1

MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII ȘI INOVĂRII

UNIVERSITATEA „DUNĂREA DE JOS” GALAŢI FACULTATEA DE ȘTIINŢA ȘI INGINERIA ALIMENTELOR

REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT

CERCETĂRI PRIVIND ÎNCAPSULAREA BACTERIILOR

PROBIOTICE ÎN FABRICAREA PRODUSELOR LACTATE FERMENTATE

Coordonator știinţific, Doctorand, Prof. dr. ing. G. M. Costin Ing. Alexandru Cîrîc

2009

2

4

2.4.5. Maltodextrinele 115

2.4.6. Inulina 119

2.4.7. Bifidobacteriile 124

Capitolul 3. REZULTATE ȘI CONCLUZII 130

3.1. Teste preliminare 131

3.1.1. Alegerea preparatului bacterian utilizat 121

3.1.2. Alegerea agentului încapsulant 135

3.1.3. Alegerea bazei de obţinere a preparatului lichid 138

3.1.4. Alegerea materialului de balast 141

3.1.5. Obţinerea preparatului probitic lichid 142

3.2. Teste de optimizare 144

3.2.1. Alegerea tipului optim de proces 145

3.2.2. Alegerea tipului optim de aparat 154

3.2.3. Alegerea concentraţiilor optime 162

3.2.4. Alegerea variabilelor optime de proces 165

3.2.5. Realizarea preparatului final 177

3.3. Testarea preparatului final 179

3.4. Concluzii 183

3.5. Direcţii viitoare de cercetare 184

BIBLIOGRAFIE 186

5

OBIECTIVELE CERCETĂRII

Premisele demersului știinţific

Ne este tuturor binecunoscută, fie că suntem specialiști în domeniu, fie că suntem doar simpli consumatori ai produselor probiotice, importanţa unei microflore intestinale echilibrate și a unei alimentaţii sănătoase. Microflora intestinală este cea care, acţionând aproape ca un organ al corpului omenesc, ne facilitează digestia anumitor alimente, având un rol important în metabolism, reglează – încă de la naștere – sistemul imunitar și inhibă dezvoltarea anumitor bacterii patogene în intestin. De asemenea, a fost demonstrat importantul rol pe care anumite bacterii probiotice îl joacă în mecanismele reglării colesterolului sangvin sau a inhibării dezvoltării anumitor tipuri de celule canceroase.

Știm, așadar, că microflora intestinală, în special cea probiotică, este benefică. Știm, de asemenea, că această microfloră poate fi scoasă din starea ei de echilibru biologic de anumiţi factori, cum ar fi stările generale patogene ale organismului sau consumul unor antibiotice cu spectru larg, dar și de o alimentaţie dezordonată și neechilibrată. Soluţia oferită încă de la începutul secolului 20 de Metchinikov, a fost suplimentarea alimentaţiei cu bacterii vii, care sunt prezente în alimente precum lactatele fermentate. Nu s-a cunoscut însă, pentru o destul de lungă perioadă de timp, faptul că majoritatea bacteriilor benefice intestinului uman nu au capacitatea de a trece, păstrându-și viabilitatea, prin sucurile gastrice.

Bacteriile considerate la ora actuală ca fiind probiotice se confruntă, mai mult sau mai puţin, cu aceeași barieră și anume capacitatea lor de a-și menţine viabilitatea la trecerea prin stomac și intestinul subţire (Elli et al 2006). În acest sens, un număr semnificativ de studii genetice au fost desfășurate pentru obţinerea unei bacterii probiotice „perfecte”. Genetica pare a fi însă o știinţă pe care omenirea nu o stăpânește încă complet, neavând capacitatea de predicţie asupra dezvoltării ulterioare a unor specii modificate genetic sau asupra impactului lor viitor cu mediul.

Soluţia optimă, cel puţin în stadiul dezvoltării actuale, pare a fi protecţia bacteriilor probiotice pentru a le asigura trecerea prin sucurile gastrice și cele intestinale cu o pierdere cât mai nesemnificativă a viabilităţii (Adhikari et al., 2000, Cîrîc, 2004, Chen et al. 2005, Kailasapathi, 2002,2003)

Sunt cunoscute, de asemenea, cercetările efectuate în acest domeniu de Saarella M. (Saarella, 2008) și de întreaga sa echipă de la VTT Finlanda, privitoare la menţinerea și îmbunătăţirea viabilităţii bacteriilor probiotice, ale lui Behzai S.S. (Behzai, 2008) și ale institutului IFA Tulln din Austria, cu privire la stabilizarea celulelor probiotice, precum și poziţia lui Meiners J.A. (Meiners, 2008) referitoare la posibilităţile de încapsulare a probioticelor și utilizarea lor în forma încapsulată în alimente solide; ca și încercările efectuate de Chavarri et al. (Chavarri, 2008) pentru încapsularea unui simbiotic.

6

Obiectivele cercetării întreprinse.

Având în vedere stadiul dezvoltării actuale a cercetării în domeniu, ne propunem să identificăm metoda optimă de protecţie a bacteriilor probiotice, pentru ca acestea, având o viabilitate cât mai constantă, să își poată atinge ţinta și anume colonul distal.

Astfel, obiectivul central al prezentei lucrări, și implicit al tezei de doctorat, poate fi formulat ca fiind obţinerea unui preparat probiotic cu performanţe superioare, referindu-ne aici în special la viabilitatea bacteriilor probiotice.

După cum am afirmat mai sus, s-a abordat întreaga problemă ca pe un proces de izolare a bacteriei lactice de mediul înconjurător, protejând-o astfel de factorii mediului prin care trece, dar realizând totodată o eliberare controlată a acesteia la nivelul distal al tractului intestinal.

Se ivesc însă o serie de probleme ce ţin de viabilitatea preparatului iniţial supus unor operaţii tehnologice, de materialele utilizate pentru realizarea obiectivului nostru, de tehnologiile aflate la dispoziţie și suficient studiate pentru a putea fi aplicabile în actuala situaţie și, nu în ultimul rând, de anumite caracteristici fizice, chimice și microbiologice ale produsului obţinut în final.

Așadar, pentru atingerea acestui obiectiv central al lucrării, am formulat o serie de obiective intermediare care au constituit etape ale cercetării:

ì Alegerea preparatului probiotic iniţial și caracterizarea acestuia sub aspect microbiologic precum și din punct de vedere al solubilităţii acestuia și al gradului de documentare;

ì Selecţionarea ingredientelor componente ale preparatului final, în afara bacteriilor probiotice în sine, în funcţie de caracteristicile și compatibilitatea acestora;

ì Alegerea tehnicii optime de realizare a procesului de microîncapsulare a unui preparat microbiologic viabil;

ì Alegerea utilajelor și echipamentelor optime pentru obţinerea produsului încapsulat;

ì Elaborarea procesului tehnologic de obţinere a produsului probiotic microîncapsulat;

ì Optimizarea procesului de obţinere; ì Demonstrarea performanţelor superioare ale preparatului probiotic

obţinut sub aspectul viabilităţii. Atingerea tuturor aceste obiective ne poate conduce în final la rezultatul

dorit. Bibliografia care stă la baza lucrării ne va ajuta pe tot parcursul desfășurării experimentelor să nu ne îndepărtăm de obiectivele propuse sau să avem o abordare explorată anterior și ale cărei rezultate nu au fost satisfăcătoare din punct de vedere știinţific.

7

Capitolul 1. STUDIU DOCUMENTAR 1.1. Introducere

Lucrarea s-a dorit a fi, încă de la alegerea temei, o noutate în domeniul produselor probiotice. Dacă până în momentul de faţă, tema probioticelor pare o cale destul de “bătătorită” din punct de vedere tehnologic, prezenta abordare are un caracter interdisciplinar, fiind mai mult decât o lucrare de strictă tehnologie. Tema produselor probiotice este abordată în prezenta lucrare nu numai din punctul de vedere, de acum rutinat, al studierii și enunţării unor efecte benefice pentru organism, ci și sub aspectul unei noi tehnologii și a unor beneficii pentru sănătate calitativ și cantitativ superioare.

Cercetările întreprinse pe plan mondial au arătat că un consum regulat de produse lactate acide poate determina o îmbunătăţire generală a stării de sănătate a consumatorului, atât datorită caracteristicilor lor chimice cât, mai ales, datorită microflorei pe care o “transportă” în tractul digestiv (Costin, 2007).

Deși au existat numeroase studii care au prezentat efectul benefic al microflorei probiotice, majoritatea au fost efectuate doar cu titlu generic, prezentând acţiunea unui produs care avea în momentul consumului un anumit număr de bacterii probiotice per unitatea de studiu (fie că e vorba de doza administrată, fie că este vorba de mililitru sau gram de produs). Se cunoaște de asemenea la ora actuală faptul că viabilitatea microorganismelor conţinute în produsele lactate acide scade odată cu trecerea timpului, și că, după un anumit număr de zile de la data fabricaţiei, produsul, deși încă aflat în standardele de siguranţă alimentară, nu mai conţine un număr suficient de bacterii probiotice viabile.

O a doua problemă apărută în colonizarea tractului digestiv cu bacterii probiotice, fie pe cale alimentară, fie pe cale farmaceutică, este rezistenţa scăzută a acestora la condiţiile de mediu întâmpinate pe tot parcursul tractului digestiv.

Cunoscute fiind cele enunţate mai sus, lucrarea realizează abordarea temei produselor probiotice dintr-un cu totul alt unghi și anume protecţia microorganismelor probiotice pentru asigurarea viabilităţii acestora până la nivel intestinal, acolo unde trebuie să fie eliberate și să colonizeze în mod specific mucoasa intestinală. Acestă lucrare își propune găsirea tehnicii optime de microîncapsulare, testările pornind de la tehnici simple, precum cea de emulsionare-gelifiere și oprindu-se asupra tehnicii de uscare prin pulverizare în cameră de uscare cu ajutorul duzelor ultrasonice.

