tierärztliche hochschule hannover · jahrestagung physiologie und pathologie der fortpflanzung,...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Einfluss von Haltezeiten während der Frühphase der

Konservierung auf den Energiemetabolismus und

die Qualität von Eberspermien

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae –

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Ulrike Wallner

Heidenheim a. d. Brenz

Hannover 2015

Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken/

Klinik für kleine Klauentiere und forensische

Medizin und Ambulatorik

Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. med. vet. Dagmar Waberski

2. Gutachterin: Prof. Dr. Martina Hoedemaker, PhD

Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2015

Eine Arbeit aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen

Meiner Familie

und Thomas

Auszüge aus der vorliegenden Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit in Form einer

Veröffentlichung und zwei Vorträgen vorgestellt:

M. Schulze, H. Henning, K. Rüdiger, U. Wallner, D. Waberski (2013); Temperature management during semen processing: Impact on boar sperm quality under laboratory and field condition Theriogenology, 80, 990-998

„Effects of holding times during boar semen processing on energy metabolism

and bacterial growth“

U. Wallner, H. Henning, Q. T. Nguyen, D. Waberski

(47. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung, Gießen,

27.02.2014)

„Revision of current protocols for boar semen processing:Retarded cooling of

diluted semen enhances sperm quality“

U. Wallner, S. Kastens, A. Riesenbeck, H. Henning, D. Waberski (48th Annual Conference on Physiology and Pathology of Reproduction, Zürich, 11.02.2015)

http://www.researchgate.net/researcher/2076830178_S_Kastens

http://www.researchgate.net/researcher/42297277_A_Riesenbeck

http://www.researchgate.net/researcher/15313802_H_Henning

http://www.researchgate.net/researcher/39918486_D_Waberski

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ..................................................................................................................... 1

2 Literaturübersicht ........................................................................................................ 2

2.1 Kälteschock bei Eberspermatozoen ........................................................................ 2

2.1.1 Einfluss von Kälteschock auf Plasmamembranen ............................................ 2

2.1.2 Einfluss von Haltezeiten auf die Kälteschocksensibilität ................................... 4

2.2 Samenverarbeitungsverfahren in der Praxis ............................................................ 6

2.3 Energiemetabolismus bei Spermatozoen ................................................................ 7

2.3.1 ATP-Produktion und Energieladung ................................................................. 7

2.3.2 Einfluss der Lagerung auf den Energiemetabolismus ......................................11

3 Material und Methoden ...............................................................................................16

3.1 Versuchsübersicht ..................................................................................................16

3.2 Verbrauchsmaterialien und Geräte .........................................................................17

3.3 Lösungen und Chemikalien ....................................................................................18

3.4 Tiere .......................................................................................................................18

3.5 Samengewinnung ..................................................................................................19

3.6 Untersuchung des nativen Samens ........................................................................19

3.7 Monitoring der Probentemperatur ...........................................................................20

3.8 Experimentelle Designs ..........................................................................................21

3.8.1 Experiment 1: Vergleich zweistufig isothermer und zweistufig hypothermer

Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden ......................................................21

3.8.2 Experiment 2: Auswirkungen von Haltezeiten und Haltetemperaturen des

vorverdünnten Samens bei zweistufig isothermer Verdünnung .......................24

3.8.3 Experiment 3: Vergleich zweistufig isothermer mit zweistufig hyperthermer

Verdünnung ....................................................................................................27

3.8.4 Experiment 4: Auswirkungen von Haltezeiten des ausverdünnten Samens nach

zweistufig hypothermer (Exp. 4 a) oder einstufig isothermer Verdünnung

(Exp. 4 b) ........................................................................................................29

3.8.5 Experiment 5: Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlrate des

ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung ......................31

3.8.6 Experiment 6: Temperaturverlauf in der Prozesskette der Samenverarbeitung

auf einer Besamungsstation und Vergleich mit Laborstandards ......................33

3.8.6.1 Temperaturverlauf im Sperma während der Verarbeitung auf einer

Besamungsstation bei Samenverarbeitung ..............................................33

3.8.6.2 Vergleich des Verdünnungsverfahrens einer Besamungsstation mit dem

Laborstandard ..........................................................................................35

3.9 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA) ......................................................37

3.9.1 Testprinzip ......................................................................................................37

3.9.2 Gerät und Software .........................................................................................38

3.9.3 Messung .........................................................................................................39

3.10 Membranintegrität in der Durchflusszytometrie .......................................................40

3.10.1 Testprinzip ......................................................................................................40

3.10.2 Gerät und Farbstoffe .......................................................................................41

3.10.3 Grundeinstellungen .........................................................................................41

3.10.4 Messung und Auswertung ...............................................................................43

3.11 Mitochondrienmembranpotential in der Durchflusszytometrie .................................44

3.11.1 Testprinzip ......................................................................................................44


3.11.3 Grundeinstellungen .........................................................................................45


3.12 Kinetik des Calcium-Influx ......................................................................................47

3.12.1 Testprinzip ......................................................................................................47


3.12.3 Vorbereitung der Medien und Spermien ..........................................................48

3.12.3.1 Messung und Auswertung ........................................................................49

3.13 Bestimmung des ATP-Gehalts und der Energieladung ...........................................51

3.13.1 Testprinzip ......................................................................................................51

3.13.2 Geräte und Vorbereitung .................................................................................52


3.13.3.1 Präparation der Spermien für die Lagerung bei -20 °C .............................54

3.13.3.2 Erstellen der Standardkurve für die ATP-Messung ...................................54

3.13.3.3 Extraktion von ATP aus der gefrorenen Probe .........................................55

3.13.3.4 Messung der Lumineszenz und Berechnung der ATP-Konzentrationen ...55

3.13.3.5 Konvertieren der Nukleotide und deren Bestimmung ...............................56

3.13.3.6 Berechnung der Energieladung ................................................................57

3.14 Bestimmung der Gesamtkeimzahl ..........................................................................57

3.15 Statistische Auswertung .........................................................................................57

4 Ergebnisse ..................................................................................................................59

4.1 Experiment 1: Vergleich von zweistufig isothermer und zweistufig hypothermer

Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden ................................................................59

4.1.1 Temperaturverlauf während der Samenverarbeitung.......................................59

4.1.2 CASA-Motilitätsparameter ...............................................................................61

4.1.3 Membranintegrität ...........................................................................................63

4.2 Experiment 2: Auswirkungen von Haltezeiten und -temperaturen des vorverdünnten

Samens bei zweistufig isothermer Verdünnung .........................................................65




4.2.4 Mitochondrienmembranpotential .....................................................................71

4.2.5 Energiestoffwechsel ........................................................................................73

4.2.6 Gesamtkeimzahlbestimmung ..........................................................................75

4.3 Experiment 3: Vergleich zweistufig isothermer mit zweistufig hyperthermer

Verdünnung ..............................................................................................................79


4.3.2 Casa-Motilitätsparameter ................................................................................81


4.4 Experiment 4 a: Auswirkungen von Haltezeiten des ausverdünnten Samens nach

zweistufig hypothermer Verdünnung .........................................................................84



4.4.3 Membranintegriät ............................................................................................87

4.5 Experiment 4 b: Auswirkungen von Haltezeiten des ausverdünnten Samens nach

einstufig isothermer Verdünnung...............................................................................88




4.6 Experiment 5: Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlung des ausverdünnten

Samens nach einstufig isothermer Verdünnung ........................................................92




4.7 Experiment 6: Temperaturverlauf in der Prozesskette der Samenverarbeitung auf

einer Besamungsstation und Vergleich mit Laborstandards ......................................96




4.7.4 Spezifische Reaktivität gegenüber Bikarbonat (Calcium-Influx) ..................... 100

5 Diskussion ................................................................................................................ 101

6 Zusammenfassung ................................................................................................... 111

7 Summary ................................................................................................................... 113

8 Literaturverzeichnis .................................................................................................. 115

9 Anhang ...................................................................................................................... 122

9.1 Tabellen und Grafiken .......................................................................................... 122

9.2 Chemikalien ......................................................................................................... 146

9.3 Rezepte ................................................................................................................ 147

9.3.1 Formolcitrat ................................................................................................... 147

9.3.2 HBS (HEPES®- buffered saline) .................................................................... 147

9.3.3 Tyrode basierte Medien ................................................................................. 148

9.3.3.1 Herstellung der Stammlösungen ............................................................ 148

9.3.3.2 Herstellung der Tyr BikCa-Vormischung .................................................... 148

9.3.3.3 Herstellung der TyrCa-Vormischung ........................................................ 149

9.3.3.4 Komplettierung der Medien .................................................................... 149

9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien ....................................................................... 150

10 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................. 153

11 Tabellenverzeichnis .................................................................................................. 159

Danksagung ...................................................................................................................... 161

Erklärung ............................................................................ Fehler! Textmarke nicht definiert.

Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

Abb. Abbildung

ADP Adenosindiphosphat

AK Adenylatkinase

ALH gemittelte maximale seitliche Kopfauslenkung von der mittleren Bahn

(amplitude of lateral head displacement)

AMP Adenosinmonophosphat

ATP Adenosintriphosphat

BCF Frequenz des Kreuzens des gewundenen Bewegungspfades mit der

gemittelten Bewegungsbahn (beat cross frequency)

BSA bovines Serumalbumin

BTS Beltsville Thawing Solution

bzw. beziehungsweise

Ca Calzium

ca. circa

CASA computer-assistierte Spermienanalyse

cm Zentimeter

D Tag (die)

DAP Länge der gemittelten Bahn (distance average path)

DCL Länge der gewundenen Bahn (distance curved line)

DNS Desoxiribonuleinsäure (desoxy ribonucleic acid)

DSL Länge der direkten Strecke (distance straight line)

EC Energieladung (energy charge)

EDTA Ethylendiamintetraacetat

et al. et alii

Exp. Experiment

Fa. Firma

FITC Fluoreszeinisothiocyanat

FL 1-4 Filter Nummer 1 – 4

FSC Vorwärtsstreulicht (forward scatter)

g Erdbeschleunigung (gravitational acceleration)

G Gate

h Stunde (hora)

HBS Hepes-gepufferte Salzlösung (hepes buffered saline)

Hz Hertz

Jagg Agglutinierte Form des Farbstoffs JC-1

JC-1 5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbo-cyanine iodide

l Liter

LIN Linearität (linearity)

M Mol

MAS Morphologisch abweichende Spermien

mg Milligramm

min Minute

Mio Millionen

ml Milliliter

mM millimol

MMP Mitochondrienmembranpotential

Mrd Milliarden

ms Millisekunde

MW Mittelwert

n Probandenzahl (numerus)

neg. negativ

nm nanometer

p Irrtumswahrscheinlichkeit (probability)

PEP Phosphoenolpyruvat

PI Propidiumiodid

PK Pyruvatkinase

pmol picomol

PNA peanut agglutinin, Lektin der Erdnuss (arachis hypogea)

pos. positiv

PPi Pyrophosphat

prog. progressiv

PVA Polyvinylalkohol

PVP Polyvinylpyrrolidon

R Reaktivität

RLU relative light units

RN Range

RT Raumtemperatur

s Sekunde

s. siehe

SD Standardabweichung (standard deviation)

Sp. Spermien

SSC Seitwärtsstreulicht (sideward scatter)

STR straightness

Tab. Tabelle

VAP Geschwindigkeit der gemittelten Bahn (velocity average path)

VCL Geschwindigkeit der gewundenen Bahn (velocity curved line)

VSL Geschwindigkeit der direkten Strecke (velocity straight line)

WOB wobble

z.B. zum Beispiel

ZDS Zentralverband der deutschen Schweineproduktion e.V.

Einleitung

1

1 Einleitung

Da Eberspermien sehr kältesensibel sind, ist die Konservierung noch immer mit

Schwierigkeiten verbunden. Die Verarbeitung von Ebersperma zu

flüssigkonservierten Samenportionen hat in der Schweinezucht eine hohe Relevanz.

Inzwischen werden über 90% der Sauen künstlich besamt; mehr als 95 % der

Besamungen werden mit flüssig konserviertem Samen durchgeführt, der bei + 17 °C

gelagert wird (JOHNSON et al. 2000, RIESENBECK 2011). Eine hygienische und

temperaturoptimierte Verarbeitung des Spermas gilt als maßgeblich für die Qualität

des bis zu fünf Tagen gelagerten Spermas.

Es ist seit langem bekannt, dass Haltezeiten des vorverdünnten Samens bei höheren

Temperaturen (20 – 32 °C) während der Frühphase der Verarbeitung positive

Auswirkungen auf die Kältetoleranz der Zellen bei nachfolgender Abkühlung auf die

Lagerungstemperatur haben (PURSEL et al. 1973 b, CASAS et al. 2013). Bei

welcher Temperatur und innerhalb welcher Zeitspanne die bestmögliche Adaption

der Zellen stattfindet, und ob Haltezeiten bei höheren Temperaturen möglicherweise

negative Effekte auf Energiestoffwechsel und Bakterienwachstum in den

Spermaportionen haben, ist noch weitestgehend unbekannt. Zudem sind Haltezeiten

bis zu sechs Stunden während der Prozesskette der Spermaverarbeitung häufig

unvermeidlich, ohne dass deren Auswirkung auf Spermaqualität und mikrobiellen

Status bekannt ist.

Ziel der vorliegenden Studie war es daher, den Einfluss von Haltezeiten zwischen

30 min und 6 h bei 21 °C sowie 32 °C während der Frühphase der Konservierung auf

die Qualität gelagerten Eberspermas unter Anwendung gängiger Praxisverfahren der

Spermaverdünnung zu untersuchen. Dabei wurden neben spermatologischen

Parametern, wie der Motilität und Membranintegrität, mögliche Einflüsse auf den

Energiestoffwechsel und das bakterielle Wachstum betrachtet. Zusätzlich sollten die

praxisüblichen Verarbeitungsmethoden überprüft und Temperaturprofile während der

Verarbeitungskette erhoben werden.

Literaturübersicht

2

2 Literaturübersicht

2.1 Kälteschock bei Eberspermatozoen

2.1.1 Einfluss von Kälteschock auf Plasmamembranen

Eberspermien gelten im Gegensatz zu anderen Säugetierspermien als besonders

sensibel gegenüber Abkühlung. Dabei spielt die Struktur der Plasmamembran der

Samenzellen eine große Rolle. Wie alle biologischen Membranen besteht diese aus

Lipiden (hauptsächlich Phospholipide), die sich in einer Doppelschicht anordnen, und

Proteinen. Membranen sind fluide Strukturen, was bedeutet, dass sich Moleküle

innerhalb der Ebene der Doppelschicht bewegen können. Sie sind asymmetrisch

aufgebaut, das heißt die Lipid- und Proteinzusammensetzung der beiden Schichten

ist unterschiedlich (DE LEEUW et al., 1991). Die Fähigkeit von Spermien, niedrige

Temperaturen zu tolerieren, scheint vor allem von der Lipidzusammensetzung der

Membran abzuhängen, welche tierartlich sehr verschieden ist (DE LEEUW et al.,

1990; WATERHOUSE et al., 2006).

Ein relativ geringer Cholesteringehalt in der Plasmamembran unterscheidet die

Samenzellen von temperaturempfindlichen Spezies wie z.B. dem Eber von denen

temperaturresistenter Spezies (z.B. Mensch, Kaninchen). Der Cholesteringehalt von

Eberspermien beträgt ca. 0,034 µmol/ 109 Zellen, Bullenspermien enthalten ca.

0,893 µmol/ 109 Zellen, während Spermien von Menschen und Kaninchen einen

Cholesteringehalt von ca. 1,4 µmol/ 109 Zellen haben (DARIN-BENNETT u. WHITE,

1977; NIKOLOPOULOU et al., 1985). Beim Eber ergibt sich daraus ein, im Vergleich

zu anderen Arten, niedriges molares Cholesterin/ Phospholipid-Verhältnis von 0,12,

welches die Temperaturempfindlichkeit der Zellen verstärkt. Beim resistenteren

Bullen beträgt das Verhältnis 0,45, beim Menschen sogar 0,99 (DARIN-BENNETT u.

WHITE 1977, NIKOLOPOULOU et al. 1985; DE LEEUW et al., 1990). PARKS und

LYNCH (1992) berichten von einem Verhältnis von 0,26 beim Eber.

Die Kombination aus niedrigem Gehalt an Cholesterin und dessen asymmetrischen

Verteilung in der Membran - es befindet sich mehr in der äußeren Schicht als in der

inneren - macht vor allem die innere Schicht sehr anfällig. PARKS und LYNCH

(1992) fanden außerdem eine Beziehung zwischen der Kältesensitivität und dem

Literaturübersicht

3

Proteingehalt der Plasmamembran. Eberspermien zeigten einen höheren Gehalt an

Membranproteinen als Spermien anderer Säugetierspezies.

Zudem besteht ein ungünstigeres Verhältnis von ungesättigten zu gesättigten

Fettsäuren, welches bei Eberspermien > 2,5 im Vergleich zu ungefähr 1 bei

humanen Spermien beträgt. Der relativ hohe Anteil an ungesättigten Fettsäuren

macht die Samenzellen anfällig für Schäden durch Peroxidation, welche sich negativ

auf Motilität, Metabolismus, Zellstruktur und Fertilität auswirken (WHITE, 1993). Ein

hoher Anteil an ungesättigten Fettsäuren zusammen mit dem niedrigen

Cholesteringehalt verursacht zusätzlich eine höhere Fluidität der Spermienmembran,

und dadurch eine erhöhte Kälteschocksensibilität (LADBROOKE u. CHAPMAN,

1969; WATERHOUSE et al., 2006).

Kälteschock führt zu Schäden in der Membran der Samenzellen. Einige

Veränderungen der Membran sind dabei reversibel, während andere fatal für die

Zelle sind (GUTHRIE u. WELCH, 2005). Das offensichtlichste Zeichen eines

ausgeprägten Kälteschocks ist ein irreversibler Motilitätsverlust. Dieser wird begleitet

von erhöhter Permeabilität der Plasmamembran, welche zum Verlust von Kationen,

ATP und Enzymen führt (PARKS u. LYNCH, 1992; DROBNIS et al., 1993).

Kälteschock bei Eberspermien entsteht, wenn frisch ejakulierte Samenzellen

entweder schnell, mit einer Abkühlrate von 1 - 2 °C/ min oder schneller, abgekühlt

werden (JOHNSON et al., 2000) und/ oder unter 15 °C gekühlt werden (DE LEEUW

et al., 1991). Bei Temperaturen von < 15 °C treten bei einer Subpopulation von

Spermien bereits Motilitätsverluste, verringerte Membranintegrität sowie eine erhöhte

Permeabilität der Membran auf (DROBNIS et al., 1993; JOHNSON et al., 2000). Der

Zusammenhang von Kälteschockverhalten und der Lipidzusammensetzung der

Spermienmembran lässt darauf schließen, dass die Schädigung mit einem

Phasenübergang (Phasentransition) der Membranlipide zusammenhängt (DROBNIS

et al., 1993, reviewed in WATSON, 1996). Die Membranlipide wechseln bei der

Abkühlung vom flüssigen in einen gelförmigen Zustand. Die verschiedenen

Lipidgruppen innerhalb der Membran erreichen diesen Zustand der Phasentransition

bei unterschiedlichen Temperaturen. Wenn dabei feste und flüssige Bereiche direkt

nebeneinander auftreten, kann es zur Phasenseparation kommen, wobei

Literaturübersicht

4

Membranproteine irreversibel agglutinieren und dadurch ihre Funktion verlieren (DE

LEEUW et al., 1990; DE LEEUW et. al., 1991). Diese Defekte sind geringer, wenn

sich die Membran entweder in der flüssigen oder in der Gelphase befindet. Die

Permeabilität erhöht sich aber stark durch die Reorganisation während der

Phasentransition (DROBNIS et al., 1993). Da die Transition für jede

Phospholipidgruppe bei einer anderen Temperatur stattfindet, kann nur ein

Temperaturbereich für die Reorganisation der Membran angegeben werden. Bei

Ebersamenzellen liegt der Bereich des Phasenübergangs bei 30 – 10 °C (DROBNIS

et al., 1993; SCHMID et al., 2013).

In praktischer Hinsicht ist es wichtig, dass die Kälteschocksensibilität weniger von der

Lagerungsdauer abhängig ist, sondern vielmehr von der Zieltemperatur und davon,

in welcher Geschwindigkeit diese erreicht wird (JOHNSON et al., 2000; SCHMID et

al. 2014).

2.1.2 Einfluss von Haltezeiten auf die Kälteschocksensibilität

Das Halten bzw. die Inkubation von verdünntem und frischem unverdünnten

Eberspermien bei 24 – 26 °C (PURSEL et al., 1973 b) sowie bei 30 °C (PURSEL et

al., 1972) für bis zu 7,5 Stunden vor der Endverdünnung führt zu einer graduellen

Kälteschockresistenz für die weitere Abkühlung und Lagerung bei 5 °C. Die Autoren

zeigten, dass vor allem die Spermien, die 4,5 h und 6 h gehalten wurden, gegenüber

den direkt abgekühlten Proben bessere Motilität und Membranintegrität aufwiesen.

CASAS et al. (2013) zeigten, dass Proben, die einer Haltezeit von 24 h bei 17 °C

ausgesetzt waren, bessere Motilität und höhere Membranintegrität bei der Abkühlung

und während der 24-stündigen Lagerung bei 5 °C aufwiesen, als Proben, die ohne

Haltezeit abgekühlt wurden. Dagegen beschrieben GUTHRIE und WELCH (2005),

dass Haltezeiten von 24 h bei 15 °C von verdünntem Ebersamen vor dem Einfrieren

der Proben zu verringerten Wurfgrößen führte.

Vor allem in der Kryokonservierung der Eberspermien werden mittlerweile die

positiven Effekte einer Haltezeit bei Temperaturen über 15 °C beobachtet und

genutzt. In den meisten Kryoprotokollen werden Haltezeiten von mindestens zwei bis

vier Stunden nach der Verdünnung und vor der weiteren Abkühlung integriert, um die

Literaturübersicht

5

Schäden des Einfrierens und Auftauens zu minimieren (WATSON, 1996; ERIKSSON

et al., 2001). Die Zeitspanne hat dabei größeren Einfluss als die Haltetemperatur.

Verlängerte Haltezeiten bei 17 °C von bis zu 10 h oder 20 h führen zu einer höheren

Membranintegrität nach dem Auftauen (ERIKSSON et al., 2001). TAMULI und

WATSON (1994) berichteten von erhöhter Kälteresistenz von Eberspermien nach

Haltezeiten bis zu 16 h bei Raumtemperatur.

Die genauen Mechanismen, durch welche die Haltezeiten zu einer besseren

Kältetoleranz der Membran führen, werden noch diskutiert. Vermutlich wird durch die

Haltezeiten den Samenzellen die Möglichkeit zur Reorganisation der Membranlipide

und somit zur Adaption an niedrige Temperaturbereiche gegeben. Während der

Zeitspanne binden Komponenten aus dem Seminalplasma bzw. Verdünner an der

Zellmembran und tragen zur Stabilisierung bei (PURSEL et. al., 1973 a; CASAS u.

ALTHOUSE, 2013; ERIKSSON et al., 2001). Substanzen, wie beispielsweise

Phosphatidylserin, schützen dabei die Plasmamembran von Eberspermien

gegenüber Kälteeinflüssen (BUTLER u. ROBERTS, 1975; NIKOLOPOULOU et al.,

1985).

Im Gegensatz dazu stellen PETRUNKINA et al. (2005) die Verarbeitung von

Spermien bei höheren Temperaturen in Frage. Spermien, die mit 32 °C warmen

Verdünner verdünnt wurden, zeigten eine erhöhte Destabilisierung der Membran im

Gegensatz zu mit 21 °C verdünnten Proben. Die Autoren nahmen an, dass die

Spermien, die bei Temperaturen nahe der Körpertemperatur verarbeitet werden,

nicht, wie bei niedrigen Temperaturen, ihren Stoffwechsel verringern. Dies könnte

beispielsweise in Form von Membrandestabilisierungen zu Beeinträchtigungen der

Spermienqualität führen, die die Kapazitation beeinflussen. Die genauen Vorgänge,

wie bzw. ob sich die Haltezeiten, vor allem nahe der Körpertemperatur,

beispielsweise auf Vorgänge wie den Energiestoffwechsel auswirken, sind nach

Kenntnis der Autorin nicht beschrieben.

Nicht nur die Abkühlung, sondern auch der Verdünnungsgrad des Ejakulats während

der Haltezeit beeinflusst die Kältesensibilität der Eberspermien. Proben, die 1:2

vorverdünnt einer Haltezeit für 1 h, 3 h oder 5 h bei 30 °C ausgesetzt und

anschließend ausverdünnt wurden, zeigten höhere Motilität nach dem Kälteschock

Literaturübersicht

6

(5 °C), als die Proben, die vor der Haltezeit bereits ausverdünnt wurden (PURSEL et

al., 1973 a).

2.2 Samenverarbeitungsverfahren in der Praxis

Grundsätzlich werden derzeit in der Praxis zwei unterschiedliche Methoden für die

Verdünnung von flüssigkonservierten Eberspermien durchgeführt: Die einstufige und

die zweistufige Verdünnung. Bei der einstufigen Verdünnung werden die Spermien

isotherm, d.h. mit einem auf 32 °C (± 1 °C) temperierten Verdünner innerhalb von

30 min nach der Samengewinnung in einem Schritt auf die Endkonzentration

ausverdünnt. Bei der zweistufigen Verdünnung wird das Ejakulat zunächst mit auf

32 °C (± 1 °C) angewärmten Verdünner im Verhältnis 1:1 vorverdünnt, und in einem

zweiten Schritt entweder mit ebenfalls 32 °C (± 1 °C) warmen Verdünner (zweistufig

isotherm) oder mit einem hypothermen, auf 21 °C (± 1 °C) temperierten Verdünner,

ausverdünnt (zweistufig hypotherm) (WABERSKI, 2009). Vor allem bei der zweistufig

hypothermen Verdünnung werden die Proben häufig vor der zweiten Verdünnung

einer Haltezeit von bis zu 20 min bei Raumtemperatur ausgesetzt. Die

Vorverdünnung ist ein kritischer Schritt in der Samenverarbeitung und sollte nicht in

einem niedrigeren Verhältnis als 1:1 durchgeführt werden, da sich sonst der

stabilisierende Effekt auf die Samenzellen verringert (PURSEL et al., 1972; STÄHR

et al., 2009; WABERSKI, 2009).

Die in der Praxis am häufigsten durchgeführte Verdünnung ist das zweistufig

hypotherme Verfahren (LÓPEZ RODRÍGUEZ et a., 2012). Diese ist für den Ablauf

der Samenverarbeitung in Besamungsstationen praktikabler, da an

produktionsintensiven Tagen oder bei Transport von vorverdünnten Ejakulaten aus

entfernten Eberställen in zentrale Labore zur Weiterverarbeitung ohnehin Haltezeiten

bei Raumtemperatur auftreten, deren Dauer variabel ist. Aus wirtschaftlicher Sicht

spielt außerdem eine Rolle, dass bei hypothermer Ausverdünnung weniger Energie

für das Erwärmen des Verdünners benötigt wird. Ein weiterer Grund für die

hypotherme Verdünnung ist das Ziel, die Samenproben schnellstmöglich auf die

Lagerungstemperatur abzukühlen, da so ein zeitnaher Versand bei konstanten

Literaturübersicht

7

Temperaturen möglich ist (LÓPEZ RODRÍGUEZ et al., 2012). Weiterhin könnte

durch beschleunigtes Abkühlen mögliches Bakterienwachstum verringert werden.

Festzustellen ist, dass Haltezeiten derzeit in der Praxis wenig standardisiert sind und

keine gesicherten Informationen über das Abkühlverhalten (Temperaturprofile) in den

verdünnten Samenproben während der Anwendung der unterschiedlichen

Verdünnungsregime vorliegen.

Ob die Spermienqualität durch die zweistufig hypotherme Verdünnung und den damit

verbundenen schnellen Temperaturabfall der Samenproben beeinträchtigt wird, wird

noch diskutiert. Bei einem direkten Vergleich von zweistufig isothermer Verdünnung,

mit zweistufig hypothermer Verdünnung, (Verdünnertemperatur 20 – 23 °C, nach

isothermer Vorverdünnung im Verhältnis 1:1), konnte kein Einfluss des

Verdünnungsregimes auf CASA-Motilitätsparameter festgestellt werden

(PETRUNKINA et al., 2005; LÓPEZ RODRÍGUEZ et al., 2012). PETRUNKINA et al.

(2005) konnten zusätzlich keine negativen Effekte der zweistufig hypothermen

Verdünnung auf die Membranintegrität, sowie keine Veränderung der

Reaktionsfähigkeit auf kapazitierende Stimuli zeigen.

In einem parallel zur vorliegenden Studie erfolgten Praxisversuch von mehreren

europäischen Besamungsstationen (n = 23) wurden Verdünnungsmethoden und

Spermaqualität untersucht. 30 % der Besamungsstationen verarbeiteten den Samen

einstufig isotherm, bei 70 % erfolgte die Verdünnung zweistufig hypotherm

(24 ± 3 °C). Hier konnte ein Einfluss des Verdünnungsregimes ermittelt werden. Die

zweistufig hypotherm verdünnten Proben wiesen eine niedrigere Membranintegrität

und niedrigere Aktivität der Mitochondrien im Vergleich zu den einstufig verarbeiteten

Proben. Die Autoren führen dies auf den schnellen Temperaturabfall in den für

Eberspermien kritischen Temperaturbereich zurück (SCHULZE et al., 2013).

2.3 Energiemetabolismus bei Spermatozoen

2.3.1 ATP-Produktion und Energieladung

Samenzellen von Säugetieren sind hochspezialisierte und funktionelle Zellen, deren

Hauptaufgabe es ist, das paternale Genom zu der Eizelle zu bringen. Um diese

Literaturübersicht

8

Aufgabe zu erfüllen, ist zunächst die Entwicklung und Reifung der Spermien im

Hoden notwendig. Während dieser Zeit sind die Spermien in der Regel immotil. Ein

wichtiger Schritt während der Passage durch den Nebenhoden ist der Erwerb der

progressiven Motilität, die in erster Linie energieabhängig ist. Diese wird aber

gleichzeitig durch das Milieu der viskösen epididymalen Flüssigkeit gehemmt. In

dieser verbleiben die Samenzellen bis zur Ejakulation (MISRO u. RAMYA, 2012).

Eine kontinuierliche Energiebereitstellung für energieverbrauchende Prozesse wie

Motilität, Biosynthese, aktiver Ionentransport, Kapazitation und Akrosomenreaktion

wird wie bei allen tierischen Zellen durch die Synthese von ATP ermöglicht. Der

größte Teil der bereitstehenden Energie wird allerdings für die Motilität aufgewendet,

die durch das Schlagen der langen Geißel erzeugt wird (BOHNENSACK u.

HALANGK, 1986). Die Geißel macht ca. 90 % der Länge des Spermiums bei

Säugetieren aus. Energie in Form von ATP gilt als Notwendigkeit, damit die effiziente

Geißelbewegung zur Vorwärtsbeweglichkeit führen kann. Veränderte

Bewegungsmuster, aufgebrauchte Energieressourcen oder beides führen dazu,

dass die Zellen die Fähigkeit der Vorwärtsbeweglichkeit verlieren und damit auch ihre

Befruchtungsfähigkeit. Es ist daher wichtig, den Energiestatus der Spermien zu

kennen, um deren Potential für Motilität und Überleben einzuschätzen.

Zum Verständnis des Energiestoffwechsels muss der Aufbau eines Spermiums bzw.

der Geißel betrachtet werden. Die Geißel untergliedert sich in drei Teile; dem

Mittelstück, dem Hauptstück (ca. ¾ der Gesamtlänge) sowie dem Endstück. Sie

besteht aus einem Axonem, welches aus neun Mikrotubuli-Paaren gebildet wird, die

sich um ein zentrales Mikrotubulus-Paar gruppieren. Das Axonem erstreckt sich über

die gesamte Länge des Flagellums (FAWCETT, 1975). Mitochondrien sind nur im

Mittelstück der Geißel zu finden, wo sie das Axonem umhüllen. Hier kann unter

aeroben Bedingungen Energiestoffwechsel stattfinden (TRAVIS et al., 1998).

In der fibrinösen Hülle der Geißel, die für die Stabilität und für die optimale

Krümmung zuständig ist, wurden vor allem im Hauptstück Enzyme der Glykolyse

(z.B. Hexokinase und Phosphofruktokinase) nachgewiesen.

Die benötigte Energie in Form von intrazellulärem Adenosintriphosphat (ATP) kann

durch zwei verschiedene Stoffwechselwege generiert werden: Durch die Glykolyse

Literaturübersicht

9

und die oxidative Phosphorylierung, wobei die oxidative Phosphorylierung eine

größere Energieausbeute vorweist. Bei der Glykolyse wird Glukose zu Pyruvat

umgewandelt, wobei nur ein kleiner Teil des energetischen Potentials von Glukose

freigesetzt wird: 2 Mol ATP pro Mol Glukose. Wenn Pyruvat in den Mitochondrien

durch die oxidative Phosphorylierung weiter oxidiert wird, werden pro Mol Glukose

30 Mol ATP freigesetzt (FORD, 2006). Welche Art des Energiestoffwechsels in

überwiegendem Maße in Spermien stattfindet, und welche Substrate in welchem

Verhältnis dafür herangezogen werden, ist nach bisherigen Erkenntnissen abhängig

von der Tierart (FORD, 2006; MISRO u. RAMYA, 2012).

ATP, welches in den Mitochondrien erzeugt wird, müsste auch bis in die distalen

Segmente des Flagellums transportiert werden, um den Energiebedarf des Axonems

zu decken. Die Distanz von Bildungs- zu Verbrauchsstätte erscheint allerdings zu

groß, um ATP auf ganzer Länge der Geißel zur Verfügung zu stellen (TURNER,

2003). Die Mitochondrien von Eberspermien enthalten nur wenige innere Cristae, an

welchen wichtige Schritte der ATP-Synthese stattfinden, im Gegensatz zu

beispielsweise Mitochondrien von Leberzellen. Deshalb wird angenommen, dass

diese wenig effizient und damit für die Hauptenergieversorgung nicht geeignet sind

(RODRIGUEZ-GIL, 2013).

Es wird von einigen Forschern angenommen, dass die Glykolyse bei Eberspermien

den wichtigsten Weg für die Energiegewinnung darstellt (MARIN et al., 2003; MISRO

u. RAMYA, 2012). Obwohl die Ausbeute bei der Glykolyse wesentlich geringer ist

als bei der oxidativen Phosphorylierung zeigten MARIN et al. (2003), dass nur 5 %

der Energie von Eberspermien durch letztere erzeugt werden. Eine Erklärung dafür

ist, dass sich die Samenzellen nach der Ejakulation im weiblichen Genitaltrakt unter

hauptsächlich anaeroben Bedingungen fortbewegen müssen. Unter diesen

Umständen ist die Glykolyse der effizientere Stoffwechselweg (RODRIGUEZ-GIL,

2013). Studien mit Mäusen zeigten, dass die Glykolyse unverzichtbar für die

Funktionen der Spermien ist, aber die oxidative Phosphorylierung für die männliche

Fruchtbarkeit nicht essentiell ist (MISRO u. RAMYA, 2012). Vor allem scheint die

Glykolyse für die Kapazitation und speziell für die Hyperaktivierung wesentlich zu

sein. Dies legt nahe, dass die Glykolyse den primären Stoffwechselweg darstellt und

Literaturübersicht

10

oxidative Phosphorylierung eine Reservefunktion erfüllt. Eine weitere Theorie ist,

dass sich die Spermien ihrer Umwelt anpassen, also je nach verfügbarem Substrat

den entsprechenden Syntheseweg wählen. Beispielsweise würde bei Mangel an

Glukose und Fruktose mehr Laktat und Pyruvat in den Mitochondrien verarbeitet

werden. Außerdem scheinen verschiedene Vorgänge in der Zelle unterschiedliche

Energiequellen zu nutzen. So erfordert die Akrosomenreaktion bei Eberspermien

wahrscheinlich eher Laktat oder Pyruvat für die ATP-Produktion in den

Mitochondrien, während Energie für die Motilität wie oben erwähnt hauptsächlich

über die Glykolyse gewonnen wird (MIKI, 2017; RODRIGUEZ-GIL, 2013).

FORD (2006) dagegen berichtet, dass der Austausch von ATP, Adenosindiphosphat

(ADP) und Phosphat (Pi) zwischen dem Flagellum und den Mitochondrien mit Hilfe

der Adenylatkinase, die als Shuttle fungiert, durchaus möglich ist und dadurch die

Aufrechterhaltung der Motilität über den mitochondrialen Stoffwechsel gewährleistet

werden kann. Außerdem zeigen seine Experimente, dass Spermien von Mäusen, bei

denen die Glykolyse mit dem GAPDH-Inhibitor α-Chlorohydrin geblockt wurde,

dennoch für lange Zeit motil waren. Weiterhin argumentiert der Autor, dass die

Spermien der meisten Spezies auch in zuckerfreien Medien vollständig motil bleiben.

Wie oben erwähnt, ist Energie in Form von ATP wichtig, um die für die Zellen

lebenswichtigen Synthesereaktionen durchzuführen. Das Maß der Energieladung

(„Energy charge“, EC) ermöglicht eine Einschätzung der Wachstumsphasen, der

Vitalität der Zellen und einen Vergleich von Zellpopulationen (FORD u. LEACH,

1998). Die Menge von metabolisch verfügbarer Energie, die vorübergehend im

Adenylat-System gespeichert ist, hängt linear mit dem Stoffmengenanteil von ATP

plus der Hälfte des Stoffmengenanteils von ADP zusammen (CHAPMAN et al.,

1971). Dieser Parameter, definiert als Energieladung, und die Formel zur

Berechnung wurden von ATKINSON (1967; 1968) wie folgt beschrieben:

Energy charge (EC) =[ATP] + 0,5[ADP]

[ATP] + [ADP] + [AMP]

Literaturübersicht

11

Die Grundvoraussetzung ist, dass Zellen/ Organismen versuchen, ein bestimmtes

Verhältnis von ATP zu ADP und Adenosinmonophosphat (AMP) aufrechtzuerhalten,

und dieses von den Wachstumsphasen der Zellen abhängt (WIEBE u. BANCROFT,

1975). CHAPMAN et al. (1971) zeigten, dass eine große Auswahl von Organismen,

sowohl Eukarioten als auch Prokarioten, während derselben Wachstumsphase

dieselbe Energieladung haben. Aktiv wachsende und sich teilende Zellen haben ein

EC-Verhältnis von 0,8 - 0,95; Zellen, die sich in einer stationären Wachstumsphase

befinden, zeigen ein Verhältnis von 0,6 und ruhende bzw. alternde Zellen haben ein

Verhältnis von unter 0,5 (WIEBE u. BANCROFT, 1975).

CHULAVATNATOL et al. (1977) analysierten den Nukleotid-Gehalt von humanen

Samenzellen mittels Biolumineszenz-Assay und zeigten, dass die physiologische

Energieladung von humanen Samenzellen zwischen 0,8 und 0,9 liegt. Damit

bestätigten sie ATKINSONS Aussage, dass jede normale, homöostatische Zelle eine

physiologische Energieladung zwischen 0,8 und 0,95 hat (ATKINSON, 1968). Mittels

Erhöhung des pH-Werts auf über 9 verursachten CHULAVATNATOL et al. (1977)

einen drastischen Abfall der Motilität und des Nukleotid-Gehalts. Dennoch blieb die

Energieladung stabil bei ca. 0,8. Bei einer pH-Wert-Erniedrigung auf unter 8 sank die

Motilität ebenfalls drastisch ab, der Nukleotid-Gehalt und die Energieladung sanken

aber nur geringgradig. Auch längere Inkubation bei 30 °C des Spermas verursachte

einen Rückgang der Motilität und des Nukleotid-Gehalts, die Energieladung

allerdings blieb bei über 0,6. Die Autoren schlossen aus den Ergebnissen, dass die

Energieladung nicht direkt mit dem ATP-Gehalt gekoppelt ist und dass sie in

humanen Samenzellen auch unter Stress stabil ist.

