regulace transkripce u prokaryot

Regulace transkripce u prokaryotRegulace transkripce u prokaryot - kapitola 16Restrikční enzymy - kapitola 5Molekulární klonování – kapitola 4 a 5

Výsledek testu

10

10

20

30

40

50

60

2 body3 body 4 body

Obecný mechanismus replikace

• DNA polymeráza potřebuje RNA primer• Okazakiho fragmenty (1000 – 2000bp)• Odstranění primerů exonuklázovou aktivitou DNAP• Ligace niků

DNA polymeráza III• Několik podjednotek

• DnaE (-podjednotka, syntéza)• DnaQ (-podjednotka, proof-reading – korekturní aktivita)• HolE (-podjednotka, potřebná pro stabilitu)• DnaN (-podjednotka)• Přídatné podjednotky (, , , , ) – clamp loading complex

RT PCR• Složitá manipulace s geny obsahující

exony• mRNA již obsahuje sekvenci, která je

translatovatelná• Pomocí reverzní transkriptázy (enzym z

retrovirů) vytvoření DNA z mRNA• Vytvoření jednoho vlákna cDNA –

templátová DNA• Studium exprese genů

Regulace exprese genů• E.coli

• Ze 4000 genů je exprimováno v každý okamžik alespoň 1000• Dle podmínek, geny jsou zapnuty a vypnuty• Změna teploty změna exprese 50-100 genů

Figure 16.12D Protein Gels of E. coli under Different ConditionsE. coli was grown in 50 mM acetate or 20 mM formate. Three gels were run for each condition and the Figure shows a layered view of two three-gel composites. The pink and green spots are proteins induced in acetate or formate, respectively. The circled spots are those that were statistically validated, based on a pair-wise comparison of all the individual gels. (Credit: Joan L. Slonczewski and Christopher Kirkpatrick, Kenyon College, Gambier, Ohio.)

• Jednobuněčný organismus reguluje expresi svých genů v závislosti na změně prostředí (teplota, osmolarita, zdroj látek), či vnitřních signálů (příprava na dělění apod.)

• Regulace probíhá na mnoha úrovních:• Na úrovni transkripce primárního transkriptu• Na úrovni úpravy primárního transkriptu• Na úrovni stability transkriptu• Na úrovni translace• Na úrovni úpravy a sbalení peptidového řetězce do funkčního

proteinu• Na úrovni kontroly aktivity proteinu• Na úrovni degradace proteinu

Regulace exprese

Efektivní vs rychlá regulace• Efektivní regulace je na úrovni transkriptu

• Vyžaduje méně energie• Rychlá regulace je na úrovni proteinu

• Protein je vždy připraven plnit svou funkci

• Pozitivní• Gen se nepřepisuje, pokud

není aktivován

• Negativní• Exprese genu je pozastavena

dokud není represor vyvázán

Pozitivní vs negativní regulace

Regulace transkripce• Na úrovni přístupu transkripčních faktorů k DNA

• Důležitější u E (heterochromatin)• U P – ne až tak důležitá

• Na úrovni rozeznání promotoru• U E – tři různé RNAP• U P – 1 RNAP, ale různé faktory

• Na úrovni iniciace transkripce• Nutná přítomnost aktivačních proteinů• Represor blokuje postup RNAP

• Na úrovni elongace mRNA• Ne úplně běžné (zpomalení elongacem či předčasné ukončení transkripce)

• Na úrovni terminace mRNA• Anti-terminator proteiny• Umožňuje transkripci genů downstream od terminátoru

- faktory • podjednotka RNAP rozeznává promotor • Alternativní faktory

Sigma factor Jméno

Consensus sequence

-35 mezera -10

Housekeeping 70 RpoD TTGACA 16-18 TATAAT

Stationary phase 38 RpoS CCGGCG 16-18 CTATACT

Nitrogen control 54 RpoN TTGGNA 6 TTGCA

Flagellar motion 28 FliA CTAAA 15 GCCGATAA

Heat shock 32 RpoH CTTGAA 13-15 CCCCATNT

Extracytoplasmic heatshock 24 RpoE GAACTT 16 TCTGAT

Faktor tepelného šoku• Při vysoké teplotě proteiny se špatně balí, ztrácí svou funkcí

agregují• E.coli

• 37°C – OK• 43° - pořád OK• 46°C - exprese heat shock proteinů (30% z celkového množství

proteinů)• Chaperony (pomáhají správně sbalit protein)• Proteázy (degradují špatně sbalené proteiny)