Aplicarea acestei tehnologii pentru preparatele bacteriene a reprezentat o provocare și o noutate la nivel mondial, având în vedere faptul că pulverizarea cu ajutorul duzelor ultrasonice este ea însăși un domeniu în care cercetarea și dezvoltarea de noi aparate și utilaje nu este decât la început. Avantajele acestei soluţii constau în fluxul continuu în care se poate face încapsularea, în dimensiunile uniforme și ușor de stabilit ale capsulelor și în faptul că tehnologia

8

poate fi scalabilă la nivel industrial fără investiţii majore din partea celor interesaţi. Complexitatea soluţiei ţine de stabilirea variabilelor optime de proces, variabile ce au fost determinate prin încercări și analize multiple. Lucrarea a fost structurată pe trei capitole, acestea urmând de fapt cursul firesc al abordării unei provocări știinţifice, despre care ne-am documentat, am stabilit metodele de abordare ale subiectului și, în final, am găsit calea optimă de rezolvare a problemei. 1.2. Teoria încapsulării – aspecte generale Încapsularea este definită, în general, ca o acţiune de acoperire perfectă a unei substanţe de încapsulat într-o altă substanţă ce formează învelișul exterior, cu scopul de imobilizare, de protejare, de control al transferului, de structurare sau de imprimare a unei anumite caracteristici funcţionale substanţei încapsulate (Vandamme, 2007)

Termeni utilizaţi

Descriere Dimensiuni Ilustrare schematică

microcapsule Produse obţinute prin acoperirea unui miez lichid cu o membrană solidă

µm

nanocapsule Aceeași structură ca și a microcapsulelor, dar dimensiuni mai reduse

nm

microsfere

sau microparticule

Atât miezul (conţinutul) cât si membrana sunt solide. De multe ori nu se poate face o delimitare clară între membrană și conţinut, membrana acţionând ca o matrice poroasă în care substanţele active sunt absorbite.

µm

Nanosfere sau nanoparticule

Aceeași structură ca și microsferele, dar dimensiuni mai mici

nm

lipozomi Membrană lipidică constituită de cele

mai multe ori din fosfolipide și colesterol. Sub-tipuri: unilamelare și multilamelare

µm

niozomi Structură similară lipozomilor, dar membrana este constituită din molecule sintetice amfifilice.

nm

Tabel 1.1. Principalele forme și terminologia utilizată pentru produsele obţinute în urma

operaţiei de microîncapsulare

1.3. Aplicaţii generale industriale ale operaţiei de microîncapsulare.

9

APLICATIILE MICROINCAPSULARII

COSMETICĂ

INDUSTRIA FARMACEUTICA SI

MEDICALA

ELECTRONICA

TRATAREA DESEURILOR

FOTOGRAFIE

GRAFICĂ SI PICTURA

INDUSTRIA TEXTILA

INDUSTRIA DETERGENTILOR

INDUSTRIA CHIMICĂ

BIOTEHNOLOGIE

AGRICULTURA

INDUSTRIA ALIMENTARĂ

PARFUMURI, ENZIME, AGENŢI DE CHELARE, AGENTI DECOLORANTI, ACTIVATORI DE DECOLORARE, ANTISTATICI, INALBITORI,SUBSTANTE ABRAZIVE

MATERIALE CE POT SUFERI TRANZITII DE FAZA, COLORANTI, PIGMENTI, PARFUMURI, BACTERICIDE SI FUNGICIDE, SUBSTANTE REPULSIVE, AGENTI CU EFECT TERMOCROM, STABILIZATORI DE CULOARE, AGENTI

ANTISTATICI, SUBSTANTE IGNIFUGE, AGENTI DE IMPERMEABILIZARE, CATALIZATORI, ENZIME, ADEZIVI, ANTISEPTICI, COMPUSI BIOACTIVI MEDICALI, COMPUSI BIOACTIVI COSMETICI

COLORANTI, REVELATORI, PIGMENTI, PARFUMURI, SOLVENTI ORGANICI, ADEZIVI, COMPUSI FOTOSENSIBILI, COMPUSI TERMOSENSIBILI, TONERE, CRISTALE LICHIDE

HALOGENURI DE ARGINT, PIGMENTI COLORANTI, EMULSII FOTOGRAFICE, COMPUSI FOTOPOLIMERIZABILI, TONERE ELECTROFOTOGRAFICE, COMPUSI FILMOGENI DE INGLOBARE, REVELATORI FOTOGRAFICI, CULORI,

PLASTIFIANTI

MICROORGANISME, SUBSTRATURI, ENZIME CATALIZATOARE, DETOXIFIANTI, DESEURI LICHIDE (SOLIDIFICARE), DESEURI INDUSTRIALE CU RISC POTENTIAL CRESCUT, DESEURI RADIOACTIVE

CRISTALE LICHIDE, MATERIALE CE POT SUFERI TRANZITII DE FAZA, MATERIALE SEMICONDUCTOARE, ADEZIVI, AGENTI DE USCARE, AGENTI DE IGNIFUGARE, AGENTI ANTISTATICI, SUBSTANTE REPULSIVE

ANTIBIOTICE, ANALGEZICE, ANTIPIRETICE, SEDATIVE, INHIBITORI DE PROSTAGLANDINA, CONTRACEPTIVE, INTERFERON, INSULINĂ, SULFONAMIDE, HIDROCORTIZON, CITOSTATICE, FACTOR VII, ALCALOIZI ENZIME,

BACTERII, VITAMINE, MINERALE, AMINOACIZI ESENTIALI, EXTRACTE DE PLANTE, EMULSII ANTIULCER, ABSORBANTI, DETOXIFIANTI, HEMOGLOBINA, ANTIGENI, ANTICORPI, CELULE VII, CELULE TISULARE,

MARCHERI RADIOACTIVI, COLORANTI FLUORESCENTI, AGENTI DE CONTRAST, CRISTALE LICHIDE, MATERIALE CE POT SUFERI TRANZITII DE FAZA

PARFUMURI, ULEIURI ESENTIALE, ANTIPERSPIRANTI, AGENTI UMECTANTI, EXTRACTE DE PLANTE MEDICINALE, HIDROLIZATE PROTEICE, HORMONI, VITAMINE, MINERALE, LIPIDE, ANTIBIOTICE, FUNGICIDE,

ANTISEPTICE, AGENTI BROZANTI, CREME SOLARE, COLORANTI CAPILARI, SUBSTANTE EPILATOARE, ENZIME

CATALIZATORI SI ENZIME, AGENTI OXIDANTI SI REDUCATORI, INHIBITORI DE COROZIUNE, MATERIALE IGNIFUGE, ADEZIVI, AGENTI DE USCARE SI DE INTARIRE, ADITIVI PENTRU MASE PLASTICE, AGENTI DE

UMFLARE, SOLVENTI ORGANICI, APA, MASTIC, COLORANTI SI PIGMENTI, STABILIZATORI DE POLIMERIZARE, AGENTI PROTECTORI UV, ADITIVI DE VULCANIZARE, ADITIVI DE INGLOBARE, FUNGICIDE, ALGICIDE,

SUBSTANTE REPULSIVE,PARFUMURI, ULEIURI ESENTIALE, LUBRIFIANTI, RASINI SCHIMBATOARE DE IONI, MATERIALE CROMATOGRAFICE, MATERIALE HIDROSCOPICE

ENZIME IMOBILIZATE, COMPLEXE MULTIENZIMATICE, MICROORGANISME, CELULE VII, CELULE ARTIFICIALE, COMPEXE CELULARE (HIBRIZI), CULTURI TISULARE, ANTICORPI MONONUCLEARI, MARCHERI, ADN SI ARN, COMPUSI NUTRITIONALI, ALIMENTATIE PENTRU ACVACULTURA, SUBSTANTE ABSORBANTE, MATERIALE

CROMATOGRAFICE

INSECTICIDE, ACARICIDE, NEMATOCIDE, MOLUSCIDE, IERBICIDE, ALGICIDE, FUNGICIDE, FEROMONI, SUBSTANTE REPULSIVE, HORMONI VEGETALI, FERTILIZANTI PARTICULARI, MICROELEMENTE, BIOINSECTICIDE

MICROBIENE

AROME, ULEIURI ESENŢIALE, SARE, COLORANŢI, EXTRACTE DE PLANTE, ANTIOXIDANŢI, ULEIURI, CONSERVANŢI, VITAMINE, MINERALE, AGENTI ANTI-INGHET, AGENTI DE INGROSARE, ACIZI GRASI ESENTIALI, AMINOACIZI, DROJDII, ENZIME, MICROORGANISME, INDICATORI DE TEMPERATURĂ, ACIDIFIANTI, PLANCTON

ARTIFICIAL, PRINCIPII ACTIVI (PENTRU MASCAREA GUSTULUI)

Figura 1.3. Aplicaţiile încapsulări

11

1.4. Metode de microîncapsulare utilizate 1.4.1. Materiale utilizate in procesul de microîncapsulare

Materiale de încapsulare

Materiale hidrofile Materiale hidrofobe

Ceruri Lipide PolimeriCarbohidrati Proteine

Nemodificaţi Modificaţi Gume

Vegetale Animale

ZahărSirop de glucoză

MaltodextrineAmidon

DextrineCiclodextrine

Octenil succinat

Guma acaciaAlginat

Guma xantan

Proteina de soiaGluten

Proteina din orez

GelatinaGelatina de peste

CazeinaProteine din zer

Albumina

Ceara de albineParafină Lecitina Shellac

Figura 1.4. Materiale încapsulante din industria alimentară

1.4.2. Metode tehnice de microîncapsulare

Prilling Pulverizare Emulsionare Micro-emulsionare

Solidificare „Hot-melt” Spray-coolig Spray-freezing

Spray-congealing

Emulsionare/ cristalizare

Evaporare Spray-drying (uscare prin pulverizare

propriu-zisă)

Emulsionare/ evaporare solvent

Gelifiere Gelifiere ionică sau termică

Spray-chilling Emulsionare/ gelifiere

Polimerizare Polimerizare interfazică, polimerizare în suspensie

Polimerizare interfazică

Coacervare Coacervare interfazică sau formare de complecși polielectroliţi

Coacervare simplă sau complexă

Tabel 1.2. Terminologie uzuală a metodelor de încapsulare, pornind de la metodele de dispersare a lichidului

1.5. Funcţionalităţi și constrângeri ale bacteriilor lactice probiotice 1.5.1. Aparatul digestiv – fiziologie și microbiologie

Pentru a putea înţelege mai bine modul de acţiune al bacteriilor probiotice și beneficiile pe care acestea le aduc organismului gazdă, trebuie mai întâi să

12

avem o privire de ansamblu asupra fiziologiei aparatului digestiv uman și a microflorei tubului digestiv, atât în condiţii normale cât și în stări patogene.