2.3.2 Einfluss der Lagerung auf den Energiemetabolismus

Mit zunehmender Lagerungsdauer nimmt die Befruchtungsfähigkeit der

Eberspermien ab. Dies wird als Folge eines natürlichen, unvermeidbaren

Alterungsprozesses angesehen. Neben der sinkenden Befruchtungsfähigkeit finden

während der Lagerung auch strukturelle und funktionelle Veränderungen statt. Die

Motilität wird hierbei häufig als Maßstab für einen intakten Metabolismus

herangezogen. Für die Motilität wird ein Grenzwert von 60 – 70 % für die

Literaturübersicht

12

Verwendung in der künstlichen Besamung gesetzt (JOHNSON et al., 2000). Mit

zunehmender Lagerungsdauer sinkt die Motilität und der Grenzwert wird im mit BTS

verdünnten Samen teilweise sogar schon nach 48 h (KUMARESAN et al., 2009) oder

nach 96 h (CEROLINI et al., 2000; WAERHOUSE et al., 2004) Lagerungsdauer

unterschritten. Andererseits werden in einigen Studien auch nach einer Lagerung

von über 100 h noch mehr als 60 % motile Spermien gefunden (WABERSKI et al.,

1994, HENNING et al., 2012).

Die Abnahme der Motilität während der Lagerungsdauer wird unter anderem mit der

zunehmenden Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies („reactive oxygen

species“, ROS), oder von der sich anschließenden Lipidperoxidation in Verbindung

gebracht (CEROLINI et al., 2000; GUTHRIE et al., 2008; KUMARESAN et al., 2009).

Eberspermien gelten wegen ihres hohen Gehalts an mehrfach ungesättigten

Fettsäuren als sehr anfällig, da diese als Substrat für die ROS dienen. Diese wirken

sich nicht nur auf die Motilität sondern vor allem auf den Energiestoffwechsel der

Zellen aus. Der Angriff von freien Radikalen auf die ungesättigten Fettsäuren der

Samenzellmembranen führt zu irreversibler Reduktion der Membranfluidität und zur

Schädigung membranverbundener ATPasen, die für die Regulation der

intrazellulären Ionenkonzentration verantwortlich sind, um die normale

Spermienbeweglichkeit aufrechtzuerhalten. Es wurde gezeigt, dass niedrige

Konzentrationen dieser Substanzen zahlreiche zelluläre Enzyme und metabolische

Prozesse wie die Glykolyse hemmen, und dadurch die ATP-Produktion der Zelle

limitieren (GOGOL et al. 2009).

Die Mitochondrien gelten als Hauptbildungsstätte der intrazellulären ROS. Ihr

vermehrtes Auftreten führt zu einer Unterbrechung des Elektronentransports in den

Mitochondrien. Da der Elektronentransport für die oxidative Phosphorylierung

essentiell ist, führt eine Störung zur Reduktion des Mitochondrienmembranpotentials

und damit zu einer verringerten mitochondrialen ATP-Produktion und in Folge dessen

zu verringerter Motilität (CRAMER u. KNAFF, 1990; GUTHRIE et al., 2008).

ARMSTRONG et al. (1999) zeigten, dass ROS zu Membranschäden führen; dadurch

wird der ATP-Gehalt reduziert und die Motilität der Samenzellen verringert sich. Sie

wiesen nach, dass H2O2 die für humane Samenzellen aggressivste ROS ist. Der

Literaturübersicht

13

Zusatz von H2O2 (0,3 mM – 1,5 mM) in der Samenprobe führte zu einer Reduktion

der Motilität und dosisabhängig zur Verringerung des ATP-Gehalts der Spermien.

Zudem konnten die Autoren bei hohen Konzentrationen von H2O2 einen Effekt auf

das Mitochondrienmembranpotential nachweisen. Allerdings zeigten GUTRIE et al.

(2008) bei Eberspermien, dass der Zusatz von 300 µM H2O2 eine abrupte Reduktion

der Motilität verursachte, aber keinerlei Veränderungen im ATP-Gehalt der Zelle

festzustellen waren. Die Autoren vermuten, dass das H2O2 nicht zu einer

Unterbrechung der Funktion der Mitochondrien geführt hat, sondern stattdessen die

Nutzung von ATP im Axonem unterbrochen oder die Kontraktionsfähigkeit gestört

wurde.

GOGOL et al. (2008) ermittelten mit Hilfe der Chemilumineszenzmessung den

oxidativen Schaden von Eberspermien während der Lagerung und die Auswirkungen

auf den ATP-Gehalt. In vorherigen Studien konnten die Autoren bei humanen

Spermien zeigen, dass die induzierte Photonenemmission eng mit der

Lipidperoxidation der Samenzellen zusammenhängt und somit als Indikator für

oxidativen Stress dienen kann. Nach sieben Tagen Lagerung der mit BTS

verdünnten Samenproben bei 15 °C erhöhten sich die Werte der Chemilumineszenz

signifikant, parallel dazu sanken die Motilität und der ATP-Gehalt. Die Motilität sank

innerhalb der ersten vier Tage um 8 %, der ATP-Gehalt um 25 %. Nach sieben

Tagen Lagerung war die Motilität um 11 % gesunken, der ATP-Gehalt um 33 %. Die

Autoren vermuten, dass die erniedrigte Motilität die Folge der herabgesetzten ATP-

Produktion ist. LONG und GUTRHRIE (2006) analysierten den ATP-Gehalt mit Hilfe

eines Biolumineszenz Assays und zeigten, dass keine signifikanten Veränderungen

bei in mit BTS konservierten Ebersamenproben während der Lagerung über fünf

Tage bei 17 °C auftraten. DZIEKONSKA et al. (2009) testeten den ATP-Gehalt von

Ebersamenproben, die mit dem Verdünner Kortowo 3 (K3) verdünnt wurden, über

eine Lagerungsdauer von drei Tagen bei 16 °C. Dem Verdünner wurde bei einem

Teil der Proben Eigelb zugesetzt. Der ATP-Gehalt wurde ebenfalls mit einem

Biolumineszenz-Assay bestimmt. Bei den Proben ohne Eigelb sank der ATP-Gehalt

signifikant von 12,9 nmol/ 108 Spermien an Tag 0 auf 9,6 nmol/ 108 Spermien an

Literaturübersicht

14

Tag 3. Mit Zusatz von Eigelb waren keine signifikanten Veränderungen während der

Lagerungsdauer zu messen.

Der Nukleotid-Gehalt wurde von KAMP et al. (2003) im frischen Eberejakulat, sowie

in 1:2 mit BTS verdünnten Ejakulat nach einer Haltezeit von 60 min bei 35 °C mittels

eines Spektrofluorometers gemessen. Für dieselbe Zeit wurde unverdünntes Ejakulat

bei 15 °C gehalten. Außerdem wurden die Messungen mit neunfach verdünnten

Samenproben nach einer Lagerungsdauer von 48 h bei 15 °C durchgeführt. Die

Energieladung (EC) wurde nach der in Kapitel 2.3.1 genannten Formel berechnet. Im

frischen Ejakulat wurde eine EC von 0,82 ermittelt. Nach 60 min bei 35 °C sank bei

den 1:2 verdünnten Proben die EC auf 0,33. Dagegen betrug bei den unverdünnten

Proben, die 60 min bei 15 °C gehalten wurden, die EC 0,58; nach 48 h Lagerung

wurde bei den neunfach verdünnten Proben mit 0,59 ein sehr ähnlicher Wert

ermittelt. Die Autoren vermuten, dass diese großen Unterschiede vom

Sauerstoffverbrauch der Samenzellen abhängen. Ihre Berechnungen ergaben, dass

beim Halten der Ebersamenprobe in einem geschlossenen Gefäß bei 35 °C nach

10 min der Sauerstoff aufgebraucht ist. Durch die Abkühlung werden die

Samenzellen immotil und der Verbrauch reduziert sich um 98,6%. Deshalb kann eine

höherer EC aufrechterhalten werden.

Dass die Auswirkungen der Lagerung auf die Spermien auch von dem Einzeltier

abhängen können, zeigten YI et al. (2008). Sie verglichen die Samenproben eines

kältschockresistenten Ebers mit den Samenproben eines kälteschockempfindlichen

Ebers bezüglich der Lagerungsfähigkeit bei 17°C. Als kälteschockresistent galt ein

Eber, wenn nach zwei Tagen Lagerung bei 4 °C noch mehr als 70 % motile

Spermien vorhanden waren. Als Parameter wurde unter anderem der ATP-Gehalt

der Samenzellen mittels Biolumineszenzmessung analysiert. Während der Lagerung

sank der ATP-Gehalt bei dem kälteschockresistenten Eber von

2,26 µM/ 2 x 107 Spermien auf 0,74 µM/ 2 x 107 Spermien, beim

kälteschockempfindlichen Eber von 1,57 µM/ 2 x 107 Spermien auf

0,11 µM/ 2 x 107 Spermien nach vier Tagen Lagerung bei 17 °C. Die für die

Befruchtungsfähigkeit kritische Motilität von 60 % wurde vom kälteschockresistenten

Literaturübersicht

15

Eber nach vier Tagen, vom kälteschockempfindlichen Eber nach drei Tagen

Lagerung bei 17 °C erreicht.

Material und Methoden

16

3 Material und Methoden

3.1 Versuchsübersicht

Das übergeordnete Ziel war es, die Einflüsse der Verdünnertemperatur, der

Abkühlgeschwindigkeit der Samenproben und von verschiedenen

Verarbeitungsregimes, wie zum Beispiel dem Halten des 1:1 (v:v) verdünnten oder

ausverdünnten Spermas bei 32 °C und 21 °C, auf die Qualität flüssig konservierter

Eberspermien während der Lagerung bei 17 °C zu untersuchen.

Zunächst wurden im Experiment 1 zwei im ZDS-Handbuch für Besamungsstationen

(STÄHR et al., 2009) beschriebene und in der Praxis gängige

Verarbeitungsverfahren verglichen. Im Anschluss wurden Ansätze zur Optimierung

der Prozesskette getestet, die auf verschiedenen Ebenen der Spermaverdünnung

ansetzten.

In den Experimenten 2 bis 4 wurden die Auswirkungen von Haltezeiten bei 21 °C und

32 °C des vorverdünnten (Exp. 2 und 3) bzw. ausverdünnten (Exp. 4) Samens auf

die Qualität der gelagerten Samenprobe untersucht. In Experiment 3 wurden

zusätzlich zwei Verdünnungsverfahren - zweistufig isotherm vs. zweistufig

hypertherm - vergleichend untersucht.

Experiment 5 diente zur Untersuchung der Auswirkungen einer beschleunigten

Abkühlrate des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung.

In Experiment 6 wurde der Temperaturverlauf während der Prozesskette in einer

Besamungsstation dokumentiert und in Beziehung zu Laborstandards gesetzt.

Zusätzlich wurde die Verarbeitungsmethode auf der Besamungsstation im Labor

nachgestellt und die Spermaqualität mit der nach im Laborstandard verarbeiteten

Samenproben verglichen.

Die Inhalte der Experimente sind als Übersicht in Abb. 1 und in Kapitel 3.8 detailliert

dargestellt.


17

Abb. 1: Übersicht aller durchgeführten Experimente

3.2 Verbrauchsmaterialien und Geräte

Alle verwendeten Materialien und Geräten sind im Anhang aufgelistet (Kapitel 9.4).

Experiment 6 Temperaturverlauf in der Prozesskette der Samenverarbeitung auf einer

Besamungsstation und Vergleich mit Laborstandards

Experiment 2 Auswirkungen von Haltezeiten und Haltetemperaturen des vorverdünnten Samens bei

zweistufig isothermer Verdünnung

Experiment 3

Vergleich zweistufig isothermer und zweistufig hyperthermer Verdünnung nach

Haltezeiten bei 21 °C

Experiment 5 Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlrate des ausverdünnten Samens nach

einstufig isothermer Verdünnung

Experiment 4 a Auswirkungen von Haltezeiten des

ausverdünnten Samens nach

zweistufig hypothermer Verdünnung

Experiment 4 b

Auswirkungen von Haltezeiten des

ausverdünnten Samens nach

einstufig isothermer Verdünnung

Experiment 1

Vergleich zweistufig isothermer und zweistufig hypothermer Verdünnung bei zwei

Verdünnungsgraden


18

3.3 Lösungen und Chemikalien

Die Rezepte für die verwendeten Lösungen sowie eine Liste der dazugehörigen

Chemikalien mit deren Bezugsquellen befinden sich im Anhang dieser Arbeit (Kapitel

9.2 und 9.3).

Das Wasser wurde über eine Ionenaustauschersäule (Fa. Landgraf, Langenhagen)

aufbereitet und danach durch eine Milipore Express PLUS Membran

(Polyethersulfon, hydrophil, 0,22 µm Porendurchmesser, 47 mm Filterdurchmesser)

sterilfiltriert (Druckfiltrationseinheit Sartobran 300, Fa. Landgraf, Langenhagen).

3.4 Tiere

Für die Versuche im Labor der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken

standen zwölf institutseigene, klinisch gesunde und im Sinne der

Gewährschaftsbestimmungen des Zentralverbandes der deutschen

Schweineproduktion (ZDS, 2005) normosperme Eber zur Verfügung. Voraussetzung

für die Normospermie waren mindestens 70 % motile Spermien und weniger als

25 % morphologisch abweichende Spermien (MAS) im Ejakulat.

Es handelte sich um fertile Eber der Rassen Pietrain (n=8), Deutsche Landrasse

(n=2) und Duroc (n=2) im Alter zwischen einem und fünf Jahren.

Für jeden Versuch wurden, sofern nicht anders beschrieben, sechs Ejakulate von

verschiedenen normospermen Ebern verwendet.

Für die Untersuchungen auf einer Besamungsstation standen elf klinisch gesunde,

fertile Eber zur Verfügung. Für diese Messungen wurden teilweise Ejakulate von

Ebern verwendet, die zu diesem Zeitpunkt nicht für den Verkauf bestimmt waren.

Fünf von diesen elf Ejakulaten waren nicht normosperm.


19

3.5 Samengewinnung

Die Samengewinnung fand mit der sogenannten „Handmethode“ mit Hilfe eines

kunststoffüberzogenen Stahlphantoms statt. Nach Abgang des Vorsekrets wurde die

spermienreiche und spermienarme Phase in einem auf ca. 36 °C vorgewärmten

Samenauffangbecher (Fa. Minitüb, Tiefenbach) aufgefangen, der mit einem

Samenauffangbeutel (US BagTM, Fa. Minitüb, Tiefenbach) versehen war. Eine im

Beutel integrierte Gaze separierte das Bulbourethraldrüsensekret vom übrigen

Ejakulat. Die Gaze wurde nach der Samenentnahme abgetrennt und der

verschlossene Beutel in einer ebenfalls auf ca. 36 °C vorgewärmten Styroporkiste in

das naheliegende Labor transportiert.

Die Samengewinnung auf der Besamungsstation fand unter ähnlichen Bedingungen

statt. Die spermienreiche und spermienarme Phase wurden in einem vorgewärmten

500 ml Schraubglas aufgefangen und mit Rohrpost direkt in das Labor verbracht.

Das Bulbourethraldrüsensekret wurde hier mittels eines auf das Glas aufgesetzten

Milchfilters getrennt.

3.6 Untersuchung des nativen Samens

Nach Ankunft im Labor wurde die Ejakulate in einen auf 36 °C vorgewärmten 500 ml

Glaszylinder umgefüllt und standardspermatologisch untersucht. Es wurden das

Volumen, die Farbe, die Konsistenz, die Spermienkonzentration, die

Spermiengesamtzahl, der pH-Wert, der Anteil motiler Samenzellen nach subjektiver

Schätzung und der Anteil der morphologisch abweichenden Spermien bestimmt.

An einem Phasenkontrastmikroskop mit Heiztisch (Axiostar Plus, Fa. Zeiss, Jena)

wurde bei 38 °C und 200-facher Vergrößerung (Phase 2) der Anteil motiler

Samenzellen geschätzt, indem mindestens drei Gesichtsfelder in drei

unterschiedlichen Tropfen (1,5 – 5 µl) ausgewertet wurden. Die hierfür verwendeten

Objektträger, Deckgläschen und Pipettenspitzen wurden auf einer Heizplatte

(HT 200, Minitüb GmbH, Tiefenbach) auf 38 °C vorgewärmt.


20

Die Spermienkonzentration wurde mit der Zählkammer „Thoma-neu“ (Fa. Jürgens,

Hannover) im Phasenkontrastmikroskop (Axiostar Plus, Zeiss, Jena) ermittelt (400-

fache Vergrößerung, Phase 2). In Anlehnung an die Methodik nach KRAUSE (1966)

erfolgte die Auswertung, wobei in jeder Kammerhälfte alle 16 Felder ausgezählt

wurden. Für ein valides Ergebnis mussten in jeder Hälfte mindestens 100

Spermienköpfe vorhanden sein, der Toleranzbereich zwischen den Hälften lag bei

einer Differenz von 10 %. Die Spermiengesamtzahl errechnete sich aus dem Produkt

von Volumen und Spermienkonzentration des Ejakulates. Der pH-Wert wurde mit

einem pH-Meter (Multiplex 3000/ pMX, Fa. WTW, Weilheim) gemessen.

Die Bestimmung des Anteils morphologisch abweichender Spermien wurde in

Anlehnung an die Klassifikation nach KRAUSE (1966) durchgeführt. Abhängig von

der Spermienkonzentration wurden zwischen 5 – 30 µl des nativen Samens in 300 µl

4 %-iges Formolcitrat pipettiert. Je 200 Zellen wurden bei 1000-facher Vergrößerung

(Ölimmersion, Phase 3) mikroskopisch beurteilt.

3.7 Monitoring der Probentemperatur

Das Abkühlverhalten der Samenproben bei der Anwendung der verschiedenen

Verdünnungsarten wurde durch den Temperaturlogger Micromec® multisens (Fa.

Technetics, Freiburg) dokumentiert. Dieser verfügt über acht flexible, zwei bis fünf

Meter lange Temperatursonden (TK700C, Messbereich -200 bis +600 °C,

Messgenauigkeit 0,1 °C, Technetics, Freiburg), die auch in Flüssigkeiten zur

Temperaturmessung eingesetzt werden können. Da während der Versuche die

Temperaturmessung nicht möglich war, erfolgten die Messungen in einem separaten

Ansatz mit wassergefüllten Ebersamenflaschen. In einem Vorversuch konnte gezeigt

werden, dass das Abkühlverhalten einer Ebersamenprobe mit 20 Mio Spermien/ ml

dem Abkühlverhalten von Wasser entspricht. Für jedes Experiment wurde die

Temperatur in je 3 Probengefäßen (500 ml Glaszylinder bzw. aufrechtstehende

Ebersamenflaschen) mit einer Doppelmessung (je zwei Sonden pro Probengefäß,

mittig angebracht) aufgezeichnet. Über 6 Stunden erfolgte einmal pro Minute die

Aufzeichnung der Probentemperatur, zeitgleich wurde mit einer weiteren Sonde die


21

jeweilige Umgebungstemperatur dokumentiert. Das Auslesen der Daten am PC

erfolgte mit der Software MM-grafix (Version 7.1, Technetics, Freiburg). Die Daten

wurden in Excel exportiert, wo die weitere Auswertung und Erstellung der Grafiken

stattfand.

3.8 Experimentelle Designs

3.8.1 Experiment 1: Vergleich zweistufig isothermer und zweistufig

hypothermer Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden

Hypothese:

Bei zweistufigem Verdünnungsverfahren weisen Samenproben, die im zweiten

Verdünnungsschritt isotherm verdünnt wurden, eine bessere Qualität während der

Lagerung bei 17 °C auf, als solche die hypotherm verdünnt wurden. Der negative

Effekt einer zweistufig hypothermen Verdünnung ist stärker ausgeprägt bei einer

Samenprobe mit höherem Verdünnungsgrad (10 x 106 Spermien/ ml) als bei einem

Verdünnungsgrad von 20 x 106 Spermien/ ml.

Versuchsdurchführung:

Nach der standardspermatologischen Untersuchung und Dichtebestimmung erfolgte

die isotherme Verdünnung des Samens mit auf 32 °C vorgewärmten BTS (Beltsville

Thawing Solution, ca. 330 mOsmol/ kg, pH 7,05-7,11 bei Raumtemperatur; Fa.

Minitüb, Tiefenbach) im Verhältnis 1:1 (v:v). Um ein vergleichbares

Temperaturverhalten der Proben zu erreichen wurden stets konstante Volumina von

200 ml Ejakulat und 200 ml BTS in einem auf 32 °C vorgewärmten 500 ml

Glaszylinder vermischt. Nach einer erneuten Dichtebestimmung wurde die

Samenprobe zu gleichen Teilen in zwei auf 32 °C vorgewärmte 250 ml Glaszylinder

überführt und die Zylinder mit Parafilm verschlossen.

Für die zweistufig isotherme Verdünnung die nach den Vorgaben für die

„zweiphasige Verdünnung“ des ZDS-Handbuchs (2009) durchgeführt wurde, wurde

einer der Zylinder während der zweiten Dichtebestimmung (für ca. 15 min) bei 32 °C

im Wasserbad gehalten. Anschließend erfolgte die Verdünnung in


22

Ebersamenflaschen (100 ml, Fa. Minitüb, Tiefenbach) mit auf 32 °C temperiertem

Verdünner auf eine Endkonzentration von 20 x 106 Spermien/ ml bzw.

10 x 106 Spermien/ ml. Hierzu wurde die entsprechende Menge des vorverdünnten

Samens in die Flaschen vorgelegt und mit BTS auf 100 ml aufgefüllt. Nachdem

verbleibende Luft so weit wie möglich entfernt wurde, wurden die Flaschen

verschlossen, für 90 min bei 21 °C gehalten und daraufhin bei 17 °C im Klimaschrank

gelagert. Die Abkühlung bzw. Lagerung der Flaschen erfolgte immer stehend und mit

ca. 2 cm Abstand zueinander, um für alle Proben eine möglichst gleiche

Abkühlungsrate zu gewährleisten.

Der zweite Glaszylinder wurde für die zweistufig hypotherme Verdünnung, die nach

den Vorgaben für die „zweiphasige Verdünnung“ des ZDS-Handbuchs (2009)

durchgeführt wurde, für 20 min in einem auf 21 °C temperierten Klimaschrank (Fa.

Minitüb, Tiefenbach) gehalten. Danach fand die Ausverdünnung wie oben

beschrieben statt, mit dem Unterschied, dass ein auf 21 °C temperierter Verdünner

verwendet wurde. Wie bei der isothermen Variante kühlten die Proben 90 min bei

21 °C ab. Die Lagerung erfolgte ebenfalls wie oben beschrieben bei 17 °C.

Die Messung der Motilitätsparameter mittels computerassistierter Spermienanalyse

(CASA; siehe Kapitel 3.9) und der Integrität der Plasma- und Akrosommembran

(siehe Kapitel 3.10) der zweistufig isothermen verdünnten Probe fand unmittelbar

nach der Verdünnung der Proben auf die finale Konzentration statt. Die weitere

Analyse aller Proben erfolgte nach 24 h, 72 h und 144 h.

Der Ablauf von Experiment 1 ist in Abb. 2 dargestellt.


23

Abb. 2: Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in Experiment 1. Vergleich von hypothermer und isothermer Verdünnung mit Haltezeiten bei zwei Haltetemperaturen (21 °C/ 32 °C) und zwei Verdünnungsstufen (10 x 106 Spermien/ ml; 20 x 106 Spermien/ ml). Sp = Spermien

zweistufig

hypotherm

zweistufig

isotherm

Vorverdünnung 1:1 isotherm

BTS, 32 °C

200 ml

Haltezeit bei 21 °C

20 min

200 ml


15 min

Haltezeit

90 min bei 21 °C

Lagerung bei 17 °C

200 ml Nativsperma

Ausverdünnung: BTS, 21 °C

100 ml 10 Mio Sp/ ml

100 ml 20 Mio Sp/ml

Ausverdünnung: BTS, 32 °C

100 ml 10 Mio Sp/ ml

100 ml 20 Mio Sp/ml


24

3.8.2 Experiment 2: Auswirkungen von Haltezeiten und Haltetemperaturen

des vorverdünnten Samens bei zweistufig isothermer Verdünnung

Hypothese:

Haltezeiten des 1:1 (v:v) verdünnten Spermas bis 60 Minuten bei 32 °C haben im

Gegensatz zu Haltezeiten bei 21 °C einen positiven Einfluss auf die Qualität der bei

17°C gelagerten Samenproben.

Längere Haltezeiten (> 60 min bis 6 h) bei 32 °C haben dagegen einen negativen

Einfluss auf den Energiestoffwechsel und das Keimwachstum der später bei 17 °C

gelagerten Samenproben.


Da in der Prozesskette der Samenverarbeitung in Besamungsstationen

Verzögerungen während der Verarbeitung und damit Haltezeiten der Ejakulate

unterschiedlicher Länge auftreten können, wurde in diesem Versuch das

Hauptaugenmerk auf die Auswirkungen von Haltezeiten (30 min, 60 min, 3 h und 6 h)

von 1:1 (v:v) verdünntem Samen bei 32 °C auf die Qualität der gelagerten

Samenproben gelegt. Hierbei wurden neben den Motilitätsparametern und der

Membranintegrität zusätzlich der ATP-Gehalt und die Energieladung der Spermien,

der Anteil der Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential, sowie der Effekt

auf die mikrobiologische Qualität analysiert. Die Verdünnung des Samens erfolgte

zweistufig isotherm.

Für diesen Versuch wurden insgesamt zwölf Ejakulate von neun verschiedenen

Ebern verwendet. Der Versuch wurde zweimal mit jeweils sechs Ejakulaten

durchgeführt. Da der zeitliche Abstand der Versuche bei ca. einem Jahr lag, wurde

jedes Ejakulat trotz der Verwendung der gleichen Tiere eigenständig gewertet.

Die Vorverdünnung, die zweistufig isotherme Verdünnung sowie die Abkühlung und

Lagerung der Samenproben wurde wie in Kapitel 3.8.1 beschrieben, durchgeführt.

Die vorverdünnten Samenproben wurden vor der Ausverdünnung Haltezeiten

ausgesetzt, mit Ausnahme der Kontrollproben, die direkt ausverdünnt wurden. Eine

Hälfte der 1:1 (v:v) vorverdünnten Samenproben (Zylinder 1) wurde für 30 min, 60

min, 3 h und 6 h Haltezeiten bei 32 °C gehalten. Die Ausverdünnung fand direkt nach

jeder Haltezeit statt.


25

Der zweite Zylinder wurde für dieselben Haltezeiten im Klimaschrank bei 21 °C

gehalten. Um auch hier eine zweistufig isotherme Verdünnung gewährleisten zu

können, wurde ein 500 ml Glaszylinder mit einem auf 32 °C vorgewärmtem

Verdünner zeitgleich in den Klimaschrank verbracht und kühlte parallel mit der Probe

ab. Die isotherme Ausverdünnung fand ebenfalls nach jeder Haltezeit statt. Die

Abkühlung und Lagerung der Proben entsprachen den bei 32 °C verarbeiteten

Proben.

Die Messung der Membranintegrität (s. Kapitel 3.10) und der Motilitätsparameter

(s. Kapitel 3.9) wurde bei allen zwölf Ejakulaten direkt nach jeder Haltezeit sowie

nach 24 h und 72 h durchgeführt. Sechs Ejakulate wurden einer weiteren

Untersuchung nach 144 h Lagerung unterzogen.

Das Mitochondrienmembranpotential wurde bei sechs Ejakulaten zu denselben

Zeitpunkten wie die Membranintegrität und die Motilität analysiert (s. Kapitel 3.11).

Die Probenentnahme für die Bestimmung der ATP-Konzentration und der

Energieladung im nativen Samen erfolgte zunächst direkt nach der

standardspermatologischen Untersuchung (s. Kapitel 3.13). Dazu wurde eine

zusätzliche Samenprobe (100 ml, 20 x 106 Spermien) direkt nach der

standardspermatologischen Untersuchung isotherm mit vorgewärmtem BTS

verdünnt, um eine vergleichbare Menge Samenzellen für die Messung eines

Kontrollwerts der ATP-Konzentration zur Verfügung zu haben. Die weitere

Probenentnahme fand zu den oben genannten Messzeitpunkten, also nach jeder

Haltezeit sowie nach 24 h, 72 h, und 144 h Lagerung statt.

Der Einfluss der Haltezeiten auf die mikrobiologische Qualität der Proben wurde

durch eine Gesamtkeimzahlbestimmung ermittelt. Von 4 Ejakulaten wurde je 1 ml

des nativen Samens entnommen. Am Tag der Verdünnung erfolgte des Weiteren die

Beprobung des 1:1 (v:v) verdünnten Samen der Kontrolle (nach ZDS-Handbuch

verarbeitete Probe) sowie nach 60 min und 6 h Inkubation bei 32 °C sowie 21 °C.

Nach 72 h Lagerungsdauer wurde in den ausverdünnten Proben erneut eine

Gesamtkeimzahlbestimmung durchgeführt. Alle Proben für die mikrobiologische

Untersuchung wurden nach der Entnahme gekühlt (< 10°C, Styroporbox mit


26

Kühlakkus) ins Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule

Hannover verbracht und dort untersucht (s. Kapitel 3.14).


Abb. 3: Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in Experiment 2. Vergleich von Haltezeiten bei verschiedenen Haltetemperaturen (21 °C/ 32 °C) bei zweistufig isothermer Verdünnung. *15 min: Kontrolle, Verarbeitung nach ZDS - Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

zweistufig

isotherm

zweistufig

isotherm


BTS 32 °C

200 ml


15 min*, 30 min, 60 min, 3 h, 6 h

Ausverdünnung

BTS, isotherm

Haltezeit

90 min bei 21 °C

Lagerung bei 17 °C

200 ml Nativsperma

Ausverdünnung

BTS, isotherm

200 ml


30 min, 60 min, 3 h, 6 h


27

3.8.3 Experiment 3: Vergleich zweistufig isothermer mit zweistufig

hyperthermer Verdünnung

Hypothese:

Die Ausverdünnung mit im Vergleich zur Samenprobe hyperthermen Verdünner hat

einen negativen Einfluss auf die Qualität des bei 17 °C gelagerten Samens.


Während des Betriebsablaufs in einer Besamungsstation kann es zu Verzögerungen

kommen und damit zu Haltezeiten bei Raumtemperatur, so dass der vorverdünnte

Samen allmählich abkühlt. Der Verdünner wird hingegen in der Regel auf einer

konstanten Temperatur von 32 °C gehalten. Daraus kann sich unter

Praxisbedingungen eine hypertherme Ausverdünnung ergeben. Im Experiment

wurde die zweistufig hypertherme Verdünnung der im Kapitel 3.8.1 untersuchten

zweistufig isothermen Verdünnung als Kontrolle gegenübergestellt.

Die Vorverdünnung sowie die Abkühlung und Lagerung erfolgten wie in Kapitel 3.8.1

beschrieben, die zweistufig isotherme Verdünnung mit Haltezeiten analog zu der

Beschreibung in Kapitel 3.8.2.

Für die zweistufig hypertherme Verdünnung wurde ebenfalls ein 250 ml Glaszylinder

mit 200 ml vorverdünntem Sperma für die angegebenen Haltezeiten, mit Ausnahme

der Kontrollprobe, bei 21 °C gehalten. Ein 500 ml Zylinder mit BTS wurde während

des Versuchs bei 32 °C gehalten. Die hypertherme Ausverdünnung erfolgte nach

jeder der Haltezeiten mit dem auf 32 °C temperierten Verdünner.

Die untersuchten spermatologischen Parameter waren auch in diesem Experiment

die Membranintegrität (s. Kapitel 3.10) sowie die Messung CASA –

Motilitätsparameter (s. Kapitel 3.9). Die Messungen wurden jeweils direkt nach der

Verdünnung auf die Endkonzentration und nach 24 h und 72 h Lagerungsdauer

durchgeführt.



28

Abb. 4: Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in Experiment 3. Vergleich zweistufig isothermer und zweistufig hyperthermer Verdünnung nach Haltezeiten bei 21 °C. *15 min: Kontrolle, Verarbeitung nach ZDS - Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

zweistufig

isotherm

zweistufig

hypertherm


BTS 32 °C

200 ml


30 min, 60 min, 3 h, 6 h

Ausverdünnung

BTS, 32 °C

Ausverdünnung

BTS, isotherm

Haltezeit

90 min bei 21 °C

Lagerung bei 17 °C

200 ml Nativsperma

200ml


15min*, 30 min, 60 min, 3 h, 6 h


29

3.8.4 Experiment 4: Auswirkungen von Haltezeiten des ausverdünnten

Samens nach zweistufig hypothermer (Exp. 4 a) oder einstufig isothermer

Verdünnung (Exp. 4 b)

Hypothese:

Haltezeiten des zweistufig hypotherm oder einstufig isotherm ausverdünnten

Spermas haben einen positiven Einfluss auf die Qualität der bei 17 °C gelagerten

Samenprobe.

Versuchsdurchführung Exp. 4 a:

Isotherm 1:1 (v:v) vorverdünntes Sperma (Volumen: 400 ml) wurde 20 min bei 21 °C

gehalten und anschließend mit auf 21 °C temperierten BTS in 100 ml

Ebersamenflaschen ausverdünnt. Die Kontrolle wurde gemäß der ZDS-

Empfehlungen für 90 min bei 21 °C gehalten und dann bei 17 °C gelagert. Eine

Versuchsvariante wurde bis zu 6 h bei 21 °C gehalten, während die zweite

Versuchsvariante bei 32 °C gehalten wurde. Nach Ende der Haltezeiten (30 min,

60 min, 3 h bzw. 6 h) wurden alle Proben für 90 min bei 21 °C gehalten und

anschließend bei 17 °C gelagert.

Die Analyse der Membranintegrität (s. Kapitel 3.10) sowie der Motilität (s. Kapitel 3.9)

fand am Tag der Samenverarbeitung (d 0) sofort nach den initialen Haltezeiten

(30 min – 6 h) und nach 24 h und 72 h Lagerung statt.

Der Ablauf von Experiment 4 a ist in Abb. 5 dargestellt.

Versuchsdurchführung Exp. 4 b:

Dieses Experiment untersuchte ebenfalls den Effekt von Haltezeiten des

ausverdünnten Spermas auf die Qualität des gelagerten Spermas. Der Unterschied

zu Experiment 4 a lag darin, dass in diesem Versuch eine einstufig isotherme

Verdünnung verwendet wurde, die nach den Empfehlungen des ZDS-Handbuchs für

„einphasige Verdünnung“ durchgeführt wurde.

Die Ejakulate wurden nach der standardspermatologischen Untersuchung mit auf

32 °C temperierter, isothermer BTS in einem Schritt zur Endkonzentration

20 x 106 Spermien/ ml ausverdünnt. Hierfür wurde die entsprechende Menge


30

Ejakulat in der Ebersamenflasche vorgelegt und langsam mit dem Verdünner auf

100 ml aufgefüllt. Die Kontrolle (Verarbeitung ohne Haltezeiten, nach ZDS-

Handbuch) wurde wie bei den vorausgegangenen Versuchen erstellt, während in den

Versuchsvarianten Samenproben für 30 min, 60 min, 3 h bzw. 6 h bei 32 °C bzw.

21 °C gehalten wurden. Die weitere Abkühlung, Lagerung und Analyse erfolgte

analog zu Experiment 4 a.

Der Ablauf von Experiment 4 b ist in Abb. 6 dargestellt.

Abb. 5: Temperatur- und Zeitregime der zweistufig hypothermen Samenverarbeitung in Experiment 4 a. Vergleich von Haltezeiten bei verschiedenen Haltetemperaturen (21 °C/ 32 °C) des ausverdünnten Samens nach zweistufig hypothermer Verdünnung.

zw

eis

tufi

g

hyp

oth

erm

Ausverdünnung mit BTS 21 °C


30 min, 60 min, 3 h, 6 h


30 min, 60 min, 3 h, 6 h

Haltezeit

90 min bei 21 °C

Lagerung bei 17 °C

Vorverdünnung 1:1

isotherm

BTS 32 °C


20 min

0 min Haltezeit

(Kontrolle)

200 ml Nativsperma


31

Abb. 6: Temperatur- und Zeitregime der einstufig isothermen Samenverarbeitung in Experiment 4 b. Vergleich von Haltezeiten bei verschiedenen Haltetemperaturen (21 °C/ 32 °C) des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung.

3.8.5 Experiment 5: Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlrate des

ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung

Hypothese:

Eine schnelle Abkühlrate der Samenprobe während der Frühphase der

Konservierung hat einen negativen Einfluss auf die Qualität der gelagerten

Samenprobe.


Die Folgen einer erhöhten Abkühlrate nach der Samenverarbeitung auf die Qualität

des bei 17°C gelagerten Samens wurden mit diesem Versuch untersucht.

Ausverdünnung einstufig isotherm

mit BTS, 32 °C


30 min, 60 min, 3 h, 6 h


30 min, 60 min, 3 h, 6 h

Haltezeit

90 min bei 21 °C

200 ml Nativsperma

Lagerung bei 17 °C

0 min Haltezeit

(Kontrolle)


32

Zu diesem Zweck wurden die Ejakulate wie in Kapitel 3.8.4 (Exp. 4 b) beschrieben

einstufig isotherm mit auf 32 °C temperierter BTS verdünnt. Anschließend wurde je

ein Teil der Proben in 100 ml Flaschen wie bei den vorausgegangenen Versuchen

90 min bei 21 °C gehalten und danach bei 17 °C gelagert. Der andere Teil der

Samenproben wurde direkt nach der einstufig isothermen Verdünnung in die

Lagerung bei 17 °C überführt.

Die Analyse von Membranintegrität (s. Kapitel 3.10) und Motilität (s. Kapitel 3.9) fand

nach 24 h, 72 h und 144 h Lagerungsdauer statt.


Abb. 7: Temperatur- und Zeitregime der einstufig isothermen Samenverarbeitung in Experiment 5. Vergleich von einer beschleunigten Abkühlrate ohne Haltezeit zur Standardabkühlung mit 90 min Haltezeit nach einstufig isothermer Verdünnung.

Ausverdünnung einstufig isotherm

mit BTS 32 °C

Haltezeit

90 min bei 21 °C

(Kontrolle)

Nativsperma

Lagerung bei 17 °C


33

3.8.6 Experiment 6: Temperaturverlauf in der Prozesskette der

Samenverarbeitung auf einer Besamungsstation und Vergleich mit

Laborstandards

3.8.6.1 Temperaturverlauf im Sperma während der Verarbeitung auf einer

Besamungsstation bei Samenverarbeitung

Dieser Versuch wurde in Zusammenarbeit mit dem Labor einer Besamungsstation

durchgeführt. Ziel des Experimentes war es, die Haltezeiten des vorverdünnten

Samens während der Samenverarbeitung und den Temperaturverlauf der Proben in

der Prozesskette, von Ankunft der Ejakulate im Labor bis zur Umlagerung der

Spermaportionen für den Versand, in Relation zur Qualität des gelagerten Samens

setzen.