• RpoH a RpoE

RpoH• RpoH

• 30°C – není potřebný, je rychle degradován

• 42°C - protein je stabilní, se jeho exprese

• 50°C – aktivace exprese dalších heat shock genů, RpoH je posléze inaktivován

• Transcripce RpoH genu je pod normálním promotorem (70 – ten je neaktivní při teplotě nad 50°C) a také pod promoterm vázající 24 (RpoE, transkripce pokračuje do 57°C, kdy RNAP je destabilizována)

Formace spory u Bacillus• Kaskáda alternativních faktorů• Když je nouze o výživné látky

sporulace• faktory důležité pro vytvoření spóry

• E a K – v mateřské buňce• Pre- E – environmentální signály zapínají

expresi• F a G – ve sporulující buňce

• F – transkripce ranných sporulujících genů (aktivují pre- E)

• G – transkripce pozdních sporulujících genů (aktivují pre –K)

Anti- a anti-anti-sigma faktory • Anti sigma faktory se vážou na

faktory a zabraňují nasednutí na promotor

• SpoIIAB je anti-sigma faktorem pro F

• SpoIIAA je anti-anti sigma faktorem a uvolňuje F

Aktivátor vs represor • Aktivátor – transkripční faktor,

nutný pro expresi genu• Represor – vypíná expresi genu• U pozitivní regulace – aktivátor

nutný pro zapnutí exprese• U negativní regulace – represor

neumožňuje transkripci dokud není vyvázán

• Indukční činidlo (inducer) • Obvykle malá signální sloučenina

(živina)• váže se na regulační proteinu

Operon• Kluster genů pod jedním promotorem• Polycistronická mRNA

• Francois Jacob and Jaques Monod – poprvé definovali operon – negativně regulovaný laktózový operon• Nobelova cena v roce 1965 (s Andre Lwoff)

Lac operon• Lac operon:

• lacZ – β galaktosidáza• lacY – permeáza laktózy• lacA – acetyláza laktózy (není esenciální)

• LacI – represor• Upstream of lacAYZ• V opačném směru

• LacO - operátor

Lac operon• Lac operon:

• lacZ – β galaktosidáza• lacY – permeáza laktózy• lacA – acetyláza laktózy (není esenciální)

• LacI – represor• Upstream of lacAYZ• V opačném směru

• LacO – operátor• Inducer – allo-laktóza, IPTG• Lac operon je vždy trošičku aktivní• Lac operon neni úplně standardní

Negativní represibilní regulace trp operonu• Operon pro syntézu tryptofanu – trpEDBCA• Represor – trpR• Opačný systém než Lac operon!

Negativní represibilní regulace trp operonu - atenuace

• U prokaryot k translaci může docházet ihned po zahájení transkripce

• TrpL – leader 130bp• Sekvence 1,2,3,4 – mohou vytvořit vlásenku• Obsahuje velmi vzácné kodóny pro Trp

• Atenuace• Není to on/off• Translace je vyladěna na přítomnost trp

araBAD operon• Jeden protein může být aktivátorem a represorem zároveň

• Aktivátor se obvykle váže před promotor (upstream)• Pomáhá rozeznat oblast a vazbě na DNA

• Represor se obvykle váže na oblast za promotorem (downstream)• Brání vazbě RNAP na promotor• Brání posunu RNAP vpřed

araBAD operon• Jeden protein může být aktivátorem

a represorem zároveň (vážou se na různou oblast DNA)

• AraC – regulační protein kontrolující transport a metabolism arabinózy

• AraBAD (metabolismum) a AraFG (transport, uptake) operony jsou reprimovány AraC při absenci arabinózy, a aktivovány při její přítomnosti

Ko-represory• Některé represory jsou aktivní pouze, pokud vážou nějakou

molekulu • Velmi časté u biosyntetických metabolických drah• Příklad: arginin

Represory vázající se na protein• Mlc

• Represe genů účastnící se metabolismu glukózy

• Při absenci glukózy, transporter PtsG je fosforylován

• Přítomnost glukózy vede k jeho defosforylace

• PtsG váže Mls • Exprese genů je spuštěna

Kovalentní modifikace represorů a aktivátorů• OxyR

• Oxidace OxyR peroxidem vodíku• Oxiduje –SH skupiny na S-S skupiny – aktivace a vazba na DNA• Spuštění exprese genů na protekci proti oxidativnímu stresu

