Golgi (Scheel et al., 2013).


Figure 8 : Cycle de multiplication du VHC (Liang et Ghany, 2013).

1.3.5 Variabilité génétique

L’infection par le VHC est caractérisée par des niveaux élevés de production et de clairance

virales quotidiennes, de l’ordre de 1012 virions en moyenne, et par des populations virales de

taille considérable (Neumann et al., 1998). Ces 2 caractéristiques favorisent la variabilité d’un

virus lorsque sa polymérase est susceptible de générer des erreurs au cours de la réplication.

C’est le cas de l’ARN polymérase du VHC, qui commet de nombreuses erreurs qu’elle ne

peut pas corriger car elle est dépourvue d’activité 3’-5’ exonucléase correctrice (activité de

proofreading). La sélection de populations virales variantes au sein de groupes

(géographiques, épidémiologiques) d’individus s’infectant entre eux conduit à l’émergence

des génotypes et sous-types du VHC. La variabilité génétique virale est également

responsable, à l’échelon d’un individu infecté, de la distribution en quasi-espèces.

1.3.5.1 Génotypes et sous-type du VHC

Les souches de VHC se répartissent en 7 génotypes (1 à 7). Au sein de chaque génotype, il

existe un nombre varié de sous-types (Khodabandehloo et al., 2014). Une cartographie de la

distribution mondiale des génotypes montre que les génotypes 1, 2 et 3 sont largement


distribués, tandis que les génotypes 4, 5 et 6 sont généralement confinés à certaines régions.

Le génotype 1 est le plus largement distribué et représente le génotype le plus fréquemment

isolé en Amérique du Nord, en Europe, en Amérique du Sud, en Asie et en Australie. Le

génotype 4 circule majoritairement en Egypte, tandis que le génotype 3 représente près de la

moitié des souches isolées au Royaume-Uni et au Danemark et est le génotype majoritaire en

Inde, au Pakistan et en Thaïlande (Dore et al., 2014). Le génotype 5 est quasi exclusivement

retrouvé en Afrique du Sud. Le génotype 6 est endémique en Asie du Sud-Est et est

fréquemment isolé à Hong Kong et en Chine. Le génotype viral pourrait influencer le taux de

passage à la chronicité de l’infection aiguë. En effet, une étude réalisée auprès de plus de 600

individus ayant une hépatite aiguë C montrait que le génotype 1 était indépendamment

associé à une clairance spontanée de l’infection, en particulier chez les femmes (Grebely et

al., 2014). Par opposition, le génotype ne semble pas influencer la présentation clinique et la

sévérité des lésions hépatiques ou le développement de manifestations extra-hépatiques. La

détermination du génotype voire du sous-type (1a versus 1b) pour les patients infectés par un

génotype 1 est essentielle pour la prise en charge du malade car elle conditionne jusqu’à

présent le traitement antiviral.

1.3.5.2 Distribution en quasi-espèce du VHC

Le VHC a une distribution en quasi-espèces. La distribution en quasi-espèces du VHC est un

des mécanismes par lequel le virus est capable d’échapper à la pression de sélection liée aux

réponses cellulaires et humorales de l’hôte (Farci et al., 2000). La distribution en quasi-

espèces du VHC joue également un rôle majeur dans l’échec aux traitements en sélectionnant

de façon graduelle des variants viraux résistants. Les variants capables de conférer une

résistance aux différentes classes d’antiviraux directs préexistent généralement à des taux

faibles chez la plupart des patients jamais exposés aux médicaments.


La prévalence de l’infection virale C varie de 0,4%-0,8% en Europe de l’Ouest à 1,6% aux

Etats-Unis, jusqu’à 5% dans certaines régions d’Italie. Une forte prévalence est observée en

Afrique sub-Saharienne, en Asie, en Amérique du Sud et au Moyen-Orient avec la plus forte

prévalence enregistrée en Egypte (9%) (Armstrong et al., 2006; Hatzakis et al., 2011).


En France, la prévalence des anticorps anti-VHC, estimée par l’enquête nationale de l’Institut

de Veille Sanitaire en 2004, était de 0,84%, soit plus de 350 000 personnes ayant été infectés

au cours de leur vie (Meffre et al., 2010). Plus de deux-tiers des sujets séropositifs pour le

VHC avaient de l’ARN, soit une prévalence de l’infection chronique de 0,53%.

Figure 9 : Epidémiologie du VHC (Gower et al 2014).

1.3.7 Modes de transmission

L’utilisation de drogues par voie veineuse reste le mode majeur de transmission du VHC. La

transmission lors de gestes médicaux invasifs est en nette diminution du fait d’un

renforcement des précautions universelles d’asepsie. Le risque de transmission sexuelle du

VHC est extrêmement faible chez les couples hétérosexuels stables. Le risque de transmission

de la mère à l’enfant est rare (<5%). Il dépend essentiellement du niveau de charge virale chez

la mère.

1.3.8 Diagnostic

1.3.8.1 Diagnostic sérologique Ce test met en évidence les anticorps présents chez le patient témoignant du contact de celui-

ci avec le virus de l’hépatite C: la positivité n’implique pas forcément l’existence d’une

maladie virale évolutive que seule la présence d’un ARN viral sérique positif pourra affirmer.

On estime en effet que 10 à 15 % des sujets vont guérir spontanément de leur hépatite virale C

aiguë : ces sujets garderont une sérologie positive mais auront un ARN viral indétectable.


De rares faux négatifs peuvent exister (co-infectés VIH-VHC ou patients traités par traitement

immunosuppresseur, nouveau-nés de mère ARN positive, séroconversions retardées) (Bernard

et al., 2005).

1.3.8.2 Tests de détection et de quantification de l’ARN

Lest tests de détection et de quantification de l’ARN du VHC sont désormais basés sur le

principe de l'amplification en temps réel de la cible soit à l'aide de RT-PCR ou TMA. La

détection et la quantification de l’ARN du VHC sont indispensables en pratique clinque afin

de poser le diagnostic de l’hépatite C, d’identifier les patients qui ont une indication de

traitement, d’évaluer la réponse aux traitements antiviraux et de détecter l’émergence de

variantes viraux résistants avec le traitement sans interféron.. Les résultats doivent être

exprimés en unités internationales par millilitre (UI/ml), idéalement en Log UI/ml, afin de

pourvoir comparer les résultats émanant de différents laboratoires et utilisant des techniques

différentes. Ces techniques bénéficient d’un large intervalle de quantification linéaire, adapté

à la mesure des valeurs observées en pratique clinque, en l’absence comme en cours d’un

traitement antiviral. Plusieurs trousses commerciales de PCR en temps réel sont disponibles

comme COBAS TaqMan HCV test v2.0, COBAS Ampliprep-COBAS TaqMan HCV test

v2.0, RealTime HCV et Artus HCV QS-RGQ assay, Abbott m2000rt et m2000sp. Les

performances analytiques de ces tests de quantification sont satisfaisantes (Chevaliez, 2015).

1.3.8.3 Détermination du génotype de VHC

Les souches de VHC se répartissent en 7 génotypes, susceptibles de répondre différemment

au traitement. La détermination du génotype voire du sous-type pour les patients infectés par

un génotype 1 (1a versus 1a) est essentielle pour la prise en charge du malade car elle

conditionne jusqu’à présent le traitement antiviral. La méthode de référence pour la

détermination du génotype viral est l’analyse phylogénique de la séquence nucléotidique

d’une portion du génome viral.