Die frisch gewonnenen Ejakulate erreichten das Labor via Rohrpost in einem 500 ml

Schraubglas. Als erstes wurde die Spermienkonzentration des Ejakulats gemessen

und direkt eine erste Vorverdünnung im Glas durchgeführt. Die Vorverdünnung

erfolgt mit auf 32 °C angewärmter BTS, indem jede Probe auf 500 ml aufgefüllt

wurde. Im Anschluss wurden die Motilität und der Anteil morphologisch

abweichender Spermien mikroskopisch geschätzt. Das Sperma wurde mit auf 26 °C

temperierter BTS ausverdünnt und anschließend in 80 ml Tuben abgefüllt. Die

Samenportionen wurden nach Ebern getrennt in Tüten gefüllt und in oben offenen

Plastikboxen im anliegenden Versandraum (21 °C Raumtemperatur) bis zum

Versand gelagert. Die am Samengewinnungstag nicht verkauften Proben wurden in

einem verschließbaren auf 17 °C temperierten Kühlregal bis zum nächsten Tag

gelagert.

Um die Haltezeiten vor der Abfüllung unter Praxisbedingungen zu erfassen, wurde

bei sieben Ejakulaten die Dauer der Verzögerungen während der Prozesskette

notiert.

Anhand von vier Ejakulaten einer Tagesproduktion wurde die Abkühlung während

der gesamten Verarbeitungskette gemessen. Direkt nach der Ankunft im Labor

wurden die Ejakulate wie oben beschrieben vorverdünnt. Zwei Ejakulate wurden

direkt weiterverarbeitet, die anderen Beiden wurden erst nach einer Stunde abgefüllt,


34

um eine Haltezeit zu simulieren. Während dieser Zeitspanne wurde die Temperatur

des vorverdünnten Spermas zwölfmal, im Abstand von drei bis sechs Minuten, mit

einem Glasthermometer gemessen und notiert. Bei der anschließenden

Untersuchung und zweiten Verdünnung mit dem auf 26 °C temperierten BTS wurde

ebenfalls die Temperatur des Samens gemessen. Unmittelbar nach der Abfüllung

wurden die Samentuben je eines Ebers in eine Plastikbox gelegt und in den

Versandraum verbracht. Dort wurden jeweils zwei Tuben eines verarbeiteten

Ejakulates (n = 4) mit einer Temperatursonde (mikromec® multisens) bestückt. Um

die Temperatur in der Tube zu messen, wurde die Tube an der Tülle aufgeschnitten

und die Sonde bis zur Mitte der Tube eingeführt. Mit Hilfe eines vulkanisierenden

Klebebandes wurde die Sonde an der Tülle fixiert. Anschließend wurde eine Tube

mittig, zwischen die anderen Tuben in die Box gelegt, so dass sie von allen Seiten

von der gleichen Menge Tuben umgeben war. Die andere Tube wurde oben auf den

anderen Tuben platziert. Die Temperatur wurde einmal pro Minute dokumentiert.

Während der gesamten Verarbeitung betrug die Raumtemperatur am Versuchstag

zwischen 21 °C und 22 °C. Nachdem der Versand der Tuben für diesen Tag beendet

war (ca. 5 h nach Beginn des Versuchs), wurden die Boxen in ein Klimaregal mit

17 °C umgelagert, welches nach ca. 1,5 h mit einem Rollo verschlossen wurde. 6,5 h

nach Platzierung der Messsonden in den Tuben wurde die Messung beendet.

Die Prozesskette in der Besamungsstation ist in Abb. 8 dargestellt.


35

Abb. 8: Prozesskette der Samenverarbeitung in einer Besamungsstation. Die grauen Flächen stellen Zeitpunkte für mögliche Verzögerungen in der Verarbeitung dar, aus denen sich Haltezeiten unterschiedlicher Länge ergeben.

3.8.6.2 Vergleich des Verdünnungsverfahrens einer Besamungsstation mit dem

Laborstandard

Im Labor der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken der Tierärztlichen

Hochschule Hannover wurde das Temperaturregime der Besamungsstation

nachgestellt und mit dem Laborstandard (Verarbeitung nach ZDS-Empfehlungen für

„einphasige Verdünnung“) verglichen. Die wesentlichen Unterschiede in der

Vorgehensweise auf Besamungsstationen und im Forschungslabor liegen darin,

dass in Besamungsstationen zumeist zweistufig hypotherm verdünnt wird und die

vorverdünnten Ejakulate Haltezeiten unterschiedlicher Länge bei Raumtemperatur

Dichtebestimmung

Ankunft des Samens im Labor

(500 ml Schraubglas, Rohrpost)

mikroskopische

Motilitätsschätzung

Ausverdünnung (BTS 26 °C)

Abfüllung

Versandraum (21 °C)

Vorverdünnung im Glas (Auffüllen auf 500 ml)

BTS 32 °C

Haltezeit bei RT

Haltezeit bei RT

Haltezeit bei RT


36

ausgesetzt sind. Um die Samenqualität während der Lagerung zu bestimmen,

wurden CASA-Motilitätsparameter (Kapitel 3.9), Membranintegrität (Kapitel 3.10) und

Calcium-Influx (Kapitel 3.12) gemessen.


Bei dem Laborstandard wird direkt nach der standardspermatologischen

Untersuchung das Ejakulat in der Ebersamenflasche auf 20 x 106 Spermien/ ml

isotherm mit auf 32 °C vorgewärmter BTS ausverdünnt. Die Samenproben werden

dann für 90 min bei 21 °C gehalten und anschließend zur weiteren Abkühlung und

Lagerung bei 17 °C gelagert.

Bei der Simulation der Samenverarbeitung der Besamungsstation fand nach der

standardspermatologischen Untersuchung eine isotherme Vorverdünnung (BTS,

32 °C) des Nativspermas im Verhältnis 1:1 (250 ml: 250 ml) statt. Danach wurde der

Samen 30 min bei 21 °C gehalten. Diese Zeitspanne entsprach der vorher ermittelten

mittleren Standzeit der Besamungsstation. Daraufhin wurde mit auf 26 °C

temperierten Verdünner die Ausverdünnung in der Ebersamenflasche durchgeführt.

Für die weitere Abkühlung wurde die Flasche in einer Plastikbox mittig zwischen 40

Tuben gelegt, die auf dieselbe Temperatur vorgewärmt waren. Analog zu den

Messungen in der Besamungsstation verblieb die Box für 2,5 h bei 21 °C.

Anschließend wurde diese in den auf 17 °C temperierten Klimaschrank verbracht.

Die Messung der Motilitätsparameter (s. Kapitel 3.9) und der Membranintegrität (s.

Kapitel 3.10) fanden nach 24 h und 144 h statt. Die Motilitätsparameter wurden

zusätzlich nach 72 h bestimmt. Die Analyse des Calcium-Influx (s. Kapitel 3.12) fand

nach 24 h Lagerungsdauer statt.

Der Ablauf des Vergleichs ist in Abb. 9 dargestellt.


37

Abb. 9: Vergleich von Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in der

Besamungsstation mit Laborstandard in Experiment 6. Sp = Spermien

3.9 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA)

3.9.1 Testprinzip

Die Untersuchung der Probe fand im negativen Phasenkontrast statt, so dass die

Spermienköpfe als weiße Fläche auf grauem Hintergrund erschienen. Die Spermien

wurden von einer Kamera erfasst und die Bilder an den angeschlossenen Computer

weitergeleitet. Die weißen Flächen wurden von der Software als Samenzellen

erkannt und diese ermittelte daraus den Anteil motiler Spermien. Aus den Daten

wurden zusätzlich verschiedene Motilitätsparameter wie zurückgelegte Distanz,

Geschwindigkeit der Spermien und deren Bewegungsmuster errechnet.

Station Standard Vorverdünnung 1:1

isotherm, BTS 32 °


30 min

Ausverdünnung

20 x 106 Sp/ ml

hypotherm, BTS 26 °C

Ausverdünnung

20 x 106 Sp/ ml

isotherm, BTS 32 °C

Haltezeit in Flaschen

einzeln

90 min bei 21 °C

Lagerung bei 17 °C

Nativsperma

Haltezeit in Tuben in

Box mittig zwischen 40 auf

26 °C temperierten Tuben

Lagerung bei 17 °C


38

3.9.2 Gerät und Software

Für die Messung der Motilitätsparameter stand das SpermVision®-System (Fa.

Minitüb, Tiefenbach) zur Verfügung. Dieses bestand aus einem Mikroskop (Okular

10, Objektiv 20, BX41TF, Fa. Olympus, Hamburg) mit einem beheizbaren Objekttisch

und einem automatisch fahrbaren Kreuztisch, sowie einer Heizplatte (HT 300, Fa.

Minitüb, Tiefenbach) zum Vorwärmen der Messkammern und Pipettenspitzen, die

gleichzeitig die Temperatur des Objekttisches steuerte. Für die Messung wurde die

Probe in eine Leja-Messkammer mit 20 µm Schichtdicke (SC 20-01-04-B, Leja

Products B.V., Nieuw-Vennep, Niederlande) pipettiert. Die mit Hilfe eines TV-

Adapters (U-TV 0.63XC; Olympus, Hamburg) am Mikroskop angebrachte

Digitalkamera (AccuPiXEL TM6760 CL, Auflösung 600 x 800 Pixel, JAI A/S,

Glostrup, Dänemark), nahm die Bilder des Präparates auf, die direkt an den

Computer weitergeleitet wurden. Für die Analyse der Bilder und die Steuerung des

automatischen Kreuztisches wurde die Software SpermVision® (Version 3.7, Fa.

Minitüb, Tiefenbach) verwendet. Für die Bewegungsparameter und die Motilität

wurden 10 aufeinanderfolgende Positionen, die in der zentralen Längsachse der

Kammer lagen, angesteuert. Pro Messposition wurde in 0,5 Sekunden eine Serie von

30 Einzelbildern aufgenommen. Als Spermienkopf wurde vom System jede weiße

Fläche zwischen 23 µm2 und 120 µm2 detektiert. Anhand deren Positionsänderung

während der 0,5 Sekunden errechnete die Software die folgenden

Motilitätsparameter:

Zurückgelegte Wegstrecken [µm]: DSL = distance straight line

DCL = distance curvilinear line

DAP = distance average path

Geschwindigkeiten [µm/ s]: VSL = velocity straight line

VCL = velocity curvilinear line

VAP = velocity average path


39

Gerichtetheit der Bewegung: WOB = VAP / VCL = wobble

STR = VSL / VAP = straightness

LIN = VSL / VCL = linearity

gemittelte maximale seitliche Kopf-: ALH = amplitude of lateral head-

auslenkung von der mittleren Bahn displacement

[µm]

Frequenz des Kreuzens des tat-: BCF = beat cross frequency

sächlichen Bewegungspfads mit

der gemittelten Bahn [Hz]

durchschnittlicher Richtungswechsel: AOC = average orientation change

des Spermienkopfes [°]

Die Motilitätsklassen der einzelnen Samenzellen wurden anhand der berechneten

Parameter folgendermaßen definiert:

Immotil: AOC < 2,5

lokal motil: AOC > 2,5 und DSL < 4,5

progressiv motil: Spermien, die nicht diesen Kriterien entsprachen.

Als Ergebnis der Motilitätsmessung wurden die Gesamtmotilität in Prozent und der

prozentuale Anteil der progressiv motilen Spermien dokumentiert. Die

Motilitätsparameter wurden für jede einzelne Samenzelle gespeichert und ein

Mittelwert von jedem Parameter für die Gruppe der progressiv motilen Spermien

berechnet.

3.9.3 Messung

Als Vorbereitung für die Messungen wurden die Heizplatte und der Objekttisch

genauso wie die Leja-Messkammern und die Pipettenspitzen auf 38 °C erwärmt.


40

Zwei Milliliter des verdünnten Samens wurden für 15 min in einem offenen

Reagenzglas bei 38 °C im Wasserbad inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationsdauer

wurde das Reagenzglas mit Parafilm verschlossen und zur Durchmischung evtl.

abgesetzter Samenzellen mehrfach um 180° geschwenkt. Die Messkammer wurde

dann mit 2,7 µl der Probe befüllt, so dass eine vollständige Befüllung ohne

Lufteinschlüsse vorlag. Dazu wurde die Pipette genau senkrecht über der

Einfüllmulde positioniert, und der Inhalt gleichmäßig freigegeben, so dass der

Tropfen durch Kapillarkräfte in die Kammer gesogen wurde. Die erfolgreich befüllte

Kammer wurde mit dem Kreuztisch automatisch auf die erste Messposition gefahren

und, nach fokussieren des Bildes mit dem Feintrieb des Mikroskops und Einstellen

der Lichtintensität für einen optimalen Kontrast, die Analyse gestartet.

Alle Messungen wurden innerhalb von 60 Sekunden nach Befüllen der Kammer

abgeschlossen und am Ende des Versuchstags die Messdaten als Excel-Datei

exportiert.

3.10 Membranintegrität in der Durchflusszytometrie

3.10.1 Testprinzip

Diese Analyse beruht auf der unterschiedlichen Permeabilität für

Fluoreszenzfarbstoffe von intakten und defekten Membranen der Samenzelle.

Anhand von Fluoreszenzfarbstoffen mit verschiedenem Bindungsverhalten sowie

unterschiedlichem Emissionsspektrum können die Defekte der Plasma- und

Akrosommembranen gleichzeitig sichtbar gemacht und unterschieden werden. Der

rot fluoreszierende Farbstoff Propidiumiodid dringt bei defekter Plasmamembran in

die Zelle ein und bindet an die DNA; das grün fluoreszierende FITC-PNA zeigt

Schäden am Akrosom durch das Binden an die Innenseite der äußeren

Akrosomenmembran auf.


41

3.10.2 Gerät und Farbstoffe

Die Analyse der Membranintegrität der Samenzellen fand am Durchflusszytometer

„Dako Galaxy“ (Fa. Dako, Hamburg) statt. Die Steuerung erfolgte durch die Software

„FloMax“ 2.0 (Fa. Partec, Münster). Zur Ausstattung gehörten ein Argonionenlaser

(488 nm; 20 mW) zur Anregung der Farbstoffe, sowie drei verschiedene Filter: Die

Detektion von grünem Fluoreszenzlicht fand im Kanal FL-1 (537,5/22,5 nm) und

oranges Licht im Kanal FL-2 (590/25 nm) statt. Rotes Licht wurde im Kanal FL-3

durch einen Longpassfilter (630 nm LP) detektiert, blaues Licht im Kanal FL-4

(465 nm BP).

Eine weitere Anregung erfolgt durch eine HBO Quecksilberlampe (300 bis 400 nm,

100 W). Im Strahlengang sind zur Selektion der Wellenlängen zwei Filter

hintereinander geschaltet. Der erste Filter lässt Licht mit einer Wellenlänge zwischen

300 und 700 nm passieren, der zweite selektiert auf eine Wellenlänge zwischen

270 nm und 405 nm, der Hauptemissionspeak liegt hier bei 365 nm.

Die Differenzierung von DNA-haltigen Partikeln (Spermien) und Detritus wurde mit

dem membranpermeablen Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 erreicht, welcher

durch Bindung an die DNA alle in der Probe enthaltenen Zellen blau färbte. Das nicht

membrangängige, rot fluoreszierende Propidiumiodid (PI, Fa. Sigma-Aldrich,

Steinheim) dagegen kann nur bei defekter Plasmamembran in die Zelle eindringen

und an die DNA binden. Zur Darstellung von Samenzellen mit geschädigter äußerer

Akrosomenmembran wurde Peanut-Agglutinin eingesetzt, welches an

Fluoreszeinisothiocyanat (FITC-PNA, Axxora GmbH, Lörrach), gekoppelt ist. FITC-

PNA bindet spezifisch an β-Galaktosereste an der Innenseite der äußeren

Akrosomenmembran. Im Falle eines grünen Fluoreszenzsignals ist damit von einer

Schädigung der äußeren Akrosomenmembran auszugehen.

3.10.3 Grundeinstellungen

Um die Ausrichtung des Lasers, der UV-Lampe und der optischen Bank zu

überprüfen und ggf. einzustellen, wurde zu Beginn des Versuchstags mit


42

fluoreszierenden Beads (Calibration Bead 3 µm, Fa. Partec, Münster) und UV-Beads

(DNA control UV, Fa. Partec, Münster) das Durchflusszytometer kalibriert. Als

Sheathlösung diente in 5 l Aqua dest. gelöstes Sodium Azide (500 mg, Partec

GmbH, Münster) und Tween® 20 (500 µl, Partec GmbH, Münster) (3 - 4 mOsmol,

pH Wert: 6,0 – 6,5; Raumtemperatur). Die Sheathlösung wurde bei Raumtemperatur

gelagert und verwendet.

Vor der ersten Messung wurden außerdem die Grundeinstellungen der

Signalverstärkungen festgelegt, die dann für alle Messungen des Versuchstages

beibehalten wurden.

Für die Grundeinstellungen sowie die späteren Messungen setzten sich die Proben

folgendermaßen zusammen:

980 µl HBS

5 µl Propidiumiodid (1 mg/ml)

5 µl FITC PNA (600 µg/ ml)

5 µl Hoechst 33342 (150 µl/ ml)

5 µl Samenprobe (20 x 106 Spermien/ ml)

Die Messungen erfolgten nach 5 min Inkubation der Probe auf einer Wärmeplatte bei

38 °C (Heizplatte, HT 300, Fa. Minitüb, Tiefenbach).

Als Maß für die Partikelgröße wurde die Signalverstärkung der Vorwärtsstreuung

(FSC = forward scatter) und die Seitwärtsstreuung (SSC = sideward scatter) jeweils

auf linearen Skalen dargestellt. Die im Histogramm des FSC entstandene

glockenförmige Kurve repräsentierte die Partikelgröße. Ereignisse, die links davon

lagen, wurden von der Analyse ausgeschlossen, da es sich hierbei um Debris und

Schmutzpartikel handelte. In einem Punktewolkendiagramm (dotplot) wurden FSC

(Abszisse) und SSC (Ordinate) gegeneinander aufgetragen. Die Signale der

Spermien stellten sich als eine Dreiecks- bzw. „L“-Form dar.

Um die Verstärkung der Fluoreszenzkanäle festlegen zu können, wurden die

Signalverstärkungen während der Messungen so eingestellt, dass bei Kanal FL-1

und FL-3 zwei Populationen zu differenzieren waren. Hierfür wurde auf der

logarithmischen Abszisse die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der PI-

negativen bzw. FITC-PNA-negativen Spermien so verschoben, dass sie mittig über


43

dem Wert 1 lag. Die PI- bzw. FITC-PNA-positive Population zeigte in der Regel eine

um den Faktor 10 erhöhte Fluoreszenzintensität. Im Kanal FL-4 wurde das Signal auf

der logarithmischen Skala so verstärkt, dass die Hoechst 33342-positiven Ereignisse

zwischen der zweiten und dritten Dekade dargestellt wurden. An jedem Versuchstag

wurden die Grundeinstellungen überprüft und, im Falle einer Abweichung der

Signaldarstellung, die Signalverstärkungen neu justiert.

3.10.4 Messung und Auswertung

Alle Messungen wurden mit der oben genannten Dreifachfärbung in einem

abgedunkelten Raum durchgeführt. Jeweils 880 µl eines Mastermix aus HBS und

Farbstoffen wurden in 3,5 ml Reagenzröhrchen (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) aliquotiert,

verschlossen und im Wärmeschrank auf 38 °C angewärmt. Zum Zeitpunkt der

Messung wurden 5 µl der zu messenden Spermaprobe in die angewärmte Lösung

pipettiert und mit dem Vortex gemischt. Nach 5 min Inkubation auf einer Wärmeplatte

bei 38 °C wurde, nach erneutem Mischen, die Analyse gestartet. Je Spermienprobe

wurden 10.000 Ereignisse bei einer Flussrate von 400 – 600 Ereignissen/ Sekunde

erfasst.

Für die Auswertung wurden zunächst verschiedene Grenzlinien („Ranges“)

verwendet, um die Messereignisse zu selektieren, die für eine Auswertung relevant

sind. Die erste Range (RN1) im FSC-Kanal grenzte die Ereignisse ein, die der Größe

von Eberspermien entsprachen (Abszisse, lineare Skala, Bereich von 0 – 150). Die

zweite Range (RN2) definierte im Kanal FL-4- die DNA-haltigen Messereignisse. Aus

RN1 und RN2 wurde ein logisches Gate G1 (RN1 and RN2 = G1) gebildet. Dieses

wurde auf alle Histogramme gelegt, so dass nur noch Messereignisse angezeigt

wurden, die der Größe von Spermien entsprachen und DNA enthielten.

Für die Auswertung wurden Messergebnisse aus den Kanälen FL-1 (PNA-FITC) und

FL-3 (PI) in einem Histogramm als Dotplot gegenübergestellt. Um eine Überlagerung

der Emmissionsspektren der Farbstoffe zu korrigieren, wurde eine nachträgliche

mathematische Kompensation durchgeführt.

Durch eine vertikale und horizontale Grenzlinie (Gate) wurde das Dotplot in vier

Quadranten (Q1 – Q4) aufgeteilt. Q1 entsprach dem prozentualen Anteil PI-positiver


44

und FITC-PNA-negativer, Q2 definierte PI- und FITC-PNA positive Ereignisse. In Q3

wurden Zellen mit intakter Plasma- und Akrosomenmembran (PI- und FITC-PNA

negative Zellen) bestimmt und im vierten Quadranten (Q4) PI-negative und FITC-

PNA-positive Zellen. Soweit möglich, wurden für den gesamten Versuchszeitraum

ein einheitliches „Gate“ und identische Einstellungen für die Kompensation

beibehalten.

3.11 Mitochondrienmembranpotential in der Durchflusszytometrie

3.11.1 Testprinzip

Das Prinzip dieser Messung beruht auf den Eigenschaften des Farbstoffes 5,5',6,6'-

Tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbo-cyanine iodide (JC-1, Fa. Enzo

Lifescience, Lörrach; Stammlösung 1,53 mM), der sich, abhängig vom

elektrochemischen Gradient der Mitochondrienmembran, reversibel vom Monomer

zu einer aggregierten Form transformiert und dabei seine Fluoreszenzeigenschaften

verändert. Als grün fluoreszierendes Monomer färbt er das Zellplasma grün, bei

steigendem Mitochondrienmembranpotential lagert der Farbstoff sich dort an und

bildet orange fluoreszierende Aggregate. Eine zusätzliche Färbung mit dem Farbstoff

Propidiumiodid (PI, Kapitel 3.8.2) ermöglicht die zusätzliche Differenzierung von

lebenden und toten Spermien.


Für die Analyse wurde das unter 3.10.2 beschriebene Gerät verwendet.

Die Abgrenzung von Zellen zu anderen Partikeln erfolgte mit Hoechst 33342

(Stammlösung 150 µl/ ml), die Differenzierung in plasmamembranintakte

und -defekte Samenzellen erfolgte mit Propidiumiodid (PI, Stammlösung 1 mg/ ml).

Die detaillierten Eigenschaften dieser Farbstoffe wurden bereits in Kapitel 3.10.2

beschrieben. Der lipophile, kationische Farbstoff 5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'-

tetraethylbenzimidazolylcarbo-cyanine iodide (JC-1, Fa. Enzo Lifescience, Lörrach;

Stammlösung in DMSO: 1,53 mM/ l) passiert sowohl die Plasma- als auch


45

Mitochondrienmembran. Je nach dem vorliegenden Gradienten der

Mitochondrienmembran liegt JC-1 als Monomer (bei niedrigem Gradienten) oder in

aggregierter Form (bei hohem Mitochondrienmembranpotential) vor. Die beiden

Formen haben unterschiedliche Emmisionsspektra: das Monomer fluoresziert grün

(Emissionsmaximum: 527 nm), während die aggregierte Form eine

Orangefluoreszenz (590 nm) aufweist.

3.11.3 Grundeinstellungen

Am ersten Versuchstag wurden die Grundeinstellungen für die Verstärkung von FSC

und SSC sowie der Fluoreszenzsignale von PI (Rotfluoreszenz, Kanal FL-3) und

Hoechst 33342 (Blaufluoreszenz, Kanal FL-4) wie in Kapitel 3.10.3 beschrieben

vorgenommen. Für das Einstellen der Verstärkung von JC-1, wurde zunächst 1 ml

einer Spermaprobe bei -20 °C eingefroren und wieder aufgetaut, um Spermien mit

einen niedrigen Mitochondrienmembranpotential zu erhalten. Diese Probe wurde mit

1 µl JC-1 vermischt und 15 Min. bei 38 °C im Wasserbad inkubiert. Nach erneutem

Mischen wurden 5 µl der Probe in 995 µl auf 38 °C angewärmtes HBS pipettiert,

vermischt und die Messung gestartet. Die Verstärkung für das FL-2-Signal wurde so

reguliert, dass es in der ersten Dekade einer logarithmischen Skala abgebildet

wurde, das Signal von FL-1 in der zweiten Dekade. Danach wurde 1 ml einer frischen

Samenprobe mit 1 µl JC-1 vermischt und nach der Inkubationszeit wieder 5 µl in HBS

überführt und gemessen. Die Fluoreszenzsignale sollten hier weiterhin deutlich

innerhalb der Grenzen der Histogramme liegen. Für die Feinjustierung der

Signalverstärkungen wurde eine Färbung mit allen drei Farbstoffen verwendet.

Neben den Histogrammen für die einzelnen Fluoreszenzkanäle wurde zusätzlich ein

Dotplot verwendet, in dem FL-1 gegen FL-2 (Grün- gegen Orangefluoreszenz)

aufgetragen wurden. Die mathematische Kompensation für die Überlagerung der

Farbspektren wurde vor Beginn des Versuchs festgelegt. Diese Grundeinstellungen

wurden gespeichert und für die gesamte Versuchsdauer verwendet.


46


Alle Arbeitsschritte wurden in einem abgedunkelten Raum durchgeführt. Im Vorfeld

der Messungen wurden entsprechend der Anzahl Proben je ein 3,5 ml

Reagenzröhrchen mit 995 µl HBS vorbereitet. Diese wurden verschlossen in einem

Metallblock im Wärmeschrank auf 38 °C erwärmt. Zu Beginn der Untersuchung

wurde 1 ml der Samenprobe mit 1 µl JC-1, 10 µl Hoechst 33342 und 20 µl PI

vermischt und offen für 15 min bei 38 °C inkubiert. Anschließend, nach erneutem

Mischen mit dem Vortex, wurden 5 µl des gefärbten Spermas in die vorgewärmte

HBS Lösung pipettiert, gemischt und die Messung gestartet. Pro Messung wurden

10.000 Ereignisse erfasst.

Für die Auswertung wurden wie in Kapitel 3.8.4 Ranges gebildet, um die

auszuwertenden Messereignisse zu definieren. Im Histogramm des FL-4 Kanals

wurde die erste Range (RN1) gebildet, um die DNA-haltigen Ereignisse darzustellen.

Die zweite Range (RN1) im FSC-Kanal grenzte die Ereignisse ein, die der Größe von

Eberspermien entspricht (Abszisse, lineare Skala, Bereich von 0 – 150). Aus RN1

und RN2 wurde ein logisches Gate G1 (RN1 AND RN2 = G1) gebildet, und auf das

Histogramm des FL-3 Kanal gelegt. So wurden dort nur noch Messereignisse

gezeigt, die der Größe von Spermien entsprachen und DNA enthielten. PI – positive

Messereignisse wurden mit der dritten Range definiert (RN3).

Der prozentuale Anteil der Samenzellen mit hohem Mitochondrienmembranpotential

konnte im Dotplot FL-1/ FL-2 abgelesen werden. Für die Auswertung wurde mittels

einer horizontalen Linie in diesem Histogramm eine Trennung der Samenzellen mit

mehrheitlich hohem Mitochondrienmembranpotential (Q2), diese lagen über der

Linie, von denen mit niedrigem Potential ermöglicht (Q4). Durch ein zweites

logisches Gate G2 (RN1 AND RN2 AND RN3 = G2) wurden hier nur Ereignisse

berücksichtigt, die der Größe von Spermien entsprachen, DNA enthielten und eine

intakte Plasmamembran aufwiesen.

Außerdem konnte die mittlere Fluoreszenzintensität aller Spermien ermittelt werden.

Dafür wurden im Histogramm des Kanals FL-2 die Messwerte für DNA-haltige

Partikel mit der Größe von Spermien (G1) dargestellt. Eine weitere Range (RN4)


47

wurde über die gesamte Breite der Abszisse des FL-2 Histogramm gesetzt und das

arithmetische Mittel der Fluoreszenzintensität abgelesen.

Das beschriebene Gating wurde für alle Proben verwendet.

3.12 Kinetik des Calcium-Influx

3.12.1 Testprinzip

Der Assay beruht auf der durchflusszytometrischen Erfassung der Veränderungen

des intrazellulären Calciumgehaltes von Spermien unter in vitro-

Kapazitationsbedingungen. Der Anstieg der intrazellulären Calciumionen-

konzentration dient hier als Indikator für die Reaktion auf kapazitationsinduzierende

Stimuli. Die Veränderung der intrazellulären Calciumionenkonzentration wird mit Hilfe

eines Farbstoffs ermittelt, der an Calciumionen bindet. Die Fluoreszenzintensität der

Zellen ist dabei direkt mit dem freien Calciumgehalt der Zellen korreliert (HENNING

et al., submitted).


Für die Analyse wurde das in 3.10.2 beschriebene Gerät verwendet.

Der intrazelluläre Calciumgehalt wurde mit Hilfe des Farbstoffs Fluo-3/ AM (Fa.

Biomol, Hamburg) ermittelt. Dieser Farbstoff bindet selektiv an Calciumionen. Durch

den Acetoxymethylester (AM) ist er auch bei Zellen mit intakter Plasmamembran

membrangängig. Intrazelluläre Esterasen spalten den Ester ab, so dass das

verbleibende Fluo-3 nicht mehr membrangängig ist und in der Zelle verbleibt. Fluo-3

bildet mit Calcium einen Komplex, der durch den Laser des Durchflusszytometers

angeregt grünes Fluoreszenzlicht emittiert (Emissionsmaximum bei 526 nm). Im

Kanal FL-1 wurde das Signal detektiert und auf einer logarithmischen Skala

dargestellt. Dabei wird die Fluoreszenzintensität von der Menge des

aufgenommenen Calciums bestimmt.


48

Die Abgrenzung von Zellen zu anderen Partikeln erfolgte mit Hoechst 33342

(Stammlösung 300 µl/ ml), die Differenzierung in plasmamembranintakte

und -defekte Samenzellen erfolgte mit Propidiumiodid (PI, Stammlösung 1 mg/ ml).

Die Eigenschaften dieser Farbstoffe wurden bereits detailliert in Kapitel 3.10.2

beschrieben.

3.12.3 Vorbereitung der Medien und Spermien

Am Versuchstag wurden von den unter Kapitel 9.3 beschriebenen Tyrodemedien

jeweils 100 ml hergestellt. Dafür wurden den eingefrorenen Tyrode-Stammlösungen

Na-Laktat, Na-Pyruvat, Gentamycinsulfat und Phenolrot frisch hinzugefügt und das

Volumen auf 100 ml mit destilliertem Wasser ergänzt. Der pH-Wert wurde auf 7,6 bei

Raumtemperatur für das Kapazitationsmedium (TyrBikCa) und auf 7,55 für das nicht

kapazitierende Medium (TyrCa) eingestellt und die Osmolarität überprüft

(300 ± 5 mOsmol/ kg). Schließlich wurden die Lösungen über Spritzenfilter (PES

Membran, Porendurchmesser 0,22 µm, Fa. Roth, Karlsruhe) filtriert. In beiden

Medien wurde nun 3 mg/ ml BSA (Albumin bovine Fraction V, Serva, Heidelberg)

gelöst.

In je 20 ml der beiden Medien wurde 5 µl/ ml der PI-Stammlösung zugesetzt,

vermischt und jeweils 995 µl in 3,5 ml Reagenzröhrchen aliquotiert. Anschließend

wurde die bikarbonathaltige Lösung (TyrBikCa) in einem CO2-Inkubator (100 %

Luftfeuchtigkeit, 5 % CO2, 38 °C) auf 38 °C erwärmt. Das nicht kapazitierende

Medium (TyrCa) wurde mit Parafilm luftdicht verschlossen und im Wärmeschrank auf

dieselbe Temperatur erhitzt. Als Sheath-Lösung wurden zwei Liter HBS-Lösung

vorbereitet (300 ± 5 mOsmol, pH 7,55, Raumtemperatur) und im Sheath-Kanister auf

einer Heizplatte auf 38 °C vorgeheizt.

Um die Spermien mit Fluo-3/AM zu beladen, wurden jeweils 2 ml der verdünnten

Samenprobe mit 2 µl der Fluo-3/AM-Stammlösung (1 mM in DMSO) und

5 µl Hoechst 33342 vermischt und 15 min unter Lichtauschluss inkubiert. Erneutes

Mischen und weitere 15 min Inkubation folgten.


49

3.12.3.1 Messung und Auswertung

Die Grundeinstellungen für die Verstärkungen wurden am ersten Versuchstag

festgelegt. An jedem Untersuchungstag wurden diese überprüft und falls notwendig

angepasst. Für die Einstellungen wurden die mit Farbstoff beladenen Spermien

verwendet und dabei auch die erfolgreiche Beladung mit Fluo-3/ AM überprüft.

Vorbereitet wurden folgende Ansätze:

995 µl TyrCa (mit PI) + 5 µl verdünntes Sperma

993,5 µl TyrCa (ohne PI) + 5 µl verdünntes Sperma

993,5 µl TyrCa (ohne PI) + 5 µl verdünntes Sperma + 1,5 µl A23187-Stammlösung

993,5 µl TyrCa (mit PI) + 5 µl verdünntes Sperma + 1,5 µl A23187-Stammlösung

Die Konzentration der Stammlösung des Calciumionophors A23187 (Fa. Alexis,

Lausen, Schweiz) betrug 500 mM/ ml, die Endkonzentration in den Ansätzen lag

damit bei 2 µM/ ml. Für den zweiten Ansatz wurde TyrCa verwendet, die kein

Propidiumiodid enthielt. Ein Aliquot für die Grundeinstellungen wurde vor der oben

genannten Färbung separiert und bei 38 °C erwärmt.

Die Verstärkungen für FSC, SSC, FL-3 und FL-4 wurden mit dem ersten Ansatz

festgelegt. Mit dem zweiten Ansatz wurde die Verstärkung für FL-1 ermittelt. Die

Festlegung der Verstärkung erfolgte wie im Kapitel 3.10.3 angegeben. Der dritte

Ansatz diente der Prüfung, ob die Beladung mit Fluo-3/ AM erfolgreich war. Das

Calciumionophor im Ansatz Nummer drei bewirkte einen Permeabilitätsanstieg der

Plasmamembran. Das Calcium aus dem Medium kann so ins Zytosol einströmen und

verursacht bei erfolgreicher Beladung mit Fluo-3/ AM eine deutliche Verschiebung

der Fluoreszenzintensität nach rechts. Der vierte Ansatz diente zur Feinjustierung der

Einstellungen.

5 µl der vorbehandelten Spermiensuspension wurden pro Ejakulat, Medium und

Inkubationszeitpunkt in die vorbereiten Reagenzröhrchen pipettiert. Die Messungen

erfolgten bei beiden Medien (TyrBikCa und TyrCa) nach 3 und nach 60 min. Von jeder

Probe wurden 10.000 Ereignisse mit einer Flussrate von 400 – 600 Ereignissen/ s


50

gemessen. Als Sheath-Lösung und Spüllösung zwischen den Messungen diente das

auf 38 °C erwärmte HBS.

Im FSC-Histogramm wurde mit Grenzlinien („range“) Agglutinationen und Debris

abgetrennt, die in den Histogrammen nach drei Minuten Inkubationsdauer festgelegt

wurden. Eine zweite Range definierte im Kanal FL-4 die DNA-haltigen Ereignisse. In

die Berechnungen wurden damit nur die Ereignisse der Spermienpopulation

miteinbezogen. Anhand der Diagramme nach 3 min Inkubation wurden die Grenzen

zwischen PI-negativen und –positiven sowie Spermien mit geringem intrazellulären

Calciumgehalt (Fluo-3-negativ) und hohem intrazellulärem Calciumgehalt (Fluo-3–

positiv) festgelegt. Die Grenzen wurden mit vertikalen und horizontalen Linien in den

FL-3/ FL-1 Dotplot eingezogen und so die prozentuale Verteilung auf die einzelnen

Quadranten ermöglicht. Q1 entsprach dem prozentualen Anteil PI-positiver und Fluo-

3-negativer, Q2 definierte PI- und Fluo3-positive Ereignisse. In Q3 wurden PI- und

Fluo-3-negative Zellen bestimmt und im vierten Quadranten (Q4) PI-negative und

Fluo3-positive Zellen.

Die Kompensation wurde anhand der Proben für die Grundeinstellung und

Überprüfung der Indikator-Beladung vorgenommen.

Die Reaktivität auf die Inkubationsbedingungen wurde nach der Methode von

HENNING et al. (2012) bestimmt. Es wurde in der Population der lebenden Zellen mit

basalem intrazellulären Calciumgehalt (PI-neg./ Fluo-3 neg.) die Differenz

zwischen 60 min und dem Anfangszeitpunkt der Inkubation (3 min) bestimmt. Die

Reaktivität im nicht kapazitierenden Medium wurde ebenso berechnet. Um die

spezifische Reakivität zu ermitteln, wurde die Differenz aus der Reaktivität im

Tyrode- und im Kontrollmedium in der Population der lebenden Spermien mit

niedrigem intrazellulären Calciumgehalt (PI-neg./ Fluo-3 neg.) gebildet.


51

3.13 Bestimmung des ATP-Gehalts und der Energieladung

3.13.1 Testprinzip

Die chemische Energie, die für die Motilität der Spermien erforderlich ist, wird in

Form von Adenosintriphosphat (ATP) bereitgestellt.

Der Test ermöglicht mittels der Firefly-Luciferin-Luciferase-Reaktion die qualitative

Bestimmung von ATP. Die Analyse beruht auf der Eigenschaft des Enzyms

Luciferase bei der Reaktion mit ATP, Luciferin und Sauerstoff, Licht zu emittieren,

welches photometrisch detektiert werden kann.

Luciferin + ATP + O2 Luciferase→ Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Licht

Unter definierten Bedingungen ist die Lichtintensität proportional zur ATP

Konzentration.

Nach der Asservierung der Proben (Kapitel 3.13.3.1) wurde deren ATP-Gehalt

gemessen, dann wurden mit Hilfe von Enzymen ADP und AMP in mehreren Schritten

in ATP umgewandelt, um sie dann mit dem oben genannten ATP-Assay analysieren

zu können. Durch Subtraktion des zuerst gemessenen ATP-Gehalts von diesen

Ergebnissen war es möglich die Menge jedes Nukleotids in der Probe zu bestimmen.

Die einzelnen Schritte der Umwandlung sind in den folgenden Gleichungen

dargestellt:

ADP + Phosphoenolpyruvat Pyruvatkinase→ ATP + Pyruvat

AMP + ATP Adenylatkinase→ 2 ADP

Das Konzept für die Ermittlung der Energieladung („Energy Charge“, EC) der

Samenzelle beruht auf dem Vergleich des Nukleotidgehalts (ATP, ADP, AMP) einer

Zelle, mit einem Akku bzw. einer Batterie. Die gemeinsamen Elemente umfassen: (1)

Die Gesamtmenge an Material bleibt in der Regel konstant, und (2) chemische

Energie kann durch Veränderung der Verhältnisse der Komponenten gespeichert

und wiedergewonnen werden (FORD u. LEACH, 1998).