Figura 1.17. Evoluţia numărului de microorganisme de-a lungul tractului digestiv 1.5.2. Motivaţia utilizării aportului extern de bacterii vii.

Scăderea numărului de bacterii benefice din intestin, datorată, de exemplu, administrării unor antibiotice cu spectru larg, poate afecta echilibrul microbian intestinal și capacitatea organismului de a digera complet anumite alimente. Sunt administrate de obicei antibiotice pentru vindecarea unor boli, datorate unor infecţii, dar poate apărea și un consum neintenţionat de antibiotice prin consumarea cărnii sau laptelui provenit de la animale aflate sub tratament. Antibioticele pot cauza forme de sindrom diareic specific (ADD – antibiotic-asociated diarrhea), prin iritarea intestinului, dezechilibrarea microflorei intestinale sau prin posibilitatea de a se dezvolta oferită bacteriilor patogene. Un alt efect nedorit al antibioticelor este apariţia unui număr din ce în ce mai mare de bacterii rezistente la antibiotice, care pot crea adevărate epidemii, datorită absenţei răspunsului la medicamentele uzuale (Czarnecki, 2008).

Modificarea numărului și speciilor existente în microflora intestinală poate conduce la imposibilitatea organismului de a fermenta carbohidraţii și de a metaboliza acizii biliari, fapt care generează diareea.

Reducerea nivelului anumitor bacterii stimulează dezvoltarea în număr mare a altora, precum Clostridium difficile și Salmonella kedougou, care pot conduce la stări de boală ale tractului intestinal.

Microflora intestinală se modifică de asemenea în cazul unor îmbolnăviri grave, acum nu doar datorită antibioticelor, ci și ischemiei intestinale, lipsei

13

apetitului și compromiterea sistemului imunitar. Efectele negative ale acestor stări au condus la căutarea unor posibilităţi de a se realiza o decontaminare selectivă a tractului digestiv, care să înlăture bacteriile patogene, stimulând astfel recolonizarea tractului cu bacterii benefice. Această recolonizare poate fi generată de organismul însuși sau poate veni din exterior. Aportul de bacterii vii, benefice, din exterior poate veni pe doua căi: prin farmabiotice sau prin probiotice. 1.5.3. Influenţa produselor lactate funcţionale asupra sănătăţii

Nr. crt.

Denumire Produse lactate în care sunt prezente

Beneficii pentru sănătate

1 2 3 4 1 Lactobacillus casei

• DN 114001

• Shirota

• GG (ATCC 53103)

Actimel (Danone) Yakult Culturelle, Gefilus, LC1

stabilizarea nivelului de bifidobacterii existent în tractul intestinal și scăderea numărului de microorganisme producătoare de indoli și fenoli

2 Lactobacillus reuteri

• RC14

• ATTC PTA-4965

• ATTC PTA-4964

Stoneyfield Yogurt sănătatea intestinului, imunitatea generală și sănătatea cavităţii bucale

3 Lactobacillus acidophillus

• NCFB 1748

• LA5

Arla Acidophilus, majoritatea produselor lactate comerciale probiotice uzuale

îmbunătăţirea microflorei intestinale, efecte de stimulare a creșterii, intensificarea acţiunii β-galactozidazei, acţiune hipocolesterolemiantă, acţiune de control a cancerului

4 Lactobacillus rhamnosus

• 271

• VTT E-97800

Primaliv

efect antimicrobian asupra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus

cereus și Clostridium

perfringens 5 Lactobacillus plantarum

• 229v în curs de cercetare

6 Bifidobacterium

• Bb-12

majoritatea produselor lactate comerciale probiotice uzuale

îmbunătăţirea metabolismului proteic, îmbunătăţirea metabolismului vitaminic, acţiune antibacteriană (diminuarea numărului de bacterii patogene și de putrefacţie), prevenirea constipaţiei, tratamentul bolilor hepatice, efecte imunoactivatoare

Tabelul 1.4. Bacterii probiotice, produse lactate în care sunt prezente comercial și efectele lor asupra stării de sănătate

14

Capitolul 2. MATERIALE ȘI METODE DE LUCRU 2.1.Metode de analiză

Lucrările experimentale desfășurate au avut ca scop optimizarea procesului de încapsulare prin obţinerea unor preparate cât mai stabile, cu o granulozitate cât mai uniformă și situată sub 30µm (limita de percepţie a limbii umane), fără ca viabilitatea preparatului să fie afectată în mod dramatic.

În acest sens s-au efectuat analize fizico-chimice pentru determinarea activităţii apei în produsul final precum și a vâscozităţii gelurilor intermediare obţinute.

De asemenea s-au efectuat analize microbiologice și biochimice ale produsului finit precum și a produselor iniţiale și intermediare, având ca scop determinarea viabilităţii bifidobacteriilor, dar și siguranţa alimentară a produselor obţinute. În plus, pentru demonstrarea ipotezelor formulate și atingerea obiectivelor propuse s-au utilizat și metode de simulare biomedicală. 2.1.1. Analize fizico-chimice

a. Determinarea activităţii apei Activitatea apei a fost determinată cu ajutorul aparatului Ebro AVX3001 din dotarea Institutului de Cercetări Alimentare

b. Determinarea vâscozităţii Determinarea vâscozităţii a fost necesară pentru stabilirea tipului de duză

ce poate fi utilizat la pulverizarea produsului ce are în compoziţie hidrocoloizi și pentru stabilirea concentraţiei de hidrocoloizi. Determinarea a fost realizată cu ajutorul vâscozimetrului Visco-Star R aflat în dotarea Institutului de Cercetări Alimentare 2.1.2. Analize microbiologice

a. Determinarea bifidobacteriilor Analiza a fost utilizată pentru determinarea numărului total de bacterii

viabile în preparatele de Bb-12. Metoda folosită este utilizata în mod curent în Laboratoarele de cercetare ale Companiei de Cercetări Aplicative și Investiţii – Institutul de Cercetări Alimentare b. Teste de confirmare a purităţii culturii utilizate și a selectivităţii mediului MRS-NNLP I. Determinarea bacteriei Lactobacillus acidophilus

Determinarea bacteriei Lactobacillus acidophilus a fost realizată pentru a confirma absenţa sau prezenţa în cultura iniţială a Lactobacillus acidophilus

II. Testare biochimică de confirmare a existenţei bifidobacteriilor cu ajutorul testelor API

Sistemul API a fost utilizat pentru confirmarea coloniilor dezvoltate pe mediul MRS-NNLP ca fiind colonii de bifidobacterii.

Sistemul API 20A dă posibilitatea identificării ușoare și rapide a anaerobilor, cu ajutorul a 21 de teste biochimice. Aceste teste sunt completate sau în completarea altor teste (cultivarea pe mediu selectiv teste microscopice), rezultatele obţinute folosind la confirmarea și identificarea completă

15

2.1.3.Test de confirmare a încapsulării și eliberării controlate a

bifidobacteriilor

Pentru simularea mediului purtător căruia îi sunt destinate, în testările ulterioare, acest tip de produs, se adaugă 1 gram pulbere la 9 ml lapte steril. Se obţine o suspensie de particule în lapte care este menţinută sub agitare. Din suspensia obtinută se trece, în tuburi Eppi de 1,5ml, 0,1 ml și se adaugă 0,9 ml din soluţia de simulare a sucului gastric. Se inchide tubul Eppi și se agită puternic, până la realizarea unei suspensii omogene în tub. Se deschide iar tubul și se așază în suportul special din AnaeroJar, se închide AnaeroJar-ul, se introduce dioxid de carbon până la 0,5 atm și se incubează în termostat la 37°C. După 120 de minute de termostatare, tuburile Eppi se scot din AnaeroJar, se închid cât mai rapid și se introduc la centrifugare. Centrifugarea se face la 8000 rpm timp de 10 minute. Supernatantul rămas se indepartează complet, având însă grijă să nu se pipeteze din decantat. Peste decantatul obţinut se adaugă 0,9ml din soluţia de simulare a bilei, se inchide tubul Eppi și se agită puternic până la suspendarea completă a decantatului în soluţie. Se deschide tubul și se așază în suportul special din AnaeroJar, se inchide AnaeroJar-ul, se introduce dioxid de carbon până la 0,5 atm și se incubează în termostat la 37°C. După 60 de minute de termosatatre, tuburile Eppi se scot din AnaeroJar, se închid cât mai rapid și se introduc la centrifugare. Centrifugarea se face la 8000 rpm timp de 10 minute. Supernatantul rămas se îndeparteaza complet, având însă grija să nu se pipeteze din decantat. Se repetă etapa anterioară, singura modificare fiind adăugarea soluţiei de simulare a sucului pancreatic în locul lichidului de simulare a bilei. 2.2. Studiu microscopic 2.2.1. Microscopie optică

Microscopul optic (fotonic) utilizează spectrul luminii vizibile sau, în cazuri speciale, radiaţiile ultraviolete. Cu ajutorul acestui microscop, obiectele pot fi examinate în stare nativă sau după ce sunt fixate și colorate. 2.2.2.Microscopie electronică de baleiaj (SEM)

S-au folosit metode chimice de fixare utilizate în microscopia electronică cu formaldehidă tamponată, urmată de postfixare în soluţie tamponată de tetraoxid de osmiu 1% timp de două ore. După spălare și deshidratare în acetonă preparate au fost uscate pe hartie de filtru. S-au utilizat metode de crestere a conductibilităţii electrice a preparateor obţinute, prin carbonatare și metalizare cu aur. Vizionarea s-a facut la microscopul Quanta 200 aflat în dotarea Universităţii « Dunărea de Jos » din Galaţi. 2.3. Tehnici de încapsulare utilizate 2.3.1. Emulsionare-gelifiere ionotropică