Cela permet de comparer les séquences obtenues avec les séquences des souches prototypes

disponibles dans les banques de séquences. Néanmoins d’autres méthodes existent : les

méthodes fondées sur l’hybridation inverse (plus rapide et plus sensible que la méthode de

séquençage), qui sont largement utilisées dans les laboratoires de biologie ; les méthodes de

RT-PCR utilisant des amorces et des sondes spécifiques des génotypes. Différentes trousses

commerciales sont disponibles : TRUGENE HCV 5’NC Genotyping fondée sur le

séquençage direct d’une portion de la région 5’NC ; INNO-LiPA HCV 2.0, technique


d’hybridation inverse qui utilise des sondes dirigées contre la région 5’NC et contre la région

codant la protéine de capside du VHC, permettant une bonne différenciation des sous-types 1a

et 1b d’une part, des génotypes 6c-1 et 1 d’autres part ; Abbott RealTime HCV Genotype II,

méthode fondée sur la PCR utilisant des amorces spécifiques de génotypes dirigées contre la

région 5’NC et la région codant la protéine NS5B (Chevaliez , 2015).

1.3.8.4 Détection et quantification de l’antigène de capside

Les tests de détection des génomes viraux (DGV) ont pour principaux avantages une

spécificité et une sensibilité importante en comparaison des tests sérologiques. Toutefois, les

inconvénients majeurs de ces tests sont le fait qu’ils nécessitent du temps, des équipements

techniques sophistiqués, des personnels expérimentés, des espaces de laboratoire dédiés et ce

sont des techniques couteuses. L’antigène de capside est un marqueur indirect de la

réplication virale. Chez les patients présentant une infection par le VHC, de nombreuses

études ont montré que le titre de l’antigène de capside était positivement corrélé à la charge

virale. Ainsi, en raison du caractère bon marché (30 à 50% moins onéreux que les tests de

DGV) et automatisé, la quantification de l’antigène de capside du VHC pourrait être utilisé

comme une méthode alternative au DGV. Actuellement, la détection de l'antigène de capside

du VHC est réalisée au moyen d'un test immunologique chimioluminescent microparticules

entièrement automatisé (Architect, Abbott Laboratories). Les performances du test sont

satisfaisantes avec une spécificité de 100% et une sensibilité de 99,99%, La limite inférieure

de détection est de 3 fmol/L correspondant à environ 1000 UI/mL d'ARN du VHC. Par

conséquent, la détection de l'antigène VHC pourrait avoir une application en pratique clinique

chez les individus ayant un test de dépistage positif pour la détection des anticorps anti-VHC.

D’autre part, ce test pourrait également avoir un intérêt dans le monitorage de l’efficacité des

traitements anti-VHC en particulier chez les patients traités par des combinaisons d’antiviraux

directs sans interféron.

1.3.8.5 Détermination du profil de résistance génotypique

La méthode de référence pour l’identification des mutations de résistance est le séquençage du

gène codant la protéine ciblée par l’agent antiviral. La comparaison des séquences obtenues

avec celles de souches sauvages sensibles au médicament disponibles dans les banques

permet d’identifier des substitutions capables de conférer une diminution de sensibilité au

médicament.


La comparaison de la séquence pré thérapeutique avec celle obtenue au moment de la

suspicion de la résistance doit être réalisée pour mettre en évidence le changement amino

acidique. Il n’existe pas à ce jour de trousses commerciales. En pratique clinique, il n’y a pas

d’indication quant à l’utilisation des tests de résistance génotypique (ni avant l’instauration du

traitement, ni en cas d’échec thérapeutique). Cela reste vrai pour toutes les options

thérapeutiques incluant l’interféron. Les indications des tests de résistance restent à évaluer

avec les traitements sans interféron, en particulier chez des patients en échec avant un

retraitement (Chevaliez, 2015).

1.3.9 Traitement

Contrairement aux infections chroniques par le VHB ou le VIH, l’infection par le VHC est

curable par le traitement antiviral. L’objectif du traitement antiviral est d’améliorer la qualité

de vie et la survie des patients en empêchant la progression de la maladie vers la cirrhose,

l’insuffisance hépatique terminale, le CHC et le décès. Cet objectif est atteint si la réplication

virale est profondément et durablement inhibée permettant d’avoir un ARN indétectable 12

semaines après l’arrêt du traitement antiviral, c’est la réponse virologique soutenue (RVS).

Jusqu’à récemment au moins pour « les pays du nord », le traitement de l’hépatite C reposait

sur l’administration d’interféron pégylé et de ribavirine pendant 24 à 48 semaines selon le

génotype. Cette bithérapie pégylée guérissait environ la moitié des patients. La tolérance de la

bithérapie pégylée était médiocre. En 2011, les premiers antiviraux directs (DAA pour direct

acting antivirals) ont été disponibles ; il s’agissait des antiprotéases capables d’inhiber la

maturation de la polyprotéine en inhibant la fonction protéasique de la protéine NS3. Le taux

de guérison a ainsi augmenté d’environ 30%. Ces molécules n’étaient actives que sur les

souches de génotype 1 et devaient être administrées en combinaison avec l’interféron pégylé

et la ribavirine. La tolérance était moyenne. Depuis 2014-2015, trois classes d’antiviraux sont

désormais disponibles : les antiprotéases de 2ème vague 1ère génération avec le simeprevir et le

paritaprevir boosté par le ritonavir ; les inhibiteurs de la protéine NS5A avec le daclatasvir,

l’ombitasvir et le ledipasvir ; les inhibiteurs de la protéine NS5B comprenant les inhibiteurs

nucléotidique avec le sofosbuvir et les inhibiteurs non nucléosidiques avec le dasabuvir. Les

schémas thérapeutiques sont variables en fonction du génotype. La durée de traitement est de

12 ou 24 semaines. Les chances de guérison sont généralement supérieures à 90% (EASL,

2015).


1.3.10 Prévention

Il n’existe pas de vaccin contre l’hépatite C. Par conséquent, la prévention de l’infection par le

VHC passe par la réduction du risque d’exposition au virus dans les établissements de soins,

les populations à haut risque tels que les consommateurs de drogues injectables, et lors des

rapports sexuels chez les hommes ayant des rapports sexuels avec les hommes. Une question

à l'époque des antiviraux à action directe (DAA) est de savoir si nous avons encore besoin

d'un vaccin. Il pourrait être raisonnablement soutenu, parce que la plupart des gens ne sont

pas conscients de leur infection et les symptômes limités de la maladie, de plus la vaccination

est le seul moyen si l’on veut envisager d’éradiquer le VHC. En effet, la guérison de

l’infection ne protège pas d’une éventuelle réinfection. Cependant, les réponses immunitaires

vis-à-vis du VHC sont encore largement méconnues, ce qui entrave le développement d’un

vaccin. (Hullegie et al., 2015).


2. OBJECTIF DU MEMOIRE :

Objectif général

Déterminer la prévalence de l’ADN du VHB, de l’ARN du VHC et de l’ARN du VHD et de

déterminer les génotypes du virus de l’hépatite B, C et D dans la population Togolaise et les

caractéristiques sérologiques et moléculaires.

Objectifs spécifiques :

o Evaluer la performance des TROD pour la détection de l’AgHBs ou des anticorps anti-

VHC par rapport à une méthode de référence type EIA à partir d’un prélèvement

veineux au pli du coude;

o Quantifier les charges virales (ADN du VHB, ARN du VHC) chez les patients dont la

sérologie était positive pour le VHB±VHD et/ou le VHC;

o Analyser phylogéniquement les souches de VHB, VHD et VHC circulant au Togo.


MATERIELS

ET

METHODES


3. MATERIELS ET METHODES

3.1 Cadre d’étude

Ce travail a été effectué à :

- Au centre de recherche biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) qui abrite le

laboratoire de biologie et de génétique (LABIOGENE) de l’Université de

Ouagadougou au Burkina Faso.

- L’ONG ASADH (Association Sauvons l’Afrique Des Hépatites) en collaboration

avec le laboratoire Africain Institute of Molecular Biology and Immunology

Research (AIMBIR) à Lomé-Togo.

- L’Institut Mondor de Recherche Biomédicale « IMRB », INSERM U955 Equipe

18, hôpital Henri Mondor, Université Paris-Est Créteil, Centre National de

Référence des Hépatites Virales B, C et delta.