52

Die Energieladung errechnet sich durch die Summe von ATP (mol) plus die Hälfte

der ADP-Fraktion. Dies wird dividiert durch die Gesamtsumme aller Nukleotide. Die

Formel wurde in Kapitel 2.3.1 beschrieben.

Es handelt sich hier um ein lineares Maß der Stoffwechselenergie, die im Adenin-

Nukleotidsystem gespeichert ist. Wenn nur AMP vorhanden ist, ist die Energieladung

Null. Ist ATP als einziges Nukleotid verfügbar, entspricht das der Energieladung 1.

Bei Werten > 0,6 wird von vitalen Zellen gesprochen. Während des Zellwachstums

und der Zellteilung beträgt die Energieladung 0,8 – 0,95, in einer stationären

Wachstumsphase ist die Ladung 0,6. Ruhende bzw. alternde Zellen zeigen eine

Energieladung von < 0,5 (WIEBE u. BANCROFT, 1975).

3.13.2 Geräte und Vorbereitung

Die Bestimmung des ATP-Gehalts der Probe wurde modifiziert nach LONG und

GUTHRIE (2006) mittels ATP-Bioluminescent- Assay-Kit (FLAA, Fa. Sigma Aldrich,

Steinheim) durchgeführt. Dieser beinhaltete den „Dilution buffer“, „Assay-Mix“ sowie

den „ATP-Standard“. Die Lösungen wurden nach Herstellerangaben aufbereitet. Der

„Dilution buffer“ ist ein portioniertes Lyophilisat aus MgSO4, DTT, EDTA, bovinem

Serumalbumin (BSA) und Tricin, das mit 50 ml sterilem Wasser (Ampuwa®, Fa.

Fresenius, Bad Homburg) in Lösung gebracht wird. Diese war bis zu zwei Wochen

bei 0 - 5 °C stabil. Beim „Assay-Mix“ handelt es sich ebenfalls um ein portioniertes

gefriergetrocknetes Pulver; es enthält Luciferase, Luciferin, MgSO4, DTT, EDTA,

BSA und Tricin und wurde mit 5 ml sterilem Wasser gelöst. Die Wasserqualität ist

hier von hoher Bedeutung, da schon eine minimale Kontamination eine hohe

Hintergrundlumineszenz verursachen kann. Diese Lösung ist unter Lichtauschluss

ebenfalls mindestens zwei Wochen bei 0 - 5 °C stabil. Da eine lagerungsbedingte

Abnahme der Lumineszenz nicht auszuschließen ist, wurde an jedem Versuchstag

eine neue Standardkurve erstellt. Der „Assay-Mix“ wurde 1:25 (v:v) mit dem „Dilution

buffer“ verdünnt und dunkel bei 4 °C gelagert.

Für die Konvertierung der Nukleotide wurden Adenylatkinase (AK; M 3003, Sigma-

Aldrich, Steinheim) und Pyruvat-Kinase (PK; P1506, Sigma-Aldrich, Steinheim)

verwendet. Beide lagen als Suspension in (NH4)2SO4 vor. Um das Ammoniumsulfat


53

zu eliminieren, wurden die Suspensionen für 5 min bei 1000 g zentrifugiert. Das

dabei entstehende Pellet wurde in 20 mM Tricin, pH 7,5, incl. 0,1% BSA (Albumin

bovine Fraction V, Serva, Heidelberg) gelöst. Es wurde jeweils nur die für den

Versuchstag benötigte Menge Enzym vorbereitet.

Für den Reaktionspuffer A wurde zunächst ein zehnfach konzentrierter Puffer

hergestellt (750 mM Tricin, 50 mM MgCl2 und 0,125 mM KCl, pH 7,5). Eine 1:10

Verdünnung mit sterilem Wasser ergab den Puffer A (75 mM Tricin, 5 mM MgCl2

und 0,0125 mM KCl, pH 7.5). Puffer B enthielt neben dem Inhalt von Puffer A 0,5 mM

Phosphoenolpyruvat (PEP) (P7022, Sigma- Aldrich, Steinheim) und 0,4 µg/ µl

Pyruvatkinase. Schließlich wurde aus dem Puffer B durch Zugabe von 0,5 µg/ µl

Adenylatkinase der Reaktionspuffer C hergestellt. Wie oben beschrieben, konvertiert

Adenylatkinase AMP um zu ADP; Phosphoenolpyruvat sowie Pyruvatkinase sind für

die Umwandlung von ADP zu ATP zuständig.

Für die Detektion der Lumineszenz stand ein Tecan GENios Pro plate reader (Tecan

Group Ltd, Männedorf, Schweiz) in der Abteilung Endokrinologie der Klinik für Rinder

zur Verfügung. Die Verarbeitung der Daten fand mit der Software MagellanTM

(Version V5.03, Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) statt.


Die Analyse der Nukleotide erfolgte in sechs Schritten:

Präparation der Spermien für die Lagerung bei -20°C

Erstellen der Standardkurve für die ATP - Messung

Extraktion von ATP aus der gefrorenen Probe

Messung der Lumineszenz und Berechnung der ATP - Konzentrationen

Konvertieren der Nukleotide und deren Bestimmung

- ATP - Bestimmung

- Konvertierung von ADP in ATP und Messung des ATP - Gehaltes

- Konvertierung von AMP in ATP und Messung des ATP - Gehaltes

Berechnung der Energieladung


54

3.13.3.1 Präparation der Spermien für die Lagerung bei -20 °C

Um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse des ATP-Assays zu gewährleisten, wurde

angestrebt alle Proben eines Versuchdurchgangs an einem Tag zu messen. Um dies

zu gewährleisten, wurden die Proben bis zur ATP-Analyse bei -20 °C gelagert. Um

den Abbau von ATP während der Lagerung zu verhindern, wurden 100 µl jeder zu

untersuchenden Probe (entspricht 2 x 106 Spermien) mit 1 µl Phosphatase Inhibitor

Cocktail 2 (P5725, Fa. Sigma Aldrich, Steinheim) versetzt, gemischt und 30 min auf

Eis inkubiert. Anschließend wurden die Proben bei -20 °C eingefroren und gelagert.

Erstellung und Verifizierung des Protokolls erfolgte in einem parallel laufenden

Projekt (NGUYEN et al., unveröffentlicht).

3.13.3.2 Erstellen der Standardkurve für die ATP-Messung

Zunächst wurde eine Serienverdünnung des ATP-Standards mit sterilem Wasser

hergestellt, um folgende Konzentrationen zu erhalten: 62,5, 125, 250, 500, 1000 und

2000 pmol ATP/ ml. Für die Ermittlung der Standardkurve wurden je 25 µl der

Standardkonzentrationen sowie eine Kontrolle (steriles Wasser) in die Wells einer 96

Well Mikrotiter Platte (white wall, clear bottom, Fa. Greiner Bio-One, Frickenhausen)

pipettiert. Alle Proben wurden im Doppelansatz gemessen. Um die Reaktion zu

starten, wurde mit Hilfe einer elektronischen Pipette (Biohit eLine E 1000, Biohit,

Rosbach, Germany) in jedes Well 100 µl des verdünnten „Assay-Mix“ pipettiert. Die

Detektion der Lumineszenz im Plattenphotometer (100 ms/ well) schloss sich

unmittelbar an. Die Ergebnisse der Doppelansätze wurden jeweils gemittelt und die

relativen Lichteinheiten (relative light units, RLU) der Kontrolle wurden von den

Ergebnissen der Standards subtrahiert. Die so ermittelten Ergebnisse entsprachen

dem ATP-Gehalt der Standards. Es wurde eine lineare Regressionslinie erstellt und

die dazugehörige Gleichung zur Berechnung der Menge an ATP in den Proben

verwendet (Abb. 10).


55

Abb. 10: Beispiel einer Standardkurve des ATP-Assays

3.13.3.3 Extraktion von ATP aus der gefrorenen Probe

Um die Nukleotide aus den Proben zu extrahieren, wurden diese, ohne vorher

aufzutauen, mit 900 µl eines auf 95 °C erhitzten „boiling buffer“ (50 mM Tricin, 10 mM

MgSO4 und 2 mM EDTA, pH 7,80) versetzt und für 10 min bei 95°C in einem

Thermomixer 5436 (Eppendorf, Hamburg) inkubiert. Danach kühlten die Proben

10 min auf Eis ab und wurden anschließend für 30 min bei 4 °C und 5000 g

zentrifugiert. Der Überstand wurde für die weitere Bestimmung des Nukleotidgehalts

verwendet.

3.13.3.4 Messung der Lumineszenz und Berechnung der ATP-Konzentrationen

Die ATP-Messung wurde, als Doppelansatz durchgeführt. Als Null-Kontrolle diente

steriles Wasser, um die Hintergrundluminiszenz zu bestimmen und später korrigieren

zu können. Es wurden jeweils 25 µl des Überstandes einer Probe in zwei Wells

pipettiert. Zusätzlich wurde als Positivkontrolle in jedem Messdurchgang die

Lichtintensität eines ATP-Standards gemessen. Um eine zu lange Verzögerung der

photometrischen Messung zu vermeiden, die zu einer reduzierten Lichtintensität

y = 213,22x - 8890,3 R² = 0,9995

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

0 500 1000 1500 2000 2500

rela

tive lig

ht

units

Standardprobe

RLU results

Linear (RLU results)


56

führen kann, wurde der verdünnte „Assay-Mix“ mit Hilfe einer elektronischen Pipette

hinzugefügt. Unmittelbar danach wurde die bei der Reaktion entstehende

Lichtintensität photometrisch detektiert. Die Ergebnisse der doppelt gemessenen

Proben wurden gemittelt und anschließend die Hintergrundlumineszenz durch

Subtraktion des Wertes der Nullkontrolle vom Probenwert korrigiert. Mit dem

Ergebnis der Standardprobe wurde ein Korrekturfaktor berechnet. Dieser ergab sich

aus der Division der RLUs der Standardprobe eines Messdurchgangs durch den

entsprechenden Messwert der Standardprobe, der der Standardkurve des

Messtages zugrunde lag. Die RLUs der Samenproben wurden dann mit dem

Korrekturfaktor multipliziert. Die ATP-Konzentrationen errechneten sich aus den

korrigierten RLUs der Proben mit Hilfe der Gleichung der linearen

Regressionsgeraden (y = ax + b) aus der Standardkurve, wobei „y“ den relative light

units und „x“ der ATP-Konzentration entsprach.

3.13.3.5 Konvertieren der Nukleotide und deren Bestimmung

Für die Ermittlung der Konzentration der einzelnen Nukleotide muss zunächst erneut

ATP in den Proben bestimmt werden (Messung 1). Zu diesem Zweck wurden je 25 µl

des Puffer A mit je 100 µl des Überstandes der ATP-Extraktion (Kapitel 3.13.3.3) in

einem Eppendorfgefäß vermischt und für 30 min bei 30°C inkubiert. Um die Reaktion

zu stoppen, wurden danach die Proben für 3 min bei 95°C erhitzt und anschließend

auf Eis abgekühlt.

Um ADP zu ATP umzuwandeln (Messung 2) wurden 25 µl Puffer B mit 100 µl des

Überstands vermischt. Das in dem Puffer enthaltene Phosphoenolpyruvat und die

Pyruvatkinase konvertierten das vorhandene ADP zu ATP. Die so vorbereitete Probe

wurde 30 Minuten bei 30 °C inkubiert, darauf ebenfalls drei Minuten bei 95 °C erhitzt

und anschließend auf Eis gekühlt, um die Reaktion zu stoppen.

25 µl Puffer C wurde mit 100 µl Probe vermischt, dieser enthielt zusätzlich zu

Phosphoenolpyruvat und Pyruvatkinase das Enzym Adenylatkinase, welches AMP

zu ADP wandelt (Messung 3). Die Inkubationszeit betrug hier 90 Minuten bei 30 °C.


57

Die Reaktion wurde ebenso durch Erhitzen der Probe für drei Minuten bei 95 °C

induziert und nachfolgendes Abkühlen gestoppt.

Nach der jeweiligen Abkühlzeit wurde die ATP-Konzentration aller Proben nach der

unter 3.13.3.4 beschriebenen Methode analysiert.

3.13.3.6 Berechnung der Energieladung

Die AMP-Konzentration wird durch Subtraktion des Ergebnisses der Messung 2 von

den Werten der Messung 3 errechnet. ADP kann analog durch Subtraktion des

Ergebnisses der Messung 1 mit dem Ergebnis von Messung 2 (ATP-Konzentration)

ermittelt werden. Die Ergebnisse wurden zur Berechnung der Energieladung

herangezogen, die mittels der unter Kapitel 2.3.1 genannten Formel durchgeführt

wurde.

3.14 Bestimmung der Gesamtkeimzahl

Die Gesamtkeimzahlen wurden kulturell, nach einer Verdünnungsreihe im

anschließenden Spatelverfahren und Bebrütung auf Blutagar im Institut für

Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover bestimmt.

3.15 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung fand mit SAS (Version 9.2; SAS Inst. Inc., Cary, NC,

USA) und IBM SPSS Statistics 2.0 statt. Grafisch wurden, wenn nicht anders

angegeben, die Mittelwerte und Standardabweichungen dargestellt.

Nach der Prüfung der Merkmale auf Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilk-Test

(PROC UNIVARIATE) war trotz Logarithmierung oder Quadrierung der Originalwerte

die große Mehrzahl der Daten nicht normalverteilt. Um den Einfluss der Haltezeiten,

Verdünnungsart und Lagerungsdauer überprüfen zu können, wurde der Friedman-

Test verwendet. Paarvergleiche zwischen Haltezeiten, Verdünnungsarten und


58

Lagerungszeiten wurden mittels des Wilcoxon signed rank Test für nicht

normalverteilte Daten durchgeführt. Bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von

p < 0,05 wurden die Unterschiede zwischen den verglichenen Haltetemperaturen und

–zeiten bzw. Lagerungszeitpunkten als signifikant erachtet. Korrelationskoeffizienten

nach Spearman wurden zwischen Parametern mit der Prozedur CORR ermittelt.

Um Spermiensubpopulationen darstellen zu können, wurden die Motilitätsparameter

mit SPSS klassiert. Hierfür wurden die Ergebnisse jedes Parameters in Klassen

eingeteilt und der prozentuale Anteil jeder Klasse ermittelt.

Ergebnisse

59

4 Ergebnisse

4.1 Experiment 1: Vergleich von zweistufig isothermer und

zweistufig hypothermer Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden

4.1.1 Temperaturverlauf während der Samenverarbeitung

Nach der Vorverdünnung des Samens im Verhältnis 1:1 (v:v) wurde eine Hälfte

(200 ml) für die isotherme Verarbeitung im Glaszylinder für 15 min bei 32 °C

gehalten. Während der Ausverdünnung in 100 ml Ebersamenflaschen mit isothermen

Verdünner (32 °C) fiel die Temperatur von 31,6 °C auf 31,3 °C ab.

Bei der hypothermen Verarbeitung wurden die andere Hälfte der vorverdünnten

Proben (200 ml) zunächst 20 min bei 21 °C gehalten. Währenddessen sank die

Temperatur von 31,3 °C auf 29,0 °C. Bei der Ausverdünnung mit dem hypothermen

Verdünner (21 °C) sank die Temperatur der Proben um 5,6 °C von 29 °C auf 23,4 °C.

Während der folgenden 90 min wurden die Samenproben bei 21 °C

Umgebungstemperatur gehalten. Beide Kurven zeigen eine asymptotische

Annäherung an die Umgebungstemperatur. Während der ersten 30 min nach der

Verdünnung zeigten die isotherm verdünnten Proben eine durchschnittliche

Abkühlrate von 0,13 ± 0,05 °C/ min, dann 0,08 ± 0,04 °C/ min (31 - 60 min) und

schließlich 0,05 ± 0,04 °C/ min (61 - 90 min). Die Abkühlrate der hypotherm

verdünnten Proben bei 21 °C betrug 0,03 ± 0,04 °C/ min (0 – 30 min nach der

Verdünnung), 0,01 ± 0,04 °C/ min (31 – 60 min), und 0,01 ± 0,04 °C/ min (61 –

90 min). Nach 90 Minuten bei 21 °C erreichten die isotherm verdünnten Proben

23,3 °C während die hypotherm verarbeiteten Proben 21,9 °C aufwies. Nach 150 min

hatten beide Varianten die gleiche Temperatur erreicht (20,3 °C). Zwischen dem

Zeitpunkt des Umlagerns bis zur 150. Minute betrug die Abkühlrate der isotherm

verdünnten Proben 0,08 ± 0,05 °C/ min, die der hypothermen dagegen

0,05 ± 0,04 °C/ min. Nach 262 Minuten (isotherm) bzw. 292 Minuten (hypotherm)

nach der ersten Verdünnung erreichten die Proben die Lagerungstemperatur von

17,0 ± 0,5 °C.

Der Temperaturverlauf ist in Abb. 11 dargestellt

Ergebnisse

60

Abb. 11: Temperaturverlauf während der zweistufig hypothermen (blaue Linie) und

isothermen (rote Linie) Samenverarbeitung bei Experiment 1. Mittelwerte von je 3

Samenproben. Die Samenproben wurden im Verhältnis 1:1 (200 ml: 200 ml) mit Beltsville

Thawing Solution (BTS, 32 °C) verdünnt. Für die zweistufig isotherme Verdünnung wurde

eine Hälfte des vorverdünnten Samen für ca. 15 min bei 32 °C (Wasserbad) gehalten um

dann mit BTS (32 °C) auf die Endkonzentration in Ebersamenflaschen verdünnt zu werden.

Abkühlung der Proben 90 min bei 21 °C anschließend weitere Abkühlung und Lagerung in

einen auf 17 °C temperierten Klimaschrank verbracht. Für zweistufig hypotherme

Verarbeitung wurde nach der Vorverdünnung die andere Hälfte der Probe für 20 min bei

21 °C gehalten. Die weitere Verdünnung erfolgte mit auf 21 °C temperierter BTS, wodurch

der schnelle Abfall der Probentemperatur zu erklären ist. Die weitere Verarbeitung entsprach

den zweistufig isotherm verarbeiteten Proben.

*: Wechsel der Messsonde zwischen zwei Gefäßen

10

15

20

25

30

35

0 30 60 90 120 150 180 210 240

Tem

per

atu

r °C

Minuten

zweistufig hypotherm zweistufig isotherm

verdünnt, gehalten bei 17°C verdünnt, gehalten bei 21°C 1:1 bei 32 °C

verdünnt, gehalten bei 21°C verdünnt, gehalten bei 17°C 1:1 bei 21 °C

*

9

Ergebnisse

61

4.1.2 CASA-Motilitätsparameter

Abb. 12: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Art der zweistufigen Verdünnung (isotherm vs. hypotherm), Verdünnungsgrad (20 x 10

6 und 10 x 10

6 Spermien/ ml) und

Lagerungsdauer (d 1, d 3, d 6) bei 17 °C; n = 6 Ejakulate. #: Unterschiede zw. Verdünnungsarten bei gleicher Lagerungsdauer und Verdünnungsgrad (p < 0,05) *: Unterschiede zw. Verdünnungsgraden bei gleicher Lagerungsdauer und Verdünnungsart (p < 0,05) a, b: Unterschiede zw. Lagerungstagen (d1 – d6) für eine Verarbeitungsvariante (p < 0,05)

Von der Verdünnungsart beeinflusst wurden die Gesamtmotilität, progressive

Motilität, Linearität (LIN) und Wobble (WOB). Signifikante Unterschiede konnten aber

nur bei der Gesamtmotilität ermittelt werden. Innerhalb der Samenproben mit

10 x 106 Spermien/ ml zeigte sich an d 1 ein signifikanter höherer Wert von 4,4 % bei

der Gruppe, die isotherm verdünnt wurde, im Vergleich zur hypothermen Gruppe.

Der Verdünnungsgrad hatte Einfluss auf die Gesamtmotilität, progressive Motilität,

Velocity average path (VAP), Velocity straight line (VSL), Wobble (WOB) und

Amplitude of lateral head displacement (ALH). Allerdings gab es bei VAP, VSL und

WOB keine signifikanten Unterschiede zwischen den analysierten Proben (Tabelle 1).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

isotherm hypotherm isotherm hypotherm

motile

Sperm

ien in %

Verdünnungsart/ -stufe

d1

d3

d6

20 x 106 10 x 106

a,b b b b

b

a a,b

# * *

a a a a

b

Ergebnisse

62

Bei zweistufig hypothermer Verdünnung zeigte sich bei den Proben mit

20 x 106 Spermien/ ml an d 3 mit 86,2 ± 6,9 % eine signifikant höhere Gesamtmotilität

als bei den auf 10 x 106 Spermien/ ml Proben mit 76,5 ± 10,3 %. An d 6 gab es

signifikante Veränderungen zwischen den Verdünnungsgraden der zweistufig

isotherm verdünnten Proben. Die Gesamtmotilität betrug 77,1 ± 12,1 % bei

20 x 106 Spermien/ ml und 61,9 ± 15,0 % bei der Spermienkonzentration von

10 x 106 Spermien/ ml.

Die progressive Motilität (Tabelle 1) zeigte ebenfalls an d 6 der zweistufig isotherm

verdünnten Proben signifikante Unterschiede zwischen den Vedünnungsgraden.

Samenproben mit einer Konzentration von 20 x 106 Spermien/ ml wiesen eine

progressive Motilität von 62,4 ± 18,2 % auf, während bei den Samenproben mit

10 x 106 Spermien/ ml nur 45,8 ± 19,9 % der Samenzellen progressiv motil waren.

Alle Motilitätsparameter, mit Ausnahme von der velocity curvilinear (VCL), wurden

von der Lagerungsdauer beeinflusst (p < 0,05). Die Gesamtmotilität und progressive

Motilität verringerten sich bei allen Verarbeitungsvarianten zwischen d 0 bzw. d 1 und

d 6 (Tabelle 1). Bei den zweistufig isotherm verdünnten Samenproben sank die

Gesamtmotilität von 91,1 ± 2,2 % nach 24 h auf 86,4 ± 5,1 % bereits nach 72 h.

Innerhalb beider Verdünnungsgrade verringerte sich auch die progressive Motilität

der zweistufig isotherm verdünnten Samenproben bereits zwischen 24 h und 72 h.

Bei Proben mit einer Konzentration von 20 x 106 Spermien/ ml sank sie zwischen

Lagerungstag 1 und 3 um 11,6 %, bei den auf 10 x 106 Spermien/ ml verdünnten

Proben verringerte sie sich im gleichen Zeitraum um 16,1 %. Bei den weiteren

Motilitätsparametern war der Einfluss der Lagerung weniger deutlich ausgeprägt.

In der grafischen Darstellung (Abb. 12) wurden die Ergebnisse des

Verdünnungstages (d 0) nicht mit abgebildet, da hier nur die zweistufig isothermen

Proben analysiert wurden und dadurch kein Vergleich der Verdünnungsarten möglich

ist.

Ergebnisse

63

4.1.3 Membranintegrität

Abb. 13: Prozentualer Anteil membranintakter (PI und FITC-PNA negativer) Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Art der zweistufigen Verdünnung (isotherm vs. hypotherm), Verdünnungsgrad (20 x 10

6 und 10 x 10

6 Spermien/ ml) und Lagerungsdauer (d 1, d3, d 6) bei 17 °C; n = 6 Ejakulate.

#: Unterschiede zwischen Verdünnungsarten bei gleicher Lagerungsdauer und Verdünnungsgrad

(p < 0,05)

a, b: Unterschiede zwischen Lagerungstagen (d1 –d6) für eine Verarbeitungsvariante (p < 0,05)

Der Anteil der PI- sowie FITC-PNA-negativen (plasma- und

akrosomenmembranintakte) Spermien wurde von der Art der Verdünnung (isotherm,

bzw. hypotherm) und der Lagerungsdauer beeinflusst (p < 0,05).

In der auf 20 x 106 Spermien/ ml verdünnten Gruppe wiesen hypotherm verdünnte

Samenproben am Lagerungstag 3 signifikant geringere Prozentsätze

membranintakter Spermien als isotherm verdünnte Proben auf, wobei die mittlere

Differenz mit 1,8 % gering war. In der Versuchsgruppe mit 10 x 106 Spermien/ ml

waren zu allen Lagerungszeitpunkten signifikant geringere Prozentsätze

membranintakter Spermien in den hypotherm verdünnten Proben, verglichen mit

isotherm aufbereiteten Proben festzustellen.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

isotherm hypotherm isotherm hypotherm

Mem

bra

nin

takt

e Sp

erm

ine

in %

Verdünnungsart/ -grad

d1

d3

d6

20 x 106 10 x 106

a a,b b a

b b a a b a a b

# #

# #

Ergebnisse

64

Während der Lagerung sanken die Werte der isotherm auf 20 x 106 Spermien/ ml

verdünnten Proben zwischen Lagerungstag 1 und 6 signifikant um 4 %. Bei der

hypothermen Verdünnung konnte ein signifikanter Abfall von 3,1 % der

membranintakten Spermien zwischen d 1 und d 3 festgestellt werden.

Bei der auf 10 x 106 Spermien/ ml verdünnten Gruppe sanken die Werte der isotherm

verdünnten Proben zwischen Lagerungstag 1 und 6 signifikant um 5,4 %. Die

hypotherm verdünnen Proben zeigten im gleichen Zeitraum einen signifikanten Abfall

von 6,5 %.

In der grafischen Darstellung (Abb. 13) wurden die Ergebnisse des

Verdünnungstages (d 0) nicht mit abgebildet, da hier nur die zweistufig isothermen

Proben analysiert wurden und dadurch kein Vergleich der Verdünnungsarten möglich

ist.

Ergebnisse

65

4.2 Experiment 2: Auswirkungen von Haltezeiten

und -temperaturen des vorverdünnten Samens bei zweistufig

isothermer Verdünnung


Der Zylinder mit der 1:1 (v:v) vorverdünnten Samenprobe wurde bis zu 6 h bei 21 °C

gehalten; hier verringerte sich die Temperatur von 31,1 °C auf 23,9 °C innerhalb der

ersten 90 Minuten. Die Abkühlrate betrug 0,10 ± 0,08 °C/min (0 – 30 min), dann

0,09 ± 0,08 °C/ min (31 – 60 min) und schließlich 0,05 ± 0,06 °C/ min (61 – 90 min).

Nach der Ausverdünnung der Kontrollproben mit isothermem Verdünner wurden

diese ebenfalls für 90 min bei 21 °C Umgebungstemperatur gehalten. In diesem

Zeitraum sank die Temperatur der Samenprobe von 30,2 °C auf 23,8 °C. Die

durchschnittliche Abkühlrate der Kontrollprobe bei 21 °C während der ersten 30 min

nach der Verdünnung betrug 0,10 ± 0,07 °C/ min, dann 0,07 ± 0,06 °C/ min (31 –

60 min) und schließlich 0,04 ± 0,06 °C/min (61 – 90 min).

Beide Kurven zeigen eine asymptotische Annäherung an die Umgebungstemperatur.

Die vorverdünnte Probe im Zylinder erreichte nach 269 min 21,0 ± 0,5 °C.

Die Temperatur der gehaltenen Samenproben zum Zeitpunkt der Ausverdünnung

belief sich auf 28,2 °C (Probe mit 30 min Haltezeit), 25,3 °C (60 min Haltezeit),

22,1 °C (3 h Haltezeit) und 21,5 °C (6 h Haltezeit). Die Abkühlraten in den ersten

30 min nach der jeweiligen Verdünnung betrug 0,08 ± 0,07 °C/ min (30 min Haltezeit)

und 0,05 ± 0,05 °C/ min (60 min Haltezeit). Bei den Samenproben, welche länger als

drei Stunden gehalten wurden, war die Abkühlrate in derselben Zeitspanne

< 0,01 °C/ min. Bei der Umlagerung in den auf 17 °C temperierten Klimaschrank

konnten folgende Temperaturen gemessen werden: 23,3 °C (30 min Haltezeit),

22,4 °C (60 min Haltezeit), 21,7 °C (3 h Haltezeit) und 21,3 °C bei der für 6 h

gehaltenen Samenprobe. Die Temperatur des Klimaschranks (17,0 ± 0,5 °C) wurde

von den Kontrollproben nach 273 min erreicht. Die für 30 min und 60 min gehaltenen

Proben erreichten sie fast zeitgleich (294 bzw. 297 min). Die für 3 h gehaltenen

Proben erreichten sie nach 423 min und die Probe mit der längsten Haltezeit (6 h)

erreichte die Lagerungstemperatur nach 576 min.

Ergebnisse

66

Die Abkühlung der bei 32 °C gehaltenen Proben verlief nach der Ausverdünnung im

Anschluss an die Haltezeiten analog zu der Abkühlung der Kontrollkurve. Sie

verschoben sich lediglich auf der Zeitachse um die Dauer der jeweiligen Haltezeiten.

Der Temperaturverlauf ist in Abb. 14 dargestellt. Exemplarisch wurde der

Temperaturverlauf der für 60 min bei 32 °C gehaltenen Proben in dieser Abbildung

dargestellt (gestrichelte Linie).

Abb. 14: Temperaturverlauf der bei Experiment 2 bei 21 °C gehaltenen Proben. Mittelwerte von je 3 Samenproben. Diese wurden im Verhältnis 1:1 (200 ml: 200 ml) mit Beltsville Thawing Solution (BTS, 32°C) verdünnt und zweistufig isotherm weiterverarbeitet. Je 200ml des vorverdünnten Samen wurden bei 32 °C bzw. 21 °C gehalten (für 30 min, 60 min, 3 h und 6 h), danach ausverdünnt (in 100 ml Ebersamenflaschen), für weitere 90 min bei 21 °C gehalten und anschließend bei 17 °C gelagert. Dargestellt sind die Haltezeiten bei 21 °C. Klammern beschreiben die rote bzw. blaue Kurve. Die Kontrollproben (rote Linie), wurde ohne Haltezeiten direkt weiterverarbeitet. Die blaue Linie entspricht den Proben, welche vorverdünnt 3h bei 21 °C gehalten und anschließend isotherm ausverdünnt wurden. Die schwarze Linie beschreibt den Temperaturverlauf der 1:1 vorverdünnten Proben. Die gestrichelte Linie zeigt exemplarisch den Temperaturverlauf der Proben mit 60 min Haltezeit bei 32 °C. Um die Grafik übersichtlicher zu gestalten, wurde auf die Darstellung weiterer Haltezeiten bei 32 °C verzichtet. *Kontrolle: 15 min bei 32°C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

10

15

20

25

30

35

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

Tem

pera

tur

in °

C

Minuten

Kontrolle* 30 min Haltezeit 60 min Haltezeit 3 h Haltezeit

6 h Haltezeit Vorverdünnte Probe 60 min bei 32 °C

Ausverdünnt 90 min bei 21 °C

Weitere Abkühlung und Lagerung bei 17 °C

3h Haltezeit bei 21 °C des 1:1 verdünnten Samens

Ausverdünnt 90 min bei 21 °C Weitere Abkühlung und Lagerung bei 17 °C

Ergebnisse

67


Abb. 15: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Die gestreifte Säule entspricht der Kontrolle*, rote Säulen den Proben mit Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C. Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=12 Ejakulate für d0 – d3; n=6 Ejakulate für d6. Klammer: Unterschiede zwischen den Haltetemperaturen bei gleicher Lagerungsdauer und Haltezeit

(p > 0,05)

*Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

Die Haltezeit hatte auf die Motilität der Spermien keinen Einfluss.

Die Haltetemperatur hatte auf die Gesamtmotilität (Abb. 15) und progressive Motilität

bei n = 12 (d0 – d3) Einfluss (Tabelle 3). Signifikante Unterschiede zeigten sich bei

der Gesamtmotilität nur an d 1: Die Motilität bei den für 30 min gehaltenen Proben

war bei einer Haltetemperatur von 32 °C signifikant höher als bei 21 °C, wobei die

mittlere Differenz mit 0,8 % gering war. Bei den für 6 h bei 32 °C gehaltenen Proben

zeigten die Proben eine signifikant niedrigere Motilität als bei 21 °C, wobei die

mittlere Differenz von 0,2 % auch hier gering war.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d0 d1 d3 d6

mo

tile

Sp

erm

ien

in

%

Lagerungsdauer

Kontrolle

32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

n=12 n=6

*

Ergebnisse

68

Mit Ausnahme von der Gesamtmotilität und der progressiven Motilität wurden alle

erhobenen Motilitätsparameter durch die Lagerungsdauer beeinflusst (p < 0,05),

allerdings konnten nur wenige signifikante Unterschiede ermittelt werden (Tabelle 3).

In der folgenden Grafik (Abb. 16) sowie in den Abbildungen 41 – 47 (Anhang)

wurden Spermiensubpopulationen einiger Motilitätsparameter dargestellt. Hierfür

wurden jeweils die Kontrollproben und die für 6 h bei 32 °C bzw. 21 °C gehaltenen

Proben analysiert. Bei allen Parametern waren Unterschiede hauptsächlich an Tag 0

zu sehen, ab d 1 zeigten die Kurven der verschiedenen Behandlungsgruppen jeweils

sehr ähnliche Geschwindigkeitsprofile. Am meisten ausgeprägt waren diese bei den

Geschwindigkeitsparametern VCL (velocity curvilinear) und VSL (velocity straight

line, Abb. 41). Bei der Analyse wurde die Geschwindigkeit in einzelne Klassen à 20

µm/ s (VCL) bzw. 10 µm/ s (VSL) aufgeteilt und der Anteil der Spermien pro Klasse

ermittelt.

Bei VCL ergab die Analyse von d 0 bei den Kontrollproben mit 8,2 % den größten

Anteil der Spermien bei 61 – 80 µm/ s. Die für 6 h bei 32 °C gehaltenen Proben hatte

einen Peak mit 8,6 % der Spermien bei 81 – 100 µm/ s, bei den bei 21 °C gehaltenen

Proben waren mit 6,7 % die meisten Spermien in der Geschwindigkeitsklasse 141 –

160 µm/ s vertreten. Nach 24 h Lagerungsdauer (d 1) wiesen die Spermaproben der

unterschiedlichen Temperaturgruppen sehr ähnliche Geschwindigkeitsprofile auf.

Die Peaks bei VSL befanden sich in niedrigeren Geschwindigkeitsklassen.

Samenproben, die für 6 h bei 32 °C gehalten wurden, erreichten mit 8,6 % der

Spermien bei 41 – 50 µm/ s ihren Höhepunkt. Sowohl die für 6 h bei 21 °C

gehaltenen Proben, als auch die Kontrollproben waren mit den meisten Spermien,

15,28 % (Kontrolle) und 18,72 % (21 °C), in der Geschwindigkeitsklasse

51 - 60 µm/ s vertreten.

Ergebnisse

69

Abb. 16: Prozentualer Anteil der Spermien pro Geschwindigkeitsklasse der VCL (velocity curvilinear; in µm/ s) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

9%

10%

Sper

mie

nan

teil

pro

Kla

sse

in %

Geschwindigkeitsklassen in µm/ s

VCL

K d0

21-6 d0

32-6 d0

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

9%

10%

Sper

mie

nan

teil

pro

Kla

sse

in %

Geschwindigkeitsklassen in µm/ s

K d1

21-6 d1

32-6 d1

A

B

Kontrolle*-d0

21°C-6h-d0

32°C-6h-d0

Kontrolle*-d1

21°C-6h-d1

32°C-6h-d1

Ergebnisse

70


Abb. 17: Prozentualer Anteil membranintakter (PI und FITC-PNA negative) Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Die gestreifte Säule entspricht der Kontrolle*, rote Säulen den Proben mit Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C. Die Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=12 Ejakulate für d0 – d3; n=6 Ejakulate für d6). Klammer: Unterschiede zwischen den Haltezeiten bei gleicher Haltetemperatur und Lagerungsdauer

(p > 0,05).


Die statistische Auswertung zeigte Einflüsse der Haltezeit und der Lagerungsdauer

auf den Anteil membranintakter Spermien (p < 0,05).

Proben, die bei 32 °C gehalten wurden, zeigten signifikante Veränderungen durch

die Haltezeit nach Lagerungstag 1 und 3. An d 1 zeigten sich signifikante

Unterschiede zwischen 30 min Haltezeit und 60 min, wobei die mittlere Differenz mit

0,3 % gering war. An d 3 zeigten die Proben nach 3 h und 6 h Haltezeit signifikant

geringere Werte im Vergleich zu 30 min, wobei auch hier die mittlere Differenz mit

0,8 % nach 3 h und 1,1 % nach 6 h gering war.

Die Proben, die bei 21 °C gehalten wurden, zeigten haltezeitabhängig signifikante

Veränderungen an d 1. Nach 30 min Haltezeit waren noch 89,4 ± 2,9 % Spermien

membranintakt, dieser Wert sank um 0,3 % nach 3 h Haltezeit. Ein weiterer

Unterschied ergab sich zwischen den für 60 min und 3 h gehaltenen Proben. Der

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d0 d1 d3 d6

Mem

bra

nin

takt

e Sp

erm

ien

in %

Lagerungsdauer

Kontrolle(=0min)32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

n=12 n=6

*

Ergebnisse

71

Wert verringerte sich ebenfalls um 0,3 % von 89,5 ± 3,1 % (60 min) auf 89,1 ± 3,1 %

(3 h).

Signifikante Unterschiede der Lagerungsdauer konnten im Paarvergleich nicht

ermittelt werden.

Die Ergebnisse sind in Abb. 17 dargestellt.

4.2.4 Mitochondrienmembranpotential

Abb. 18: Prozentualer Anteil der PI-negativen (Plasmamembran-intakten) Spermien mit mehrheitlich hohem Mitochondrienmembranpotential (MMP) in Abhängigkeit von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Die gestreifte Säule entspricht der Kontrolle*, rote Säulen den Proben mit Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C. Die Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten; n=6 Ejakulate. Klammer: Unterschied zw. Lagerungstagen (d0 – d6) innerhalb einer Verarbeitungsvariante (p < 0,05)


Das Mitochondrienmembranpotential (Abb. 18) wurde durch die Lagerungsdauer

(p < 0,05) beeinflusst. Signifikante Unterschiede zeigten sich nur innerhalb der für

30 min bei 32 °C gehaltenen Proben an d 6. Hier sank das

Mitochondrienmembranpotential von 87,2 ± 7,6 % an d 3 auf 76,6 ± 18,2 % an d 6.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

d0 d1 d3 d6

MM

P in

%

Lagerungsdauer

Kontrolle

32-30

32-60

32-3

32-6

21-30

21-60

21-3

21-6

n=6

*

Ergebnisse

72

Abb. 19: Mittlere Fluoreszenzintensität (orange Jagg) aller Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer, Haltetemperatur und der Haltezeit des vorverdünnten Samens. Die gestreifte Säule entspricht der Kontrolle*, rote Säulen den Proben mit Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C. Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten;n=6 Ejakulate. Klammer: Unterschied zwischen Lagerungstagen (d0 – d6) für eine Verarbeitungsvariante. (p < 0,05) *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

Die mittlere Fluoreszenzintensität (Orangefluoreszenz, Jagg) wurde nur von der

Lagerungsdauer beeinflusst (p < 0,05, Abb. 19).

Bei für 3 h bei 32 °C gehaltenen Samenproben sank der Wert signifikant von

15,5 ± 5,9 an d 0 auf 11,6 ± 4,7 nach 3 Tagen Lagerung. Die Fluoreszenzintensität

der Kontrollproben sank signifikant von 14,0 ± 4,8 an d 1 auf 10,9 ± 5,1 nach 6 Tagen

Lagerung. Bei den bei 21 °C gehaltenen Proben zeigten sich signifikante

Veränderungen der Fluoreszenzintensität; bei der für 30 min gehaltenen Probe

sank der Wert von 16,4 ± 6,6 (d 1) auf 11,2 ± 4,6 (d 6) und nach 60 min Haltezeit von

15,81 ± 7,2 (d 1) auf 11,9 ± 5,1 (d 6).