Se prepară o soluţie apoasă de alginat de sodiu 2% la care se adaugă o soluţie tampon pentru a asigura pH=8. În soluţia de alginat (20ml) se adaugă suspensia de substanţă de încapsulat (10ml). Peste acest amestec se adaugă 5ml

16

suspensie de ioni de calciu (carbonat de calciu) în proporţie de 500mM Ca2+, ulei de floarea soarelui și ca emulgator SPAN 80. Pentru emulsionare am folosit un agitator magnetic reglat la turaţia 250rpm timp de 15 minute. S-a obţinut astfel o emulsie de tip A/U. După emulsionare se adaugă cu agitare continuă 20ml ulei de floarea soarelui în care au fost emulsionaţi 0,1 moli acid acetic în scopul eliberării ionilor de calciu necesari procesului de gelifiere ionotropică a soluţiei de alginat. După 10 minute de agitare, peste emulsia A/U se adaugă în picătură, cu amestecare ușoară, 150 ml soluţie CaCl2 0,05mMol/l pentru inversarea de fază a emulsiei. După separarea fazei uleioase, ar loc filtrarea fazei apoase printr-un filtru de sticlă, care se spală cu soluţie de TWEEN 1%. După filtru se prelevează probe de gel care se supun experimentărilor ulterioare. 2.3.2. Extrudare

S-a preparat o soluţie de alginat de sodiu 1% în soluţie ¼ strength Ringer, soluţie al cărei pH a fost de 7,9. În 20 ml soluţie au fost adăugaţi 10 ml suspensie de bifidobacterii. Amestecul astfel obţinut a fost aspirat în seringă și picurat prin acul acesteia într-un pahar cu soluţie de CaCl2 (Fluka 21108) 0,05mMol/l. Picurarea s-a efectuat de la înălţimea de 10 cm deasupra nivelului de lichid.

Granulele astfel obţinute au fost menţinute în soluţia de întărire timp de 30 de minute, după care amestecul a fost filtrat prin instalaţia de filtrare cu pompă de vacuum (figura 2.6.). Filtrul a fost ulterior uscat în curent de aer la temperatura ambiantă, și s-au recoltat probele de capsule obţinute. 2.3.3. Uscare prin pulverizare

Principiul fundamental presupune pulverizarea unui lichid, îndepărtarea unei părţi cât mai mari din lichidele evaporabile din compoziţia acestuia și colectarea particulei uscate. În anumite cazuri tendinţele soluţiilor utilizate de a realiza fenomene de înglobare pot fi stimulate pentru a conduce la procese de microîncapsulare. De asemenea procesul poate fi coordonat în așa fel încât sa obţinem particule cu dimensiunea, umiditatea și textura dorită.

A. Sistemul de uscare prin pulverizare SonoDry750 cu duză ultrasonică SonoDry750 este un sistem de uscare prin pulverizare destinat utilizării directe pe masa de laborator. Este folosit în mod uzual pentru uscarea soluţiilor apoase sau a suspensiilor, într-un singur ciclu de uscare. SonoDry750 poate lucra și cu solvenţi organici, în acest caz fiind necesară funcţionarea împreună cu componenta opţională Nitrogen InertLoop. Sistemul este controlat prin intermediul

unui PLC asociat unui display LCD, cu ajutorul căruia pot fi setate și urmărite variabilele de proces, fie în sistem manual, fie în sistem automat. De asemenea

Figura 2.7. Instalaţia de uscare prin pulverizare SonoDry750

17

sistemul poate fi comandat cu ajutorul unui software specific, prin legarea staţiei centrale a sistemului la un computer prin intermediul unei interfeţe serial. Aparatul are în dotarea standard două cicloane de separare, pentru a se putea face o separaţie pe două fracţiuni granulometrice a preparatului obţinut. Principiul funcţional SonoDry750 operează în mod normal ca un uscător prin pulverizare în care fluidele circulă echicurent, atât produsul pulverizat cât și fluidul fierbinte având aceeași direcţie de circulaţie. Dacă aparatul este utilizat ca uscător cu duza de pulverizare pneumatică, aerul comprimat este utilizat pentru dispersarea fluxului de lichid în picături fine, care vor fi uscate în ciclon. Atunci când se utilizează duza ultrasonică, lichidul se pulverizează pe suprafaţa rezonantă a duzei. Aparatul are posibilitatea de programare a următorilor parametri: temperatura de intrare a gazului de uscare, debitul de gaz circulant, depresiunea sistemului, debitul de lichid dozat și debitul de gaz de pulverizare. Pulverizarea cu ajutorul ultrasunetelor

Pe scurt, atunci când un film de lichid este așezat pe o suprafaţă plană care este pusă în mișcare vibratorie în așa fel încât vibraţia să fie perpendiculară pe suprafaţa respectivă, lichidul absoarbe o parte din energia vibraţională care este transformată în unde staţionare. Aceste unde, cunoscute sub denumirea de unde capilare, formează un model de forma unei reţele rectangulare la suprafaţa lichidului, cu creste și depresiuni alternante ce se extind în toate direcţiile (precum ilustrat în figura 2.9.) Când amplitudinea vibraţiilor este crescută, amplitudinea crestelor crește

corespunzător, acestea devenind mai proeminente iar depresiunile mai adânci. La amplitudinea critică, undele capilare nu își mai pot menţine stabilitatea. Drept urmare pelicula cedează și mici picături de lichid sunt aruncate de pe suprafaţa lichidului, suprafaţa ce este paralelă cu suprafaţa de pulverizare. B. Sistemul de uscare prin pulverizare Büchi B-290

Aparatul Büchi Mini Spray Dryer B-290 este un echipament de laborator produs de Büchi în colaborare cu Niro în scopul simulării cât mai bune la scară de laborator a condiţiilor și fenomenelor ce au loc în uscătoarele semiindustriale și industriale produse de Niro.

Figura 2.9. Suprafaţă de pulverizare ultrasonică

18

Aparatul impresionează utilizatorul prin multitudinea de echipamente opţionale cu care poate fi dotat, dar și prin versatilitatea sa și posibilitatea de adaptare pentru o gama foarte largă de produse ce pot fi uscate cu ajutorul lui. Vorbim aici atât de produsele având ca solvent apa, cat și de produsele pe bază de solvenţi organici. Echipamentul Büchi B-290 Advanced pe care s-au efectuat testările aparţine Institutului de Cercetări Alimentare al Companiei de Cercetări Aplicative și Investiţii S.A. București și are ca dotări opţionale următoarele: Inert Loop B-295, Dezumidificator B-296, Filtru de ieșire și Filtru de intrare.

C. Sistemul de uscare prin pulverizare semiindustrial NIRO

Sistemul de uscare prin pulverizare semiindustrial NIRO ATOMIZER este un uscător destinat staţiilor pilot, cu încălzire electrică și un singur ciclon de separator de pulberi. Pulverizarea este realizată cu ajutorul unui disc de pulverizare cu turaţie maximă de 30000 rot/min. Capacitatea de evaporare a instalaţiei este de 13 litri apă evaporată pe oră.

2.4. Materiale utilizate pentru obţinerea microcapsulelor probiotice

Lucrarea a urmărit sursele, structura, metodele de obţinere, proprietăţile și siguranţa alimentară a următoarelor substanţe: 2.4.1. Gelatina

Gelatina este o substanţă solidă, translucidă, incoloră, casantă și de cele mai multe ori fără un gust specific, extrasă din colagen de origine animală. Este utilizată ca agent de gelifiere în industria alimentară, farmaceutică și cosmetică. Gelatina este un hidrolizat ireversibil al colagenului.

Figura 2.12. Mini Spray Dryer B-290

Figura 2.17. Sistemul de uscare NIRO aflat în dotarea C.C.A.I. S.A. București

19

2.4.2. Proteine din zer Concentratele proteice din zer sunt amestecuri de pulberi ce au la bază preparate din zer, tratat tehnologic în diferite moduri, pentru a obţine o concentraţie proteică net superioară celei iniţiale. 2.4.3. Amidon

Amidonul este un polizaharid vegetal de rezervă, constituent principal al alimentelor ce folosesc drept materii prime cereale sau produse derivate din cereale 2.4.4.Alginaţii

Majoritatea algelor brune, cu dimensiuni mari, sunt potenţiale surse de alginat. Proprietăţile alginatului obţinut variază în funcţie de specia algelor din care acesta se extrage, așadar alegerea algelor ce vor fi recoltate în scopul obţinerii de alginat se bazează atât pe disponibilitatea, dar și pe proprietăţile alginatului pe care ele îl conţin. 2.4.5. Maltodextrinele

Maltodextrinele, aceste substanţe simple și pentru mult timp neluate în considerare la adevărata lor valoare, încep să evolueze și tind să treacă peste statutul lor iniţial de simple ingrediente alimentare. În afară de rolul lor tradiţional, de aditiv folosit pentru creșterea în volum, fără a influenţa valoarea nutritivă a produsului, și de material suport, maltodextrinele tind, în ultimii ani, să fie folosite cu rol de înlocuitor al grăsimilor, de suplimente nutriţionale sau de formatoare de filme superficiale, cu o multitudine de aplicaţii în industria alimentară și nu numai. 2.4.6. Inulina

Inulina, un carbohidrat nedigerabil, este un fructan care nu este doar o substantă regăsită în multe plante drept substanţă de rezervă, ci intră în dieta zilnică a oamenilor de câteva secole. Este prezentă în multe legume, fructe și cereale consumate în mod curent, printre care menţionam ceapa, usturoiul, grâul și cicoarea. 2.4.7. Bifidobacteriile

Fermentarea cu bacterii lactice este una dintre cele mai vechi metode de procesare a alimentelor și de conservare a lor. Produsele fermentate cu ajutorul bifidobacteriilor sunt considerate ca având anumite beneficii profilactice, probiotice și terapeutice. Alimentele ce conţin bifidoacterii sunt bine împământenite în obiceiurile alimentare din ţări precum Japonia sau anumite ţări de vestul Europei și se află într-o continuă creștere în preferinţele publicului din America de Nord și Australia. Datorită acestui fapt, din ce în ce mai multe iaurturi existente pe aceste pieţe conţin Bifidobacterii. În lucrare sunt discutate câteva aspecte legate taxonomia și locurile de apariţie și dezvoltare a acestor bacterii, ecologia tubului gastrointestinal, caracteristicile de creștere și metabolizarea carbohidraţilor de către bifidobacterii.