3.2 Type et période d’étude

Il s’agit d’une étude rétrospective qui s’est déroulée de Janvier 2012 à Décembre 2014. Un

dépistage des hépatites B et C à l’aide de tests rapides d’orientation diagnostique (TROD) a

été proposé après un entretien. Le consentement de chaque participant a été recueilli.

3.3 Matériels et réactifs de Laboratoire

Automates : ARCHITECT i* System version 8.1 ; Abbott (m2000rt version 5 et

m2000sp version 6.0) ; VITROS ECi/ECiQ 3600 et du système intégré VITROS 5600

v.4; ROCHE Cobas/TaqMan version 2; QIAsymphony® SP/AS version 1 ; 3031

Genetic Analyzer v.2 ; 2720 ThermalCycler (Applied Biosystems) et Red (Alpha

Innotech).

Cartouches de réactif pour Architect, Abbott m2000rt et QIAsymphony DSP

Virus/Pathogen Midi Kit, trousses Diasorin, réactifs de biologie moléculaire pour la

détermination des séquences nucléotidiques.


3.4 Méthode d’étude

3.4.1 Population d’étude

Tous les sujets reçus en conseil de dépistage volontaire (CDV) à l’ONG ASADH, ayant une

sérologie positive pour le VHB et/ou VHC à l’aide de TROD ont été invités à donner leur

consentement éclairé (confère annexe) afin de participer à la présente étude.

Ainsi, 520 sujets porteurs du VHB et 53 sujets porteurs du VHC ont été recrutés pour cette

étude et ont accepté un prélèvement sanguin au pli du coude.

3.4.2 Critères d’inclusion

Sujets séropositifs pour le VHB et/ou le VHC, sans distinction de sexe, reçus

en visite de suivi dans le centre.

Sujets de nationalité Togolaise ou ayant vécu au moins pendant 2 ans au Togo.

3.4.3 Critères d’exclusion

Sujets recevant un traitement antiviral pour leur hépatite virale

Sujets non dépistés positifs pour le VHB et/ou le VHC à l’aide d’un TROD.

3.4.4 Paramètres étudiés et recueil des données

Les données sociodémographiques suivantes ont été recueillies : âge, sexe, ethnie, statut

matrimonial. Les analyses sérologiques et moléculaires à partir des prélèvements sanguins

ont été réalisées au laboratoire de virologie de l’hôpital Henri Mondor. Un questionnaire a

permis de recueillir le consentement éclairé des enquêtés, de même que les autres

paramètres (cf annexe). Les données recueillies ont fait l’objet d’un traitement

informatique, d’une analyse statistique à l’aide du logiciel Stata® 10.0 (StataCorp LP,

College Station, Texas). Les résultats ont été discutés à la lumière de la littérature.

3.5 Méthodes Virologiques

3.5.1 Marqueurs Sérologiques du VHB, VHD et du VHC

La recherche de l’AgHBs et des anticorps anti-VHC ont été réalisées par l’intermédiaire d’un

test rapide (TROD) « ABON® » à partir du sang total capillaire prélevé après auto-piqure au

bout du doigt. Pour les patients dépistés positifs ayant accepté la convocation les marqueurs


sérologiques suivants ont été recherchés voir quantifier à l’aide d’un prélèvement sanguin au

pli du coude :

pour le VHB : détection de l’AgHBs et détermination du titre de l’AgHB, détection

des anticorps totaux anti-HBc et évaluation du titre des anticorps anti-HBs;

pour le VHC : détection des anticorps anti-VHC, détection-quantification de l’antigène

de capside chez les sujets ayant un ARN détectable ;

pour le VHD : détection des anticorps anti-VHD.

L’ensemble de ces paramètres a été évalué à l’aide de techniques ELISA automatisées excepté

pour la recherche des anticorps anti-VHD qui a été réalisée à l’aide d’une méthode ELISA

manuelle en microplaque. L’ensemble du travail a été effectué dans le laboratoire de virologie

de l’hôpital Henri Mondor et le laboratoire de virologie de l’hôpital d’Avicenne pour

l’évaluation des paramètres sérologiques et moléculaires du VHD.

3.5.2 Principe des tests rapide d’orientation diagnostique (TROD) ABON®

Le principe des tests rapides d’orientation diagnostique ABON® HBV et HCV est basé sur

une technique immunochromatographique qualitative. Lors du dépôt du sang total sur la

membrane les antigènes viraux ou les anticorps anti-virus, présents dans l’échantillon vont

migrer, puis se fixer sur les particules d’or colloïdal recouvertes de protéine A de

staphylococcus aureus (affinité particulière pour les Ig) et rencontrer les anticorps dans le cas

de la recherche d’un antigène, ou les antigènes recombinants dans le cas de la détection

d’anticorps. Lors de la rencontre antigène/anticorps un agglomérat de particules recouvertes

de protéine A se forme, créant ainsi une bande colorée visible à l’œil nu. La bande contrôle

réagit de la même manière en formant un complexe anticorps anti-anticorps humain (sur la

membrane)/anticorps humain (présent dans l’échantillon).

MAX

Bande contrôle

Bande test

migration

Y

Y

Y


Y

Y

Y

Y

Y Dépôt sérum/plasma

*

*

*

*

*

*

*

*

*

* Particules recouverte de protéine A

Anticorps anti-anticorps humain

Antigènes recombinant du HCV

Figure 10 : Exemple du test ABON® HCV

3.5.3 Principe des tests sérologiques qualitatifs sur VITROS

Immunodiagnostic

Cet automate utilise une technique d’immunodosage immunométrique, incluant une réaction

simultanée de l’Ag ou l’Ac, présent dans l’échantillon, avec l’Ag ou l’Ac présent dans les

puits. Les complexes antigène/anticorps sont fixés par la streptavidine revêtant les puits. Le

conjugué marqué à la peroxydase de raifort (HRP) se lie à l’Ag ou l’Ac formant ainsi un

« sandwich ». Les substances non liées sont éliminées par lavage. Un réactif contenant des

substrats luminogènes et un agent de transfert d’électrons est ajouté dans les puits. La HRP du

conjugué lié, catalyse l’oxydation du dérivé du luminol, produisant ainsi de la lumière.

L’agent de transfert d’électrons (un acétanilide substitué) amplifie le signal lumineux émis et

en prolonge l’émission. Les signaux lumineux sont lus par le système.


3.5.4 Principe de la sérologie quantitative sur ARCHITECT pour la

quantification de l’AgHBs et de l’antigène de capside du VHC

Cet automate réalise, un dosage immunologique en deux étapes utilisant la technologie de

dosage immunologique micro particulaire par chimiluminescence (CMIA) avec des

protocoles de dosage flexibles, appelés Chemiflex. Dans un premier temps, l'échantillon et les

microparticules paramagnétiques recouvertes d'anticorps sont mis en présence. L'antigène

présent dans l'échantillon se lie aux microparticules recouvertes d'anticorps. Après lavage, le

conjugué d'anticorps marqué à l'acridinium est ajouté. Après un second cycle de lavage, les

solutions de préactivation et d'activation sont ajoutées au mélange réactionnel. La réaction

chimiluminescente résultante est mesurée en unités relatives de lumière (URL). Il existe un

rapport direct entre la quantité d’antigène présente dans l'échantillon et les URL détectées par

le système optique ARCHITECT i* System. La concentration en antigène présente dans

l'échantillon est déterminée à l'aide d'une courbe de calibration. Si la concentration de

l'échantillon est égale ou supérieure à 3,00 fmol/L, l'échantillon est considéré réactif pour

l'antigène de capside du VHC. Son domaine de linéarité s’étend de 3 à 20 000 fmol/L. Si la

concentration de l'échantillon est égale ou supérieure à 0,05 UI/mL, l'échantillon est considéré

réactif pour l'AgHBs. Son domaine de linéarité s’étend de 0,05 à 250 UI/mL.