0

5

10

15

20

25

30

d0 d1 d3 d6

arb

itra

ry u

nit

s

Lagerungsdauer

Kontrolle

32-30

32-60

32-3

32-6

21-30

21-60

21-3

21-6

n=6

*

Ergebnisse

73

4.2.5 Energiestoffwechsel

Abb. 20: ATP – Gehalt der Spermien in pmol/ 50000 Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Die grüne Säule entspricht dem ATP – Gehalt der unbehandelten Samenprobe, die gestreifte Säule der Kontrolle*. Rote Säulen entsprechen den Proben mit einer Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C. Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=6 Ejakulate. Klammer: Unterschied zwischen Lagerungstagen (d0 – d6) für eine Verarbeitungsvariante. (p < 0,05)


Die Haltezeit und Haltetemperatur hatten keinen Einfluss auf den ATP-Gehalt der

Spermien. Nur ein Einfluss der Lagerungsdauer konnte ermittelt werden. In der

grafischen Darstellung (Abb. 20) wird deutlich, dass alle ATP-Werte an d 1

tendenziell niedriger sind als am Verdünnungstag (d 0) und anschließend über die

Lagerung stabil bleiben. Signifikante Unterschiede bestehen nur zwischen der für

60 Minuten bei 21 °C gehaltenen Samenproben an d 0 mit 306 ± 94 pmol/ 50000

Spermien im Vergleich zu d 1 mit 231 ± 60 pmol/ 50000 Spermien, bzw. zu d 6 mit

254 ± 66 pmol/ 50000 Spermien.

Der ADP - und AMP - Gehalt der Spermien zeigte sich stabil während der Lagerung

und wurde weder von der Haltezeit und -temperatur noch von der Lagerungsdauer

beeinflusst (Tabelle 5).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

d0 d1 d3 d6

ATP

in p

mo

l/ 5

0.0

00

Sp

erm

ien

Lagerungsdauer

ATP nativ

Kontrolle

32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

*

Ergebnisse

74

Abb. 21: Energieladung (EC) der Spermien in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer, Halte-temperatur und der Haltezeit des vorverdünnten Samens. Die grüne Säule entspricht der EC der unbehandelten Samenproben, die gestreifte Säule der Kontrollen*. Rote Säulen entsprechen den Proben mit einer Haltetemperatur von 32 °C und die blauen Säulen Proben mit einer Haltetemperatur von 21 °C. Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=6 Ejakulate. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

Die aus den Nukleotiden errechnete Energieladung („Energy Charge“, EC) der Zellen

kann Null betragen bei Zellen, die nur AMP enthalten und kann einen Wert bis Eins

erreichen bei Zellen, die nur ATP enthalten. Bei Werten > 0,6 ist von vitalen Zellen

auszugehen (s. Kapitel 3.13.1). Der Wert von 0,6 wurde im Mittel während des

Versuchs nicht unterschritten.

Beeinflusst wurde die EC nur von der Haltetemperatur. Allerdings wurden im

statistischen Test keine signifikanten Unterschiede im Paarvergleich ermittelt

(Abb. 21).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

d0 d1 d3 d6

Ener

giel

adu

ng

Lagerungsdauer

ATP nativ

Kontrolle

32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

*

Ergebnisse

75

4.2.6 Gesamtkeimzahlbestimmung

Abb. 22: Gesamtkeimzahlen (GKZ) der Samenproben in KbE/ ml (MW + SD) in Abhängigkeit von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens (n = 4). Die grüne Säule entspricht der GKZ im nativen Ejakulat, die gestreifte Säule der Kontrolle*, rote Säulen entsprechen den Proben mit einer Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C (je 60 min und 6 h); n=4 Ejakulate.


Die Gesamtkeimzahlbestimmung an d 0 ergab im nativen Samen im Mittel

33125 ± 18186 KbE (Abb. 22), die Ergebnisse der Einzeltiere im nativen Ejakulat

variierten dabei von 15000 KbE bis 50000 KbE. Die Werte der 1:1 vorverdünnten

Proben befanden sich alle in einem Bereich von < 1000 KbE: In der Kontrollprobe

wurden 93,75 ± 130 KbE gezählt. Auch die für 60 min gehaltenen Proben bewegten

sich mit 72,5 ± 88 KbE (32 °C) und 126 ± 131KbE (21 °C) im geringgradigen Bereich.

Dasselbe gilt für die Proben die 6 h gehalten wurden mit 797 ± 1496 KbE (32 °C) und

434 ± 713 KbE (21 °C). Der Temperaturgruppenvergleich ergab keinen Unterschied

im Keimwachstum. Bei den ausverdünnten Proben konnten nach 72 h Lagerung

(d 3) in der Kontrollprobe und nach 60 min Haltezeit bei beiden Temperaturen keine

Keime mehr nachgewiesen werden. Bei den Proben, die 6 h gehalten wurden, war

1

10

100

1000

10000

100000

nativ Kontrolle 60min 6h Kontrolle 60min 6h

Kb

E/m

l

Probenentnahme

32°C 21°C

d0 (1:1 verdünnt) d3 (ausverdünnt)

* *

Ergebnisse

76

mit 138 ± 243 KbE (32 °C) und 50 ± 100 KbE (21 °C) noch Keimwachstum

vorhanden, allerdings im geringgradigen Bereich.

In der vergleichenden Darstellung der Eber (Abb. 23) ist zu sehen, dass die Werte

aller Proben an d 0 im geringgradigen Bereich von 102 KbE liegen, mit Ausnahme

von Eber 2, der unmittelbar nach 6 h Haltezeit bei beiden Temperaturen mehr

Keimwachstum im verdünnten Sperma aufweist, d.h.: 3000 KbE bei 32 °C und 1500

KbE bei 21 °C Haltetemperatur. Dieses reduzierte sich in der ausverdünnten,

gelagerten Probe. Nach 72 h Lagerung (Abb. 24) zeigte bei der in 32 °C für 6 h

gehaltenen Probe nur noch Eber 1 mit 500 KbE und Eber 4 mit 50 KbE

Keimwachstum. Bei den bei 21 °C gehaltenen Proben wurden nur bei Eber 1 mit

200 KbE noch Keime nachgewiesen.

Ergebnisse

77

Abb. 23: Gesamtkeimzahlen (GKZ) der Samenproben in KbE/ ml (MW + SD) der Proben an Tag 0 bei 32 °C (A) und 21 °C Haltetemperatur (B) in Abhängigkeit der Eber und der Haltezeit des vorverdünnten Samens. Rote Säulen entsprechen den Proben mit einer Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C (je 60 min und 6 h); n=4 Ejakulate *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Kontrolle 32°C 60min 32°C 6h

Kb

E/m

l

Probenentnahme

Eber 1

Eber 2

Eber 3

Eber 4

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500


Kb

E/m

l

Probenentnahme

Eber 1

Eber 2

Eber 3

Eber 4

A

B

*

*

Ergebnisse

78

Abb. 24: Gesamtkeimzahlen (GKZ) der Samenproben in KbE/ ml (MW * SD) der Proben an Tag 3 bei 32 °C (A) und 21 °C Haltetemperatur (B) in Abhängigkeit der Eber und der Haltezeit des vorverdünnten Samens. Rote Säulen entsprechen den Proben mit einer Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C (je 60 min und 6 h); n=4 Ejakulate. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS- Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500


Kb

E/m

l

Probenentnahme

Eber 1

Eber 2

Eber 3

Eber 4

*

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500


Kb

E/m

l

Probenentnahme

Eber 1

Eber 2

Eber 3

Eber 4

*

A

B

Ergebnisse

79

4.3 Experiment 3: Vergleich zweistufig isothermer mit zweistufig

hyperthermer Verdünnung


Nach der Vorverdünnung im Verhältnis 1:1 (v:v) wurden die Ejakulate in zwei

Glaszylinder aufgeteilt und jeweils bis zu 6 h bei 21 °C gehalten. Innerhalb der ersten

90 min verringerte sich die Temperatur hier von 31,1 °C auf 23,9 °C. Während der

ersten 30 min bei 21 °C betrug die durchschnittliche Abkühlrate 0,09 ± 0,09 °C/ min,

dann 0,10 ± 0,05 °C/ min (31 – 60 min) und schließlich 0,05 ± 0,05 °C/ min

(61 - 90 min).

Die Kontrollprobe wurde nach der Ausverdünnung mit isothermem Verdünner für

90 min bei 21 °C Umgebungstemperatur abgekühlt. Während dieser Zeitspanne sank

die Temperatur der Samenproben im Mittel von 31,6 °C auf 24,1 °C. Sie zeigten die

gleichen Abkühlraten wie die vorverdünnten Samenproben.

Nach jeder Haltezeit wurden die unterschiedlich abgekühlten Proben mit isothermem

bzw. auf 32 °C erwärmten Verdünner ausverdünnt. Nach 30 min Haltezeit bei 21 °C

waren die vorverdünnten Proben auf 28,2 °C abgekühlt, die hypertherme

Ausverdünnung erwärmte diese auf 31,6 °C. Nach 60 min Haltezeit erwärmten sich

die Proben von 25,4 °C auf 30,4 °C, von 22,1 °C auf 29,8 °C (3 h Haltezeit) und nach

6 h Haltezeit von 21,5 °C auf 29,6 °C. Im Anschluss an die Ausverdünnung wurden

die Proben für 90 min erneut bei 21 °C gehalten. Die Abkühlraten bei in den ersten

30 min nach der jeweiligen Verdünnung betrug 0,13 ± 0,04 °C/ min (30 min

Haltezeit), 0,12 ± 0,06 °C/ min (60 min) und 0,10 ± 0,06 °C/ min nach 3 h und 6 h

Haltezeit. Nach 90 min bei 21 °C hatten alle Proben eine Temperatur von 23,7 °C.

Die Lagerungstemperatur (17,0 ± 0,5 °C) erreichten die Kontrollproben 255 min nach

Messbeginn, die für 30 min bei 21 °C gehaltenen Proben nach 273 min, die für

60 min gehaltenen Proben erreichten sie nach 305 min, die Proben mit 3 h Haltezeit

nach 532 min und die für 6 h gehaltenen Proben nach 635 min.

Der Temperaturverlauf ist in Abb. 25 dargestellt.

Ergebnisse

80

Abb. 25: Temperaturverlauf der bei Experiment 3 bei 21 °C gehaltenen und anschließend hypertherm verdünnten Proben. Mittelwerte von je 3 Samenproben. Diese wurden im Verhältnis 1:1 (200ml: 200 ml) mit Beltsville Thawing Solution (BTS, 32 °C) verdünnt und zweistufig hypertherm bzw. isotherm weiterverarbeitet. Beide vorverdünnte Proben wurden bei 21 °C gehalten (für 30 min, 60 min 3 h und 6 h), danach hypertherm (BTS, 32 °C) bzw. isotherm ausverdünnt, für weitere 90 min bei 21 °C gehalten und anschließend bei 17 °C gelagert. Dargestellt sind die hypertherm verdünnten Proben, sowie die Kontrollprobe. Klammern beschreiben den Verlauf der roten bzw. blauen Kurve. Die Kontrollproben (rote Linie), wurde ohne Haltezeiten direkt isotherm weiterverarbeitet. Die blaue Linie entspricht den Proben, welche vorverdünnt 3h bei 21 °C gehalten und anschließend hypertherm (BTS 32 °C) ausverdünnt wurden. Um die Grafik übersichtlicher zu gestalten, wurde auf die Darstellung der isothermen Verdünnung verzichtet.

10

15

20

25

30

35

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

Tem

per

atu

r in

°C

Minuten

30 min Haltezeit 60 min Haltezeit 3 h Haltezeit

6 h Haltezeit Kontrolle (zweist. isotherm)



3h Haltezeit bei 21 °C des 1:1 verdünnten Samens

Ausverdünnt 32 °C BTS 90 min bei 21 °C Weitere Abkühlung und Lagerung bei 17 °C

Ergebnisse

81

4.3.2 Casa-Motilitätsparameter

Abb. 26: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Verdünnertemperatur im zweiten Verdünnungsschritt, der Haltezeit des vorverdünnten Samens und der Lagerungsdauer. Dargestellt sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), hypertherm ausverdünnte Proben (rote Säulen) und isotherm ausverdünnte Proben (blaue Säulen). Farbabstufungen: unterschiedliche Haltezeiten; n=6 Ejakulate. Klammer: Unterschiede zwischen Lagerungstagen (d0 – d3) für eine Verarbeitungsvariante (p > 0,05)


Die Temperatur des Verdünners beeinflusste von den Motilitätsparameter nur die

Geschwindigkeitsparameter VCL, VSL und VAP (p < 0,05). Statistisch signifikante

Unterschiede konnten bei den für 6 h gehaltenen Proben nach 3 Tagen Lagerung

ermittelt werden (Tabelle 6). Die für 6 h gehaltenen Proben zeigten nach 3 Tagen

Lagerungsdauer eine velocity average path (VAP) der hypertherm ausverdünnten

Proben von 63,97 ± 11,55 µm/ s, wohingegen der Wert der isotherm ausverdünnten

Probe mit 60,35 ± 9,97 µm/ s signifikant niedriger war. Die velocity straight-line (VSL)

an Lagerungstag 3 der hypertherm ausverdünnten Proben betrug 50,11 ± 4,81 µm/ s,

die Werte der isotherm verdünnten Proben dagegen 46,18 ± 4,94 µm/ s.

Von den Haltezeiten beeinflusst wurden nur die Parameter straightness (STR),

linearity (LIN), wobble (WOB) und amplitude of lateral head displacement (ALH).

Signifikante Unterschiede zeigte sich vor allem am Tag der Verdünnung (d 0).

Während der Lagerung verminderten sich diese (Tabelle 6).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d0 d1 d3

Mo

tile

Sp

erm

ien

in %

Lagerungsdauer

32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

Kontrolle*

Ergebnisse

82

Alle Motilitätsparameter wurden durch die Lagerungsdauer beeinflusst (p < 0,05).

Signifikante Unterschiede konnten nur bei der isothermen Verdünnung festgestellt

werden. Hier sank die Gesamtmotilität bei der für 6 h gehaltenen Probe von

93,0 ± 2,2 % an d 0 auf 84,3 ± 15,4 % an d 3. Die für 30 min gehaltenen Probe

verringerte sich von 92,8 ± 3,0 % an d 1 auf 89,5 ± 5,2 % an d 3.

Bei der progressiven Motilität zeigten sich signifikante Unterschiede nach 72 h

Lagerung ebenfalls hauptsächlich bei den isotherm verdünnten Proben (nach 3 h und

6 h Haltezeit, Tabelle 6). Bei den für 30 min gehaltenen Proben zeigten sowohl die

isotherm verdünnte, als auch die hypertherm verdünnte Probe signifikante

Unterschiede. Die progressive Motilität der hypertherm ausverdünnten Probe sank

von 85,6 ± 4,0 % an d 0 auf 80,3 ± 6,47 % nach 3 Tagen Lagerung. Der Wert der

isotherm ausverdünnten Probe sank von 85,22 ± 4,2 % (d 0) auf 78,6 ± 10,8 % an

d 3.

Die Gesamtmotilität in Abhängigkeit von der Verdünnertemperatur bei der

Ausverdünnung ist in Abb. 26 dargestellt.

Ergebnisse

83


Abb. 27: Prozentualer Anteil membranintakter (PI und FITC-PNA negative) Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Verdünnertemperatur im zweiten Verdünnungsschritt, der Haltezeit des vorverdünnten Samens und der Lagerungsdauer; n=6 Ejakulate Dargestellt sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), hypertherm ausverdünnte Proben (rote Säulen) und isotherm ausverdünnte Proben (blaue Säulen). Farbabstufungen: unterschiedliche Haltezeiten. #: Unterschied zwischen den Verdünnertemperaturen innerhalb eines Lagerungstages. (p > 0,05) Klammer: Unterschiede zwischen Lagerungstagen für eine Verarbeitungsvariante. (p < 0,05) *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS Empfehlung (STÄHR et al., 2009)

Der Anteil der PI- und FITC-PNA-negativen (plasma- und

akrosomenmembranintakter) Spermien wurde von der Temperatur des zweiten

Verdünners und von der Lagerungsdauer beeinflusst (p < 0,05) (Abb. 27).

Der Einfluss der Temperatur des zweiten Verdünners zeigte sich statistisch

signifikant im Paarvergleich nur bei den für 60 min gehaltenen Proben an

Lagerungstag 3. Die hypertherm verdünnten Samenproben zeigten geringere

Prozentsätze membranintakter Spermien als isotherm verdünnte Proben auf, wobei

die mittlere Differenz mit 0,8 % gering war.

Die Werte bewegten sich bei der Lagerungsdauer von 72 h in einem sehr engen

Bereich. Mit Ausnahme eines Messzeitpunktes lagen die Mittelwerte der

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d0 d1 d3

Mem

bra

nin

tegr

ität

in %

Lagerungsdauer

Kontrolle

32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

#

*

Ergebnisse

84

membranintakten Samenzellen bei allen Proben während der gesamten

Lagerungsdauer bei über 90 %.

Signifikante Unterschiede zeigten sich nur bei den isotherm verdünnten Proben:

Die für 60 min gehaltenen Proben wiesen nach Lagerungstag 1 und 3 signifikant

niedrigere Werte auf verglichen mit d 0, wobei die mittleren Differenzen zwischen den

Lagerungstagen mit 1 % bis 2,2 % gering waren. Nach 30 min Haltezeit ergab die

Messung an d 0 einen Anteil von 92,7 ± 2,3 % membranintakten Spermien; dieser

Wert erniedrigte sich auf 92,3 ± 2,0 an (d 1) und auf 90,6 ± 1,6 % an d 3.

Bei den für 3 h gehaltenen Proben reduzierte sich der Wert von 92,4 ± 1,6 % (d 0)

auf 90,7 ± 0,7 % (d 3).

4.4 Experiment 4 a: Auswirkungen von Haltezeiten des

ausverdünnten Samens nach zweistufig hypothermer Verdünnung


Nach der isothermen Vorverdünnung wurde das Sperma zunächst 20 min bei 21 °C

gehalten. Die Temperatur nach der Verdünnung betrug 31,6 °C; während der

Haltezeit kühlten die Proben auf 29,0 °C ab. Die anschließende Ausverdünnung in

100 ml Ebersamenflaschen wurde hypotherm mit einem auf 21 °C temperierten BTS

durchgeführt; dadurch verringerte sich die Probentemperatur auf 23,8 °C. Die

Kontrollproben wurden anschließend 90 min bei 21 °C gehalten, wobei die

Temperatur auf 21,9 °C sank. Die durchschnittliche Abkühlrate der Kontrollproben

während der ersten 30 min (0 – 30 min) war 0,03 ± 0,04 °C/ min.

Die anderen ausverdünnten Proben wurden bei 21 °C oder 32 °C für 30 min, 60 min,

3 h bzw. 6 h gehalten. Die bei 32 °C gehaltenen Proben erreichten die

Haltetemperatur nach 27 min. Die Temperatur erhöhte sich in diesem Zeitraum von

23,4 °C auf 32 °C mit einer Rate von 0,27 ± 0,42 °C/ min. Nach der jeweiligen

Haltezeit wurden die Proben 90 min bei 21 °C abgekühlt. Die Abkühlrate verringerte

sich von 0,13 ± 0,05 °C (0 – 30 min), auf 0,08 ± 0,05 °C/ min (31 – 60 min) und

0,05 ± 0,04 °C/ min (61 – 90 min). Beim anschließenden Umlagern auf 17 °C war die

Ergebnisse

85

Probentemperatur 23,9 °C. Die Lagerungstemperatur von 17,0 ± 0,5 °C wurde nach

291 min (Kontrolle), 303 min (30 min Haltezeit), 334 min (60 min Haltezeit), 454 min

(3 h Haltezeit) und 642 min (6 h Haltezeit) erreicht.


Abb. 28: Temperaturverlauf der bei Experiment 4a zweistufig hypotherm verdünnten und anschließend bei 32 °C gehaltenen Proben. Mittelwerte von je 3 Samenproben. Diese wurden im Verhältnis 1:1 (200 ml: 200 ml) mit Beltsville Thawing Solution (BTS 32 °C) verdünnt 20 min bei 21 °C gehalten und schließlich mit BTS (21 °C) hypotherm ausverdünnt. Die ausverdünnten Proben (in 100 ml Ebersamenflaschen) wurden bei 32 °C bzw. 21 °C gehalten (für 30 min, 60 min, 3 h und 6 h), und danach für weitere 90 min bei 21 °C gehalten und anschließend bei 17 °C gelagert. Dargestellt sind der Temperaturverlauf der bei 32 °C gehaltenen Proben und die Kontrollproben. Die Klammern beschreiben den Verlauf der roten bzw. blauen Kurve. Die rote Kurve entspricht den Kontrollproben, die ohne Haltezeiten direkt weiterverarbeitet wurden. Die blaue Kurve entspricht den Proben, die nach der Ausverdünnung 3 h bei 32 °C gehalten wurden. Um die Grafik übersichtlicher zu gestalten wurde auf die Darstellung der Haltezeiten bei 21 °C

verzichtet.

*Kontrolle = 0 min Haltezeit, direkte Messung und Abkühlung, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung

(STÄHR et al., 2009)

10

15

20

25

30

35

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660

Tem

pera

tur

in °

C

Minuten

6 h Haltezeit 3 h Haltezeit 60 min Haltezeit 30 min Haltezeit Kontrolle*

zweistufig hypotherm ausverdünnt,

90 min Abkühlung bei 21 °C


3 h Halten bei 32 °C 90 min bei 21 °C Abkühlung und Lagerung bei 17 °C

Ergebnisse

86


Abb. 29: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Dargestellt sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), Proben mit Haltetemperatur 32 °C (rote Säulen), und Proben mit Haltetemperatur 21 °C (rote Säulen). Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=6 Ejakulate. *Kontrolle = 0 min Haltezeit, direkte Messung und Abkühlung, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung



Von der Haltetemperatur waren nur die Bewegungsparameter straightness (STR),

linearity (LIN), wobble (WOB) und ALH beeinflusst. Die Veränderungen zeigten sich

vor allem an d0 bei STR und LIN nach 60 min, 3 h und 6 h Haltezeit, bei WOB nach

3 h und 6 h und bei ALH wurden an d 0 nur Unterschiede nach 6 h Haltezeit ermittelt

(Tabelle 8).

Mit Ausnahme der velocity curved line (VCL) wurden alle erhobenen

Motilitätsparameter durch die Lagerungsdauer beeinflusst (p < 0,05). Bei der

Gesamtmotilität (Abb. 29) konnten keine signifikanten Veränderungen im

Paarvergleich festgestellt werden. Die progressive Motilität zeigte nur Unterschiede

bei Proben, die bei 21 °C gehalten wurden (Tabelle 8). Nach 60 min Haltezeit sank

der Wert von 87,3 ± 4,2 % (d 0) auf 83,2 ± 6,8 % (d 1) und nach 72 h Lagerung (d 3)

waren noch 81,0 ± 9,0 % vorwärtsbeweglich. Bei den für 6 h gehaltenen Proben

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d0 d1 d3

Motilit

ät

in %

Lagerungsdauer

32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

Kontrolle*

Ergebnisse

87

waren an d 0 noch 85,8 ± 6,1 % progressiv motil, nach d 1 reduzierte sich die

Vorwärtsbeweglichkeit auf 82,0 ± 6,8 %.

4.4.3 Membranintegriät

Abb. 30: Prozentualer Anteil membranintakter (PI und FITC-PNA negativer) Spermien (MW + SD) in

Abhängigkeit von der der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten

Samens. Dargestellt sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), Proben mit Haltetemperatur 32 °C (rote

Säulen), und Proben mit Haltetemperatur 21 °C (rote Säulen).

Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=6 Ejakulate.

Klammer: Unterschiede zwischen Lagerungstagen bei gleicher Haltetemperatur und –zeit. (p > 0,05) *Kontrolle = 0 min Haltezeit, direkte Messung und Abkühlung, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung



akrosomenmembranintakter) Spermien (Abb. 30) wurde nur von der Lagerungsdauer

beeinflusst. Die Ergebnisse lagen während der gesamten Versuchsdauer in einem

engen Bereich von 92,1 ± 1,8 % bis 89,0 ± 1,7 %.

Bei den bei 32 °C gehaltenen Proben wurden weniger Unterschiede deutlich als bei

den bei 21 °C gehaltenen Proben. Die für 30 min bei 32 °C gehaltenen Proben

enthielten am Verdünnungstag (d 0) signifikant mehr membranintakte Samenzellen

als nach 3 Tagen Lagerung, wobei die mittlere Differenz mit 2 % niedrig war. Am Tag

der Verdünnung (d 0) waren signifikant mehr membranintakte Spermien bei den für

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d0 d1 d3

Mem

bra

nin

takte

Sperm

ien in

%

Lagerungsdauer

32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

Kontrolle*

Ergebnisse

88

60 min gehaltenen Proben als nach 1 oder 3 Tagen Lagerung. Auch hier war die

mittlere Differenz mit 1,7 % an d 1 und 2 % nach 3 Tagen Lagerung gering.

Proben, die einer Haltetemperatur von 21 °C ausgesetzt wurden, wiesen bei allen

Haltezeiten signifikant höhere Ergebnisse am Tag der Verdünnung auf, verglichen

mit den Ergebnissen nach 1 oder 3 Tagen Lagerungsdauer.

Nach 30 min Haltezeit wurden am Tag der Verdünnung (d 0) 91,5 ± 1,3 %

membranintakte Samenzellen gemessen, an d 1 ergab die Messung einen Wert von

90,3 ± 0,8 %. Ähnliche Zahlen zeigten sich nach 60 min Haltezeit, mit 91,6 ± 1,0 %

(d 0) und 90,5 ± 0,5 % (d 3). Die Werte der für 3 h gehaltenen Proben sanken von

91,6 ± 1,3 % (d 0) auf 90,2 ± 1,0 % (d 1). Über alle 3 Lagerungstage wurden

Veränderungen bei den für 6 h gehaltenen Proben gemessen: Der Wert 90,5 ± 1,4 %

(d 0) verringerte sich auf 90,3 ± 0,7 % (d 1) und 89,4 ± 0,9 % nach 72 h Lagerung.

4.5 Experiment 4 b: Auswirkungen von Haltezeiten des

ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung


Nach der einstufig isothermen Verdünnung (in 100 ml Ebersamenflaschen) lag die

Temperatur der Proben bei 31,6 °C. Die Kontrollprobe wurde 90 min bei 21 °C

gehalten. In den ersten 30 min betrug die Abkühlrate 0,13 ± 0,04 °C/ min; sie sank

dann auf 0,08 ± 0,05 °C/ min (31 -60 min) und schließlich auf 0,05 ± 0,04 °C/ min

(61 – 90 min). Bei der Umlagerung in den 17 °C Klimaschrank betrug die

Probentemperatur 23,8 °C.

Nach der Ausverdünnung wurden die anderen ausverdünnten Proben bei 21 °C bzw.

32 °C für 30 min, 60 min, 3 h bzw. 6 h gehalten. Anschließend kühlten sie weitere 90

min bei 21 °C ab. Die Proben zeigten gleiche Abkühlraten wie die Kontrollproben.

Die für 30 min bei 21 °C gehaltenen Proben zeigten nach der Haltezeit noch eine

Temperatur von 27,4 °C, nach weiteren 90 min bei 21 °C sank diese auf 22,7 °C.

Nach 60 min Halten ergab die Temperaturmessung 25,3 °C, nach den

anschließenden 90 min verringerte sich diese auf 22,1 °C. Sowohl die für 3 h und für

Ergebnisse

89

6 h gehaltenen Proben waren nach der Haltezeit mit 21,6 °C vollständig auf die

Umgebungstemperatur abgekühlt. Die Lagerungstemperatur wurde nach 245 min

(Kontrolle), 270 min (30 min Haltezeit), 292 min (60 min Haltezeit), 439 min (3 h

Haltezeit) und 625 min (6 h Haltezeit) erreicht.


Abb. 31: Temperaturverlauf der bei Experiment 4b einstufig isotherm verdünnten und anschließend bei 21 °C gehaltenen Proben. Mittelwerte von je 3 Samenproben. Diese wurden einstufig isotherm mit Beltsville Thawing Solution (BTS, 21 °C) ausverdünnt und in 100 ml Ebersamenflaschen abgefüllt. Die ausverdünnten Proben wurden bei 32 °C bzw. 21 °C gehalten (für 30 min, 60 min, 3 h und 6 h), und danach für weitere 90 min bei 21 °C gehalten und anschließend bei 17 °C gelagert. . Dargestellt sind der Temperaturverlauf der bei 21 °C gehaltenen Proben und die Kontrollproben. Die Klammern beschreiben den Verlauf der roten bzw. blauen Kurve. Die rote Kurve entspricht den Kontrollproben, die ohne Haltezeiten direkt weiterverarbeitet wurden. Die blaue Kurve entspricht den Proben, die nach der Ausverdünnung 3 h bei 21 °C gehalten wurde. Um die Grafik übersichtlicher zu gestalten wurde, auf die Darstellung der Haltezeiten bei 32 °C verzichtet. *Kontrolle = 0 min Haltezeit, direkte Messung und Abkühlung, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung


10

15

20

25

30

35

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

Tem

pera

tur

in °

C

Minuten

Kontrolle* 30 min Haltezeit 60 min Haltezeit

3 h Haltezeit 6 h Haltezeit


weitere Abkühlung und Lagerung bei 17 °C

Ausverdünnter Samen 3h Haltezeit bei 21 °C

90 min bei 21 °C


Ergebnisse

90


Abb. 32: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Dargestellt sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), Proben mit Haltetemperatur 32 °C (rote Säulen), und Proben mit Haltetemperatur 21 °C (rote Säulen). Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=6 Ejakulate. Klammer: Unterschiede zwischen Lagerungstagen für eine Verarbeitungsvariante. (p < 0,05; n=6) *Kontrolle = 0 min Haltezeit, direkte Messung und Abkühlung, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung



Nur die Parameter Gesamtmotilität, progressive Motilität, straightness, linearity und

wobble wurden von der Haltetemperatur beeinflusst (p < 0,05). Bei der Gesamt- und

progressiven Motilität konnten im Paarvergleich allerdings keine Unterschiede

festgestellt werden. Veränderungen bei straightness und linearity konnten nur am

Tag der Verdünnung bei den für 6 h gehaltenen Proben gemessen werden. Der

Parameter wobble zeigte diese bei den für 60 min gehaltenen Proben, ebenfalls an

d 0 (Tabelle 11).

Alle Motilitätsparameter, mit Ausnahme der ALH wurden durch die Lagerungsdauer

beeinflusst (p < 0,05). Bei der Gesamtmotilität (Abb. 32) konnten Veränderungen nur

bei der Kontrolle bzw. den bei 32 °C gehaltenen Proben ermittelt werden. Die

Kontrolle zeigte signifikante Unterschiede zwischen d 0 mit 93,4 ± 1,6 % und d 1 mit

89,9 ± 2,7 % beweglichen Spermien. Die für 60 min bei 32 °C gehaltenen Proben

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d1 d2 d3

Mo

tilit

ät in

%

Lagerungsdauer

Kontrolle

32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

*

Ergebnisse

91

zeigten eine Gesamtmotilität von 91,5 ± 3,2 % an d 0. Dieser Wert sank auf

86,4 ± 10,2 % nach 3 Tagen Lagerung. Die für 3 h gehaltenen Proben reduzierten

sich von 92,0 ± 3,7 % (d 1) auf 89,3 ± 3,9 % bewegliche Spermien an d 3.


Abb. 33: Prozentualer Anteil membranintakter (PI- und FITC-PNA negativer) Spermien (MW * SD) in Abhängigkeit von der der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Dargestellt sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), Proben mit Haltetemperatur 32 °C (rote Säulen), und Proben mit Haltetemperatur 21 °C (rote Säulen). Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=6 Ejakulate. Klammer: Unterschiede zwischen Lagerungstagen für eine Verarbeitungsvariante. (p < 0,05) *Kontrolle = 0 min Haltezeit, direkte Messung und Abkühlung, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung


Der Anteil der PI- und FITC-PNA-negativen (plasma- und akrosommembranintakter)

Spermien wurde sowohl von der Haltetemperatur als auch von der Lagerungsdauer

beeinflusst (p < 0,05). Bezüglich der Haltetemperatur konnten aber keine

signifikanten Veränderungen ermittelt werden (Abb. 33).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d0 d1 d3

Mem

bra

nin

takt

e Sp

erm

ien

in %

Lagerungsdauer

Kontrolle

32°C-30min

32°C-60min

32°C-3h

32°C- 6h

21°C-30min

21°C-60min

21°C-3h

21°C-6h

*

Ergebnisse

92

Während der Lagerungsdauer sank der Anteil der membranintakten Spermien im

Mittel nicht unter 90 %. Die Werte in der Kontrolle verringerten sich von 92,7 ± 1,7 %

an d 0 auf 91,7 ± 2,1 % an d 1.

Weitere Veränderungen wurden hauptsächlich bei den bei 32 °C gehaltenen Proben

festgestellt. Die für 60 min bei 32 °C gehaltenen Proben enthielten am Tag der

Verdünnung 92,6 ± 1,6 % membranintakte Spermien. Dieser Wert sank auf

91,2 ± 1,0 % (d 1) und 91,0 ± 2,5 % (d 3). Signifikante Veränderungen zeigte auch

die für 6 h gehaltene Probe mit 93,1 ± 0,9 % an d 0 und 90,9 ± 1,5 %

membranintakter Spermien nach 3 Tagen Lagerung.

Bei den bei 21 °C gehaltenen Proben zeigten sich signifikante Unterschiede der bei

3 h gehaltenen Proben von 93,3 ± 2,0 % (d 0) auf 91,8 ± 2,5 % (d 3).

4.6 Experiment 5: Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlung

des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung


Im Anschluss an die isotherme Ausverdünnung in 100 ml Ebersamenflaschen wurde

ein Teil der Proben gemäß ZDS-Empfehlungen zunächst 90 min bei 21 °C gehalten

und anschließend bei 17 °C gelagert (Kontrolle). Der andere Teil der Proben wurde

direkt nach der Ausverdünnung ohne weitere Haltezeit direkt bei 17 °C gelagert.

Die bei 21 °C gehaltenen Proben sanken während der ersten 90 min von 31,6 °C auf

23,7 °C. Der Temperaturrückgang pro Minute belief sich hier auf 0,13 ± 0,04 °C/ min

(0 – 30 min), 0,08 ± 0,05 °C/ min (31 – 60 min) und 0,05 ± 0,04 °C/ min (61 –

90 min).

In derselben Zeit verringerte sich die Temperatur der direkt bei 17 °C gehaltenen

Proben von 31,1 °C auf 20,6 °C. Die Abkühlraten betrugen 0,18 ± 0,05 °C/ min (0 –

30 min), 0,11 ± 0,05 °C/ min (31 - 60 min) und 0,07 ± 0,06 °C/ min (61 -90 min).

Die Lagerungstemperatur erreichten die Proben beider Abkühlungsverfahren

beinahe zeitgleich nach 246 min (Haltezeit bei 21 °C) und nach 252 min (direkte

Abkühlung bei 17 °C).


Ergebnisse

93

Abb. 34: Temperaturverlauf der bei Experiment 5 durchgeführten beschleunigten Abkühlung (32 °C – 17 °C) und der Abkühlung gemäß ZDS-Empfehlungen (32 °C – 21 °C – 17°C) der verdünnten Samenproben in 100 ml Ebersamenflaschen. Mittelwerte von je 3 Samenproben. Die Samenproben einstufig isotherm mit 32 °C warmer Beltsville Thawing Solution (BTS) auf die Endkonzentration 20 x 10

6 verdünnt. Anschließend kühlte ein Teil der Proben nach ZDS-Empfehlungen 90 min bei 21 °C

ab (blaue Kurve) und wurden bei 17 °C gelagert. Der andere Teil kühlte direkt nach der Verdünnung bei 17 °C ab (rote Kurve).

10

15

20

25

30

35

0 60 120 180 240

Tem

pera

tur

in °

C

Minuten

32°C - 21°C - 17°C 32°C - 17°C

direkte Lagerung bei 17 °C

90 min bei 21°C Lagerung bei 17°C

Ergebnisse

94


Abb. 35: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit der Abkühlraten und Lagerungsdauer; n=6 Ejakulate. Blaue Säulen: Abkühlung laut ZDS Empfehlungen; Nach Verdünnung mit 32 °C 90 min Abkühlung bei 21 °C, anschließend weitere Abkühlung und Lagerung bei 17 °C. Rote Säulen: Proben mit schneller Abkühlrate (Verdünnung bei 32 °C, direkte Abkühlung bei 17 °C)

Die Gesamtmotilität (Abb. 35) sowie die progressive Motilität wurden weder durch die

Art der Abkühlung noch durch die Lagerungsdauer beeinflusst. Die Werte bewegten

sich bei beiden Varianten in einem sehr engen Bereich.

Straightness (STR), linearity (LIN), wobble (WOB) und aplitude of lateral head-

displacement (ALH) wurden von der Lagerungsdauer beeinflusst (Tabelle 12).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d1 d3 d6

mo

tile

Sp

erm

ien

in %

Lagerungsdauer

Abkühlung 32 -21 - 17 Abkühlung 32 - 17

Ergebnisse

95


Abb. 36: Prozentualer Anteil membranintakter (PI- und FITC-PNA negativer) Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit der Abkühlrate und Lagerungsdauer. Blaue Säulen: Abkühlung laut ZDS Empfehlungen; Nach Verdünnung mit 32 °C 90 min Abkühlung bei 21 °C, anschließend Lagerung bei 17 °C. Rote Säulen: Proben mit schneller Abkühlrate (nach Verdünnung bei 32 °C direkte Abkühlung bei 17 °C); n=6 Ejakulate. a, b: Unterschiede zwischen Lagerungstagen (d1 – d6) innerhalb derselben Abkühlgruppe (p < 0,05)


akrosomenmembranintakter) Spermien wurde nur von der Lagerungsdauer

beeinflusst (p < 0,05).

Bei den Proben welche für 90 min bei 21 °C gehalten wurden reduzierte sich der

Anteil membranintakter Spermien von 86,8 ± 3,5 % nach 24 h auf 84,3 ± 3,5 % nach

72 h und auf 83,0 ± 2,7 % nach 144 h Lagerungsdauer.

Die direkt bei 17 °C abgekühlten Proben zeigten ähnliche Werte. An d 1 wurden

86,2 ± 3,3 % gemessen, dies erniedrigte sich auf 83,8 ± 2,9 % (d 3) und 81,3 ± 2,5 %

nach 6 Tagen Lagerung.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d1 d3 d6

Mem

bra

nin

takt

e Sp

erm

ien

in %

Lagerungsdauer

Abkühlung 32 -21 - 17 Abkühlung 32 - 17

a a b b b c

Ergebnisse

96

4.7 Experiment 6: Temperaturverlauf in der Prozesskette der

Samenverarbeitung auf einer Besamungsstation und Vergleich mit

Laborstandards


Der Temperaturverlauf der einstufig isothermen Verdünnung (Laborstandard) wurde

in Kapitel 4.5.1 beschrieben.