• Fnr• Redukce Fnr spouští jeho aktivní funkci - dimerizuje (např. při

anaerobních podmínkách)• Aktivace genů důležitých pro anaerobní respiraci

Dvousložkový regulační systém

• Přidání chemické skupiny pomocí kovalentní vazby (fosfát, methyl, acetyl, AMP, ADP-riboza atd.)

• 2 složky• DNA vázající protein, váže DNA pouze když je

fosforylovaný (REGULATOR)• Kináza vnímavá na změny prostředí (SENSOR)

• Příklady:• Nedostatek kyslíku (ArcB a ArcA) – reprimuje 20 genů,

které jsou nutné pouze při aerobním metabolismu, aktivuje 6 genů nutné pro růst za anearobních podmínek

• Deprivace fosfátu (PhoR a PhoB)• Metabolismus dusíku (NtrB a NtrC)

Regulator

Sensor

Globální regulace• Regulon – skupina genů a operonů, které jsou regulovány

jedním regulačním proteinem při spuštění jednoho signálu• syntéza argininu ( 12 různých genů/operonů) regulovány jedním

represorem• Metabolismus cukrů – globální aktivátor Crp

• Crp - cyclic AMP receptor protein

• Crp zapíná geny pro metabolismus maltózy, laktózy a dalších při absenci glukózy

• cAMP je signál, že buňka má málo glukózy

• Lac operon je tudíž řízen nejenom lacI, ale take Crp

Globální regulace - Crp

Cyclic AMP

dimer

Regulační nukleotidy• Regulační nukleotidy

• cAMP• cAMP je produkování adenylát cyklázou• Přítomnost glukózy inhibuje syntézu cAMP, stimuluje export cAMP

ven z buňky• cGTP – vyšší organismy• c-di-GTP - důležitý pro biofilm produkující baktérie

• Reguluje tranzici mezi volně-plavající a biofilm vytvářející bakterií• Produkce polymeru N-acetyl-D-glucosaminu• Biofilm umožňuje baktérií přilnout k povrchu (př. Yersinia pestis, mor,

blecha)• ppGpp – kontrola hladovění u baktérií

Regulační nukleotidy – druhý posel

Když není glukóza

Když je glukózaKdyž nejsou aminokyseliny

Když nejsou aminokyseliny

DNA vázající proteiny• Histone-like proteiny

• Nepřímé• nespecifické

• H-NS (histone-like nucleoid structuring)• 2 domény:

• DNA vazebnou doménu• Protein-protein interakční doménu• Agregují (tetramery)

• Vazba na A/T bohaté oblasti – reprimují expresi

Regulace na dálku• HU (heat unstable nucleoid

protein) a IHF (integration host factor)• Pozitivní regulátory• Heterodimery• Ohýbají DNA• Pomáhají tak genovým inverzím,

integracím, rekombinacím• Regulují expresi přiblížením

regulačních proteinů

Regulace na dálku• Geny pro metabolismus dusíku• Alternativní 54 (RpoN)• Aktivátor NtrC – vazebné místo -

140 bp• Aby byl umožněn kontakt s RNAP

ohyb pomocí IHF• Prokaryotický enhancer

Anti-terminace• Anti-terminace jako kontrolní

mechanismus• Prevence terminace na

specifickém místě• Transkripce pokračuje• Běžné u virů a pro některé

bakteriální geny• Anti-terminační faktor se váže

na RNAP před dosažením terminačního místa

Manipulace s DNA• Restrikční a modifikační enzymy• Nukleázy

• DNA nukleázy – Dnázy• RNA nukleázy – Rnázy• Exonukleázy

• Buď 5‘ nebo 3‘ specifické exonukleázy• Endonukleázy

• ssDNA• dsDNA• Specifické (restrikční enzymy)• Nespecifické

Restrikční enzymy• Vyvinuty jako obrana

baktérie proti cizí DNA/RNA (např. viry)