3.5.5 Principe de méthode ELISA manuelle pour la détection des anticorps

anti-VHD

La détection des anticorps anti-VHD est basée sur une technique de compétition immuno-

enzymatique. Les anticorps anti-VHD présents dans l’échantillon entrent en compétition avec

les anticorps anti-VHD-HRP présents dans le milieu vis-à-vis d’une quantité fixe et connue

d’antigène VHD liés à la phase solide. La quantité de traceur enzymatique liée à la phase

solide, et par conséquent l’activité enzymatique, est inversement proportionnelle à la

concentration d’anticorps anti-VHD présente dans l’échantillon. La mesure de l’activité

enzymatique s’effectue après addition d’une solution incolore de chromogène/substrat qui,

sous l’action de l’enzyme, donne une coloration détectable au spectrophotomètre.Les critères

de validation de la technique sont les suivants :La valeur de l’absorbance du blanc doit être

comprise entre 0,000 et 0,15nm. Le calcul de la valeur seuil= 0,5CNx + 0,5CPx. [0,5 de la

moyenne de la valeur d’absorbances des témoins négatifs (CNx) + de la moyenne de la valeur

d’absorbances des témoins positifs (CPx)]. 0,000 ≤ Blanc ≤0,150, CNx ≥ 0.600, CPx ≤


0,080, CNx – CPx ≥ 0. La présence ou l’absence des anticorps anti-delta est déterminée en

comparant la valeur d’absorbance des échantillons avec la valeur seuil

Valeur d’absorbance échantillon ≤ valeur seuil →Echantillon Positif

Valeur d’absorbance échantillon ≥ valeur seuil →Echantillon Négatif.

3.6 Marqueurs moléculaires du VHB, VHD et du VHC

Chez les patients séropositifs pour le VHC et/ou AgHBs-positif, les marqueurs moléculaires

suivants ont été recherchés à l’aide d’un prélèvement sanguin au pli du coude :

Pour le VHB : détection-quantification de l’ADN du VHB, détermination du génotype

chez les sujets ayant un ADN du VHB positif

Pour le VHC : détection-quantification de l’ARN du VHC, détermination du génotype

chez les sujets ayant un ARN du VHC positif

Pour le VHD : détection-quantification de l’ARN du VHD, détermination du génotype

chez les sujets ayant un AZRN du VHD positif

3.6.2 Technique de quantification des acides nucléiques

3.6.2.1 Principe de la technique de détection-quantification de l’ADN du

VHB à l’aide de la plate-forme de PCR en temps réel CAP/CTM (Roche)

Le test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® (CAP/CTM) VHB, v2.0 est un test basé

sur l'amplification de l'acide nucléique, permettant une mesure quantitative de l'ADN du

VHB, dans le plasma ou dans le sérum.

Le test comporte deux étapes :

- L’extraction de l’ADN du VHB à partir des échantillons sériques ou plasmatiques et

l'amplification par PCR simultanée de l'ADN cible ainsi que la détection en temps réel

de la fluorescence dont l’intensité est directement proportionnelle à la quantité d’ADN

du VHB présent dans l’échantillon.

Le mélange réactionnel contient des paires d'amorces et des sondes spécifiques à la fois de

l'ADN du VHB et d’un standard de quantification (QS) du VHB. Le mélange réactionnel

permet une mesure quantitative de l’ADN du VHB avec des performances équivalentes quel

que soit le génotype du VHB (Chevaliez et al., 2010). La détection de l'ADN amplifié est


réalisée à l'aide d'une sonde oligonucléotidique spécifique de la séquence amplifiée et d'une

sonde oligonucléotidiques doublement marquée spécifique du QS. Ce système permet

l'identification indépendante de l’ADN du VHB et de l’ADN du standard du QS. Le QS est

incorporé en quantité connue à tous les échantillons. Il subit alors toutes les étapes de

traitement comme les échantillons cliniques : extraction, amplification par PCR et détection

grâce à des sondes de détection.

L'analyseur COBAS®TaqMan® ou COBAS® TaqMan® 48 détermine la concentration

d'ADN du VHB dans les échantillons cliniques par comparaison du signal de l’ADN du VHB

au signal du QS pour chaque échantillon et les contrôles (HPC et LPC pour respectivement

high et low positive controls). Les résultats sont exprimés en unités internationales par

millilitre (UI/mL). Le domaine de linéarité s’étend de 20 à 100 000 000 UI/mL (i.e. 1,3 to 8,0

Log UI/mL). La limite de quantification est identique à la limite de détection, i.e 20 UI/mL.

3.6.2.2 Principe de la détection-quantification de l’ARN du VHC à l’aide de

la plate-forme de PCR en temps réel m2000 (Abbott)

Le principe de la plate-forme Abbott RealTime est basé sur l’amplification d’une cible

spécifique du VHC après transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire simple brin

(ADNc). Un contrôle interne (séquence d’ARN) est introduit dans chaque échantillon avant

l’extraction. Cette séquence d'ARN est simultanément amplifiée par RT-PCR et permet de

s’assurer que le procédé a été correctement effectué et qu’il n’y pas d’inhibiteur dans

l’échantillon à tester. La quantité de séquences cibles de VHC présente à chaque cycle

d'amplification est mesurée à l'aide de sondes oligonucléotidiques marquées par un

fluorochrome sur l’automate Abbott m2000rt™. Les sondes ne génèrent aucun signal, à moins

d'être spécifiquement liées au produit amplifié. Le cycle d'amplification au cours duquel le

signal fluorescent est détecté par le m2000rt est proportionnel à la concentration d'ARN VHC

présente dans l'échantillon. Les résultats sont exprimés en UI/mL. Le domaine de linéarité

s’étend de 12 à 100 000 000 UI/mL (i.e. 1,2 to 8,0 Log UI/mL). La limite de quantification est

identique à la limite de détection, i.e 12 UI/mL).


3.6.2.3 Principe de la détection-quantification de l’ARN du VHD à l’aide de

la plate-forme de PCR en temps réel m2000 (Abbott)

La quantification de l’ARN du VHD passe par deux principes : RT-PCR qualitative et la PCR

quantitative. Le principe est le même que celui énoncé dans la quantification de l’ARN du

VHC.

3.7 Détermination des génotypes viraux

La détermination des génotypes est réalisée par analyse phylogénique d’une portion d’un gène

après séquençage des produits d’amplification. Les séquences nucléotidiques ainsi générées

sont comparées à des séquences de référence des différents génotypes disponibles dans les

banques.

3.7.1 Principes

3.7.1.1 Principe de l’extraction des acides nucléiques

L’extraction des acides nucléiques a été réalisée à l’aide de l’automate QIASymphony

utilisant la trousse Midi kit DSP Virus Pathogen. L’extraction se déroule en 4 étapes :

- Etape de lyse : l’échantillon est mis en contact avec un tampon de lyse afin de lyser les

virus et de libérer les acides nucléiques viraux

- Etape de liaison : des particules magnétiques sont ajoutées au milieu réactionnel, les

acides nucléiques se lient à ces particules polarisées.

- Etape de lavage : les particules magnétiques sont séparées du premier milieu

réactionnel et placées dans un second milieu afin de réaliser des lavages en tampon

alcoolique.

- Etape d’élution : la polarité du milieu réactionnel change lors des lavages successifs,

libérant ainsi les acides nucléiques purifiés à partir des particules magnétiques. Celles-

ci sont alors éliminer du milieu et le produit final est élué.

3.7.1.2 Principe de la RT-PCR one step

La première étape consiste à synthétiser une chaîne d’ADN complémentaire (ADNc) simple

brin à partir d’une matrice d’ARN, et ce par l’action d’une enzyme la transcriptase inverse

issue des rétrovirus. La seconde étape consiste à synthétiser des ADN double brin grâce à

l’action d’une Taq polymérase. L’opération est réitérée de nombreuses fois afin d’amplifier

la cible en grande quantité.