20

Capitolul 3. REZULTATE ȘI CONCLUZII

Pentru o prezentare schematică a lucrărilor experimentale, am realizat schema logică a cercetării experimentale realizate. Această schemă este prezentată în figura 3.1.

Alegerea preparatului bacterian utilizat

Alegerea agentului încapsulant

Alegerea bazei de obţinere a preparatului lichid

Alegerea materialului de balast

Alegerea tipului optim de proces

Alegerea tipului optim de aparat

Alegerea concentraţiilor optime

Alegerea variabilelor optim e de proces

Este preparatul bacterian optim pentru obiectivele asumate?

Are subtanţa aleasă caracteristicile dorite?

Este solu ţia aleasă compatibilă cu restul amestecului?

Numarare bifidobacterii

Test APITest lactobacili

Este materia lul ales pretabil operaţiilor tenologice că rora va fi supus?

Preparat bacterian lichid

Conduce procesul la atingerea obictivelor asumate?

Furnizează utilizarea aparatului cele mai bune rezultate?

Sunt concentraţiile utilizate necesare ș i suficiente scopului utilizării?

Preparat bacterian m icroîncapsulat

Este procesul optim izat tehnologic?

Extrudare

Emulsionare gelifiere

Pulverizare

NIRO

BUCHI

SONODRY

Bifidobacterii

Maltodextrine

Alginat

Temperatura uscare

Frecvenţa duză

Debit de preparat

Puterea duzei

Debit de aer

START

NU

NU

NU

NU

NU

NU

NU

NU

DA

DA

DA

DA

DA

DA

DA

DA

Capitol numă rul

3.1.4.

3.2.1.

3.2.2.

3.2.3.

3.2.4.

3.1.2.

3.1.1.

3.1.3.

TESTE PRELIM INARE

TESTE DE OPTIMIZARE

Figura 3.1. Schema logică a experimentelor realizate

21

3.1.Teste preliminare Testările preliminare au fost realizate cu scopul determinării proprietăţilor

materialelor ce vor intra în compoziţia preparatului final. Acest tip de testări sunt necesare deoarece, așa cum am menţionat anterior, proprietăţile individuale ale fiecărui component ce intră în structura capsulelor sunt determinante atât pentru modul de conducere a procesului tehnologic de obţinere cât mai ales pentru proprietăţile ulterioare ale produsului. În cazul de faţă testele preliminare iniţiale au avut în vedere o gamă relativ mare de substanţe. Pe măsura efectuării parţiale a testelor preliminare și odată cu începerea testelor de optimizare, numărul de substanţe rămase în testare a fost restrâns din ce în ce mai mult, ajungându-se în final să fie complet testate doar ingredientele care iau parte la obţinerea preparatului. Vom alege, așadar, preparatul bacterian pe care îl vom utiliza, polimerul cu care vom realiza încapsularea, lichidul de bază a amestecului precum și materialul de balast. În alegerea acestora trebuie ţinut însă cont de câteva reguli simple:

I. Substanţele utilizate trebuie sa fie biocompatibile II. Substanţele utilizate trebuie să fie acceptate pentru utilizarea în

alimentaţia umană III. Să existe compatibilitate între toţi participanţii la amestec. IV. Să nu existe reacţii secundare între componentele amestecului V. Componentele utilizate să fie pretabile tuturor operaţiilor pe care le

presupun experimentele realizate. 3.1.1.Alegerea preparatului bacterian utilizat

În experimentele efectuate s-a plecat de la premisa că preparatul bacterian liofilizat utilizat pentru obţinerea preparatului probiotic lichid poate fi atât un preparat monocultură cât si un amestec de culturi probiotice. S-a pornit, așadar, de la patru culturi liofilizate, dintre care două monoculturi de bifidobacterii și două culturi mixte probiotice (DI-PROX BF 801- Bioprox, Bb-12 - Chr. Hansen, ABT-4 - Chr. Hansen, BAT - Sacco pentru MTC România) Concluzii

Punctajul maxim a fost înregistrat de către preparatul Chr. Hansen. Cu un număr mediu a trei loturi distincte de 6,6 x 1011 unităţi formatoare de colonii pe gramul de cultură liofilizată, cultura liofilizată Bb-12 de la Chr. Hansen s-a dovedit a fi cea mai viabilă cultură dintre cele testate. De asemenea solubilitatea culturii a fost bună în apă distilată sterilă. Teste ulterioare au demonstrat o și mai bună dizolvare in lapte degresat reconstituit, mediu căreia îi este destinată o astfel de cultură.

Din punctul de vedere al documentării acestei tulpini, date suficiente au fost furnizate, la cerere, de reprezentanţa locala a companiei Hansen, iar adiacent acestora au fost întâlnite studii în literatura consultată, realizate de către diverși cercetători sau institute de cercetare, cu scopuri mai mult sau mai puţin comerciale. În plus, preţul acestui preparat este comparabil cu al preparatului companiei Bioprox.

22

Preparatul Bb-12 produs de a fost selectat pentru a fi folosit în continuare în testările având ca scop obţinerea unui preparat bacterian microîncapsulat. 3.1.2. Alegerea agentului încapsulant

Experimentele realizate au avut în vedere găsirea unui agent încapsulant care, la o cât mai mică concentraţie în produs să realizeze efectul maxim de încapsulare. Din literatura parcursă a rezultat că pentru operaţia de încapsulare sau pentru cea de microîncapsulare a unor substanţe active se pot folosi următoarele: gumele naturale, proteinele zerului, alginaţii, amidonul si amidonul modificat, dextrinele și derivaţii glucozei, gelatina, polimerii sintetici (cum sunt poliacrilaţii), silicaţii etc. Dintre acestea cel mai des utilizate în încercările reușite de încapsulare a organismelor vii au fost guma shellac în combinaţie cu alginatul de sodiu, gelatina, amidonul, alginatul de sodiu si proteinele zerului. Deoarece guma shellac este, pe lângă preţul descurajant pentru astfel de aplicaţii, și greu de găsit, s-a renunţat la testarea unui astfel de amestec (shellac și alginat), evidentă fiind neeconomicitatea și greutatea cu care ar putea fi realizat industrial. Concluzii

Agentul de încapsulare optim pentru atingerea obiectivelor propuse, dintre materialele supuse testării, este alginatul de sodiu produs de Sigma.

Acest produs are următoarele caracteristici: pH: 6-8; vâscozitate: 100-200 mPa*s (soluţie apoasă 1%); conţinut de acid guluronic 65-70%; conţinut de acid manuronic 25-35%. Produs va fi folosit in continuare pe parcursul experimentelor și va fi numit alginat de sodiu. 3.1.3. Alegerea bazei de obţinere a preparatului lichid

Baza de obţinere a preparatului lichid este deosebit de importantă, deoarece aceasta trebuie să îndeplinească mai multe condiţii simultan pentru a asigura o structură omogenă preparatului final, dar și pentru a nu afecta în mod negativ funcţionalitatea amestecului.

Astfel, aceasta substanţă trebuie să fie biocompatibilă, dar și inertă din punct e vedere chimic faţă de agentul de încapsulare și faţă de eventualul material de balast. Am studiat trei posibile substanţe: laptele degresat reconstituit, apa bidistilată sterilă și soluţia ¼ strength Ringer Concluzii

Baza optimă de realizare a amestecului probiotic lichid este soluţia ¼ strength Ringer. Conţinutul de calciu liber în această soluţie este sub nivelul de 120 mg/l și în cazul folosirii ei nu se pune problema unei diferenţe de presiune osmotică atunci când se realizează o suspensie de bacterii.

Drept concluzii colaterale putem spune în primul rând că substanţele complexe pot influenţa în mod negativ posibilităţile de realizare ale amestecului lichid iar în al doilea rând menţionăm valoare de 120 mg/l calciu liber, valoare la care deja se realizează gelifierea unei soluţii de alginat 1%.

Soluţia adoptată este dacă nu și soluţia perfectă, cu siguranţă soluţia cea mai bună și la îndemână în această situaţie.

23

3.1.4. Alegerea materialului de balast

Termenul general de „material de balast” a fost adoptat pentru a denumi substanţa sau amestecul de substanţe inerte pe parcursul operaţiilor tehnologice desfășurate pentru obţinerea produsului finit, al căror rol singular este acela de a adăuga un plus de substanţă uscată amestecului lichid, în cazul în care o anumită operaţie tehnologică sau un anumit utilaj folosit necesită existenţa unui minim de substanţă uscată în soluţie, minim care nu este atins doar prin adăugarea componentelor funcţionale.

În cazul de faţă, adăugarea materialului de balast a fost necesară în cazul operaţiei de uscare prin pulverizare, niciunul dintre utilajele de uscare prin pulverizare utilizate în testări neputând obţine rezultate bune în cazul în care amestecul lichid pulverizat are un conţinut de substanţă uscată sub 13%.Ca material de balast am testat două produse: Fibruline Instant – Cosucra și Dry MD 01960 – Cargill Concluzii

În cazul inulinei s-a observat o lipire accentuată în zona duzei de pulverizare și pe pereţii turnului de uscare. Acest lucru a condus și la obţinerea unei cantităţi foarte mici de inulină uscată in vasul de decantare a pulberilor.

În cazul soluţiei de maltodextrină turnul de uscare a rămas mult mai curat, cantitatea obţinută in vasul de decantare a pulberilor fiind semnificativ mai mare.Aceste observaţii, întărite de faptul că produsul denumit Fibruline are un conţinut mare de mono si dizaharide, ne-au condus la alegerea ca material de balast a maltodextrinelor. 3.1.5. Obţinerea preparatului probiotic lichid

Obţinerea preparatului probiotic lichid este faza anterioară obţinerii capsulelor și uscării acestora. Acest preparat trebuie să fie perfect omogen, să nu prezinte bule de aer sau aglomerări ale substanţelor pulverulente 3.2.Teste de optimizare

Dacă în urma testărilor preliminare am obţinut preparatul lichid, suspensia de celule vii într-un polimer gelifiant, testele de optimizare urmăresc găsirea celor mai bune metode tehnologice de transformare a preparatului lichid într-un preparat pulverulent, capabil să asigure toate condiţiile necesare celulei vii, pentru ca aceasta să supravieţuiască în condiţiile existente în tubul gastric și să devină activă la momentul în care ajunge la nivelul distal al tractului digestiv inferior.