In der Besamungsstation wurden die Ejakulate nach Ankunft im Labor mit auf 32 °C

temperierten BTS vorverdünnt und während der mikroskopischen Untersuchung und

vor der Abfüllung im Mittel 28 min bei 21 °C gehalten und kühlten dabei auf 29,5 °C

ab. Die anschließende Ausverdünnung wurde mit einem auf 26 °C angewärmten

Verdünner durchgeführt, danach erfolgte die Abfüllung in die 80 ml Tuben. Nach der

Abfüllung war die Temperatur der Tuben auf 24,5 °C abgekühlt. Für die nächsten

2,5 h wurden 40 Tuben in einer Plastikbox bei 21 °C gehalten. Die außen liegenden

Tuben kühlten in dieser Zeit auf 22,4 °C mit einer durchschnittlichen Abkühlrate von

0,02 ± 0,08 °C/ min ab. Die inneren Tuben erreichten 23,2 °C mit einer Rate von

0,01 ± 0,04 °C/ min. Anschließend wurden die Boxen in einen auf 17 °C temperierten

Klimaschrank verbracht. Die nach Laborstandard verarbeiteten und einzeln

abgekühlten Proben erreichten nach 3 h bei 17 °C die Lagerungstemperatur mit einer

Abkühlrate von 0,025 °C/ min. Im selben Zeitraum erreichten die außen liegenden

Tuben in der Box 20,7 °C mit einer Abkühlrate von 0,014 °C/ min und die innen

liegenden Tuben 19,4 °C mit einer Abkühlrate 0,012 °C/ min.

Am Ende des Versuchs, 7 h nach Beginn der Temperaturmessung, betrug die

Temperatur der außen liegenden Tuben 19,4 °C, die der innen liegenden Tuben

18,5 °C.

Für die Simulation der Verarbeitung der Station wurden die Proben nach der

isothermen Vorverdünnung im Verhältnis 1:1 für 30 min bei 21 °C gehalten. Die

Temperatur der Ausverdünnung und weiteren Haltetemperaturen wurde wie oben

beschrieben durchgeführt. Das Halten der abgefüllten Proben erfolgte in einer

Plastikbox mit 40 auf 24 °C vortemperierten Tuben.


Ergebnisse

97

Abb. 37: Temperaturverlauf während der einstufig isothermen (Standard TiHo, schwarze Linie) und zweistufig hypothermen (Station, rote und blaue Linie) Samenverarbeitung bei Experiment 6. Beim Standard wurden die Proben direkt isotherm ausverdünnt, 90 min bei 21 °C einzeln gehalten und anschließend bei 17 °C gelagert. Bei der simulierten Verdünnung der Besamungsstation fand eine isotherme Vorverdünnung (1:1) statt, anschließend eine Haltezeit von 30 min bei 21 °C und mit BTS (26 °C) ausverdünnt. Nach der Abfüllung wurden 40 Tuben zusammen für 2,5 h in einer Plastikbox bei 21 °C gehalten und danach bei 17 °C gelagert. Die rote Linie zeigt den Temperaturverlauf mittig liegender Tuben, die blaue Line die Temperatur außen liegender Tuben; n=4 Ejakulate.

13

15

17

19

21

23

25

27

29

31

33

1 31 61 91 121 151 181 211 241 271 301 331 361 391

Tem

pera

tur

(°C

)

Zeit (min)

Standard TiHo Tuben mittig Tuben vorne

1:1 @ 21 °C Nach Abfüllung 40 Tuben/ Box bei 21°C Abkühlung/ Lagerung bei 17°C in Box

Ausverdünnt, einzeln 90 min bei 21 °C


Tuben außen

Ergebnisse

98


Abb. 38: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Verarbeitungsart und Lagerungsdauer; n=6 Ejakulate. Standard (blaue Säule): einstufig isotherme Verdünnung (32°C), Abfüllung in 100ml Flaschen, Haltezeit 90 min bei 21°C, Lagerung bei 17°C. Station (rote Säule): zweistufige Verdünnung (32 °C, 26 °C), Abfüllung in 100 ml Flaschen, Positionierung mittig im Bündel von 40 auf 26°C temperierten Besamungstuben, Haltezeit 2,5h bei 21°C, Lagerung bei 17 °C.

Bei der Gesamtmotilität (Abb. 38) konnten keine Unterschiede festgestellt werden.

Die progressive Motilität (Tabelle 15) zeigte Unterschiede nach 72 h und 144 h

Lagerungsdauer. Die Werte der nach dem Standard verdünnten Proben waren mit

81,3 ± 7,3 % (d 3) signifikant geringer als die der Proben, die nach der Methode der

Besamungsstation verdünnt wurden. Diese zeigten noch 85,3 ± 6,0 %

vorwärtsbewegliche Spermien. An d 6 war mit 73,3 ± 17,3 % (Standard) und

76,8 ± 18,2 % (Station) ein signifikanter Unterschied zu sehen.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d 1 d 3 d 6

motile

Sperm

ien in %

Lagerungsdauer

TiHo

Station

Standard

Ergebnisse

99


Abb. 39: Prozentualer Anteil membranintakter (PI- und FITC-PNA negativer) Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Verarbeitungsart und Lagerungsdauer; n=6 Ejakulate. Standard (blaue Säule): einstufig isotherme Verdünnung (32°C), Abfüllung in 100ml Flaschen, Haltezeit 90 min bei 21°C, Lagerung bei 17°C. Station (rote Säule): zweistufige Verdünnung (32 °C, 26 °C), Abfüllung in 100 ml Flaschen, Positionierung mittig im Bündel von 40 auf 26°C temperierten Besamungstuben, Haltezeit 2,5h bei 21°C, Lagerung bei 17 °C.

Die Werte der membranintakten Spermien bewegten sich bei beiden Varianten in

einem sehr engen Bereich. Signifikante Unterschiede konnten nicht ermittelt werden.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

d 1 d 2 d 3

Mem

bra

nin

takte

Sperm

ien in %

Lagerungsdauer

TiHo

Station

Standard

Ergebnisse

100

4.7.4 Spezifische Reaktivität gegenüber Bikarbonat (Calcium-Influx)

Abb. 40: Spezifische Reaktivität auf Bicarbonat berechnet anhand der Propidiumiodid-negativen (PI-neg.) und Fluo-3-negativen (Fluo-3-neg) Spermienpopulation nach 60 min Inkubationsdauer; n=6 Ejakulate. Darstellung der Werte (MW + SD) in Abhängigkeit von der Verarbeitungsart und Lagerungsdauer. Standard (blaue Säule): einstufig isotherme Verdünnung (32°C), Abfüllung in 100ml Flaschen, Haltezeit 90 min bei 21°C, Lagerung bei 17°C. Station (rote Säule): zweistufige Verdünnung (32 °C, 26 °C), Abfüllung in 100 ml Flaschen, Positionierung mittig im Bündel von 40 auf 26°C temperierten Besamungstuben, Haltezeit 2,5h bei 21°C, Lagerung bei 17 °C. a, b: signifikante Unterschiede (p < 0,05)

Nach 24 h Lagerung war die spezifische Reaktivität auf den Kapazitationsstimulus

Bikarbonat bei der Standard-Verarbeitung mit 31,7 ± 7,4 % signifikant niedriger als

bei der Verarbeitungsart der Station mit 40,3 ± 6,5 %.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

spez.

Reaktivität, %

Sperm

ien

d 1

Lagerungsdauer

Standard

Station

b

a

Diskussion

101

5 Diskussion

Aufgrund ihrer Membranzusammensetzung sind Eberspermien besonders

empfindlich gegenüber Abkühlung. Die Flüssigkonservierung ist deshalb noch immer

mit Schwierigkeiten verbunden. Die initialen Schritte der Samenverarbeitung sind

dabei maßgeblich für die Qualität des konservierten Samens.

Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von Haltezeiten zwischen 30 min

und 6 h bei 21 °C sowie 32 °C während der Frühphase der Konservierung auf die

Qualität gelagerten Eberspermas unter Anwendung gängiger Praxisverfahren zu

untersuchen. Dabei wurden neben spermatologischen Parametern, wie der Motilität

und Membranintegrität, mögliche Einflüsse auf den Energiestoffwechsel und das

bakterielle Wachstum betrachtet. Zusätzlich sollten praxisübliche

Verarbeitungsmethoden überprüft und Temperaturprofile während der


Bei der zweistufig isothermen Verdünnung mit einem auf 32 °C temperierten

Verdünnter verläuft, erwartungsgemäß und wie die Temperaturmessungen

bestätigen, die initiale Abkühlung der Samenproben langsamer, als bei der zweistufig

hypothermen Verdünnung. Bei letzterer wurde die erste Verdünnung ebenfalls mit

32 °C warmem Verdünner und die zweite Verdünnung mit auf 21 °C temperierten

Verdünner durchgeführt. Es ist seit langem bekannt, dass langsames Abkühlen die

Resistenz der Eberspermien gegen Kälteschock erhöht (PURSEL et al., 1972; 1973).

Die deshalb aufgestellte Hypothese, dass Samenproben, die zweistufig isotherm

verdünnt wurden, eine bessere Qualität während der Lagerung aufweisen als

hypotherm verdünnte Proben, konnte vor allem nach längerer Lagerungsdauer,

sowie bei höheren Verdünnungsgraden von 10 x 106 Spermien/ ml bestätigt werden

(Exp. 1). Die Gesamtmotilität war bei den hypotherm verdünnten Proben der

vorliegenden Studie mit ca. 5 % signifikant niedriger als bei den isotherm verdünnten

Proben. Eine mögliche Ursache für die erhöhte Empfindlichkeit ist, dass bei der

hohen Verdünnung der Samenproben auf 10 Millionen Spermien/ ml ein geringerer

Anteil von Seminalplasma in den Proben vorhanden ist. Es ist bekannt, dass

Diskussion

102

Seminalplasma einen stabilisierenden Effekt auf die Spermienmembran von

Eberspermien hat, der sich vor allem beim Abkühlen der Samenzellen zeigt (LEAHY

u. GADELLA, 2011). Signifikante Unterschiede zwischen hypothermer und

isothermer Verdünnung und der positive Einfluss der isothermen Verarbeitung

konnten in einem Feldversuch belegt werden (SCHULZE et al., 2013). Hier konnten

bei der isothermen Variante höhere mitochondriale Aktivität und höhere Akrosomen-

und Membranintegrität der Samenzellen ermittelt werden. Weiterhin erwiesen sich

die isotherm verdünnten Samenzellen zudem besser in einem Thermoresistenztest

als die hypotherm verdünnten Spermien, was auf eine hohe Stressresistenz des

isotherm verdünnten Samens schließen lässt.

Bei der vorliegenden Studie zeigten sich tendenziell nach sechs Tagen Lagerung

auch bei den Proben mit 20 x 106 Spermien/ ml Veränderungen der Gesamtmotilität

und der progressiven Motilität bei den hypotherm verdünnten Proben; die Werte

sanken um 9 % im Vergleich zu den isotherm verdünnten Proben. Ähnliche

Ergebnisse wurden bei der Membranintegrität deutlich. Bei den höher ausverdünnten

Proben deuten sich die Unterschiede an allen Lagerungstagen an.

Da zurzeit noch eine Spermienkonzentration von ca. 20 Millionen Spermien/ ml als

weltweiter Standard gilt, wurden die folgenden Experimente mit dieser Konzentration

durchgeführt. Es gibt allerdings eine Tendenz zur Reduktion der Spermienzahl pro

Besamungsportion. Da dadurch die Empfindlichkeit der Spermien erhöht werden

kann, muss dabei auf das Temperaturregime noch genauer geachtet werden. Neben

der Art der Verdünnung sind Haltezeiten eine weitere Möglichkeit die

Abkühlgeschwindigkeit zu reduzieren und die Adaptionszeit für die Zellen zu

verlängern. Die Hypothese, dass Haltezeiten bis zu 60 min bei 32 °C, im Gegensatz

zu Haltezeiten bei 21 °C, die Qualität des gelagerten Samens verbessern, konnte im

Experiment 2 mit Einschränkung bestätigt werden.

Während der gesamten Versuchsdauer wurde hoch standardisiert und mit Sperma

auf hohem Qualitätsniveau gearbeitet. Dies wurde vor allem nach längerer

Lagerungsdauer deutlich, denn an Tag 6 waren bei allen Samenproben noch über

80 % der Spermien motil. Unter anderen, weniger optimalen Voraussetzungen, wie

Diskussion

103

sie in der Praxis vorherrschen können, wie beispielsweise eberindividuelle

Kälteschocktoleranz, saisonal herabgesetzte Spermaqualität und höhere

Verdünnungsgrade bei hochkonzentriertem Nativsperma sind größere Abweichungen

der Messergebnisse zu erwarten. Die Haltetemperatur beeinflusste die Gesamt- und

progressive Motilität zwischen d 0 und d 3 (n=12), allerdings konnten nur marginale

signifikante Unterschiede gemessen werden.

Bei der Analyse der Subpopulationen weiterer kinematischer Parameter zeigte sich,

dass bei einigen Parametern Unterschiede des Bewegungsmusters zwischen den

frisch verdünnten Proben an d 0 und den gelagerten Proben auftraten. Vor allem die

für 6 h bei 21 °C gehaltenen Proben wichen an d 0 vom Kurvenverlauf der anderen

Proben ab. Am deutlichsten wurde dies bei den Parametern velocity curved line

(VCL), wobble (WOB), linearity (LIN) und straightness (STR). Bereits nach 24 h

Lagerungsdauer zeigten die Kurven einen einheitlicheren Verlauf. Die Ergebnisse

deuten auf einen so genannten „Verdünnungsschock“ hin, der durch eine initiale

Erhöhung der Zellaktivität charakterisiert ist, was zu Motilitätsverlust und

Membranschäden führen kann. Es gibt keine eindeutigen Erklärungen, aber es wird

vermutet, dass dies durch den plötzlichen Milieuwechsel hervorgerufen wird

(WATSON, 1995; JOHNSON et al., 2000). Der temporäre Einfluss der Verdünnung

an d 0 scheint sich vor allem bei den für 6 h bei 21 °C gehaltenen Proben zu zeigen.

Weiterhin wurden alle Proben nach der Haltezeit vor der Motilitätsmessung auf 38 °C

erwärmt. Die bei 21 °C gehaltenen Proben waren, im Gegensatz zu den anderen in

dieser Analyse berücksichtigten Proben, nach 6 h bereits auf 21 °C abgekühlt; die

erneute Erwärmung stellt einen zusätzlichen Einfluss auf die Samenzellen dar, der

aber offensichtlich ebenfalls temporär zu sein scheint.

Die Hypothese, dass sich Haltezeiten, bei 21 °C und vor allem bei 32 °C, von mehr

als 60 min negativ auf den Energiestoffwechsel auswirken, konnte nicht bestätigt

werden (Exp. 2). Der Adenylat-Gehalt der Spermien wurde weder unmittelbar nach

der Haltezeit noch nach Lagerung bis zu 144 h beeinflusst. Die vorliegende Studie

zeigte ebenfalls, dass Eberspermien über einen sehr effizienten Energiestoffwechsel

verfügen, der von Haltezeiten bis zu 6 h, Haltetemperatur bis zu 32 °C und der

Diskussion

104

Lagerung bei 17 °C über sechs Tage nicht beeinflusst wird. In der Literatur gibt es

unterschiedliche Angaben bezüglich der Stabilität des ATP-Gehalts während der

Lagerung. GOGOL et al. (2009) berichteten von einer Verringerung des ATP-Gehalts

während der Lagerung nach vier und sieben Tagen bei 15 °C. LONG und GUTHRIE

(2006) dagegen zeigten stabile Werte über fünf Tage Lagerungsdauer bei 17 °C. Es

ist allerdings schwierig, die Ergebnisse der ATP-Analysen unterschiedlicher Studien

zu vergleichen, da unterschiedliche Methoden angewendet wurden.

Die Energieladung (EC) zeigte sich während der Versuche der vorliegenden Studie

als sehr stabil; während der gesamten Versuchsdauer wurde dieser Parameter nicht

von der Haltezeit, -temperatur oder Lagerungsdauer beeinflusst und der Wert von 0,6

wurde nicht unterschritten. Dies bestätigt die Aussage von CHULAVATNATOL et al.

(1977), die bei humanen Samenzellen zeigten, dass die Energieladung auch unter

Stressbedingungen stabil bleibt. Die Beobachtung von KAMP et al. (2003), dass

eine Haltezeit von 60 min bei 35 °C einen Abfall der Energieladung auf 0,3

verursachte, konnte in den eigenen Versuchen nicht bestätigt werden. Die

Energieladung sank wie oben erwähnt auch nach einer Haltezeit 6 h bei 32 °C nicht

unter 0,6. Vermutlich ist dieser Unterschied durch die Verfügbarkeit von Sauerstoff

für die Samenzellen erklärbar. Die Haltezeiten erfolgten in der vorliegenden Studie

unter aeroben Bedingungen, bei KAMP et al. (2003) dagegen fanden diese unter

anaeroben Bedingungen statt. Vor allem bei höheren Temperaturen scheint die

Sauerstoffzufuhr essentiell für den Energiehaushalt der Samenzellen zu sein, da bei

der anaeroben Lagerung der Samenproben bei 15 – 17 °C Werte um 0,6 gemessen

werden konnten.

Um die mitochondriale ATP-Produktion aufrechtzuerhalten, ist ein elektrochemischer

Protonengradient innerhalb der Mitochondrien notwendig. Dieses sogenannte

mitochondriale Membranpotential (MMP) entsteht bei der Elektronenkopplung

innerhalb der oxidativen Phosphorylierung (CRAMER u. KNAFF, 1990).

Durchflusszytometrisch konnten lebende Zellen mit hohem MMP von denen mit

niedrigem MMP, also mit weniger bis nicht aktiven Mitochondrien mit Hilfe des

Farbstoffs JC-1 unterschieden werden (COSSARIZZA et al., 1993). Das MMP wurde

Diskussion

105

in den eigenen Versuchen weder von der Haltezeit noch von der Haltetemperatur

beeinflusst.

Die Qualität der Samenproben hängt nicht nur von der Vitalität der Samenzellen ab,

sondern ist auch abhängig vom mikrobiellen Status, der vor allem durch das Halten

bei höheren Temperaturen beeinflusst werden könnte. Durch das natürliche

Vorkommen von Bakterien im männlichen Genitaltrakt und möglichen Keimeintrag

aus der Umwelt ist es unvermeidlich, dass Ejakulate bakteriell belastet sind.

Bakteriospermie kann zu Reduktion der Motilität, Membranschäden und vermehrter

Agglutination der Zellen führen. Der negative Einfluss der Bakterien ist abhängig von

der Keimart und -konzentration und kann die Haltbarkeit der Portionen beeinflussen

(ALTHOUSE u. LU, 2005).

Da sich die Wachstumsrate von Bakterien durch Inkubation bei Temperaturen nahe

der Körpertemperatur rasant erhöhen kann (ALTHOUSE et al., 2008), war eine

Hypothese, dass sich eine Inkubation bei 32 °C von im Verhältnis 1:1 verdünnten

Ejakulaten negativ auf die mikrobielle Qualität der Samenproben auswirkt, zumal bei

einer Verdünnung in diesem Verhältnis nur eine geringe Konzentration des

Antibiotikums im Verdünner vorliegt (Exp. 2). Diese Annahme konnte jedoch nicht

bestätigt werden. Im frischen Ejakulat befanden sich im Mittel erwartungsgemäß ca.

5 x 104 KbE/ ml. Nach 60 min Haltezeit war der Keimgehalt bei 32 °C und 21 °C im

Vergleich zur Kontrolle unverändert und sogar nach 6 h Haltezeit blieben die Werte

bei beiden Temperaturen im geringgradigen Bereich von unter 1 x 103 KbE/ ml. In

den ausverdünnten Proben wurde nach drei Tagen Lagerungsdauer weder bei den

Kontrollproben noch bei den für 60 min gehaltenen Proben (beider Temperaturen)

Keimwachstum festgestellt. Die Werte der für 6 h gehaltenen Probe wiesen einen

geringgradigen Keimgehalt von 138 KbE/ ml (32 °C) und 50 KbE/ ml (21 °C) auf.

Berücksichtigt werden muss, dass das Keimspektrum hinsichtlich

Wachstumstemperaturoptimum und Antibiotika-Empfindlichkeit variieren kann. Bei

resistenten Bakterien muss davon ausgegangen werden, dass sich eine Haltezeit,

vor allem bei 32 °C, negativ auf die mikrobielle Qualität auswirkt. Resistente Keime

stellen aber ohnehin in der Ebersamenverarbeitung und –lagerung ein Problem dar;

Diskussion

106

ein vermehrtes Wachstum ist auch ohne Haltezeiten zu erwarten (ALTHOUSE et al.,

2008).

Die Hypothese, dass die Ausverdünnung mit einem im Vergleich zur Samenprobe

hyperthermen Verdünner (32 °C) einen negativen Einfluss auf die Samenqualität hat

konnte nicht bestätigt werden (Exp. 3). Die Temperaturerhöhungen von Proben, die

bereits 28 – 21 °C abgekühlt waren, scheinen keine großen Veränderungen der

Membranen zu verursachen. Lediglich Proben, die bereits vollständig auf 21 °C

abgekühlt waren, zeigten bei langer Lagerung (144 h) leicht verringerte Werte der

membranintakten Spermien, was auf eine ausgeprägte Toleranz der Spermien

gegenüber höheren Temperaturen hinweist.

Die Hypothese, dass Haltezeiten von 30 min, 60 min, 3 h und 6 h bei 21 °C und

32 °C auf die bereits ausverdünnten Samenproben einen positiven Einfluss haben,

konnte ebenfalls nicht bestätigt werden (Exp. 4). Die Haltezeiten hatten keinen

Einfluss auf die standardspermatologischen Parameter. Ein Einfluss der

Haltetemperatur auf Motilitätsparameter konnte bei den Proben, die nach einstufig

isothermer (Exp. 4 b) oder zweistufig hypothermer (Exp. 4 a) Ausverdünnung

gehalten wurden nur tendenziell gezeigt werden.

PURSEL et al. (1973 a) stellten fest, dass die Proben, die vor den Haltezeiten

ausverdünnt wurden, eine höhere Kälteschockempfindlichkeit aufwiesen, als Proben,

die erst nach den Haltezeiten ausverdünnt wurden. Die Autoren schlossen daraus,

dass durch die Verdünnung die Kälteempfindlichkeit begünstigt werden kann und mit

der Ausbildung der Kälteschockresistenz interferiert. In den Versuchen der

vorliegenden Studie konnte dieser Unterschied nicht bestätigt werden. Ein direkter

Vergleich zu den Versuchen von PURSEL et al. (1973) ist aber schwer zu ziehen, da

die Versuchsbedingungen von denen der vorliegenden Studie abwichen. Der größte

Unterschied ist, dass die Autoren den Kälteschock bei 5 °C bei einem Aliquot von nur

1 ml durchführten. Damit induzierten sie drastischere Effekte, die sich in einem

drastischen Motilitätsverlust widerspiegeln (max. Motilität: 55 %). In der vorliegenden

Studie galt es jedoch, den Einfluss subtiler Temperaturabsenkungen, wie sie unter

Diskussion

107

Praxisbedingungen gegeben sind, mit einem erweiterten Methodenspektrum zu

untersuchen. Es wurden bei keiner Probe weniger als 80 % bewegliche Spermien

gemessen; die Motilität ist demnach ein robuster Parameter unter den vorliegenden

Versuchsbedingungen.

Die Hypothese, dass eine schnelle Abkühlrate einstufig isotherm verdünnter

Samenproben während der Frühphase der Konservierung einen negativen Einfluss

auf die Qualität der gelagerten Samenproben hat, konnte tendenziell bestätigt

werden (Exp. 5). Die ermittelten Werte lagen auch bei diesem Versuch auf einem

sehr hohen Niveau, so dass sich entgegen früheren Versuchen keine signifikanten

Unterschiede zeigten. Die schnelle Abkühlrate, die durch die direkt an die

Ausverdünnung anschließende Haltezeit bei 17 °C hervorgerufen wurde, verringerte

die Motilität nach 144 h Lagerung um 6 % im Vergleich zur Messung nach 72 h. Im

gleichen Zeitraum verringerte sich bei den langsam abgekühlten Proben die Motilität

nur um 3 %. Zahlenmäßig deutlicher wurde der Unterschied bei der progressiven

Motilität, die in diesem Zeitraum durch die schnelle Abkühlung um 13 % abnahm.

Ähnliche Tendenzen zeigten sich in der Membranintegrität der Samenzellen.

Dass bei Lagerungstemperaturen unter 17 °C der Einfluss von Haltezeiten deutlicher

wird, zeigten PURSEL et al. (1973 b). Es ist außerdem anzunehmen, dass

beispielsweise durch eberindividuelle Unterschiede und weniger standardisierte

Bedingungen bei Temperatur- und Zeitmanagement größere Unterschiede messbar

sind.

In einem Feldversuch konnte gezeigt werden, dass bei Besamungsstationen, die die

zweistufig hypotherme Verdünnung anwenden, die Temperatur des zweiten

Verdünners zwischen 21 °C und 27 °C variierte (SCHULZE et al., 2013). Bei der in

der vorliegenden Studie beteiligten Besamungsstation wurde die zweite Verdünnung

mit einem auf 26 °C temperierten Verdünner durchgeführt. Eine Aussage darüber, ob

die hypotherme Verdünnung in der Praxis zur Qualitätsminderung der

Samenportionen führt, konnte deshalb im eigenen Praxisversuch (Exp. 6) nur

eingeschränkt getroffen werden. Da das vorverdünnte Sperma zu diesem Zeitpunkt

Diskussion

108

eine Temperatur von 29,5 °C aufwies, entsprach das Vorgehen nicht einer mit dem

eigenen Laborstandard vergleichbaren hypothermen Verdünnung. Ein weiterer

Unterschied bestand darin, dass die Tuben nicht wie im Labor einzeln mit Abstand

zueinander, sondern alle Tuben eines Ebers (20 – 60 Stück) in einer Plastikbox

liegend abkühlten. Im Vergleich zum Temperaturverlauf im Labor wird deutlich, dass

die Samenproben in der Station deutlich langsamer abgekühlt wurden. Vor allem die

Temperatur der Tuben, die sich in der Mitte der Box befanden, differierte zeitweise

bei gleicher Versuchsdauer bis zu 5 °C im Vergleich zur einstufig isothermen

Verdünnung im Labor. Die außen liegenden Tuben kühlten etwas schneller ab, aber

auch hier wurde während der Versuchsdauer von ca. 7 h die Lagerungstemperatur

nicht erreicht.

Bei dem im Labor nachgestellten Vergleich waren die Membranintegrität und die

Gesamtmotilität bei der langsameren Abkühlung in der Praxis tendenziell besser als

beim Laborstandard, bei der progressiven Motilität konnten nach drei Tagen

Lagerung sogar signifikante bessere Ergebnisse bei der Praxisvariante gemessen

werden. Zudem war die spezifische Reaktivität der Spermien auf den

Kapazitatationstimulus Bicarbonat, die wie in der Besamungsstation verarbeitet

wurden, nach 24 h Lagerung um 9 % höher als bei der Standardverarbeitung des

Labors. Insgesamt kann also gesagt werden, dass die langsamere Abkühlung der

gebündelten Samenportionen unter Praxisbedingungen vorteilhafter ist für die

Samenqualität als der Laborstandard.

Bei den vorliegenden Experimenten wurde akribisch auf die Einhaltung eines

standardisierten Temperaturverlaufs geachtet. Temperaturprofile von Eberejakulaten

während der Samenverarbeitung sind in der Literatur bisher nur sehr spärlich

beschrieben. Ein Augenmerk dieser Arbeit lag deshalb darauf, den Verlauf der

Abkühlung jeder Verarbeitungsvariante im Labor zu dokumentieren. Weiterhin wurde

die Temperaturkurve der Standardverarbeitungsvariante unter Laborbedingungen mit

dem Temperaturverlauf der Verarbeitung in einer Besamungsstation unter

Praxisbedingungen verglichen. Ein wesentlicher Unterschied zwischen der

Spermaverarbeitung unter Standardbedingungen im Labor und in

Diskussion

109

Besamungsstationen liegt in der Aufbereitung der Anzahl von Besamungsportionen

pro Ejakulat und dem anschließender Versand.

Wie bereits erwähnt, ist ein Argument für die zweistufig hypotherme Verdünnung in

der Praxis, dass der schnellere Temperaturabfall, der durch den zweiten, um ca.

10 °C kälteren Verdünner hervorgerufen wird, dazu führt, dass die

Lagerungstemperatur von 17 °C schneller erreicht wird. Dadurch soll der Versand

zeitnah zur Verarbeitung bei konstanter Temperatur ermöglicht werden und das

Risiko von bakteriellem Wachstum gesenkt werden. Zusätzlich werden durch die

niedrigere Temperatur Energiekosten eingespart. Außerdem scheint es die

Erwartungshaltung einiger Landwirte zu geben, dass frische Samenproben bei

Ankunft auf dem Betrieb auf 17 °C abgekühlt sein müssen und wärmere

Probentemperaturen einen Qualitätsmangel bedeuten können.

Die Temperaturmessungen des Laborstandards ergaben allerdings, dass trotz des

schnellen Abfalls bei der hypothermen Verdünnung eine Temperatur von 20 °C nicht

vorzeitig, sondern zeitgleich mit der isothermen Verdünnung nach 150 min erreicht

wird (Exp. 1). Folglich wurde die Lagerungstemperatur ebenfalls nach der gleichen

Zeitspanne erreicht. Erklärbar ist dies, da nach der hypothermen Verdünnung die

Temperatur der Proben (23 °C) relativ nahe der Umgebungstemperatur (21 °C) ist.

Dadurch verringert sich deren Abkühlrate und die Zeitspanne bis zum Erreichen der

Temperatur verlängert sich.

Das gleiche Bild zeigte sich sogar bei den Proben, die direkt nach der isothermen

Verdünnung bei 17 °C, statt zunächst bei 21 °C, abgekühlt wurden (Exp. 5). Sie

erreichten zeitgleich mit den Proben, die zunächst 90 min bei 21 °C und erst dann

bei 17 °C gelagert wurden, die Lagerungstemperatur von 17 °C nach ca. 210 min.

Schlussfolgernd sind Haltezeiten bis zu 60 min des 1:1 vorverdünnten als auch des

ausverdünnten Samens, zwischen 21 °C und 32 °C, vorteilhaft für die Samenqualität.

Temperaturen von 32 °C beeinträchtigen die Samenqualität nicht. Das Halten des

1:1 verdünnten Samens bis zu 6 h bei 32 °C hatte dabei keinen Einfluss auf den

Energiestoffwechsel der Spermien während der Lagerung. Allerdings könnten

Diskussion

110

Haltezeiten über 60 min je nach Keimbelastung und Bakterienart der Proben kritisch

für den Keimgehalt während der Lagerung sein.

Entgegen bisheriger Annahmen, führt hypotherme Verdünnung von Eberspermien,

mit auf 21 °C temperierten Verdünner, weder zum schnellen Erreichen der

Lagerungstemperatur, geringerer Keimzahl noch zu höherem Energiegehalt der

Spermien. Da nachgewiesen werden konnte, dass isotherme Verdünnung und ein

langsames Abkühlen zu verbesserter Qualität der Besamungsportionen führt, sollte

die Erwartungshaltung der Landwirte dementsprechend korrigiert werden. Der

Nachteil, dass das Erwärmen des Verdünners für die isotherme Verdünnung die

Energie- und damit Produktionskosten erhöht, könnte durch die bessere

Produktqualität und Kundenzufriedenheit ausgeglichen werden.

Zusammenfassung

111

6 Zusammenfassung

Ulrike Wallner (2015):

Einfluss von Haltezeiten während der Frühphase der Konservierung auf den

Energiemetabolismus und die Qualität von Eberspermien

Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von Haltezeiten zwischen 30 min

und 6 h bei 21 °C sowie 32 °C während der Frühphase der Konservierung auf die

Qualität gelagerten Eberspermas unter Anwendung gängiger Praxisverfahren zu

untersuchen. Dabei wurden neben spermatologischen Parametern, wie der Motilität

und Membranintegrität, mögliche Einflüsse auf den Energiestoffwechsel und das

bakterielle Wachstum betrachtet. Zusätzlich sollten die praxisüblichen

Verarbeitungsmethoden überprüft und Temperaturprofile während der


Es wurden sechs Experimente durchgeführt. Bei allen Experimenten wurden die

Motilität der Spermien mittels CASA und der Anteil membranintakter Spermien

mittels Durchflusszytometrie bestimmt. In Experiment 2 wurde zudem mit dem

Fluoreszenzfarbstoff JC-1 durchflusszytometrisch das Mitochondrienmembran-

potential ermittelt, sowie der Nukleotidgehalt (ATP, ADP, AMP) und die

Energieladung der Samenzellen gemessen. Ein weiteres Augenmerk wurde darauf

gelegt, den genauen Verlauf der Abkühlung jeder Verarbeitungsvariante im Labor zu

dokumentieren.

Im ersten Experiment wurden zunächst die zweistufig isotherme Verdünnung mit der

zweistufig hypothermen Verdünnung bei zwei Verdünnungsgraden,

10 x 106 Spermien/ ml und 20 x 106 Spermien/ ml verglichen. Während der Lagerung

bei 17 °C wiesen die isotherm verdünnten Proben eine bessere Qualität auf. Dies

zeigte sich vor allem beim höheren Verdünnungsgrad.

In den Experimenten 2 bis 4 wurden daraufhin die Auswirkungen von Haltezeiten für

30 min, 60 min, 3 h und 6 h bei 32 °C und 21 °C bei verschiedenen

Verarbeitungsbedingungen geprüft. Die Haltezeiten beeinträchtigten dabei die

Spermienqualität, den Adenylat-Gehalt sowie das Mitochondrienmembranpotential

nicht. Dies deutet darauf hin, dass Eberspermien über einen sehr effizienten

Zusammenfassung

112

Energiestoffwechsel verfügen. Das Keimwachstum wurde durch die Haltezeiten bis

zu 60 min des 1:1 verdünnten Samens nicht negativ beeinflusst.

Im fünften Experiment wurden die Auswirkungen einer beschleunigten Abkühlrate

des ausverdünnten Samens nach isothermer Verdünnung untersucht. Die schnelle

Abkühlrate bei einer direkten Abkühlung bei 17 °C wirkte sich tendenziell negativ auf

die Motilität aus. Allerdings wurden hier aufgrund des hohen spermatologischen

Niveaus nur geringe Schwankungen der Werte ermittelt.

Im abschließenden Experiment wurde im ersten Schritt der Temperaturverlauf der

Prozesskette der hypothermen Samenverarbeitung auf einer Besamungsstation mit

dem Verlauf des isotherm durchgeführten Laborstandards verglichen. Die

Samenportionen in der Besamungsstation kühlten aufgrund der höheren Temperatur

der Verdünner und der Abkühlung in Bündeln von ca. 40 – 60 Tuben langsamer ab

als die des Laborstandards. Im zweiten Schritt wurden die beiden

Verarbeitungsverfahren im Hinblick auf die Spermienqualität verglichen, wobei die

Motilität und Membranintegrität sich bei der langsamen Abkühlung der

Besamungsstation als tendenziell besser erwiesen.

Die Temperaturmessungen der Verdünnungsverfahren ergaben bei dem Vergleich

der zweistufig hypothermen mit der zweistufig isothermen Verdünnung, dass

entgegen den Erwartungen durch den hypothermen Verdünner, eine schnellere

Abkühlung auf die Lagerungstemperatur nicht erreicht wird. Bei beiden Methoden

wurde diese nach der gleichen Zeitspanne erreicht.

Schlussfolgernd sind Haltezeiten bis zu 60 min bei 32 °C und 21 °C sowohl des 1:1

vorverdünnten als auch des ausverdünnten Samens vorteilhaft für die Samenqualität;

verlängerte Haltezeiten führen nicht zum Energiedefizit der konservierten Spermien.

Allerdings könnten Haltezeiten über 60 min je nach Keimbelastung und Bakterienart

kritisch für den Keimgehalt während der Lagerung sein. Es konnte nachgewiesen

werden, dass eine isotherme Verdünnung und ein langsames Abkühlen zu einer

verbesserten Qualität der Besamungsportionen führt. Das derzeit in der Praxis noch

häufig durchgeführte zweistufig isotherme Verfahren ist aus spermatologischer Sicht

nicht empfehlenswert.

Summary

113

7 Summary

Ulrike Wallner (2015):

Effect of holding times during early stage of preservation on energy

metabolism and quality of boar spermatozoa

The aim of the present study was to test the effect of holding times between 30 min

and 6 h at 21 °C as well as 32 °C during the early stage of semen preservation on

semen quality during storage. Spermatology parameters such as motility and

membrane integrity as wells as possible influences on energy metabolism and

bacterial growth were examined. Additionally, current routine procedures in artificial

insemination (AI) laboratories were reviewed and temperature curves during semen

processing were determined.

In total, six experiments were performed. In all experiments the sperm motility was

determined by CASA and the proportion of membrane intact sperm was analyzed

using flow cytometry. In the second experiment, additionally the mitochondrial

membrane potential was determined by flow cytometry using the fluorescent dye

JC-1. Moreover, the content of nucleotides (ATP, ADP and AMP) and the energy

charge of the sperm cells were measured. Special attention was paid to document

the exact cooling curves for each variation of semen processing in all laboratory

experiments.

In the first experiment the two-step isothermic dilution was compared with the two-

step hypothermic dilution using two dilution rates, namely 10 x 106 sperm/ ml and

20 x 106 sperm/ ml. As a result, isothermic diluted samples showed a higher semen

quality during storage at 17 °C, especially at higher dilution level.

In Experiments 2 to 4 the effects of holding times for 30 min, 60 min, 3 h and 6 h at

32 °C and 21 °C were examined using different processing conditions.

Holding times neither had influence on semen quality nor on adenylate content and

mitochondrial membrane potential. This suggests that boar sperm energy metabolism

is very efficient. Bacterial growth was not negatively affected by holding times of the

1:1 pre-diluted semen up to 60 min.

Summary

114

In the fifth experiment, the effect of an accelerated cooling rate after isothermic

dilution semen was studied. Rapid cooling rates to the storage temperature at17 °C

tend to show adverse effects on motility. However, due to the high sperm quality level

only minor variations between the experimental groups were found.

In the sixth experiment the temperature profile of hypothermically processed semen

in an AI center was compared with the profile of the isothermically processed

laboratory standard. Due to the higher temperature of the diluent and the packing of

40 to 60 semen tubes in bundles, semen doses in the AI-center cooled down slower

than the single tube samples used in the laboratory standard. In the second step of

this experiment, the two methods were compared in terms of semen quality. The

results showed that semen processed with a slower cooling rate as in the AI-center

tend to have better motility parameters and membrane integrity compared to the

laboratory standard.

Contrary to expectations, the comparison of the temperature profiles of two-step

isothermic and two-step hypothermic dilution showed that hypothermic diluted

samples did not reach the final storage temperature earlier. Thus, in both dilution

methods, the storage temperature of 17°C was reached after the same period of

time.

In conclusion, holding times up to 60 min at 32 °C and 21 °C of prediluted semen and

semen diluted to final concentration are beneficial for semen quality; prolonged

holding times do not impair energy metabolism of stored semen. However,

depending on germ load and the bacterial species, prolonged holding times up to 6 h

may lead to moderately increased bacterial growth during storage. It is demonstrated

that isothermic dilution and retarded cooling results in higher sperm quality. As a

consequence, the in AI practice commonly used two-step isothermic method is no

longer recommended.