3.7.1.3 Principe de la PCR nichée

Le principe est grossièrement le même que celui énoncé précédemment et permet

d’augmenter la sensibilité de la PCR en utilisant un couple d’amorces internes à celui utilisée

dans la (RT)-PCR.

3.8 Visualisation des produits d’amplification

Après l’amplification, les acides nucléiques sont visualisés après migration des produits

d’amplification dans un gel d’agarose en présence d’un agent intercalant (acridine orange). La

migration des produits de PCR permet d’apprécier la taille du produit amplifié par

comparaison à un marqueur de taille de poids moléculaire dont la taille des différents

fragments est connue et la qualité du fragment amplifié.

3.9 Purification des acides nucléiques

Une étape de purification des acides nucléiques est nécessaire précédant la réaction de

séquence. Cette purification s’effectue sur une membrane de silice. Cette membrane a la

propriété de retenir les acides nucléiques d’une taille au moins égale à 100 paire de bases. Les

autres constituants de la PCR tels que tampon, enzyme, amorces, vont être éliminés par

lavages.

3.10 Principe du séquençage selon la méthode de SANGER

La réaction de séquençage, basée sur la méthode Sanger établie en 1977, a été réalisée avec la

trousse BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies).

La réaction de Sanger est une succession de cycle de polymérisation au cours desquels l’ADN

incorpore soit un désoxyribonucléotide (dA, dC, dG et dT) ou un didéxosyribonucléotides

(ddA, ddC, ddG et ddT) marqué par un fluorochrome en fonction du brin matrice par

complémentarité des bases. Chaque ddN est marqué à un fluorochrome différent. Au cours de

la réaction de séquençage, une seule amorce est ajoutée au milieu réactionnel à partir duquel

la synthèse sera initiée. Lorsqu’elle incorpore un désoxyribonucléotide la synthèse continue,

mais lorsqu’elle incorpore un didéxosyribonucléotide, la synthèse s’arrête car le

didésorybonucléotide est dépourvu du groupement hydroxyle qui permet de former la liaison

avec la base suivante. Ce qui permet d’obtenir des fragments de tailles différentes. Au lieu

d’utiliser un gel ultra-résolutif pour différencier les fragments d’une paire de base, la lecture

de l’enchaînement des bases est réalisée par un séquenceur automatique type capillaire qui

permet la détection des quatre fluorochromes utilisés.


La séquence nucléotidique ainsi obtenue est visualisable à partir d’un éléctrophorégramme

qui est un enchaînement de pics des différents nucléotides représentés par une couleur

différente. Chaque couleur est spécifique d’un des quatre nucléotides A, T, G et C.

3.11 Analyse des séquences nucléotidiques

L’analyse des séquences nucléotidiques fait appel à l’utilisation de logiciels informatiques

simple permettant :

- d’aligner les séquences obtenues avec des séquences de référence disponibles dans les

banques de séquences

- de réaliser des études phylogéniques selon la méthode des distances (Neighbor-

Joining) pour la détermination des génotypes

Ainsi nous avons utilisé les logiciels BioEdit, Chromas, SeqScape, Sequence Navigator,

PHYLIP, Njplot et FigTree respectivement pour la correction, l’alignement et la construction

des arbres phylogéniques.

3.12 Détermination des génotypes du VHB

La détermination du génotype du VHB a consisté à l’amplification d’une partie de la région

RT de la polymérase virale selon la méthode publiée en 2011 par Pallier et coll. Les PCR ont

été réalisées avec la trousse Advantage 2 Polymerase OZYME, utilisant l’appareil Applied

Biosystem 2720 Thermal cycler v2.0 (Applied Biosystems, USA) et les amorces du Tableau

ci-dessous.

Programme d’amplification

95°C pendant 1 min

95°C pendant 30 sec

58°C pendant 30 sec *40

68°C pendant 1 min

70°C pendant 10 min


Amorces Séquence

GenoB SE 5’-CCCTGCTCGTGTTACAGGGG-3’

GenoB ASE 5’-GTTGCGTCAGCAAACACTTGGCA-3’

GenoB SI 5’-GACTCCTGGTGGACTTCTCTCA-3’

GenoB ASI 5’-GGCATTAAAGCAGGATAACCACATTG-3’

3.13 Détermination des génotypes du VHD

La détermination du génotype du VHD a consisté à l’amplification de la région R0 selon la

méthode publiée en 2001 par Valeria IVANIUSHINA et al., Pour la réalisation de la RT-

PCR, deux mélanges réactionnels ont été faits : un pour la RT et l’autre pour la PCR. Les

amorces utilisées sont présentées dans le tableau ci-dessous.


95°C pendant 5 min



72°C pendant 1 min

72°C pendant 10 min.

Amorces Séquence

GenoD S 5’-CATGCCGACCCGAAGAGGAAAG-3’

GenoD AS 5’-GAAGGAAGGCCCTCGAGAACAAGA-3’

3.14 Détermination des génotypes du VHC

La détermination du génotype du VHC a consisté à l’amplification d’une portion de la région

NS5B codant l’ARN polymérase ARN-dépendante selon la méthode publiée en 2006 par

Bronowicki et coll. La transcription inverse et la 1ère PCR ont été réalisés en 1 seule étape

(RT-PCR OneStep). Une deuxième PCR (PCR 2) a été réalisée à partir des produits

d’amplification de la première PCR. Les amorces sont présentées dans le tableau ci-dessous.

- La RT-PCR a été réalisée avec la trousse de chez QIAGEN « OneStep RT-PCR »

utilisant l’appareil Applied Biosystem 2720 Thermal cycler v2.0 (Applied Biosystems,

USA).

- La PCR 2 a été réalisée avec la trousse Advantage 2 Polymerase OZYME utilisant

l’appareil Applied Biosystem 2720 Thermal cycler v2.0.


Programme d’amplification (RT-PCR)

- 50°C pendant 60 min


- 95°C pendant 30 sec

- 58°C pendant 30 sec X 35



Programme d’amplification (PCR)

95°C pendant 1 min


58°C pendant 30 sec X35

68°C pendant 1 min

68°C pendant 10 min

Amorces Séquence

GenoC SE 5’-TATGAYACCCGCTGYTTTGACTC-3’

GenoC ASE 5’-GCNGARTAYCTVGTCATAGCCTC-3’

GenoC SI 5’-CTGYTTTGACTCMACNGTMAC-3’

GenoC ASI 5’-CATAGCCTCCGTGAAGRCTC-3’

SE: sens externe; ASE: anti-sens externe; Si: sens interne; ASi: anti sens interne

Y: C ou T; V: A, C, ou G; R: A ou G N: A, C, G ou T; M: A ou C.


RESULTATS


4. RESULTATS

Parmi les 21 516 individus dépistés à l’aide d’un test de diagnostic rapide (TDR) au cours des

années 2012-2014, 1653 (7,7%) sujets avaient un test positif incluant 200 individus qui

étaient positifs pour le VHC et 1453 pour le VHB. L’ensemble des individus dépistés positifs

pour l’un ou l’autre des virus a été convoqué pour une prise en charge de leur hépatite. Seuls

573 sujets sont venus en consultation. Parmi ces derniers, 516 avaient un TROD positif pour

la détection de l’AgHBs et 62 sujets avaient un TROD positif pour la détection des anticorps

anti-VHC.

4.1 Caractéristiques démographiques de la population

Le tableau II présente les caractéristiques sociodémographiques de la population étudiée. Un

total de 573 patients a été inclus. La moyenne d’âge était de 33,4 ans avec un intervalle de 9 à

71 ans. La répartition par classe d’âge montrait que la majorité des patients (>80%) était âgée

de 15 à 49 ans avec plus de la moitié entre 30 et 49 ans. Comme attendu, la majorité (81%)

des patients était des hommes. L’origine géographique des individus dépistés positifs pour le

VHB et/ou le VHC était originaire de Kara, une région localisée au nord du Togo.