Bineînţeles că provocarea majoră a acestei etape este reprezentată de menţinerea unei viabilităţi cât mai bune a preparatului de bifidobacterii pe parcursul întregului proces tehnologic. Dacă în cazul testărilor preliminare s-au formulat un număr de cinci reguli de care trebuie ţinută seama pe parcursul experimentelor, în cazul de faţă putem spune că există o singură condiţie necesară dar și suficientă pentru atingerea obiectivului propus, și anume obţinerea unui maxim de efect tehnologic cu un minim de afectare a viabilităţii preparatului.

24

3.2.1. Alegerea tipului optim de proces

Tipul de proces este unul din principalii factori care influenţează realizarea preparatului. Pentru obţinerea unor preparate care să prezinte caracteristici cât mai bune trebuie să evaluăm posibilităţile de producere a acestora plecând de la modul de încapsulare, tipul de capsulă obţinută, forma și dimensiunile capsulei, rezistenţa capsulelor în mediul apos și în mediul acid. Nu în ultimul rând trebuie spus că procedeul de obţinere trebuie să fie cât mai simplu și să nu necesite investiţii majore, pentru a putea fi ulterior adaptat la nivel industrial. În tabelul 3.8. sunt enumerate metodele alese spre testare în prezentul studiu.

Metoda utilizată Metoda nr. 1 Extrudare Metoda nr. 2 Emulsionare-gelifiere ionotropică Metoda nr. 3 Uscare prin pulverizare

Tabelul 3.8 Metode de realizare a microcapsulelor După cum se observă, se pleacă de la metode simple către metode mai

elaborate. Acest lucru s-a făcut și pentru studierea fenomenelor ce pot avea loc în diferite faze ale procesului și preîntâmpinarea lor, odată cu avansarea pe parcursul experimentelor

a. Obţinerea capsulelor prin extrudare. Capsulele au fost obţinute prin extrudare în conformitate cu procedeul

descris la capitolul 2.3.2.

Figura 3.3. Dimensiunile și forma

granulelor după extrudare și întărire în clorură de calciu

b. Obţinerea capsulelor prin emulsionare-gelifiere ionotropică Procedeul și modul de lucru pentru obţinerea capsulelor de alginat prin

emulsionare-gelifiere ionotropică a fost descris la capitolul 2.3.1.

c. Obţinerea capsulelor folosind procedeul de uscare prin pulverizare

Testele preliminare pentru operaţia de uscare prin pulverizare au fost efectuate cu ajutorul uscătorului Niro, aflat în dotarea staţiei pilot a Institutului de Cercetări Alimentare – CCAI SA București. Modul de operare a acestui

aparat este descris la capitolul 2.3.3.C.

Figura 3.5. Preparatul obţinut prin procedeul de emulsionare-gelifiere

25

Concluzii Metoda extrudării

nu este o metodă care se poate adapta scopului obţinerii de microcapsule. Prin acesta metodă se pot obţine capsule de alginat, însă acestea au dimensiuni mari.Uscarea granulelor obţinute nu s-a putut realiza satisfăcător în curent de aer, acestea având și după 72 de ore de uscare un conţinut relativ ridicat de apa, și fiind dispuse sa se rehidrateze în soluţii apoase. Rehidratarea în acid clorhidric denotă faptul că acidul poate pătrunde în interiorul particulei, fără a o degrada în mod vizibil, dar odată pătruns acesta are efecte de micșorare a viabilităţii bacteriilor insuficient protejate.Metoda a fost abandonată.

În cazul obţinerii capsulelor prin emulsionare-gelifiere particulele de gel au avut dimensiuni foarte variate, fiind și foarte greu de curăţat de uleiul din amestec. De asemenea uscarea preparatului a fost la fel de greoaie ca și în cazul preparatului obţinut prin extrudare.În urma analizei rezultatelor obţinute și a testelor efectuate pe preparat, și această metodă a fost considerată ca neadecvată obiectivelor propuse.

Metoda pe care am selectat-o pentru a fi utilizată în continuare testărilor a fost uscarea prin pulverizare. Preparatele obţinute prin această metodă prezintă avantaje nete, comparativ cu celelalte preparate. 3.2.2. Alegerea tipului optim de aparat

Procedeul de microîncapsulare fiind ales, acesta trebuie optimizat în așa fel încât, utilizând acest procedeu să se obţină cele mai bune rezultate posibile. O primă optimizare o constituie alegerea aparatului de pe care se va obţine produsul final. Aveam la dispoziţie trei aparate cu care vom lucra, vom analiza în paralel rezultatele obţinute și vom selecta, în funcţie de avantajele și dezavantajele descoperite, unul dintre acestea.

a. Aparat de uscare prin pulverizare semiindustrial NIRO Pentru testarea acestui aparat s-a folosit un preparat format din: soluţie ¼

strength Ringer; 10% preparat bacterian liofilizat; 2,5% maltodextrine. Substanţa uscată totală a preparatului a fost aproximativ 13%, minimul necesar funcţionării în bune condiţii a uscătorului NIRO

Figura 3.9. Capsule obţinute prin procedeul uscării prin pulverizare in uscătorul NIRO (microscopie SEM)

26

Temperatura de intrare a aerului în uscător a fost menţinută la 175°C ± 10°C iar cea de ieșire în jurul valorii de 75°C ± 10°C.

b. Aparat de uscare prin pulverizare de laborator BUCHI Mini Spray Dryer B290

Pentru testarea acestui aparat s-a folosit un preparat cu următoarea compoziţie: soluţie ¼ strength Ringer; 11% preparat bacterian liofilizat; 2% maltodextrine

Substanţa uscată totală a preparatului lichid obţinut a fost aproximativ 13%, minimul necesar cerut de documentaţia tehnică a utilajului pentru astfel de aplicaţii. Operarea utilajului s-a făcut în

conformitate cu modul de lucru descris la

capitolul 2.3.3.B.Setările

utilajului au fost următoarele: dimensiunea

orificiului duzei de pulverizare:0,7mm;

debitul pompei de aspiraţie: 30m3/h; debitul pompei peristaltice: 6ml/min; presiunea de azot: 4,5 bari; temperatura de intrare: 150°C ± 5°C; temperatura de ieșire: 78°C ± 3°C

Figura 3.13. Forma și dimensiunile capsulelor obţinute prin procedeul uscării prin pulverizare în uscătorul NIRO (microscopie SEM)

Figura 3.14. Forma și dimensiunile capsulelor obţinute prin procedeul uscării prin pulverizare în uscătorul BUCHI Mini Spray Dryer B290

27

c. Aparat de uscare prin pulverizare de laborator SonoDry750 Pentru testarea aparatului SonoDry750 s-a folosit un preparat cu

următoarea compoziţie: soluţie ¼ strength Ringer; 11% preparat bacterian liofilizat; 2% maltodextrine. Substanţa uscată totală a amestecului a fost de aproximativ 13%, minimul recomandat de producătorul utilajului în cazul unor astfel de aplicaţii. Aparatul a fost operat în conformitate cu modul de lucru recomandat de producător și descris la capitolul 2.3.3.A.

Pentru acest experiment au fost utilizate următoarele setări ale aparatului: frecvenţa duzei de pulverizare: 120kHz; puterea curentului aplicat: 5,5 waţi; debitul de aer în aparat: 60m3/h; presiunea de vacuum: -202 mm coloană de apă; temperatura de intrare a aerului 150°C±5°C; temperatura de ieșire a aerului 85°C±5°C; debitul pompei seringă: 4ml/min

Figura 3.15.b. Diagrama procesului de uscare în uscătorul SonoDry750

Figura 3.16. Forma și dimensiunile capsulelor obţinute prin procedeul uscării prin pulverizare în uscătorul BUCHI Mini Spray Dryer B290

28

Concluzii Cele mai bune rezultate au fost înregistrate la uscarea cu ajutorului

SonoDry750. Ne-a interesat în primul rând obţinerea unor particule uniforme din punctul de vederea al dimensiunii și al formei precum și o viabilitate cât mai bună a preparatului. De asemenea s-a urmărit obţinerea unor particule sub 30 de microni, fapt reușit numai cu acest aparat. Bineînţeles trebuie sa avem în vedere și cele două dezavantaje ale aparatului: nu poate furniza automat temperatura de ieșire a aerului, iar debitele pulverizării cu ajutorul ultrasunetelor sunt foarte mici comparativ cu cele ale duzelor standard. 3.2.3. Alegerea concentraţiilor optime

Pentru optimizarea procesului de încapsulare este necesară o reţetă exactă, precisă, a preparatului umed care va fi introdus în instalaţia de uscare. Cunoaștem din capitolul anterior faptul ca acest preparat este format din soluţie ¼ strength Ringer, cultura liofilizata Bb-12, maltodextrine și alginat de sodiu. Trebuie însă să stabilim concentraţia fiecăreia dintre ele, pentru a putea continua activităţile de testare și experimentare, și pentru a ne putea axa pe determinarea parametrilor optimi de proces. Concluzii Concentraţiile alese au fost următoarele:

o preparat bacterian liofilizat Bb-12 – Chr. Hansen 11% o substanţa de balast (maltodextrine) 2% o alginat de sodiu 1%

Aceste concentraţii au furnizat rezultatele cele mai bune in cadrul testărilor efectuate, și vor fi utilizate pentru prepararea produsului final. 3.2.4. Alegerea variabilelor optime de proces

Denumirea de variabile de proces se referă, în prezenta lucrare, la coordonatele procesului ce pot fi modificate de către operatorul de proces pentru conducerea procesului spre rezultatele dorite. Am inclus aici nu doar variabilele direct reglabile din softul aparatului (temperatura de intrare, debitul de soluţie, puterea aplicată duzei de pulverizare și debitul de aer din instalaţie), ci și alegerea duzei de pulverizare a cărei utilizare oferă rezultate optime. Concluzii

În urma experimentelor realizate s-au determinat următoarele variabile de proces ca fiind optime pentru atingerea obiectivelor iniţial formulate:

- temperatura de intrare a aerului de uscare 150°C - frecvenţa duzei de pulverizare 120kHz - debitul de soluţie 4 ml/min - puterea aplicată duzei de pulverizare 11 waţi - debitul de aer din instalaţie 80 m3/h

3.2.5. Realizarea preparatului final

În urma experimentărilor efectuate și a analizelor produselor rezultate, putem spune că am obţinut o variantă optimă de produs – bifidobacterii

29

microîncapsulate. Rezumând, întregul proces de obţinere îl putem așeza în forma unei scheme tehnologice, precum în figura 3.28.