Literaturverzeichnis

115

8 Literaturverzeichnis

ALTHOUSE, G., M. WILSON, C. KUSTER, u. M. PARSLEY (1998): Characterization of lower temperature storage limitations of fresh-extended porcine semen. Theriogenology, 50, 535–543 ALTHOUSE, G.C. u. K.G. LU (2005): Bacteriospermia in extended porcine semen. Theriogenology, 63, 573–84 ALTHOUSE, G.C., M.S. PIERDON u. K.G. LU (2008): Thermotemporal dynamics of contaminant bacteria and antimicrobials in extended porcine semen. Theriogenology, 70, 1317–1323 ARMSTRONG, J.S., M. RAJASEKARAN, W. CHAMULITRAT, P. GATTI, W.J. HELLSTROM, u. S.C. SIKKA (1999): Characterization of reactive oxygen species induced effects on human spermatozoa movement and energy metabolism. Free Rad. Biol. Med., 26, 869-880 ATKINSON, D.E. (1968): The energy charge of the adenylate pool as a regulatory parameter. Interaction with feedback modifiers. Biochemistry, 7, 4030–4034 ATKINSON, D.E. u. G.M. WALTON (1967): Communications : Adenosine Triphosphate Conservation in Metabolic Regulation: Rat liver citrate cleavage enzyme. J. Biol. Chem., 242, 3239-3241 BOHNENSACK, R. u. W. HALANGK (1986): Control of respiration and of motility in ejaculated bull spermatozoa. Biochim. Biophys. Acta, 850, 72–79 BUTLER, W.J. u. T.K. ROBERTS (1975): Effects of some phosphatidyl compounds on boar spermatozoa following cold shock or slow cooling. J. Reprod. Fertil., 43, 183–187 CANVIN, A.T. u. M.M BUHR (1989): Effect of temperature on the fluidity of boar sperm membranes. J. Reprod. Fertil., 85, 533–540


116

CASAS, I. u. G.C. ALTHOUSE (2013): The protective effect of a 17°C holding time on boar sperm plasma membrane fluidity after exposure to 5°C. Cryobiology, 1, 69-75 CEROLINI, S., A. MALDJIAN, P. SURAI, u. R. NOBLE (2000): Viability, susceptibility to peroxidation and fatty acid composition of boar semen during liquid storage. Anim. Reprod. Sci., 58, 99-111 CHAPMAN, A.G., L. FALL, E. ATKINSON, u. D.E. ATKINSON (1971): Adenylate energy charge in escherichia coli during growth and starvation. J. Bacteriol., 108, 1072–1086 CHULAVATNATOL, M. u. A. HAESUNGCHARERN (1977): Stabilistation of adenylate energy charge and its relation to human sperm motility. J. Biolog. Chem., 22, 8088-8091 COSSARIZZA, A., M., BACCARANI-CONTRI, G. KALASHNIKOVA, C. FRANCESCHI, (1993): A new method for the cytofluorimetric analysis of mitochondrial membrane potential using the j-aggregate forming lipophilic cation 5,5’-6,6'-tetrachloro-1,1',3,3' tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1). Biochemical and biophysical research communications, 197, 40-45 CRAMER W. u. D. KNAFF (Hrsg.) (1990): Energy transduction in biological membranes. A textbook of bioenergetics. Springer-Verlag New York, Inc DARIN-BENNETT, A. u. I.G. WHITE (1977): Influence of the cholesterol content of mammalian spermatozoa on susceptibility to cold-shock. Cryobiology, 14, 466–470 DE LEEUW, F.E., B. COLENBRANDER, u. A.J. VERKLEIJ (1991): The role membrane damage plays in cold shock and freezing injury. Reprod. Domest. Anim., Suppl.1, 95 – 104 DE LEEUW, F.E., H.C. CHEN, B. COLENBRANDER, u. A.J. VERKLEIJ (1990): Cold-induced ultrastructural changes in bull and boar sperm plasma membranes. Cryobiology, 27, 171–183 DROBNIS, E.Z., L.M. CROWE, T. BERGER, T.J. ANCHORDOGUY, u. J.W. OVERSTREET, u. J.H. CROWE (1993): Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: A demonstration using sperm as a model. J. Exp. Zool., 265, 432–437


117

DZIEKONSKA, A., L. FRASER u. J. STRZEZEK (2009): Effect of different storage temperatures on the metabolic activity of spermatozoa following liquid storage of boar semen. J. Anim. Feed. Sci., 18, 638-649 ERIKSSON, B.M., J.M. VAZQUEZ, E.A. MARTINEZ, J. ROCA, X. LUCAS, u. H.R. MARTINEZ (2001): Effects of holding time during cooling and of type of package on plasma membrane integrity, motility and in vitro oocyte penetration ability of frozen-thawed boar spermatozoa. Theriogenology, 55, 1593–1605 FAWCETT, D.W. (1975): The Mammalian Spermatozoon. Dev. Biol., 7, 394–436 FORD, S.R. u. F.R. LEACH (1998): Bioluminescent assay of the adenylate energy charge. Methods Mol. Biol., 102, 69–81 FORD, W.C.L. (2006): Glycolysis and sperm motility: Does a spoonful of sugar help the flagellum go round? Hum. Reprod. Update, 12, 269–274 GOGOL, P., B. SZCZESNIAK-FABIANCZYK u. A. WIERZCHOS-HILCZER (2009): The photon emission, ATP level and motility of boar spermatozoa during liquid storage. Reprod. Biol., 9, 39-49 GUTHRIE, H.D. u. G.R. WELCH (2005): Impact of storage prior to cryopreservation on plasma membrane function and fertility of boar sperm. Theriogenology, 63, 396–410. GUTHRIE, H.D., G.R. WELCH u. J.A. LONG (2008): Mitochondrial function and reactive oxygen species action in relation to boar motility. Theriogenology, 70, 1209-1215 HENNING, H., A.M. PETRUNKINA, R.A.P. HARRISON u. D. WABERSKI (2012): Bivalent response to long-term storage in liquid-preserved boar semen: a flow cytometric analysis. Cytometry Part A, 81 A, 576-587 JOHNSON, L.A., K.F. WEITZE, P. FISER u. W.M. MAXWELL (2000): Storage of boar semen. Anim. Reprod. Sci., 62, 143–72


118

KAMP, G., G. BÜSSELMANN, N. JONES, B. WIESNER u. J. LAUTERWEIN (2003): Energy metabolism and intracellular pH in boar spermatozoa. Reproduction, 126, 517-525 KUMARESAN, A., G. KADIRVEL, K.M BUJARBARUAH, R.K.BARDOLOI, A. DAS, S.KUMAR, u. S. NASKAR (2009): Preservation of boar semen at 18 °C induces lipid peroxidation and apoptosis like changes in spermatozoa. Anim. Reprod. Sci., 110, 162-171 LADBROOKE, B.D. u. D. CHAPMAN (1969): Thermal analysis of lipids, proteins and biological membranes. A review and summary of some recent studies. Chem. Phys. Lipids, 3, 304–56 LEAHY, T. u. B.M. GADELLA (2011): Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction, 142, 759–778 LONG, J. A. u. H.D. GUTHRIE (2006): Validation of a rapid, large-scale assay to quantify ATP concentration in spermatozoa. Theriogenology, 65, 1620–1630 LONG, J. u. H. GUTHRIE (2006): Validation of a rapid, large-scale assay to quantify ATP concentration in spermatozoa. Theriogenology, 65, 1620-1630 LÓPEZ RODRÍGUEZ A., T. RIJSSELAERE, P. VYT, A. VAN SOOM, u. D. MAES (2012): Effect of dilution temperature on boar semen quality. Reprod. Dom. Anim., 47, e63–e66 MARIN, S., K. CHIANG, S. BASSILIAN, W.N.P. LEE, L.G. BOROS, J.M. FERNÁNDEZ-NOVELL, J.J. CENTELLES, A. MEDRANO, J.E. RODRIGUEZ-GIL, u. M. CASCANTE (2003): Metabolic strategy of boar spermatozoa revealed by a metabolomic characterization. FEBS Lett., 554, 342–346 MIKI, K., (2007): Energy metabolism and sperm function. in: E.R.S. ROLDAN u. M. GOMENDIO (Hrsg.): Spermatology, Proceedings of the 10th international Symposium on Spermatology, Madrid. Verlag Nottingham University Press, Nottingham, UK S. 309–325


119

MISRO, M.M. u. T. RAMYA, (2012): Fuel/ Energy Sources of Spermatozoa, In: S.J. PAREKATTIL u. A. AGARWAL (Hrsg.): Male fertility Verlag Springer, Heidelberg S. 209-223 NIKOLOPOULOU, M., D.A. SOUCEK, u. J.C. Vary (1985): Changes in the lipid content of boar sperm plasma membranes during epididymal maturation. Biochim. Biophys. Acta, 815, 486–498 PARKS, J. u. D. LYNCH (1992): Lipid composition and thermotropic phase behavior of boar, bull, stallion, and rooster sperm Membranes Cryobiology, 266, 255–266 PETRUNKINA, A.M., G. VOLKER, K.F. WEITZE, M. BEYERBACH, E. TÖPFER-PETERSEN, u. D. WABERSKI, (2005): Detection of cooling-induced membrane changes in the response of boar sperm to capacitating conditions. Theriogenology, 63, 2278–2299 PURSEL, V.G., L.A. JOHNSON, u. G.B. RAMPACEK (1972): Acrosome morphology of boar spermatozoa incubated before cold shock. J. Anim. Sci., 34, 278–283 PURSEL, V.G., L.A. JOHNSON, u. L.L. SCHULMAN (1973 a): Effect of dilution, seminal plasma and incubation period on cold shock susceptibility of boar spermatozoa. J. Anim. Sci., 37, 528–531 PURSEL, V.G., L.L. SCHULMAN, u. L.A. JOHNSON (1973 b): Effect of holding time on storage of boar spermatozoa at 5 °C. J. Anim. Sci., 37, 785 – 789 RIESENBECK, A. (2011): Review on international trade with boar semen. Reprod. Domest. Anim., 46, 1-3 RODRIGUEZ-GIL, J.E. (2013): Biological aspects of the mature boar spermatozoa In: S. BONET, I. CASAS, W.V. HOLT, M. YESTE (Hrsg.): Boar Reproduction Verlag Springer, Heidelberg S. 49-64


120

SCHMID, S., H. HENNING, A.M. PETRUNKINA, K.F. WEITZE, u. D. WABERSKI (2014): Response to capacitating stimuli indicates extender-related differences in boar sperm function J. Anim. Sci., 91, 5018–5025 SCHMID, S., H. HENNING, H. OLDENHOF, W.F. WOLKERS, A.M. PETRUNKINA, u. D. WABERSKI (2013): The specific response to capacitating stimuli is a sensitive indicator of chilling injury in hypothermically stored boar spermatozoa. Andrology, 1, 376 – 386 SCHULZE, M., H. HENNING, K. RÜDIGER, U. WALLNER, u. D. WABERSKI (2013): Temperature management during semen processing: Impact on boar sperm quality under laboratory and field conditions. Theriogenology, 9, 990-998 STÄHR, B, L. ROTHE u. D. WABERSKI (2009): Empfehlungen zur Gewinnung, Aufbereitung, Lagerung und Transport von Ebersperma - Handbuch für Besamungsstationen. Institut für Fortpflanzung landwirtschaftlicher Nutztiere Schönow e. V. / Tierärztliche Hochschule Hannover, Schönow/Hannover TAMULI M.K., u. P.F. WATSON (1994): Cold resistance of live boar spermatozoa during incubation after ejaculation. Vet. Rec., 135, 160-162 TRAVIS, A.J., J.A. FOSTER, N.A. ROSENBAUM, P.E. VISCONTI, G.L. GERTON, G.S. KOPF, u. S.B. MOSS (1998): Targeting of a germ cell-specific type 1 hexokinase lacking a porin-binding domain to the mitochondria as well as to the head and fibrous sheath of murine spermatozoa. Mol. Biol. Cell, 9, 263–276 TURNER, R.M. (2003): Tales from the tail: what do we really know about sperm motility? J. Androl., 24, 790–803 WABERSKI, D. (2009): Critical steps from semen collection to insemination. In: Proceedings of the Annua Meeting of the EU-AI-Vets, Ghent, Belgium. S. 66–69 WABERSKI, D. K.F. WEITZE, C. LIETMANN, W. L. ZURLAGE, F.P. BORTOLOZZO, T. WILLMEN u. R. PETZOLD (1994): The initial fertilizing-capacity of long-term-stored liquid boar semen following preovulatory and postovulatory insemination. Theriogenology, 41, 1367-1377


121

WATERHOUSE, K.E., P.M DE ANGELIS, T. HAUGAN, H. PAULENZ, P.O. HOFMO, u. W. FARSTAD (2004): Effects of in vitro storage time and semen-extender on membrane quality of boar sperm assessed by flow cytometry. Reproduction, 62, 1638–1651 WATERHOUSE, K.E., P.O. HOFMO, A. TVERDAL, u. R.R. MILLER (2006): Within and between breed differences in freezing tolerance and plasma membrane fatty acid composition of boar sperm. Reproduction, 131, 887–894 WATSON, P.F. (1996): Cooling of spermatozoa and fertilizing capacity. In: D. RATH, L. A. JOHNSON, u. K. F. WEITZE (Hrsg.): Boar Semen Preservation III, Proc 3rd in. conf. Boar Semen Preservaton, Mariensee, Deutschland Reprod. Domest. Anim. 31, S. 135–140 WHITE, I.G. (1993): Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a review. Reprod. Fertil. Dev., 5, 639–658 WIEBE, W.J. u. BANCROFT, K. (1975): Use of the adenylate energy charge ratio to measure growth state of natural microbial communities. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 72, 2112–2115 YI, Y.J., Z.H. LI, E.S. KIM, E.S. SONG, H.B. KIM, P.Q. CONG, J.M LEE u. C.S. PARK (2008): Comparison of motility, acrosome, viability and ATP of boar sperm with or without cold shock resistance in liquid semen at 17 °C and 4 °C, and frozen-thawed semen. Asian-Aust. J. Anim. Sci., 21, 190-197

Anhang

122

9 Anhang

9.1 Tabellen und Grafiken

Tabelle 1: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 1 in Abhängigkeit der Verdünnungsart, des Verdünnungsgrades und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)

Parameter Verdün-

nungsgrad Verdün-nungsart

Lagerungsdauer

d 0 d1 d 3 d 6

Gesamt-motilität

[%]

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

92,8 ± 3,1a

91,1 ± 2,2

a

89,9 ± 5,6a

86,4 ± 5,1b

86,2 ± 6,9a,*

77,1 ± 12,1b,*

68,4 ± 18,4b

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

90,5 ± 2,8a

89,3 ± 4,5

a,#

84,9 ± 4,57a,#

81,2 ± 6,8

a,b

76,5 ± 10,3a,b,

* 61,9 ± 16,0

b,*

60,6 ± 15,0b

Progressive Motilität

[%]

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

86,5 ± 4,6a

83,9 ± 3,9

a

81,9 ± 10,3a

72,3 ± 5,6b

71,9 ± 13,8a

62,4 ± 18,2b,*

53,5 ± 24,1b

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

84,2 ± 7,5a

78,8 ± 9,1

a

75,7 ± 3,2a

62,7 ± 11,2b

58,5 ± 15,5a,b

45,8 ± 19,9

b,*

40,3 ± 17,0b

VAP [µm/s]

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

79,6 ± 14,0a

67,6 ± 8,7

b

66,6 ± 11,4a

55,2 ± 9,6b

56,1 ± 16,4a,b

54,5 ± 18,6a,b

50,5 ± 14,4b

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

73,3 ± 13,7a

64,8 ± 14,0

a,b

67,3 ± 11,2a

48,1 ± 16,0b,c

44,6 ± 7,4b

39,6 ± 10,8c

42,2 ± 8,7b

VCL [µm/s]

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

117,0 ± 21,6

110,9 ±1 7,9

108,3 ± 20,7

87,2 ± 15,3

88,8 ± 31,4

83,4 ± 30,6

78,9 ± 24,4

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

109,8 ± 23,6

109,4 ± 23,8

116,3 ± 21,7 75,4 ± 25,1

72,5 ± 8,6 61,2 ± 14,5

69,5 ± 15,6

VSL [µm/s]

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

64,6 ± 12,5a

49,9 ± 4,3

b

49,5 ± 7,5

44,1 ± 8,3b

43,8 ± 11,4

44,2 ± 14,5b

40,6 ± 11,4

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

59,8 ± 12,4a

47,4 ± 9,6

b

48,6 ± 6,8a

39,1 ± 14,2b

35,4 ± 7,9a,b

32,1 ± 10,3

b

32,6 ± 6,6b

STR

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

0,81 ± 0,03

0,74 ± 0,04

0,74 ± 0,02

0,79 ± 0,02

0,79 ± 0,06

0,8 ± 0,05

0,8 ± 0,05

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

0,81 ± 0,04a

0,73 ± 0,03

b

0,72 ± 0,03 0,8 ± 0,05

a,b

0,78 ± 0,06 0,8 ± 0,06

a,b

0,77 ± 0,05

LIN

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

0,55 ± 0,04a

0,45 ± 0,04

b

0,45 ± 0,02

0,5 ± 0,04a

0,5 ± 0,07

0,53 ± 0,07a,b

0,52 ± 0,08

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

0,54 ± 0,05a

0,43 ± 0,03

b

0,42 ± 0,04 0,51 ± 0,07

a,b

0,48 ± 0,07 0,51 ± 0,08

a,b

0,47 ± 0,06

WOB

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

0,68 ± 0,03a

0,61 ± 0,03

b

0,61 ± 0,02

0,63 ± 0,04a

0,64 ± 0,05

0,65 ± 0,04a,b

0,64 ± 0,06

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

0,67 ± 0,03a

0,59 ± 0,02

b

0,58 ± 0,03 0,64 ± 0,06

a,b

0,61 ± 0,05 0,64 ± 0,05

a,b

0,61 ± 0,05

ALH [µm]

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

2,43 ± 0,44a,b,

*

2,53 ± 0,51

a

2,40 ± 0,48

2,15 ± 0,30a,b,

*

2,20 ± 0,86

2,00 ± 0,58b

1,99 ± 0,77

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

2,11 ± 0,42a,b,

*

2,30 ± 0,44

a

2,46 ± 0,48a

1,76 ± 0,33b,c,

*

1,85 ± 0,35b

1,65 ± 0,28c

1,95 ± 0,47a,b

BCF [Hz]

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

39,9 ± 2,4a

38,0 ± 2,0

a,b

37,7 ± 3,6a

34,0 ± 4,8b

32,3 ± 5,4b

31,1 ± 6,7b

28,9 ± 7,2b

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

40,3 ± 3,3a

37,3 ± 5,5

a,b

38,1 ± 3,0a

29,8 ± 8,3b,c

28,6 ± 4,5b

24,0 ± 6,2c

25,3 ± 4,4b

a-c: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Zeile unterscheiden sich (p < 0,05)

*: gleiche Symbole zeigen signifikante Unterschiede zwischen Verdünnungsgraden bei gleicher Verdünnungsart (p < 0,05)

#: gleiche Symbole zeigen signifikante Unterschiede zwischen Verdünnungsarten bei gleichem Verdünnungsgrad (p < 0,05)

VAP = velocity average path; VCL = velocity curved line; VSL = velocity straight-line; STR = straightness (VSL/VAP); LIN = linearity (VAP/VCL); WOB = wobble (VAP/VCL); ALH = amplitude of lateral head-displacement; BCF = beat cross frequency

Anhang

123

Tabelle 2: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 1 in Abhängigkeit der Verdünnungsart, des Verdünnungsgrades und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)

Parameter Verdün-

nungsgrad Verdün-nungsart

Lagerungsdauer

d 0 d1 d 3 d 6

Membran-integrität

[%]

20 x 106/ml

isotherm hypotherm

89,5 ± 1,8a 89,1 ± 1,47

a

90,4 ± 2,4a

88,9 ± 0,9a,b,

* 87,2± 1,5

b,*

85,1 ± 2,6b

83,5 ± 4,7b

10 x 106/ml

isotherm hypotherm

85,1 ± 5,5a

90,1 ± 1,7a,*

88,0 ± 2,1a,*

88,8 ± 1,8a,*

86,7 ± 1,8a,*

84,3 ± 5,2b,*

81,5 ± 6,2b,*


*: gleiche Symbole zeigen signifikante Unterschiede zwischen Verdünnungsgraden bei gleicher Verdünnungsart (p < 0,05)

Anhang

124

Tabelle 3: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 2 in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 12 Eber)

Parameter Haltezeit Haltetem-peratur

Lagerungsdauer

d0 d 1 d 3 d 6*

Gesamt-motilität

[%]

K 32 °C 90,1 ± 2,9 90,4 ± 3,6 88,8 ± 5,0 88,3 ± 1,8

30 min 32 °C 91,1 ± 2,3 90,5 ± 3,1

# 89,0 ± 5,4 87,7 ± 4,2

21 °C 91,1 ± 3,5 89,7 ± 4,2#

88,3 ± 6,6 88,7 ± 1,6

60 min 32 °C 90,8 ± 2,8 91,1 ± 3,4 89,1 ± 6,1 88,4 ± 3,6

21 °C 90,8 ± 3,4 89,4 ± 5,5 87,8 ± 6,8 88,8 ± 3,4

3 h 32 °C 91,3 ± 3,8 89,7 ± 3,7 89,1 ± 5,0 88,2 ± 3,6

21 °C 90,5 ± 3,5 90,9 ± 3,8 87,4 ± 9,4 88,6 ± 2,0

6 h 32 °C 91,9 ± 2,7 89,9 ± 7,2

# 90,0 ± 4,3 88,8 ± 2,9

21 °C 90,7 ± 3,6 90,1 ± 3,5#

88,5 ± 9,5 89,1 ± 2,3


[%]

K 32 °C 82,3 ± 5,9 81,2 ± 3,9 77,8 ± 5,8 77,1 ± 4,1

30 min 32 °C 81,9 ± 5,4

# 81,1 ± 6,4 79,7 ± 7,1

# 76,1 ± 6,0

21 °C 82,5 ± 6,6#

80,4 ± 5,3 78,7 ± 7,7#

78,2 ± 5,1

60 min 32 °C 82,6 ± 4,9 80,7 ± 3,9 80,3 ± 7,9 79,2 ± 4,6

21 °C 82,7 ± 6,4 80,3 ± 7,1 78,0 ± 9,6 77,3 ± 6,8

3 h 32 °C 83,2 ± 6,5 79,5 ± 6,8 79,8 ± 7,7 78,8 ± 5,4

21 °C 81,7 ± 5,8 82,4 ± 5,8 78,2 ± 11,6 78,1 ± 5,9

6 h 32 °C 84,0 ± 4,9 81,3 ± 7,9

# 81,5 ± 5,5 78,6 ± 5,1

21 °C 82,1 ± 5,5 79,6 ± 7,7#

79,1 ± 10,9 78,6 ± 2,0

VAP [µm/s]

K 32 °C 73,2 ± 11,7

65,2 ± 9,9

64,8 ± 12,1

63,3 ± 11,1

30 min 32 °C 71,1 ± 10,3

a,# 65,4 ± 9,3

a,b 65,0 ± 12,0

a,b,# 61,9 ± 11,4

b

21 °C 71,9 ± 7,8# 66,5 ± 11,9 62,0 ± 118

# 63,8 ± 15,4

60 min 32 °C 71,7 ± 8,6 64,7 ± 10,1 63,7 ± 11,7 69,1 ± 10,3

21 °C 71,7 ± 9 63,9 ± 12,1 62,9 ± 13,8 63,9 ± 12,9

3 h 32 °C 71,8 ± 7,7 65,6 ± 11,4 64,7 ± 10,3 67,0 ± 14,6

21 °C 68,7 ± 8,7 65,8 ± 12,0 64,6 ± 11,4 69,2 ± 13,7

6 h 32 °C 74,9 ± 8,7 65,6 ± 9,9 67,0 ± 11,6 69,1 ± 11,5

21 °C 70,2 ± 7,9 66,6 ± 10,8 63,3 ± 10,0 68,3 ± 12,4

VCL [µm/s]

K 32 °C 108,2 ± 21,9

108,9 ± 24,8

104,5 ± 24,6

107,1 ± 30,8

30 min 32 °C 108,3 ± 2,8 113,4 ± 26,5 106,3 ± 7,0 105,8 ± 28,5

21 °C 109,0 ± 18,8 115,6 ± 32,6 100,5 ± 26,3 108,2 ± 38,9

60 min 32 °C 107,7 ± 20,5

a 109,9 ± 26,3

a,b 104,3 ± 26,1

a,b 118,4 ± 28,0

b

21 °C 110,0 ± 22,0 110,3 ± 31,0 102,4 ± 28,0 107,9 ± 33,6

3 h 32 °C 107,6 ± 17,1 112,4 ± 29,3 106,3 ± 23,0 113,4 ± 34,7

21 °C 111,0 ± 24,3 114,8 ± 31,0 104,8 ± 26,6 121,4 ± 34,0

6 h 32 °C 114,5 ± 18,1 115,6 ± 30,0 110,4 ± 24,9 121,0 ± 30,6

21 °C 117,1 ± 21,9 118,3 ± 28,9 103,7 ± 23,9 117,4 ± 33,1

VSL [µm/s]

K 32 °C 59,2 ± 9,7

46,3 ± 4,63 49,0 ± 7,7

47,2 ± 3,3

30 min 32 °C 56,7 ± 7,7

a,# 46,7 ± 4,1

a,b 48,9 ± 6,6

a,b,# 45,8 ± 4,6

b

21 °C 57,4 ± 6,0# 46,6 ± 5,1 47,5 ± 6,9

# 46,9 ± 3,7

60 min 32 °C 57,3 ± 5,8

a,# 46,3 ± 4,5

a 48,3 ± 6,7

a,b 49,8 ± 2,8

b

21 °C 56,0 ± 5,9# 45,5 ± 4,6 47,9 ± 8,8 47,0 ± 5,2

3 h 32 °C 58,6 ± 6,3

a 47,0 ± 4,8

a,b 49,4 ± 5,8

a,b,# 48,2 ± 5,5

b

21 °C 51,1 ± 4,4 45,4 ± 5,8 49,1 ± 6,8# 48,9 ± 5,0

6 h 32 °C 60,9 ± 7,6

a 47,6 ± 4,6

a,b,# 51,2 ± 7,5

a,b 49,8 ± 3,4

b

21 °C 50,4 ± 5,9 46,4 ± 6,6# 48,0 ± 6,1 49,4 ± 3,3

Anhang

125

STR

K 32 °C 0,80 ± 0,03

0,72 ± 0,09

0,76 ± 0,07

0,75 ± 0,08

30 min

32 °C 0,79 ± 0,04 0,72 ± 0,08 0,76 ± 0,07 0,75 ± 0,07

21 °C 0,79 ± 0,04 0,71 ± 0,09 0,77 ± 0,06 0,75 ± 0,11

60 min

32 °C 0,80 ± 0,04 0,72 ± 0,07 0,76 ± 0,06 0,72 ± 0,08

21 °C 0,78 ± 0,05 0,72 ± 0,07 0,76 ± 0,06 0,74 ± 0,08

3 h

32 °C 0,81 ± 0,04 0,72 ± 0,07 0,76 ± 0,05 0,73 ± 0,08

21 °C 0,75 ± 0,07 0,69 ± 0,08 0,76 ± 0,06 0,71 ± 0,10

6 h 32 °C 0,81 ± 0,04 0,73 ± 0,07 0,76 ± 0,05 0,73 ± 0,08

21 °C 0,72 ± 0,08 0,70 ± 0,09 0,76 ± 0,07 0,73 ± 0,10

LIN

K 32 °C 0,55 ± 0,06 0,43 ± 0,09 0,48 ± 0,08 0,46 ± 0,10

30 min

32 °C 0,53 ± 0,07 0,43 ± 0,08 0,47 ± 0,08 0,45 ± 0,08

21 °C 0,53 ± 0,07 0,42 ± 0,09 0,48 ± 0,08 0,46 ± 0,11

60 min

32 °C 0,54 ± 0,07 0,43 ± 0,08 0,47 ± 0,07 0,43 ± 0,08

21 °C 0,52 ± 0,07 0,43 ± 0,08 0,48 ± 0,07 0,46 ± 0,09

3 h

32 °C 0,55 ± 0,06 0,43 ± 0,08 0,47 ± 0,07 0,44 ± 0,09

21 °C 0,47 ± 0,08 0,41 ± 0,09 0,48 ± 0,08 0,42 ± 0,09

6 h 32 °C 0,53 ± 0,07 0,43 ± 0,08 0,47 ± 0,06 0,42 ± 0,08

21 °C 0,44 ± 0,08 0,41 ± 0,09 0,47 ± 0,08 0,44 ± 0,10

WOB

K 32 °C 0,68 ± 0,05 0,60 ± 0,07 0,62 ± 0,05 0,60 ± 0,07

30 min

32 °C 0,66 ± 0,06 0,59 ± 0,06 0,62 ± 0,05 0,59 ± 0,06

21 °C 0,66 ± 0,06 0,59 ± 0,07 0,62 ± 0,06 0,60 ± 0,07

60 min

32 °C 0,67 ± 0,06 0,59 ± 0,05 0,62 ± 0,05 0,59 ± 0,06

21 °C 0,66 ± 0,05 0,59 ± 0,06 0,62 ± 0,06 0,60 ± 0,06

3 h

32 °C 0,67 ± 0,05 0,59 ± 0,05 0,61 ± 0,05 0,60 ± 0,06

21 °C 0,63 ± 0,07 0,58 ± 0,06 0,62 ± 0,06 0,58 ± 0,05

6 h 32 °C 0,66 ± 0,06 0,59 ± 0,06 0,61 ± 0,05 0,58 ± 0,05

21 °C 0,60 ± 0,06 0,58 ± 0,06 0,62 ± 0,06 0,59 ± 0,06

ALH [µm]

K 32 °C 2,42 ± 0,61

2,54 ± 0,63

2,33 ± 0,55

2,47 ± 0,69

30 min 32 °C 2,29 ± 0,50 2,51 ± 0,64 2,33 ± 0,60 2,43 ± 0,63

21 °C 2,27 ± 0,44 2,54 ± 0,67 2,26 ± 0,57 2,50 ± 0,85

60 min 32 °C 2,29 ± 0,47 2,49 ± 0,62 2,31 ± 0,58 2,59 ± 0,64

21 °C 2,30 ± 0,49 2,46 ± 0,70 2,26 ± 0,57 2,48 ± 0,79

3 h 32 °C 2,29 ± 0,41 2,50 ± 0,61 2,34 ± 0,52 2,64 ± 0,74

21 °C 2,40 ± 0,56 2,61 ± 0,66 2,29 ± 0,59 2,77 ± 0,79

6 h 32 °C 2,41 ± 0,40 2,48 ± 0,62 2,37 ± 0,55 2,71 ± 0,74

21 °C 2,50 ± 0,49a 2,64 ± 0,62

a,b 2,32 ± 0,60

a,b 2,77 ± 0,78

b

BCF [Hz]

K 32 °C 39,2 ± 2,5 36,9 ± 2,5 36,8 ± 4,0 35,6 ± 2,4

30 min 32 °C 39,4 ± 2,8 37,7 ± 1,8 36,9 ± 3,6

# 35,1 ± 3,8

21 °C 40,1 ± 2,4 37,5 ± 2,1 35,6 ± 4,0#

35,4 ± 2,4

60 min 32 °C 39,5 ± 2,5 36,8 ± 1,5 36,4 ± 3,8 37,1 ± 2,4

21 °C 39,4 ± 2,5 36,2 ± 3,1 35,7 ± 4,5 35,8 ± 3,4

3 h 32 °C 40,2 ± 2,1 37,3 ± 2,6 37,2 ± 3,4 36,4 ± 2,8

21 °C 39,1 ± 2,1 37,1 ± 3,0 36,9 ± 3,7 36,7 ± 3,9

6 h 32 °C 40,1 ± 2,0 37,0 ± 2,0 37,6 ± 3,7 36,6 ± 2,4

21 °C 39,6 ± 2,3 38,0 ± 2,9 36,2 ± 2,0 36,3 ± 3,1

K= Kontrolle; *: d 6: n = 6 Eber;

a-b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Zeile unterscheiden sich (p < 0,05)

#: gleiche Symbole zeigen signifikante Unterschiede zwischen Haltetemperaturen bei gleicher Lagerungsdauer (p < 0,05)


Anhang

126

Tabelle 4: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen in % (MW ± SD) von Experiment 2 in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 12 Eber)


Lagerungsdauer

d0 d 1 d 3 d 61

Membran-integrität

[%]

K 32 °C 89,6 ± 2,9 88,5 ± 3,3 90,0 ± 2,6 85,9 ± 3,6

30 min 32 °C 90,0 ± 2,4 89,3 ± 3,9* 90,0 ± 2,6 85,5 ± 5,0

21 °C 90,2 ± 2,2 89,4 ± 2,9** 89,8 ± 2,3 84,8 ± 5,2

60 min 32 °C 89,8 ± 2,9 89,0 ± 3,1* 89,9 ± 2,4*

,** 84,9 ± 4,5

21 °C 90,3 ± 2,6 89,5 ± 3,1*** 90,1 ± 2,4 86,4 ± 4,4

3 h 32 °C 90,1 ± 2,7 89,0 ± 3,6 89,2 ± 2,7* 85,5 ± 4,2

21 °C 90,8 ± 3,0 89,1 ± 3,1**;*** 89,9 ± 2,4 85,4 ± 4,3

6 h 32 °C 89,5 ± 2,4 88,3 ± 4,6 88,9 ± 2,6** 85,0 ± 4,0

21 °C 90,5 ± 3,2 89,6 ± 2,8 90,3 ± 2,1 86,9 ± 5,0

Mito-chondrien-membran-potential

[%]

K 32 °C 79,8 ± 6,9 86,4 ± 12,4 87,4 ± 9,8 78,3 ± 14,1

30 min 32 °C 77,4 ± 10,9 88,1 ± 10,6 87,2 ± 7,6 76,6 ± 18,2 21 °C 83,6 ± 7,0 83,5 ± 20,2 82,3 ± 17,7 80,6 ± 12,9

60 min 32 °C 76,2 ± 15,9 85,9 ± 13,9 83,4 ± 9,3 77,3 ± 20,8

21 °C 82,1 ± 8,8 82,6 ± 20,0 80,8 ± 11,9 77,0 ± 18,4

3 h 32 °C 87,3 ± 5,2 82,8 ± 15,8 82,6 ± 11,1 77,6 ± 17,5 21 °C 83,1 ± 6,9 82,1 ± 19,8 76,7 ± 17,8 73,4 ± 20,1

6 h 32 °C 86,9 ± 4,4 82,7 ± 19,8 83,3 ± 8,4 80,2 ± 12,3 21 °C 80,8 ± 5,6 80,5 ± 21,1 78,6 ± 14,5 74,4 ± 16,4

Mittlere Fluo-

reszenz-intensität

aller Spermien

[AU]

K 32 °C 14,1 ± 5,1 14 ± 4,8 13,5 ± 7,2 10,9 ± 5,1

30 min 32 °C 16,2 ± 3,3 16,5 ± 7,1 13,7 ± 5,3 12,3 ± 6 21 °C 19,9 ± 8,1 16,4 ± 6,6 12,6 ± 6,0 11,2 ± 4,6

60 min 32 °C 13,8 ± 7,8 15,9 ± 8,1 11,6 ± 4,4 13,8 ± 6,5 21 °C 13,6 ± 4,0 15,8 ± 7,2 11,9 ± 5,6 11,9 ± 5,1

3 h 32 °C 15,5 ± 5,8 14,9 ± 8,9 11,6 ± 4,7 11,2 ± 5,8 21 °C 13,7 ± 6,0 15,2 ± 7,9 11,4 ± 4,2 10,5 ± 5,3

6 h 32 °C 14,0 ± 4,1 15,9 ± 8,4 11,8 ± 5,2 11,6 ± 5 21 °C 12,9 ± 3,9 15,0 ± 8,8 11,3 ± 5,0 11,8 ± 5,2

K= Kontrolle; 1: d 6: n = 6 Eber;

*-***: gleiche Symbole zeigen signifikante Unterschiede zwischen Haltezeiten bei gleicher Lagerungsdauer (p < 0,05)

Anhang

127

Tabelle 5: Ergebnisse der Analyse des Energiestoffwechsels (MW + SD) von Experiment 2 in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 12 Eber)


Lagerungsdauer

d0 d 1 d 3 d 61

ATP [pmol/ 50000

Spermien]

nativ 298 ± 78 K 32 °C 336 ± 115 257 ± 127 260 ± 59 272 ± 77

30 min 32 °C 296 ± 101 237 ± 103 239 ± 72 226 ± 73

21 °C 298 ± 142a

252 ± 93b

250 ± 51a,b

240 ± 68b

60 min 32 °C 270 ± 90 223 ± 105 272 ± 60 202 ± 68

21 °C 306 ± 94 231 ± 60 239 ± 75 254 ± 66

3 h 32 °C 313 ± 85 232 ± 93 232 ± 62 251 ± 64

21 °C 278 ± 73 261 ± 88 232 ± 71 249 ± 71

6 h 32 °C 282 ± 103 250 ± 99 238 ± 61 259 ± 62

21 °C 277 ± 70 245 ± 50 236 ± 55 237 ± 62

ADP

[pmol]

nativ 104 ± 21 K 32 °C 98 ± 32 88 ± 38 125 ± 46 81 ± 40

30 min 32 °C 80 ± 51 85 ± 20 65 ± 26 66 ± 20

21 °C 90 ± 30 80 ± 19 74 ± 39 80 ± 31

60 min 32 °C 82 ± 20 78 ± 21 69 ± 27 52 ± 32

21 °C 88 ± 27 67 ± 14 73 ± 40 91 ± 42

3 h 32 °C 89 ± 38 79 ± 22 61 ± 26 70 ± 25

21 °C 86 ± 27 80 ± 31 72 ± 44 78 ± 29

6 h 32 °C 80 ± 29 70 ± 30 58 ± 38 59 ± 23

21 °C 84 ± 36 84 ± 25 69 ± 31 78 ± 36

AMP [pmol]

nativ 81 ± 56 K 32 °C 86 ± 58 103 ± 54 51 ± 58 86 ± 37

30 min 32 °C 75 ± 49 92 ± 35 104 ± 56 73 ± 44

21 °C 74 ± 43 105 ± 52 99 ± 61 91 ± 26

60 min 32 °C 93 ± 53 76 ± 49 117 ± 32 70 ± 39

21 °C 88 ± 74 90 ± 49 94 ± 52 75 ± 28

3 h 32 °C 99 ± 70 90 ± 65 88 ± 39 74 ± 27

21 °C 72 ± 71 83 ± 36 65 ± 35 80 ± 39

6 h 32 °C 74 ± 52 75 ± 53 89 ± 46 84 ± 36

21 °C 59 ± 53 78 ± 73 51 ± 39 81 ± 24

Energie-ladung

nativ 0,68 ± 0,12 K 32 °C 0,69 ± 0,11 0,61 ± 0,14 0,77 ± 0,18 0,66 ± 0,09

30 min 32 °C 0,70 ± 0,10 0,62 ± 0,12 0,62 ± 0,14 0,66 ± 0,08

21 °C 0,68 ± 0,10 0,62 ± 0,11 0,65 ± 0,12 0,67 ± 0,11

60 min 32 °C 0,67 ± 0,12 0,65 ± 0,13 0,62 ± 0,08 0,69 ± 0,10

21 °C 0,67 ± 0,13 0,64 ± 0,12 0,65 ± 0,12 0,66 ± 0,10

3 h 32 °C 0,70 ± 0,14 0,66 ± 0,21 0,64 ± 0,09 0,67 ± 0,09

21 °C 0,72 ± 0,13 0,66 ± 0,10 0,69 ± 0,11 0,67 ± 0,07

6 h 32 °C 0,70 ± 0,11 0,70 ± 0,18 0,66 ± 0,08 0,66 ± 0,10

21 °C 0,72 ± 0,12 0,68 ± 0,16 0,75 ± 0,16 0,67 ± 0,08 K= Kontrolle;