Tableau II: Caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude.

Caractéristiques Effectif (N=573)

Sexe (n, %)

Homme 464 (81,0%)

Femme 109 (19,0%)

Age (années)

Moyenne 33,4

Intervalle 9,0-71,0

Répartition par classe d’âge, n (%)

<15 8 (1,4%)

15-29 222 (38,7%)

30-44 270 (47,12%)

45-59 59 (10,29%)

>59 14 (2,44%)

Origine géographique, n (%)

CENTRALE 30 (5,2%)

KARA 336 (58,6%)

MARITIME 94 (16,4%)

PLATEAUX 58 (10,1%)

SAVANE 55 9,7%)


4.2 Performances des tests rapides d’orientation diagnostique (TROD)

Les Tableaux IV et V montrent la concordance des résultats pour la détection de l’AgHBs ou

des anticorps anti-VHC à partir de sang capillaire à l’aide de TROD (respectivement, ABON®

HBV et ABON® HCV) par comparaison à une méthode EIA (VITROS HBsAg) à partir de

d’un prélèvement de sang réalisé au pli du coude. Pour la détection de l’AgHBs, 14 (2,4%)

échantillons étaient discordants : 6 patients étaient AgHBs-négatif en EIA avec un TROD

positif et 8 patients étaient AgHBs-positif en EIA avec un TROD négatif (Tableau IV). Parmi

les échantillons sérodiscordants, 6 avaient un ADN du VHB détectable : 1 parmi les EIA

négatifs TROD positifs (2,0 Log UI/mL) et 5 parmi les EIA positifs TROD négatifs (1,3 à 6,5

Log UI/mL).

En ce qui concerne la détection des anticorps anti-VHC, 50 (8,7%) échantillons étaient

discordants : 7 patients étaient séronégatifs en EIA avec un TROD positif et 43 patients

étaient séropositifs en EIA avec un TROD négatif (Tableau V). Parmi les échantillons

sérodiscordants, 4 avaient un ARN détectable : 2 parmi les EIA négatifs TROD positifs

(respectivement, 2,5 et 5,1 Log UI/mL) et 2 parmi les EIA positifs TROD négatifs

(respectivement, 1,1 et 6,6 Log UI/mL). Parmi les patients séropositifs en EIA avec un TROD

négatif, la valeur moyenne signal/seuil de la trousse EIA (VITROS anti-HCV) utilisée pour la

détection des anticorps anti-VHC était de 5,2±7,4 (intervalle des valeurs 1,05-30,1) avec 8

échantillons avec une valeur ≥8. Le CDC (Center for Disease Control and Prevention) a

identifié des valeurs (signal/valeur seuil) pour chacune des trousses sérologiques de détection

des anticorps anti-VHC permettant de prédire à 95% un “vrai“ résultat positif

indépendamment de la prévalence ou des caractéristiques de la population étudiée. Dans le

cas de la trousse VITROS ECi anti-HCV cette valeur était fixée à 8,0.

Tableau III : Performance du test rapide ABON® HBV pour la détection de l’AgHBs par

comparaison à la méthode EIA (VITROS HBsAg)

N=573 EIA (VITROS Eci)

Positif Négatif

ABON®HBV

Positif 510 6

Négatif 8 49


Tableau IV : Performance du test rapide ABON® HCV pour la détection des anticorps anti-

VHC par comparaison à la méthode EIA (VITROS anti-HCV)

N=573

EIA (VITROS Eci)

Positif Négatif

ABON® HCV

Positif 55 7

Négatif 43 468

4.3 Hépatite B

Les caractéristiques virologiques des patients AgHBs-positif sont présentées dans le Tableau

V. Parmi les 573 patients inclus, 523 (91,3%) étaient AgHBs-positifs (associés à la présence

des anticorps anti-HBc totaux). La majorité des patients (88,3%) avait un ADN du VHB

détectable, seuls un tiers avaient une charge virale supérieure à 2000 UI/mL (i.e ≥3,30 Log

UI/mL). Tous les patients étaient infectés par un génotype E. Le titre de l’AgHBs, mesuré par

une méthode de chimioluminescence automatisée (Architect, Abbott), était en moyenne de

3,70±0,60 Log UI/mL. Le titre de l’AgHBs sérique n’était pas corrélé à l’ADN du VHB

(r=0,023, p=NS) (Figure 13). Néanmoins, si la corrélation était évaluée en fonction du statut

HBe (non évalué dans cette étude), une corrélation positive est probable.

Tableau V : Caractéristiques virologiques des patients AgHBs-positif

Caractéristiques (N=523)

ADN du VHB (Log UI/mL) (moy±DS) 3,30±1,50

ADN du VHB ≥3,30 Log UI/mL, n (%) 164 (31,3%)

ADN du VHB <3,30 Log UI/mL, n (%) 298 (57,0 %)

ADN du VHB <1,20 Log UI/mL 61 (11,7%)

Titre de l’AgHBs (Log UI/mL) (moy±DS) 3,70±0,60

Génotype E, n (%) 148100%)


Figure 11 : Analyse phylogénique du gène codant la polymérase de 167 souches du VHB

isolées des patients Togolais avec des souches de référence des différents génotypes du VHB

disponibles dans les banques.


4.4 Hépatite D

Chez les individus AgHBs-positifs, la présence des anticorps anti-HD a été évaluée à l’aide

d’une trousse EIA manuelle Diasorin et Diapro. Parmi les 523 patients AgHBs-positif, 98

(18,7%) patients avaient des anticorps dirigés contre le VHD.

Environ un tiers des individus séropositifs pour le VHD avait un ARN du VHD détectable. La

charge virale moyenne était de 3,40±1,60 Log copies/mL. Le génotype viral a été déterminé

chez 53 des 55 patients ayant un ARN détectable. Tous les sujets sauf 3 (94,3%) étaient

infectés par un génotype 1. Les trois autres patients (5,7%) étaient infectés par un génotype 5.

Tableau VI : Caractéristiques virologiques des patients séropositifs pour le VHD


ARN du VHD (Log cp/mL) (moy±DS) 3,40±1,60

Génotype (n=53)

Génotype 1 50 (94,3%)

Génotype 5 2 (5,7%)


Figure 12 : Analyse phylogénique des séquences nucléotidiques de la région R0 du VHD

isolés dans la population Togolaise par comparaison à des séquences de référence disponibles

dans les banques.


4.5 Hépatite C

Les caractéristiques virologiques des patients positifs pour les anticorps anti-VHC sont

présentées dans le Tableau VII. Parmi les 573 patients inclus, 98 avaient une valeur seuil/ratio

pour la détection des anticorps anti-VHC ≥1 (seuil de positivité défini par le fournisseur de la

trousse). Néanmoins, si l’on considère un ratio de 8 comme permettant de prédire à 95% un

“vrai“ résultat positif indépendamment de la prévalence ou des caractéristiques de la

population étudiée, 62 (10,8%) patients peuvent être considérés comme séropositifs pour le

VHC. Parmi les patients avec un ratio compris entre 1 et 8, tous sauf un avaient un ARN

indétectable. La majorité des patients (83,9%) avait un ARN du VHC détectable avec une

charge virale moyenne de 5,30 Log UI/mL. Une charge virale ≥800 000 UI/mL était observée

chez environ un tiers des patients (Tableau VII).Le génotype viral a été déterminé chez 41

patients des 50 patients ayant un ARN du VHC ≥3 Log UI/mL. Les génotypes 2 et 1

étaient les plus fréquemment isolés et représentaient respectivement, 73,2% et 17,1%. Le

sous-type n’a pu être déterminé chez 20 patients infectés par une souche de génotype 2,

suggérant l’existence d’un nouveau sous-type non décrit dans la littérature. En effet, 20

souches de génotype 2 formaient un groupe monophylétique indépendamment des autres

souches de même génotype avec des valeurs de ré-échantillonnage élevée témoignant de la

robustesse du nœud (Figure 13). Des résultats similaires étaient observés pour certaines

souches de génotype 2 (Figure 13). Le titre de l’antigène de capside (AgC), mesuré par une

méthode de chimioluminescence automatisée (Architect, Abbott), était en moyenne de

3,00±1,00 Log UI/mL. Le titre de l’AgC sérique était positivement corrélé à l’ARN du VHC

(r=0,89, p<0,001) (Figure 16). Aucune différence du titre de l’AgC n’était observée entre les

génotypes du VHC (Figure 13).