Apă d istilată Tablete 1 strength R inger

AG ITARE

Solu ţie 1 strength R inger

Preparat liofilizat Bb-12

M altodextrine Alginat de sodiu

AM ESTECARE PREPARATE

PULVERULENTE

AG ITARE M ECANICA

(blender)

REPAUS

Preparat vâscos, om ogen, pentru ob ţinrea capsulelor

STERILIZARE

AG ITARE

USCARE PRIN PULVERIZARE CU DUZĂ

ULTRASONICĂ CU AJUTORUL SO NODRY750

Preparat m icroîncapsulat pulveru lent

Figura 3.27. Schema tehnologică de obţinere a bacteriilor lactice microîncapsulate.

3.3.Testarea preparatului final În urma procesului de uscare a rezultat următoarea diagramă termică

(figura 3.29.) Microcapsulele obţinute au avut dimensiuni în jurul valorilor de 10-15

micrometri, așa cum se poate observa în figurile 3.30 și 3.31.

30

Figura 3.29. Diagrama procesului de uscare pentru obţinerea preparatului bacterian microîncapsulat

Figurile 3.30 și 3.31. Imagine microscopică a microcapsulelor obţinute Pulberea obţinută a înregistrat la analiză, după trei zile de depozitare în

plăci Petri sterile, sigilate cu Parafilm, o valoare a activităţii apei aw= 0,337. Din punct de vedere microbiologic preparatul obţinut a fost iniţial supus

diluării si cultivării pe mediu MRS-NNLP, pentru a-i testa stabilitatea și gradul de încapsulare a bacteriilor lactice. În urma acestei numărări directe rezultatul a fost de 4 x 108 (având în vedere faptul că valoarea iniţială a viabilităţii preparatului utilizat a fost de 418 x 109 unităţi formatoare de colonii pe gram de preparat liofilizat).

Având în vedere faptul că după tratarea preparatului în condiţiile de simulare ale tubului digestiv (capitolul 2.1.3.b.), viabilitatea a fost de 27 x 109 unităţi formatoare de colonii pe gram de produs, se poate deduce faptul că acele 4 x 108 colonii găsite în preparatul iniţial sunt fie bacteriile rămase neîncapsulate, fie cele rămase pe suprafaţa granulelor. În figura 3.31. este prezentată o capsula de preparat supusă unui tratament de rehidratare de aproximativ 30 de minute, urmat de prepararea unui frotiu. Se observă ca in

31

jurul granulei există celule de bifidobacterii care fie s-au desprins în timpul rehidratării, fie erau nefixate pe suprafaţa granulei, fiind celule libere încă din momentul uscării.

Figura 3.32. Frotiu realizat dintr-o capsula de preparat supusă unui tratament de rehidratare de aproximativ 30 de minute (o

diviziune reprezintă 0,01mm)

Trebuie subliniat în acest caz că toate testele de viabilitate în tractul digestiv simulat au fost făcute prin imersarea iniţială a granulelor în lapte degresat. Datorită conţinutului de calciu din lapte, la suprafaţa microcapsulelor se va forma un strat de gel, mult mai puţin susceptibil de a fi atacat de substanţele din mediul gastric decât alginatul de sodiu negelificat, existent în masa capsulei. Astfel se formează un strat de protecţie a capsulei, ca o barieră în plus în faţa acidului gastric. Acest lucru îl putem evidenţia urmărind comportamentul unui preparat, din punct de vedere al viabilităţii celulelor de bifidobacterii, în timpul trecerii prin procesul de simulare a tubului digestiv.

Figura 3.33. Variaţia viabilităţii preparatului în funcţie de momentul analizei (testul de simulare a tractului gastrointestinal)

Considerăm ca fiind momentul 0 din figura 3.33 momentul analizei viabilităţii culturii liofilizate de Bb-12 (pe care o putem considera drept materia primă pentru obţinerea preparatului de bacterii microîncapsulate). În acest punct s-a înregistrat o viabilitate de 419 x 109. Momentul I este momentul analizei pulberii de microcapsule hidratate în apă timp de 30 de minute. La acest moment viabilitatea înregistrată a fost de 4 x 108. Momentul următor pe fluxul de analize este măsurarea viabilităţii pulberii după imersarea în lapte degresat. Viabilitatea în acest punct a fost sub 105 ( considerată 105 în reprezentarea grafică). Aceleași valori ale viabilităţii au fost înregistrate și în cazul probelor recoltate după

0

I

II III IV

V

0

2

4

6

8

10

12

14

etapa

log

(via

bil

itate

)

32

tratamentul cu soluţie de acid clorhidric (momentul III) și în cazul probelor recoltate după tratamentul cu soluţia de simulare a bilei (momentul IV).

Rezultate mai bune s-au înregistrat în cazul analizei preparatului după tratamentul complet, adică și cu soluţia de simulare a sucului pancreatic.

Așadar bacteriile au fost „decapsulate” în urma experimentului de simulare a tractului digestiv. În urma „decapsulării” acestea s-au dovedit a fi viabile și au dovedit ca această metode de protecţie le asigură supravieţuirea în tractul intestinal într-un număr suficient pentru a realiza popularea colonului. 3.4. Concluzii generale

1. Obiectivele prezentei lucrări au fost atinse. S-a reușit obţinerea unui preparat probiotic cu performanţe superioare în special în ceea ce privește viabilitatea bacteriei probiotice la nivelul colonului.

2. Metoda de creștere a performanţelor culturii probiotice a fost înglobarea bacteriilor la nivel micro (denumită microîncapsulare), într-o substanţă protectoare, această substanţă având rolul de a proteja bacteria la nivelul tractului digestiv superior, fiind îndepărtată până la nivelul distal al tractului digestiv inferior, astfel încât, la nivelul colonului bacteria să își poate desfășura rolul de colonizare, rol pentru care aceasta a fost ingerată.

3. Procesul de microîncapsulare este dependent de o serie de factori : ì polimerul încapsulant, care trebuie să fie rezistent la tratamentele fizice,

chimice și biochimice la care este supus preparatul bacterian; ì metoda de încapsulare, care trebuie să fie aleasă în așa fel încât să obţinem

maximum de beneficiu cu afectarea minimă a preparatului bacterian. Prin beneficiu înţelegem aici o dimensiune minimă a microcapsulei, o distribuţie uniforma a dimensiunilor acestora și un procent de înglobare cât mai bun;

ì utilajul folosit trebuie să asigure o operare cât mai facilă și, cel puţin în această fază, de studiere și obţinere a unui produs nou, o posibilitate cât mai bună de reglare a tuturor parametrilor implicaţi

ì tratamentele termice și mecanice implicate trebuie să îndeplinească condiţia de „necesar și suficient”, pentru a afecta cât mai puţin preparatul;

ì soluţia utilizată ca bază de realizare a preparatului lichid trebuie să fie aleasă în așa fel încât să nu influenţeze în mod negativ proprietăţile unuia dintre componenţii acestui preparat;

ì eventuale substanţe de balast utilizate trebuie să respecte aceleași condiţii ca și substanţa utilizată ca bază de obţinere;

4. Procedeul optim de încapsulare este uscarea prin pulverizare a unui preparat vâscos de celule de bifidobacterii Dintre procesele de uscare prin pulverizare testate în laborator, procedeul determinat ca optim este pulverizarea cu ajutorul duzelor ultrasonice urmată de uscarea în camera de uscare, în echicurent de aer cald.

5. Pentru obţinerea preparatului microîncapsulat s-a realizat un amestec cu următoarea compoziţie: soluţie ¼ strength Ringer; preparat bacterian liofilizat Chr Hansen Bb-12 (11%); maltodextrine (2%); alginat de sodiu (1%)

33

Acest amestec a fost supus operaţiei de uscare prin pulverizare în aparatul SonoDry750 dotat cu duză ultrasonică de frecvenţă 120kHz, obţinându-se microcapsule cu dimensiuni sub 30 micrometri. S-a determinat viabilitatea preparatului după traversarea tubului gastrointestinal simulat, dovedindu-se faptul că preparatul realizat are o acţiune protectoare asupra bacteriilor viabile din componenţa sa.

6. Maltodextrinele au de asemenea un ușor efect de încapsulare, dar ele sunt solubile în apă, iar capsulele formate sunt distruse de acidul clorhidric. De aceea testele in vitro realizate prin simularea tubului digestiv au demonstrat rezistenţa capsulelor de alginat și pierderea viabilităţii celulelor de bifidobacterii în cazul în care acestea au fost încapsulate doar cu ajutorul maltodextrinelor.

7. Calciul din lapte afectează structura alginatului. Acest lucru poate fi privit sub două aspecte:

- aspectul favorabil este reprezentat de faptul că se formează o combinaţie insolubilă între alginatul de sodiu din particule și calciul din produsul lactat în care este introdusă particula combinaţie care formează o barieră de protecţie în plus a acestor microcapsule în faţa acidităţii gastrice;

- aspectul nefavorabil este reprezentat de imposibilitatea utilizării laptelui ca bază de obţinere a amestecului lichid (lucru ce ar fi putut conduce la viabilităţi superioare ale preparatului lichid iniţial), deoarece calciul existent în lapte va conduce la imposibilitatea de dizolvare a granulelor de alginat prin formarea combinaţiei insolubile alginat de sodiu – calciu.