• Vysoce specifické endonukleázy, rozeznávající 4 až 8 nt

• Štípou obě vlákna • Mechanismus jak rozlišit

svou DNA od cizí• Methylace (methylázy)

adeninu, nebo cytosinu v DNA sekvenci

Restrikční enzymy – typ I

• Rozeznávací místo tisíce bp od stěpícího místa• Reakce proběhne pouze 1x• ATP dependentní• 3 podjednotky

• HsdS - DNA vazebná (rozeznává DNA sekvenci)• HsdM – modifikační, methyluje DNA• HsdR - enzym - štípe

Restrikční enzymy - typ II• Rozeznává specifické místo, aktivita je SPECIFICKÁ• Dimer• Nepotřebují ATP• Potřebují kofaktor (MgCl2)• Palindrom (4 – 8 bází)• STICKY konce vs BLUNT konce

Restrikční enzymy – typ II• Hojně využívány v genetickém inženýrství• Rozeznávají „ inverted repeat – PALINDROM• > několik stovek enzymů• Palindrom 4, 6 či 8 nukleotidů• Isoschizomery:

• NarI• BbeI• EheI• KasI

GGCGCCCCGCGG

Enzym Organismus Sekvence

HpaI Haemophilus parainlfuenzae C/CGG

NdeII Neisseria denitrificans /GATC

EcoRI Escherichia coli RY13 G/AATTC

EcoRV Escherichia coli J62/pGL74 GAT/ATC

BamHI Bacillus amyloliquefaciens G/GATCC

BglI Bacillus globigii GCCNNNN/NGGC

NotI Nocardia aotidis-caviarum GC/GGCCGC

DraII Deinococcus radiophylus RG/GNCCY

Restrikční enzymy – typ II

GATCCNNNNNN 3‘ GNNNNNN 5‘

BamHI

5‘ NNNNNNNG3‘ NNNNNNNCCTAG


• Uplatnění sticky konců při klonování


Využití restrikčních enzymů - mapování restrikčních míst

• Restriction fragment length polymorphisms• Identifikace organismu• Forénzní genetika• Určování otcovství

Využití restrikčních enzymů - RFLP

• Molekulární klonování• PCR• Ligace do PCR vektoru• Restrikční analýza• Ligace do jiných vektorů• Použití:

• KNOCK-OUT• KNOCK-IN• Exprese genů - proteinů

Využití restrikčních enzymů - klonování

PCR vektor• pGEM-T easy (Promega)• XL1-Blue Genotype: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44

relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)].

Modro-bílá selekce• V laboratoři při klonování• Gen je klonován do lacZ genu• X-gal• Bílé kolonie jsou pozitivní

Ověření úspěšnosti klonování• Namnožení pozitivních bílých baktérií• Izolace plasmidové DNA• Restrikční analýza• Agarózová gelová elektroforéza

• Ethidium bromide (interkalační činidlo)

Ověření úspěšnosti klonování- realitaPCR Klonování do PCR vektoru Klonování do specifického vektoru

Southern blot analýza• Jedna z nejpoužívanějších metod molekulární biologie• E.M Southern (1975)

• Přenos DNA molekul na membránu nylonovou nebo nitrocelulozovou membránu• Identifikace specifického restrikčního fragmentu

• Western blot – detekce proteinů• Northern blot – detekce RNA

• Hybridizace:• Vytvoření značené (radioaktivně) próby

• Náhodné hexa – deca primery• [-32P] dATP*• dCTP, dTTP, dGTP• DNAPI – Klenow fragment

Detekce fragmentu pomocí hybridizace

• Hybridizace:• Vytvoření značené (radioaktivně) próby• Inkubace s membránou• Vyvolání na rentgenový film

Detekce fragmentu pomocí hybridizace

Důležité pojmy k zapamatování• Pozitivní regulace• Negativní regulace• Alternativní sigma faktor• Anti-terminační protein• Heat shock protein• Chaperon• proteáza• Anti-sigma faktor• Anti-anti-sigma faktor• Indukční činidlo• Operon• Polycistronická RNA• Lac operon• IPTG• Modro-bílá selekce

• Trp operon• Ara operon• Ko-represor• Dvousložkový regulační systém• cAMP• Regulon• globální regulátor• Histone-like proteiny• HU/IHF proteiny• Klonování• Restrikční enzymy• Southern blot• Hybridizace

regulace transkripce u prokaryot

Documents