Tableau VII : Caractéristiques virologiques des patients séropositifs pour le VHC


ARN du VHC (Log UI/mL) (moy±DS) 5,30±1,00

ARN du VHC ≥800 000, n (%) 17 (27,4%)

ARN du VHC<1,10 Log UI/Ml 10 (16,1%)

Titre de l’AgC (Log UI/mL) (moy±DS) 3,00±1,00

Génotype (n=41)


Génotype 2 30 (73,2%)



Figure 13 : Titre de l’antigène de capside du VHC (AgC, Log fmol/L) en fonction des

génotypes 1 (n =6), 2 (n=30) et 4 (n=3).


Figure 14 : Analyse phylogénique d’une portion du gène NS5B codant l’ARN polymérase

ARN dépendante de 30 souches par comparaison avec des souches de génotype 2 des

différentes sous types disponibles dans les banques.


4.6 Coïnfections

Le statut sérologique du VIH a été déterminé chez tous les patients à l’aide d’une trousse

ELISA de 4ème génération conformément aux recommandations de la Haute Autorité de Santé

(HAS), après obtention du consentement des patients conformément à la réglementation.

Parmi les 573 individus testés, 20 patients étaient séropositifs pour le VIH incluant 16

séropositifs pour le VHB, 3 patients séropositifs pour le VHC et 1 patient séropositif pour le

VHB et le VHC. Au total, 54 patients étaient coinfectés par le VHB et le VHC. Si l’on

considère un ratio de 8 comme permettant de prédire à 95% un “vrai“ résultat positif

indépendamment de la prévalence ou des caractéristiques de la population étudiée, seuls 18

patients avaient à la fois des anticorps anti-VHC et de l’AgHBs incluant 8 patients triplement

infectés par le VHB, le VHD et le VHC.

Figure 15 : Corrélation des titres de l’AgHBs mesurés par l’automate Architect (Abbott) avec

les valeurs mesurées sur les mêmes échantillons avec la plate-forme de PCR en temps réel

CAP/CTM96 (Roche) chez 462 patients.


Figure 16 : Corrélation des valeurs d’antigène de capside du VHC (AgC) mesurées par

l’automate Architect (Abbott) avec les valeurs mesurées sur les mêmes échantillons avec la

plate-forme de PCR en temps réel m2000 (Abbott) chez 49 patients.

Master II BioGeMa 2013-2014 Folly ANYOVI Page 54

DISCUSSION


5. DISCUSSION

Les hépatites virales B et C sont un problème majeur de santé publique dans le monde et en

particulier en Afrique Sub-saharienne (Escobedo-Melendez et al., 2014). Les complications

liées aux infections chroniques telles que cirrhose, décompensation de la cirrhose et

carcinome hépatocellulaire sont responsables d’un grand nombre de décès dans le monde y

compris au Togo. L’Afrique Sub-saharienne est une région de forte endémicité pour le VHB,

en particulier en Afrique de l’Ouest où la prévalence de l’AgHBs est supérieure à 8% avec

des valeurs pouvant atteindre 25% dans certaines régions (Ott et al., 2012). Peu de données

sur la prévalence des virus de l’hépatite B et C sont disponibles au Togo. Une étude récente

menée au Burkina Faso a montré que la prévalence de l’AgHBs était de 14,5% dans la

population générale quant à celle du VHC, elle était de 1,0% (Tao et al., 2014).

Au cours de 3 campagnes de sensibilisation au dépistage des hépatites virales menées entre

2012 et 2014, plus de 21 000 individus ont été dépistés à l’aide d’un TROD incluant 12 679

pour le VHB et 8 837 pour le VHC. Le nombre de personnes dépistées positives pour

l’AgHBs était de 1453 soit une prévalence estimée voisine de 11,5%. Ces données confirment

la forte prévalence du VHB dans la population générale au Togo. En ce qui concerne le VHC,

le nombre de sujets séropositifs était de 200 soit une prévalence estimée de 2,3%. Là encore

ces données confirment la prévalence élevée du VHC dans la population de l’Afrique Sub-

saharienne et sont en accord avec les résultats de la méta-analyse récemment publiée (Rao et

al., 2015). Bien que les TROD représentent une alternative intéressante pour le dépistage de

l’AgHBs et des anticorps anti-VHC, les performances des tests utilisées peuvent être variables

(Chevaliez et al., 2013). Nos résultats ont montré, à partir des patients dépistés positifs à

l’aide d’un TROD et pour lesquels on disposait d’un prélèvement sanguin, que les

performances cliniques du TROD utilisé pour la détection de l’AgHBs étaient satisfaisantes.

Les performances du TROD utilisé pour la détection des anticorps anti-VHC était moins

bonne avec un grand nombre de résultats discordants. Ces résultats soulignent l’importance de

l’évaluation des performances des tests rapides avant leur utilisation en pratique clinique.

Notre étude a montré que les individus porteurs de l’AgHBs étaient infectés exclusivement

par un génotype E, génotype le plus fréquemment isolé en Afrique. Environ 30% des patients

avaient un ADN du VHB supérieurs ou égal à 2000 UI/mL, les rendant éventuellement

éligibles à un traitement antiviral par analogues nucléos(t)idiques (tenofovir ou entecavir)

après prise en compte d’autres critères tes que l’activité sérique des transaminases et le stade

de fibrose.


Aucune donnée sur l’infection par le VHD n’est disponible au Togo. Des données récentes

ont montré qu’il existait de fortes variations de la prévalence delta dans les différentes régions

de l’Afrique Sub-saharienne (Andernach et al., 2014). Nous montrons pour la première fois

qu’environ 20% des patients AgHBs-positif sont coinfectés par le VHD. Le génotype 1 était

le génotype le plus fréquemment isolé au Togo.

La majorité des sujets ayant des anticorps totaux anti-VHC avait également un ARN du VHC

détectable. Les souches de génotype 2 circulent largement au Togo, comme dans de

nombreuses régions de l’Afrique de l’Ouest. Nos résultats suggèrent l’existence d’un nouveau

sous-type non encore identifié qui aurait émergé à partir d’un ancêtre ayant pour origine

l’Afrique de l’Ouest quelques part entre la Guinée et la Gambie (Purdyetal et al., 2015).


CONCLUSION ET

PERSPECTIVES


6. CONCLUSION

Une prévalence élevée du VHB, VHD et du VHC est observée au Togo justifiant la mise en

place d’un programme de vaccination national contre l’hépatite B (vaccination à la naissance)

dans le cadre de l’Expanded Program for Immunization (EPI) débuté en 2001, afin d’assurer

l’immunisation de tous les enfants âgés de moins d’un an d’une part et de faciliter l’accès au

traitement antiviraux d’autre part. En effet, des traitements très efficaces et bien tolérés sont

désormais disponibles. Malheureusement, ils ne sont généralement pas disponibles en Afrique

excepté pour certaines populations en particulier les sujets coinfectés par le VIH et le VHB

qui bénéficient de la mise à disposition du ténofovir. Les antiviraux directs contre l’hépatite C

ne sont pas encore disponibles du fait d’un coût prohibitif limitant considérablement leur

accès dans les pays à faibles ressources.

Les résultats fournis par cette étude permettent d’envisager les perspectives suivantes :

Séquencer les souches du VHC non sous typable et étudier une recombinaison

génétique entre les variants du VHC ;

Etudier l’implication du VHD dans la progression du VHB chez les patients co-

infectés et surinfectés.