Bibliografie selectivă

Lucrarea cuprinde 123 de titluri bibliografice, accesibile fie pe suport clasic fie în format electronic, dintre care cele mai elocvente sunt enumerate în ceea ce urmează: 1. Adhikari, K., Mustapha, A., Grun, I. U, Fernando, L., 2000, Viability of Microencapsulated Bifidobacteria in Set Yogurt

During Refrigerated Storage, Journal Dairy Science vol. 83, p. 1946–1951 2. Bahrim, G., 1999, Microbiologie tehnică, Editura Evrika, Brăila 3. Behzadi, S.S., 2008, „Application of fluid bed technology in the preparaţion of probiotic formulations” (prez.), Symposium on Drying and Formulation for Applications in Biotechnology, Food and Feed, IFA Tulln, Austria 4. Berger, H., L., 1998, Ultrasonic Liquid Atomization-Theory and Application, 1st ed., Hyde Park, NY: Partridge Hill Publishers,. 5. Casulschi, T., Toma, A., Laudoniu, A., 2006, Cercetari privind imbunatatirea inocuităţii produselor lactate acide, Buletin de Informare în Industria Laptelui,vol. 21, nr.3- 4 6. Chan, E. S., Zhang, Z., 2005, Bioincapsulation by compression coating of probiotic bacteria for their protection in an

acidic medium, Process Biochemistry, vol. 40, no. 10, p 3346-3351 7. Chaplin, M., Water structure and science – Starch, la www.lsbu.ac.uk/water, update din data de 4 Septembrie 2008 8. Chavarri, M., Maranon, I., Urdaneta, E., Villaran, M.C., 2008, Nutrition modulation of colon cancer with a

microencapsulated symbiotic (prez.) XVI International Conference on Bioencapsulation, DCU Dublin, Irlanda 9. Chen, K., Chen, M., Liu, J., Lin, C., Ahiu, H., 2005, Optimisation of Incorporated Prebiotics as Coating Materials for

Probiotic Microincapsulation, Journal of Food Science, vol. 70, no. 5, p. M260-M266 10. Cîrîc, Al., 2003, Cercetari asupra produselor sinbiotice, Bulletin de Informare in Industrial Laptelui, nr 1/2003, p 58 – 66 , Editura Academica, Galati 11. Cîrîc, Al., 2004, Tehnici de incapsulare a produselor alimentare, Bulletin de Informare in Industria Laptelui, nr 1/2004, Editura Academica, Galati 12. Cîrîc, Al., 2008, Techniques used for encapsulation of probiotic bacteria” (prezentare), „Al IX-lea simpozion cu participare internatională de chimia coloizilor și suprafeţelor”, Galaţi 13. Costin, G.M., 2005, Produse lactate fermentate, Editura Academica, Galati 14. Costin,G. M., 2007 (editor), Produse lactate functionale, Editura Academica, Galaţi 15. Costin,G.M., Segal, R., 1999, Alimente funcţionale. Alimentele și sănătatea, Editura Academica, Galaţi 16. Dan, V., 2001, Microbiologia alimentelor, Editura Alma, Galaţi

34

17. Dima, S., Beliciu, C., Cîrîc, Al., 2001, Cercetari privind folosirea aliginatului de sodiu în procesul de bioincapsulare

prin emulsionare-gelifiere ionotropică, în vol. Alimentele și Sănătatea la inceputul mileniului III, Editura Academica, Galaţi 18. Dolezres, Y., Lacroix, C., Cell immobilization for the dairy industry, la http://www.nisco.ch/download/27.pdf accesat 20.11.2008 19. Elli, M., Callegari, M.L., Ferrari, S., Bessi, E., Cattivelli, D., Soldi, S., Morelli, L., Feuillerat, N.G., Antoine, G.M., 2006, Survival of Yoghurt Bacteria in the Human Gut, Applied and Environmental Microbiology, vol. 72,no. 7, p. 5113-5117. 20. Frece, J., Kos, B., Beganović, J., Vuković, S., Šušković, J., 2005, In vivo testing of functional properties of three

selected probiotic strains, World Journal of Microbiology and Biotechnology, vol.21, p.1401-1408. 21. Goldberg, I.(editor), 1994, Functional Foods. Designer Foods, pharmafoods, nutraceutical, Chapman & Hall, Israel 22. Hui, Y.H., 1991, Enciclopedia of food science and technology, Wiley-Interscience Publication, NewYork 23. Kailasapathi, K., 2003, Microencapsulation of probiotic bacteria: Tehnology and potential aplication, Current Issues in Intestinal Microbiology, vol. 3, p. 39-48 24. Kailasapathy, K., Godward, G., Talwalkar, A., 2002, Micro-encapsulation of probiotic bacteria with alginate-starch as

a dairy food delivery system, Session 73, Dairy Foods: Probiotics and bioactive components in milk 25. Kjaergaard, O.G., Prilling – Multiple core encapsulation, la http://www.niroinc.com/food_chemical/prilling_encapsulation.asp accesat la 16.12.2008 26. Knight, D.J.W., Girling, K.J., 2003, Gut flora in health and disease, The Lancet, vol. 361, no. 9371, p. 1831. accesat 15.01.2007 27. Kuntz, L.A., 1997, Making the Most of Maltodextrins, in Food Product Design, Virgo Publishing, la www.foodproductdesign.com 28. Lee, J. S, Cha ,D. S., Park, H. J., 2004, Survival of Freeze-Dried Lactobacillus bulgaricus KFRI 673 in Chitosan-Coated

Calcium Alginate Microparticles, Journal of Agricultural Food Chemistry, vol. 52, p. 7300-7305 29. Lee, K.-Y., Heo, T.-R., 2000, Survival of Bifidobacterium longum Immobilized in Calcium Alginate Beads in Simulated

Gastric Juices and Bile Salt Solution, Applied and Environmental Microbiology, vol. 66, no. 2, p. 869–873 30. Lian, W.-C., Hsiao, H.-C., Chou, C.-C., 2003, Viability of microencapsulated bifidobacteria in simulated gastric juice

and bile solution, International Journal of Food Microbiology, vol. 86, no. 3, p. 293-301 31. McHugh, D.J. (editor), Production and utilization of products from commercial seaweeds, 1987, FAO Fisheries Technical Papers, vol. 288, p. 189 32. Meiners, J.A., 2008, Micro-encapsulated probiotics for improved stability in non dairy food (prez.), Symposium on Drying and Formulation for Applications in Biotechnology, Food and Feed, IFA Tulln, Austria 33. Mencinicopshi, Gh., Toma, Al.., Cîrîc, Al., Burcea, O., 2007, Calitatea laptelui în contextul conceptului siguranţei

alimentare, (prezentare la) simpozionul “Siguranţa alimentară în industria producerii și procesarii laptelui” INWENT – Agrovet, Azuga 34. Mortazavian, A., Razavi, S.H., Ehsani, M.R., Sohrabvandi, S., 2007, Principles and methods of microencapsulation of

probiotic microrganisms, Iranian Jurnal of Biotehnology, vol.5, no.1, p. 1-18 35. Mullan, W.M.A. 2002, Probiotics. Properties, benefits,mechanisms of action, safety and enumeration., www.dairyscience.info/probiotics.htm. accesat pe 14 noiembrie 2008. 36. Nakazawa, Y., Hosono, A.(editors), 1992, Functions of fermented milk, Elsevier Science Publisher Ltd, Essex, England 37. Niness, K.R., 1999, Inulin and Oligofructose: What Are They?, Journal of Nutrition, vol.129, p.1402S-1406S 38. Picot, A., Lacroix, C., 2004, Encapsulation of bifidobacteria in whey protein-based microcapsules and survival in

simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt, International Dairy Journal, vol. 14, no. 6, p. 505-515 39. Rao, A. V., Shiwnarain, N., Maharaj I., 1989, Survival of microencapsulated Bifidobacterium pseudolongum in

simulated gastric and intestinal juices, Canadian Institute of Food Science and Technology Journal, , vol. 22, no. 4, p. 345-349 40. Robinson, R.K (editor), 1985, Dairy Microbiology, Elsevier, London 41. Roissart, H., Luquet, F.M., 1994, Bacteries Lactiques, vol. I, vol II, Lorica, Paris 42. Rotaru, G., Borda, D., Sava, N., Stanciu, S., 2005, Managementul Calităţii în Industria Alimentară, Editura Academica, Galaţi 43. Saarela, M., 2008, Probiotic technology – maintaining and improveing viability (prez.), Symposium on Drying and Formulation for Applications in Biotechnology, Food and Feed, IFA Tulln, Austria 44. Steinbüchel, A.(editor), 2004, Biopolimers, WILEY-VCH, Berlin 45. Sumeri, I., Arike, L., Adamberg, K., Paalme, T., 2008, Single bioreactor gastrointestinal tract simulator for study of

survival of probiotic bacteria, Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 80, p. 317-324 46. Sun, W., Griffiths, M.W., 2000, Survival of bifidobacteria in yogurt and simulated gastric juice following

immobilization in gellan-xanthan beads, Elsevier Science B.V., International Journal of Food Microbiology, vol. 61, no.1, p. 17-25 47. Tharmaraj,N., Shah, N. P., 2003, Selective Enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus

thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and

Propionibacteria, Journal of Dairy Science vol. 86, p. 2288-2296 48. Toma, A., Laudoniu, A., Casulschi, T., Mencinicopschi, Gh., Simon, B., 2000, Produse lactate probiotice si de protectie

(cerere de brevet), Salonul Mondial de Iventica Eureka 2000 49. Vandamme, T., Poncelet, D., Subra-Paternault, P., 2007 Microencapsulation. Des Science aux Tehnologies, Lavoisier, Paris 50. Vilstrup, P.(editor), 2004, Microencapsulation of Food Ingredients, Leatherhead Food International, UK 51. Vinderola, C.G., Reinheimer, J.A., 2003, Lactic acid starter and probiotic bacteria: a comparative „in vitro” study of

probiotic characteristics and biological barrier resistance, Food Research International, vol. 36, p. 895-904