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(2004). Vaccination contre le virus de l'hépatite B et sclérose en plaques : état des lieux. Paris,

AFSSAPS Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé, INSERM « Institut

National de la Santé Et de la Recherche Médicale, ANAES Agence Nationale d’Accréditation

et d’Evaluation en Santé ».

(2003). Réunion de consensus Vaccination contre le virus de l'hépatite B. Paris, ANAES,

INSERM.


8. ANNEXES

A. Principe de la Nested PCR

B. Caractérisation des génotypes du VHB (Région RT de la Pol)

- Mode opératoire

Les deux PCR ont été réalisés avec le kit Advantage 2 Polymerase OZYME et amplifié sur

l’appareil Applied Biosystem 2720 Thermal cycler v2.0 (Applied Biosystems, USA), dans un

volume total de 25µl qui contenait 2.5µl de tampon 10X, 2.5µl de dNTP 25mM, 0.5µl de

chaque amorce (Tableau I) sens et anti-sens (10µM), 0.5µl d’enzyme Advantage, 13.5µl

d’H2O stérile et 5µl d’extrait d’ADN.

C. Caractérisation des génotypes du VHD (Région R0)

- Mode opératoire

Pour la réalisation de la RT-PCR, nous avons effectués deux mix : Mix1 pour la RT et Mix2

pour la PCR. La RT-PCR a été réalisé avec un kit d’Applied Biosystems.

- Le mix1 a été faite dans un volume total de 15µl qui contenait 5µl de DNTP 25mM,

1µl d’amorce RP 0.4pM, 4µl d’H2O stérile et 5µl d’extrait d’ARN.

Programme de dénaturation

100°C pendant 5mn

5’ 5’ 3’ 3’

1er PCR

5’ 3’

5’

3’ 5’ 3’ 5’ 3’

Produits de 1er PCR

3’ 5’

2e couple d’amorces

5’ 3’

1er couple d’amorces


- Le mix2 a été faite dans un volume total 25µl qui contenait le mix1, 5µl de tampon

1X, 2.5µl de DTT 10mM, 0.615µl de RANSin 1U/µl, 0.5µl de RT Superscript

100U/µl et de 1.385 µl d’H2O stérile. Le mix2 est rajouté au mix1 tout temps mettant

le mix1 dans les puits de bloc froid à -20°C. la séquence de l’amorce utilisée.

Les produits PCR ont été soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose à 2% (taille attendue

est de : 644 bp) et visualisé sous lumière UV.

D. Caractérisation des génotypes du VHC (Région NS5B)

- Mode opératoire

La RT-PCR de la région NS5B a été réalisé en utilisant la méthode décrite par (Bronowicki et

al 2006). La RT-PCR et le PCR ont été réalisés dans les conditions différentes avec deux Mix

utilisant deux couples d’amorces externes et internes.

- La RT-PCR a été réalisés avec le kit de QIAGEN « OneStep RT-PCR » et amplifié sur

l’appareil Applied Biosystem 2720 Thermal cycler v2.0 (Applied Biosystems, USA),

dans un volume total de 28µl qui contenait 5µl de tampon 5X, 1µl de dNTP, 1.5µl de

chaque amorce NS5B sens externe et anti-sens externe de 10 µM, 1µl d’enzyme mix,

0.1µl de RNAse OUT, 10µl d’H2O qsp 35 µl et 8µl d’ARN.

- Le second PCR a été réalisé avec le kit Advantage 2 Polymerase OZYME et amplifié

sur l’appareil Applied Biosystem 2720 Thermal cycler v2.0 (Applied Biosystems,

USA), dans un volume total de 50µl qui contenait 5µl de tampon Advantage, 5µl de

dNTP 25mM, 1µl de chaque amorce de NS5B sens interne et anti-sens interne de 10

µM, 1µl de polymérase Advantage 2, 32µl d’H2O qsp 20µl et 5µl de produit PCR

onestep.

Préparation du TAE 0,5X (solution tampon Tris/Acétate/EDTA) à partir du TAE

50X : tampon.

Pour ce faire, 10 ml de TAE 50X ont été mélangés avec 1000 ml de l’eau distillée, la solution

obtenue (TAE 0,5X) a été homogénéisée.

Préparation du gel d’agarose 2%

- Deux (02) grammes d’agarose ont été dissous dans 100 ml de TAE 0,5X.


- Une cuisson de la solution obtenue a été réalisée à l’aide d’une micro-onde pendant

quelques minutes.

- ajouter 3 μl de GelRed (0,25µl pour 25ml) au gel puis agité.

- Couler délicatement le gel dans une cuve transparent contenant les peignes en évitant

de faire des bulles, puis laissé à la température du laboratoire pendant 10-15min.

Electrophorèse et Révélation sous la lumière Ultra Violette (UV)

- Le support transparent contenant le gel a été déposé dans la cuve à électrophorèse

contenant du tampon TAE 0,5X de migration.

- Les échantillons ont été déposés sur le gel tout en s’assurant que le tampon de

migration préalablement versé dans la cuve couvre de quelques millimètres le gel.

- Pour ce faire, 2 μl de loading dye ont été mélangés avec 10 μl d’amplifiât par

échantillon et 10µl du mélange sont déposés dans des puits appropriés sur le gel.

- Cinq (05) μl du marqueur de poids moléculaire (Ladder) ont été déposés dans le

premier et le dernier puits.

- Brancher la cuve à 100 volts, et laisser migrer environ 40min

- Le gel a été révélé sous UV, puis photographié grâce à un appareil « GENE

FLASH».

Interprétation des résultats

- La PCR a été considérée positive si l’échantillon présentait une bande

correspondant à la taille du fragment d’ADN attendu (366bp et 344bp). Elle était

négative en absence de bande.

Photographie d’un gel d’agarose montrant l’amplifiât du VHD PM Echantillon


E. Séquençage des acides nucléiques

Photographie d’un éléctrophorégramme de séquençage

F. Purification de l’amplifiât

- Mode opératoire

- Dans des cupules de microplaque PCR, ajouter82µl d’eau distillé stérile à 18µl du produit

PCR, pour obtenir un volume final 100µl ;

- Recouvert la plaque d’un film adhésive, puis centrifuger pendant 15min à 4500trs ;

- Ajouter 20µl d’eau ;

- Vortex pendant 1min avec le film adhésif ;

- Laisser 10 min à la température ambiante ;

- Reprendre l’amplifiât des cupules et les mettre dans l’eppendorf préalablement préparer.

G. Réaction de séquençage de la région Pol du VHB (génotypage)

- Mix senset Mix anti-sens

1,5µl d’amorce sens (SI)et (ASI) anti-sens de 1µM ; 1,5µl de tampon 10X ; 1µl

d’Enzyme (BigDye) ; 5µl d’eau stérile et 1µl du produit purifié le tout dans un

volume réactionnel de 10µl.


96°C pendant 1 min

96°C pendant 10 secX25


60°C pendant 2 min


H. Réaction de séquençage de la région R0 du VHD (génotypage)

- Mix senset Mix anti-sens

3,5µl d’amorce sens et anti-sens (S et AS), tampon 1X ; 2 µl de BigDye ; 9,5µl d’eau

stérile et 4µl du produit purifié dans un volume réactionnel de 18µl.


96°C pendant 1 min



60°C pendant 4 min

I. Réaction de séquençage de la région NS5B du VHC (génotypage)

- Mix sens et Mix anti-sens

1,5µl d’amorce sens (SI) et (ASI) anti-sens de 1µM ; 1,5µl de tampon Enzyme 10X ; 1µl

d’Enzyme (BigDye solution) ; 5,5µl d’eau stérile et 0.5µl de l’ampliât purifié le tout

dans un volume réactionnel de 10µl.


96°C pendant 1 min



60°C pendant 2 min.

epidémiologie moléculaire des hépatites virales b, c et delta ...sont intéressées à...

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