1: d 6: n = 6 Eber;


Anhang

128

Tabelle 6: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 3 in Abhängigkeit der Haltezeit, der Verdünnertemperatur und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)

Parameter Haltezeit Verdünner-temperatur

Lagerungsdauer

d0 d 1 d 3

Gesamt-motilität

[%]

K 32 °C 93,2 ± 2,0

a 91,8 ± 2,9

a 91,4 ± 4,0

a

30 min 32 °C 92,0 ± 3,1* 89,7 ± 4,2

89,0 ± 4,8

21 °C 92,0 ± 2,7a,b

92,8 ± 3,0a

89,5 ± 5,2b

60 min 32 °C 91,4 ± 2,6 90,6 ± 4,6 90,3 ± 5,8

21 °C 91,4 ± 3,1

91,4 ± 3,5

88,3 ± 6,4

3 h 32 °C 93,3 ± 2,3* 91,5 ± 2,9

90,6 ± 4,7

21 °C 92,7 ± 2,3

89,9 ± 6,7

86,7 ± 10,8

6 h 32 °C 93,2 ± 2,7

90,0 ± 5,2

89,8 ± 5,1

21 °C 93,0 ± 2,2a 86,2 ± 14,6

a,b 84,3 ± 15,4

b


[%]

K 32 °C 87,1 ± 3,79 83,77 ± 3,82 83,57 ± 6,41

30 min 32 °C 85,6 ± 4,0

a 81,2 ± 7,2

a,b 80,3 ± 6,5

b

21 °C 85,2 ± 4,2a 85,2 ± 6,0

a,b 78,6 ± 10,8

b

60 min 32 °C 84,9 ± 3,7 83,6 ± 6,4 80,5 ± 7,5

21 °C 84,7 ± 4,7 83,4 ± 5,6 77,4 ± 8,4

3 h 32 °C 86,7 ± 4,2 84,9 ± 5,0 81,2 ± 6,1

21 °C 85,5 ± 3,4a 83,9 ± 8,2

a 76,6 ± 13,3

b

6 h 32 °C 86,4 ± 4,4 82,8 ± 7,7 81,8 ± 7,6

21 °C 85,9 ± 4,7a 78,4 ± 14,8

a 72,4 ± 18,0

b

VAP [µm/s]

K 32 °C 74,5 ± 8,1

a 65,4 ± 13,2

a,b 59,5 ± 7,6

b

30 min 32 °C 74,2 ± 6,9

a 66,3 ± 11,6

b 62,6 ± 7,1

b

21 °C 72,1 ± 4,36a 64,5 ± 14,7

a 56,9 ± 3,3

b

60 min 32 °C 72,1 ± 8,1

a 65,55 ± 12,56

a,b 59,51 ± 7,04

b

21 °C 69,8 ± 6,1a 61,95 ± 13,93

a,b 56,98 ± 9,1

b

3 h 32 °C 66,9 ± 7,0 67,7 ± 13,2 63,97 ± 11,55

21 °C 68,7 ± 4,4 66,56 ± 11,91 61,5 ± 14,41

6 h 32 °C 67,7 ± 8,9 66,52 ± 14,2 63,97 ± 11,55

#

21 °C 65,9 ± 6,0 63,85 ± 11,23 60,35 ± 9,97#

VCL [µm/s]

K 32 °C 107,9 ± 14,7

a 106,0 ± 23,6

a,b 91,3 ± 15,7

b

30 min 32 °C 107,1 ± 12,9

a 107,1 ± 23,0

a,b 98,2 ± 15,5

b

21 °C 103,7 ± 9,3a,b

103,5 ± 25,1a 89,5 ± 26,4

b

60 min 32 °C 104,5 ± 14,8

a,b 104,4 ± 23,4

a 92,4 ± 17,6

b

21 °C 100,6 ± 10,0 100,5 ± 27,4 89,3 ± 21,3

3 h 32 °C 103,2 ± 16,6 108,2 ± 24,8 101,0 ± 21,8

21 °C 106,9 ± 12,9 108,2 ± 23,4 97,3 ± 28,4

6 h 32 °C 104,9 ± 20,5 107,3 ± 26,8 105,5 ± 26,8

21 °C 105,6 ± 17,0a,b

106,4 ± 23,8a 99,0 ± 23,7

b

VSL [µm/s]

K 32 °C 61,3 ± 6,6

a 49,0 ± 7,6

b 48,16 ± 5,53

b

30 min 32 °C 61,1 ± 5,4

a 49,0 ± 6,6

b 49,6 ± 4,9

b

21 °C 59,8 ± 2,9a 49,6 ± 9,8

b 45,1 ± 8,8

c

60 min 32 °C 59,4 ± 5,2

a 50,0 ± 7,7

a,b 47,4 ± 4,3

b

21 °C 58,0 ± 4,9a 47,0 ± 8,2

b 45,4 ± 5,5

b

3 h 32 °C 52,4 ± 3,4 50,8 ± 8,4 49,8 ± 7,7

21 °C 53,6 ± 3,0 49,5 ± 7,3 47,9 ± 8,8

6 h 32 °C 51,1 ± 3,7 50,0 ± 8,0 50,1 ± 4,8

#

21 °C 48,9 ± 3,4 47,1 ± 5,8 46,2 ± 4,9#

Anhang

129

STR

K 32 °C 0,82 ± 0,03a 0,75 ± 0,04

b 0,81 ± 0,03

a

30 min

32 °C 0,82 ± 0,03a,

* 0,74 ± 0,03b 0,79 ± 0,04

a

21 °C 0,82 ± 0,02a,

*** 0,77 ± 0,03b 0,79 ± 0,04

a,b

60 min

32 °C 0,82 ± 0,03a,

** 0,76 ± 0,04b 0,8 ± 0,03

a,b

21 °C 0,83 ± 0,03a,

**** 0,76 ± 0,05b 0,8 ± 0,05

a,b,*

3 h

32 °C 0,78 ± 0,05*,** 0,75 ± 0,04 0,78 ± 0,04

21 °C 0,78 ± 0,05***,**** 0,74 ± 0,04 0,78 ± 0,05

6 h 32 °C 0,76 ± 0,08 0,76 ± 0,04 0,76 ± 0,07

21 °C 0,74 ± 0,08**** 0,74 ± 0,06 0,77 ± 0,06*

LIN

K 32 °C 0,57 ± 0,04a 0,47 ± 0,05

b 0,53 ± 0,06

a

30 min

32 °C 0,57 ± 0,05a,

*,** 0,46 ± 0,05

b 0,51 ± 0,06

c

21 °C 0,57 ± 0,03a,

**** 0,48 ± 0,04b 0,51 ± 0,07

a,b

60 min

32 °C 0,57 ± 0,04a,

*** 0,48 ± 0,05b,

* 0,52 ± 0,07a,b

21 °C 0,57 ± 0,04a,

***** 0,48 ± 0,06b 0,52 ± 0,09

a,b

3 h

32 °C 0,51 ± 0,06*,*** 0,47 ± 0,05 0,50 ± 0,07

21 °C 0,50 ± 0,06**** 0,46 ± 0,06 0,50 ± 0,07

6 h 32 °C 0,50 ± 0,08**

,*** 0,47 ± 0,05 0,49 ± 0,09

21 °C 0,47 ± 0,09****,***** 0,45 ± 0,07* 0,48 ± 0,08

WOB

K 32 °C 0,69 ± 0,03

a,* 0,62 ± 0,03

b 0,65 ± 0,04

a,b

30 min

32 °C 0,69 ± 0,04a,

** 0,62 ± 0,03b 0,64 ± 0,04

b

21 °C 0,69 ± 0,02a,

**** 0,62 ± 0,03b 0,64 ± 0,06

a,b

60 min

32 °C 0,69 ± 0,03a,

*** 0,63 ± 0,03b 0,65 ± 0,05

a,b

21 °C 0,69 ± 0,03a,

***** 0,62 ± 0,04b 0,65 ± 0,07

a,b,*

3 h

32 °C 0,65 ± 0,04*** 0,63 ± 0,04 0,63 ± 0,05

21 °C 0,65 ± 0,04****,***** 0,62 ± 0,05 0,64 ± 0,05

6 h 32 °C 0,65 ± 0,04

a,*

,**

,*** 0,62 ± 0,04

b 0,64 ± 0,06

a,b

21 °C 0,62 ± 0,06***** 0,60 ± 0,05 0,62 ± 0,06*

ALH [µm]

K 32 °C 2,29 ± 0,41

a,b 2,37 ± 0,63

a 2,07 ± 0,48

b,*

30 min 32 °C 2,25 ± 0,31 2,36 ± 0,64 2,24 ± 0,50*

21 °C 2,21 ± 0,31a,b,

** 2,32 ± 0,60a 2,12 ± 0,63

b

60 min 32 °C 2,17 ± 0,39* 2,32 ± 0,56 2,15 ± 0,53**

21 °C 2,09 ± 0,33a,

**,*** 2,37 ± 0,68

a 2,10 ± 0,62

a

3 h 32 °C 2,31 ± 0,42* 2,41 ± 0,63 2,29 ± 0,61**

21 °C 2,29 ± 0,34*** 2,43 ± 0,59* 2,22 ± 0,68

6 h 32 °C 2,31 ± 0,50* 2,44 ± 0,70 2,43 ± 0,75

21 °C 2,37 ± 0,43*** 2,42 ± 0,63* 2,39 ± 0,68

BCF [Hz]

K 32 °C 40,0 ± 0,9

a 38,1 ± 2,1

a,b 36,0 ± 2,7

b

30 min 32 °C 40,0 ± 1,3

a 37,3 ± 3,1

a,b 37,0 ± 2,5

b

21 °C 39,7 ± 1,0a 37,6 ± 4,4

a 34,0 ± 4,8

b

60 min 32 °C 40,2 ± 0,8

a 37,7 ± 2,9

b 35,2 ± 2,5

b

21 °C 39,9 ± 0,8a 35,7 ± 4,3

b 33,7 ± 4,5

c

3 h 32 °C 39,0 ± 2,1 37,8 ± 3,0 36,7 ± 3,2

21 °C 39,8 ± 1,4a 38,0 ± 3,0

a,b 35,4 ± 5,0

b

6 h 32 °C 38,9 ± 2,5

a 37,2 ± 2,9

b 36,2 ± 2,3

b

21 °C 38,9 ± 1,0a 36,6 ± 1,8

b 34,4 ± 2,6

c

K= Kontrolle;



* -

*****: gleiche Symbole zeigen signifikante Unterschiede zwischen Haltezeiten bei gleicher Lagerungsdauer (p < 0,05) VAP = velocity average path; VCL = velocity curved line; VSL = velocity straight-line; STR = straightness (VSL/VAP); LIN = linearity (VAP/VCL); WOB = wobble (VAP/VCL); ALH = amplitude of lateral head-displacement; BCF = beat cross frequency

Anhang

130

Tabelle 7: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 3 in Abhängigkeit der Haltezeit, der Verdünnertemperatur und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)

Parameter Haltezeit Verdünner-temperatur

Lagerungsdauer

d0 d 1 d 3

Membran-intakte

Spermien [%]

K 32 °C 91,4 ± 2,3

91,1 ± 1,2

90,9 ± 1,7

30 min 32 °C 91,4 ± 2,0

91,2 ± 2,5

90,6 ± 1,9

21 °C 92,7 ± 2,3a

92,4 ± 2,0a,b

90,6 ± 1,6b

60 min 32 °C 91,8 ± 2,0 91,2 ± 2,3

# 90,8 ± 2,2

21 °C 92,9 ± 1,9a

92,0 ± 2,1b,#

90,8 ± 2,1b

3 h 32 °C 91,6 ± 2,3 90,9 ± 1,9

90,1 ± 1,5

21 °C 92,4 ± 1,6a

91,3 ± 1,9a,b

90,7 ± 0,7b

6 h 32 °C 91,4 ± 2,4

91,1 ± 2,1

91,0 ± 2,1

21 °C 90,8 ± 3,8 90,8 ± 1,8 89,8 ± 1,9 K= Kontrolle;

a-b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Zeile unterscheiden sich (p < 0,05);


Anhang

131

Tabelle 8: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 4 a in Abhängigkeit der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)

Parameter Haltezeit Halte-temperatur

Lagerungsdauer

d0 d 1 d 3

Gesamt-motilität

[%]

K 32 °C 92,0 ± 3,3 91,3 ± 2,5 90,4 ± 4,2

30 min 32 °C 92,0 ± 1,9 92,2 ± 3,9 88,2 ± 7,3

21 °C 91,3 ± 3,6 92,1 ± 3,8 89,0 ± 6,5

60 min 32 °C 92,1 ± 3,8 91,0 ± 3,7 91,6 ± 3,5

21 °C 92,0 ± 3,1 90,8 ± 4,5 89,2 ± 6,6

3 h 32 °C 91,6 ± 4,3 87,1 ± 12,8 84,5 ± 17,1

21 °C 92,2 ± 2,8 89,7 ± 5,6 86,8 ± 8,7

6 h 32 °C 89,3 ± 4,6 90,9 ± 3,4 88,8 ± 5,4

21 °C 91,7 ± 3,7 89,9 ± 4,3 88,2 ± 7,6


[%]

K 32 °C 86,0 ± 4,1 83,4 ± 5,23 83,45 ± 6,85

30 min 32 °C 87,3 ± 2,7 84,7 ± 6,9 80,0 ± 12,0

21 °C 85,4 ± 5,7 84,4 ± 7,7 82,0 ± 10,5

60 min 32 °C 85,4 ± 7,2 82,9 ± 6,7 84,9 ± 4,8

21 °C 87,3 ± 4,2a 83,2 ± 6,8

b 81,0 ± 9,0

b

3 h 32 °C 86,4 ± 4,7 76,4 ± 23,4 75,0 ± 26,6

21 °C 86,6 ± 3,7 86,6 ± 3,7 78,6 ± 13,6

6 h 32 °C 82,7 ± 8,3 80,6 ± 10,7 78,9 ± 11,6

21 °C 85,8 ± 6,1a 82,0 ± 6,8

b 79,6 ± 11,5

a,b

VAP [µm/s]

K 32 °C 76,2 ± 7,8 64,3 ± 10,9 64,3 ± 11,0

30 min 32 °C 77,0 ± 10,0 70,4 ± 9,0 63,4 ± 12,7

21 °C 73,9 ± 6,2 68,3 ± 12,7 65,0 ± 9,9

60 min 32 °C 74,3 ± 8,5 65,8 ± 11,1 67,6 ± 13,4

21 °C 73,8 ± 4,6a 68,7 ± 8,3

b 67,4 ± 10,4

a,b

3 h 32 °C 77,5 ± 10,7 61,8 ± 18,8 61,2 ± 24,8

21 °C 71,2 ± 5,2 69,1 ± 10,6 64,2 ± 14,4

6 h 32 °C 72,8 ± 18,8 66,5 ± 18,5 64,3 ± 18,1

21 °C 71,0 ± 10,0 70,1 ± 12,3 67,3 ± 17,8

VCL [µm/s]

K 32 °C 113,4 ± 17,3 104,8 ± 20,5 100,48 ± 19,89

30 min 32 °C 113,4 ± 18,8 112,3 ± 19,1 100,6 ± 23,1

21 °C 110,9 ± 17,7 111,0 ± 21,7 103,6 ± 17,4

60 min 32 °C 106,7 ± 18,6 104,0 ± 18,9 106,4 ± 21,8

21 °C 110,0 ± 16,4 112,2 ± 20,0 108,0 ± 21,7

3 h 32 °C 111,4 ± 16,4 99,9 ± 32,5 97,0 ± 36,3

21 °C 110,4 ± 17,5 112,2 ± 22,2 102,0 ± 23,9

6 h 32 °C 103,8 ± 28,2 105,2 ± 30,6 100,1 ± 28,4

21 °C 117,0 ± 24,9 115,4 ± 23,6 108,7 ± 32,8

VSL [µm/s]

K 32 °C 61,8 ± 6,96

a 48,7 ± 6,6

b 51,0 ± 7,53

b

30 min 32 °C 64,0 ± 9,9

a 53,8 ± 5,8

b 49,8 ± 9,0

b

21 °C 59,7 ± 3,2a 51,2 ± 8,4

a,b 50,5 ± 6,9

b

60 min 32 °C 62,4 ± 8,0

a 50,7 ± 6,9

b 52,1 ± 8,5

a,b

21 °C 59,8 ± 4,0a 51,5 ± 4,0

b 52,0 ± 6,1

a,b

3 h 32 °C 65,9 ± 10,6

a 47,9 ± 14,5

b 47,5 ± 18,7

a,b

21 °C 55,2 ± 5,1 52,3 ± 6,0 49,6 ± 10,0

6 h 32 °C 61,7 ± 16,8 51,6 ± 12,9 51,4 ± 14,3

21 °C 52,4 ± 5,2 52,6 ± 7,4 51,3 ± 11,4

Anhang

132

STR

K 32 °C 0,81 ± 0,05a 0,76 ± 0,05

b 0,79 ± 0,04

a

30 min

32 °C 0,83 ± 0,04a 0,76 ± 0,05

b 0,78 ± 0,04

a,b

21 °C 0,80 ± 0,05a 0,75 ± 0,05

b 0,77 ± 0,04

a,b

60 min

32 °C 0,84 ± 0,05a,#

0,77 ± 0,04b 0,77 ± 0,03

a,b

21 °C 0,80 ± 0,06a,#

0,75 ± 0,05b 0,77 ± 0,05

a,b

3 h

32 °C 0,84 ± 0,04a,##

0,77 ± 0,03b 0,78 ± 0,03

b

21 °C 0,77 ± 0,06##

0,76 ± 0,05 0,77 ± 0,03

6 h 32 °C 0,84 ± 0,03

a,### 0,78 ± 0,05

b,# 0,80 ± 0,02

a,b

21 °C 0,74 ± 0,06###

0,75 ± 0,04# 0,77 ± 0,04

LIN

K 32 °C 0,55 ± 0,08a 0,47 ± 0,06

b 0,51 ± 0,05

a

30 min

32 °C 0,57 ± 0,07a 0,48 ± 0,07

b 0,50 ± 0,06

b

21 °C 0,54 ± 0,08a 0,46 ± 0,06

b 0,49 ± 0,05

b

60 min

32 °C 0,59 ± 0,09a,#

0,49 ± 0,06b 0,49 ± 0,04

a,b

21 °C 0,54 ± 0,09a,#

0,46 ± 0,06b 0,49 ± 0,07

b

3 h

32 °C 0,59 ± 0,09a,##

0,48 ± 0,06b 0,48 ± 0,05

a,b

21 °C 0,51 ± 0,09##

0,47 ± 0,07 0,49 ± 0,05

6 h 32 °C 0,60 ± 0,07

a,### 0,50 ± 0,07

b,# 0,51 ± 0,05

a,b

21 °C 0,46 ± 0,08###

0,46 ± 0,06# 0,48 ± 0,00

WOB

K 32 °C 0,67 ± 0,06

a 0,61 ± 0,04

b 0,64 ± 0,04

a

30 min

32 °C 0,68 ± 0,06a 0,63 ± 0,05

b 0,63 ± 0,04

a,b

21 °C 0,67 ± 0,06a 0,61 ± 0,03

b 0,63 ± 0,03

b

60 min

32 °C 0,70 ± 0,07a 0,63 ± 0,05

b 0,63 ± 0,04

b

21 °C 0,67 ± 0,07a 0,62 ± 0,04

b 0,63 ± 0,05

a,b

3 h

32 °C 0,70 ± 0,08a,#

0,62 ± 0,05b 0,62 ± 0,05

a,b

21 °C 0,65 ± 0,06# 0,62 ± 0,05 0,63 ± 0,04

6 h 32 °C 0,71 ± 0,07

a,## 0,64 ± 0,06

b 0,64 ± 0,05

a,b

21 °C 0,61 ± 0,06##

0,61 ± 0,06 0,63 ± 0,05

ALH [µm]

K 32 °C 2,32 ± 0,47 2,34 ± 0,45 2,27 ± 0,46

30 min 32 °C 2,31 ± 0,36 2,43 ± 0,41 2,29 ± 0,45

21 °C 2,29 ± 0,44 2,40 ± 0,49 2,34 ± 0,45

60 min 32 °C 2,19 ± 0,49 2,23 ± 0,39

# 2,28 ± 0,38

21 °C 2,27 ± 0,47a 2,44 ± 0,49

b,# 2,35 ± 0,49

a,b

3 h 32 °C 2,28 ± 0,44 2,24 ± 0,66 2,15 ± 0,59

21 °C 2,31 ± 0,48 2,46 ± 0,52 2,30 ± 0,43

6 h 32 °C 2,11 ± 0,53

# 2,24 ± 0,58 2,16 ± 0,48

21 °C 2,47 ± 0,6# 2,47 ± 0,56 2,39 ± 0,65

BCF [Hz]

K 32 °C 40,6 ± 0,64 37,5 ± 3,6 37,1 ± 3,4

30 min 32 °C 40,4 ± 1,2

a 39,3 ± 2,9

a,b 36,2 ± 4,9

b

21 °C 40,1 ± 2,4a 38,7 ± 3,6

a,b 37,0 ± 3,0

b

60 min 32 °C 39,2 ± 2,8 38,2 ± 3,5 37,7 ± 4,8

21 °C 40,3 ± 1,3 39,2 ± 2,4 37,7 ± 3,6

3 h 32 °C 39,8 ± 1,5 35,5 ± 9,7 34,0 ± 12,0

21 °C 39,7 ± 1,2 38,6 ± 2,6 36,2 ± 5,5

6 h 32 °C 38,1 ± 5,2 37,3 ± 6,4 36,1 ± 6,6

21 °C 39,9 ± 2,9a 39,2 ± 3,4

a,b 36,7 ± 5,9

b

K= Kontrolle;


# - ###: gleiche Symbole zeigen signifikante Unterschiede zwischen Haltetemperaturen bei gleicher Lagerungsdauer (p < 0,05)


Tabelle 9: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 4 a in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)

Anhang

133

Tabelle 10: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 4 a in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)


Lagerungsdauer

d0 d 1 d 3

Membran-intakte

Spermien [%]

K 32 °C 89,7 ± 1,8 89,9 ± 2,7 89,3 ± 1,1

30 min 32 °C 91,2 ± 1,1

a 89,7 ± 1,9

a,b 89,2 ± 1,7

b

21 °C 91,4 ± 1,3a

90,3 ± 0,8b

90,4 ± 1,4a, b

60 min 32 °C 91,8 ± 1,1

a 90,0 ± 1,2

b 89,8 ± 1,8

b

21 °C 91,6 ± 1,0a

90,1 ± 0,6a,b

90,5 ± 0,5b

3 h 32 °C 92,1 ± 1,7 90,2 ± 1,5 89,4 ± 2,7

21 °C 91,6 ± 1,3a

90,2 ± 1,0b

90,2 ± 0,8a,b

6 h 32 °C 91,0 ± 1,3 90,3 ± 0,8 89,0 ± 1,7

21 °C 91,5 ± 1,3a

90,3 ± 0,7a

89,4 ± 0,9b

K= Kontrolle;

a-b: Werte mit unterschiedlichen Buchstaben innerhalb einer Zeile unterscheiden sich (p < 0,05);

Anhang

134

Tabelle 11: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 4 b in Abhängigkeit der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)


Lagerungsdauer

d0 d 1 d 3

Gesamt-motilität

[%]

K 32 °C 93,4 ± 1,4a 89,9 ± 2,7

b 90,0 ± 4,4

a,b

30 min 32 °C 93,3 ± 2,1 91,1 ± 2,5 89,7 ± 4,8

21 °C 93,5 ± 1,9 92,0 ± 3,8 87,6 ± 9,2

60 min 32 °C 91,5 ± 3,2

a 90,3 ± 3,2

a,b 86,4 ± 10,2

b

21 °C 92,3 ± 3,4 92,1 ± 4,3 91,3 ± 3,5

3 h 32 °C 90,1 ± 8,7

a,b 92,0 ± 3,7

b 89,3 ± 3,9

a

21 °C 93,5 ± 2,8 93,5 ± 2,5 91,8 ± 3,7

6 h 32 °C 91,7 ± 1,7 82,7 ± 18,3 78,4 ± 22,4

21 °C 93,2 ± 3,0 92,6 ± 3,0 89,8 ± 2,8


[%]

K 32 °C 87,7 ± 1,9 81,9 ± 7,1 79,4 ± 9,6

30 min 32 °C 87,9 ± 2,9

a 81,5 ± 5,1

b 79,6 ± 6,6

a,b

21 °C 87,3 ± 2,9 84,1 ± 4,1 75,0 ± 21,3

60 min 32 °C 84,2 ± 4,3 80,8 ± 9,5 72,1 ± 24,1

21 °C 88,1 ± 3,3 84,3 ± 5,0 81,4 ± 9,9

3 h 32 °C 77,3 ± 25,7 80,3 ± 12,2 79,9 ± 9,7

21 °C 86,8 ± 4,8 85,2 ± 5,3 85,3 ± 7,3

6 h 32 °C 83,5 ± 4,0 66,8 ± 30,3 64,0 ± 31,3

21 °C 86,9 ± 4,4a,b

86,8 ± 4,0b 81,9 ± 4,1

a

VAP [µm/s]

K 32 °C 84,9 ± 11,9 65,0 ± 11,2 63,1 ± 8,1

30 min 32 °C 82,2 ± 7,4

a 64,1 ± 9,0

b 60,1 ± 15,8

b

21 °C 78,5 ± 7,8a 63,6 ± 7,1

b 64,0 ± 14,6

b

60 min 32 °C 71,7 ± 16,0

a 61,4 ± 15,3

b 56,8 ± 19,5

a,b

21 °C 73,8 ± 5,1a 64,2 ± 5,7

b 61,5 ± 16,9

a,b

3 h 32 °C 67,2 ± 22,4 61,2 ± 15,3 61,8 ± 21,3

21 °C 70,0 ± 8,5 67,2 ± 8,5 63,7 ± 14,6

6 h 32 °C 70,2 ± 15,1 52,7 ± 24,4 54,5 ± 28,8

21 °C 67,9 ± 8,8 65,4 ± 6,4 64,7 ± 16,6

VCL [µm/s]

K 32 °C 126,6 ± 21,5 101,6 ± 20,1 97,3 ± 28,8

30 min 32 °C 118,3 ± 12,1

a 98,4 ± 16,6

b 92,8 ± 26,6

a,b

21 °C 114,8 ± 14,3a 97,3 ± 14,0

b 96,5 ± 23,9

a,b

60 min 32 °C 100,3 ± 20,3 90,9 ± 22,7 87,6 ± 31,4

21 °C 107,0 ± 11,8a 96,0 ± 9,8

b 94,7 ± 28,4

a,b

3 h 32 °C 97,4 ± 26,7 91,1 ± 23,6 93,4 ± 37,3

21 °C 105,4 ± 16,9 102,9 ± 17,0 98,6 ± 24,3

6 h 32 °C 98,3 ± 21,5 76,0 ± 32,8 84,6 ± 45,3

21 °C 102,7 ± 14,9 100,5 ± 16,4 98,9 ± 29,3

VSL [µm/s]

K 32 °C 69,1 ± 9,2 51,3 ± 8,0 50,4 ± 14,1

30 min 32 °C 67,8 ± 5,7

a 51,4 ± 6,7

b 47,4 ± 11,9

b

21 °C 63,8 ± 5,6a 50,6 ± 4,9

a,b 51,4 ± 11,3

b

60 min 32 °C 60,5 ± 14,4

a 49,8 ± 12,8

b 44,9 ± 15,7

b

21 °C 60,4 ± 3,0a 52,4 ± 4,9

b 49,0 ± 12,8

a,b

3 h 32 °C 56,9 ± 20,9 50,1 ± 12,8 48,6 ± 15,4

21 °C 55,8 ± 5,7 54,1 ± 5,8 50,2 ± 11,2

6 h 32 °C 60,1 ± 13,5 43,6 ± 21,4 43,1 ± 23,1

21 °C 53,5 ± 6,4 52,0 ± 3,6 51,5 ± 12,1

Anhang

135

STR

K 32 °C 0,81 ± 0,03 0,79 ± 0,03 0,80 ± 0,02

30 min

32 °C 0,82 ± 0,03 0,80 ± 0,04 0,79 ± 0,02

21 °C 0,81 ± 0,04 0,79 ± 0,04 0,80 ± 0,02

60 min

32 °C 0,84 ± 0,03a 0,81 ± 0,03

b 0,78 ± 0,03

b

21 °C 0,81 ± 0,04 0,81 ± 0,02 0,79 ± 0,02

3 h

32 °C 0,83 ± 0,06 0,82 ± 0,03 0,79 ± 0,03

21 °C 0,80 ± 0,05 0,80 ± 0,02 0,78 ± 0,02

6 h 32 °C 0,85 ± 0,02

a,b,# 0,81 ± 0,04

a 0,78 ± 0,03

b

21 °C 0,79 ± 0,03# 0,79 ± 0,04 0,80 ± 0,04

LIN

K 32 °C 0,55 ± 0,05 0,51 ± 0,05 0,51 ± 0,02

30 min

32 °C 0,57 ± 0,06 0,52 ± 0,06 0,51 ± 0,03

21 °C 0,56 ± 0,07 0,52 ± 0,05 0,53 ± 0,03

60 min

32 °C 0,60 ± 0,07a 0,54 ± 0,05

b 0,51 ± 0,05

b

21 °C 0,57 ± 0,06 0,54 ± 0,0 0,52 ± 0,03

3 h

32 °C 0,56 ± 0,11 0,55 ± 0,05 0,53 ± 0,05

21 °C 0,53 ± 0,08 0,53 ± 0,04 0,51 ± 0,03

6 h 32 °C 0,61 ± 0,06

a,# 0,55 ± 0,07

a,b 0,50 ± 0,07

b

21 °C 0,52 ± 0,06# 0,52 ± 0,07 0,53 ± 0,06

WOB

K 32 °C 0,67 ± 0,04 0,64 ± 0,04 0,64 ± 0,02

30 min

32 °C 0,69 ± 0,05a 0,65 ± 0,04

b 0,65 ± 0,02

a,b

21 °C 0,68 ± 0,05 0,65 ± 0,03 0,66 ± 0,02

60 min

32 °C 0,71 ± 0,05a,#

0,67 ± 0,04b 0,65 ± 0,04

b

21 °C 0,69 ± 0,05# 0,67 ± 0,04 0,65 ± 0,02

3 h

32 °C 0,67 ± 0,09 0,67 ± 0,04 0,67 ± 0,05

21 °C 0,66 ± 0,06 0,65 ± 0,03 0,65 ± 0,02

6 h 32 °C 0,71 ± 0,05 0,68 ± 0,05 0,64 ± 0,06

21 °C 0,66 ± 0,05 0,66 ± 0,05 0,66 ± 0,05

ALH [µm]

K 32 °C 2,75 ± 0,66 2,18 ± 0,44 2,2 ± 0,55

30 min 32 °C 2,55 ± 0,62 2,22 ± 0,42 2,19 ± 0,50

21 °C 2,52 ± 0,58 2,18 ± 0,33 2,18 ± 0,48

60 min 32 °C 2,18 ± 0,57 2,00 ± 0,38 2,11 ± 0,65

21 °C 2,32 ± 0,45 2,18 ± 0,34 2,20 ± 0,59

3 h 32 °C 2,14 ± 0,40 2,01 ± 0,47 2,07 ± 0,68

21 °C 2,21 ± 0,32 2,27 ± 0,40 2,24 ± 0,49

6 h 32 °C 2,12 ± 0,47 1,79 ± 0,43 1,98 ± 0,79

21 °C 2,17 ± 0,30 2,29 ± 0,45 2,19 ± 0,63

BCF [Hz]

K 32 °C 39,8 ± 3,1 37,9 ± 3,9 35,9 ± 6,2

30 min 32 °C 40,4 ± 1,4

a 37,0 ± 2,9

a,b 34,3 ± 4,8

b

21 °C 40,0 ± 1,3 36,7 ± 2,9 36,2 ± 5,5

60 min 32 °C 37,8 ± 4,5 34,9 ± ,2 32,8 ± 8,9

21 °C 39,9 ± 1,2 36,9 ± 2,0 35,1 ± 6,3

3 h 32 °C 35,9 ± 10,0 35,0 ± 7,3 34,1 ± 8,1

21 °C 39,0 ± 2,8 38,1 ± 3,1 36,9 ± 5,8

6 h 32 °C 37,2 ± 4,1 29,2 ± 12,6 29,6 ± 13,9

21 °C 39,0 ± 3,2 37,6 ± 2,5 35,7 ± 5,6 K= Kontrolle;



VAP = velocity average path; VCL = velocity curved line; VSL = velocity straight-line; STR = straightness (VSL/VAP); LIN =

linearity (VAP/VCL); WOB = wobble (VAP/VCL); ALH = amplitude of lateral head-displacement; BCF = beat cross frequency

Anhang

136

Tabelle 12: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 4 b in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)


Lagerungsdauer

d0 d 1 d 3

Membran-intakte

Spermien [%]

K 32 °C 92,7 ± 1,7 91,7 ± 2,1 90,8 ± 2,8

30 min 32 °C 91,8 ± 2,4 92,1 ± 2,5 90,5 ± 3,2

21 °C 93,1 ± 2,3 92,1 ± 1,4 92,0 ± 1,0

60 min 32 °C 92,7 ± 1,6

a 91,1 ± 1,7

b 91,0 ± 2,5

b

21 °C 93,2 ± 1,8 91,8 ± 2,0 92,2 ± 1,1

3 h 32 °C 92,8 ± 1,3 92,0 ± 2,5 90,6 ± 2,7

21 °C 93,3 ± 2,0a

91,9 ± 1,6a,b

91,8 ± 2,5b

6 h 32 °C 93,1 ± 0,9

a 92,0 ± 1,9

a,b 90,9 ± 1,5

b

21 °C 92,8 ± 2,4 92,3 ± 1,6 92,1 ± 1,4 K= Kontrolle;


Anhang

137

Tabelle 13: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 5 in Abhängigkeit vom Abkühlregime und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)

Parameter Abkühlregime Lagerungsdauer

d1 d 3 d 6

Gesamt-motilität [%]

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

85,8 ± 4,7

84,8 ± 2,0

87,9 ± 3,6

86,5 ± 2,0

84,7 ± 4,5

80,5 ± 5,1

Progressive Motilität [%]

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

75,8 ± 7,5

74,1 ± 7,3

78,0 ± 6,0

77,22 ± 3,8

73,3 ± 9,3

64,23 ± 9,3

VAP [µm/s]

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

64,9 ± 6,0

62,6 ± 10,7

61,3 ± 8,4

63,2 ± 12,0

64,6 ± 5,1

54,1 ± 12,9

VCL [µm/s]

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

108,5 ± 19,5

104,7 ± 28,0

98,7 ± 16,5

103,6 ± 27,4

98,5 ± 11,5

85,9 ± 24,8

VSL [µm/s]

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

47,1 ± 3,4

45,5 ± 4,0

45,6 ± 6,1

46,7 ± 4,3

51,6 ± 5,4

41,2 ± 7,9

STR 32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

0,73 ± 0,09a

0,74 ± 0,09

0,74 ± 0,06a,b

0,75 ± 0,09

0,79 ± 0,07b

0,77 ± 0,08

LIN

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

0,44 ± 0,09a

0,45 ± 0,1

0,46 ± 0,06a,b

0,47 ± 0,09

0,53 ± 0,09b

0,49 ± 0,09

WOB

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

0,60 ± 0,05a

0,61 ± 0,06

0,62 ± 0,04a,b

0,61 ± 0,05

0,66 ± 0,06b

0,64 ± 0,05

ALH [µm]

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

2,62 ± 0,48a

2,52 ± 0,61a,b

2,39 ± 0,48a,b

2,48 ± 0,57a

2,32 ± 0,39a

2,09 ± 0,53b

BCF [Hz]

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

36,8 ± 1,3

35,1 ± 2,2

34,4 ± 3,3

35,2 ± 2,7

35,5 ± 1,9

30,7 ± 4,6

K= Kontrolle



Tabelle 14: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 5 in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)

Parameter Abkühlregime Lagerungsdauer

d1 d 3 d 6

Membran-intakte

Spermien [%]

32°C–21°C–17°C

32°C–17°C

86,80 ± 3,45a

86,15 ± 3,31a

84,30 ± 3,45b

83,78 ± 2,91b

82,97 ± 2,73b

81,28 ± 2,48c

K= Kontrolle;


Anhang

138

Tabelle 15: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 6 in Abhängigkeit von der Art der

Verarbeitung und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber)

Parameter Verarbeitung Lagerungsdauer

d 1 d 3 d 6

Gesamt-motilität [%]

Standard

Station

88,8 ± 2,7

90,3 ± 2,6

87,9 ± 3,0

90,6 ± 1,9

82,6 ± 7,0

85,6 ± 5,6

Progressive Motilität [%]

Standard

Station

83,7 ± 4,5

86,3 ± 4,0

81,3 ± 7,3#

85,3 ± 6,0#

73,3 ± 17,3#

76,8 ± 18,2#

VAP [µm/s] isotherm

hypotherm

70,4 ± 16,3

69,2 ± 12,6

66,8 ± 14,5

69,1 ± 12,5

64,6 ± 22,7

63,5 ± 21,1

VCL [µm/s] isotherm

hypotherm

103,7 ± 29,8

99,8 ± 23,5

93,1 ± 22,3

98,4 ± 18,3

89,5 ± 30,0

88,4 ± 29,5

VSL [µm/s] isotherm

hypotherm

54,5 ± 9,0

55,3 ± 7,6

54,5 ± 9,8

56,2 ± 8,6

53,3 ± 18,6

52,1 ± 17,6

STR isotherm

hypotherm

0,78 ± 0,10

0,8 ± 0,07

0,82 ± 0,06

0,81 ± 0,04

0,82 ± 0,04

0,81 ± 0,04

LIN

isotherm

hypotherm

0,54 ± 0,11

0,57 ± 0,11

0,59 ± 0,08

0,57 ± 0,06

0,59 ± 0,07

0,59 ± 0,07

WOB

isotherm

hypotherm

0,69 ± 0,06

0,7 ± 0,08

0,72 ± 0,05

0,7 ± 0,04

0,71 ± 0,05

0,71 ± 0,04

ALH [µm] isotherm

hypotherm

2,25 ± 0,68

2,11 ± 0,52

1,99 ± 0,47

2,07 ± 0,45

1,94 ± 0,5

1,93 ± 0,47

BCF [Hz] isotherm

hypotherm

37,4 ± 4,8

37,2 ± 4,6

36,1 ± 4,2

37,7 ± 3,3

33,8 ± 7,5

33,8 ± 8,1

#: gleiche Symbole zeigen signifikante Unterschiede zwischen der Art Verarbeitung bei gleicher Lagerungsdauer (p < 0,05)


Tabelle 16: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen in % (MW ± SD) von Experiment 6 in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 12 Eber)

Parameter Verarbeitung Lagerungsdauer

d 1 d 3 d 6

Membran-integrität[%]

Standard

Station 92,3 ± 1,8 91,9 ± 1,6

92,1 ± 1,9 92,0 ± 1,7

90,7 ± 2,8 91,4 ± 1,5

Spezifische Reaktivität gg. Bicarbonat [%]

Standard

Station 31,7 ± 7,4

#

40,3 ± 6,5#

#: gleiche Symbole zeigen signifikante Unterschiede zwischen der Art Verarbeitung bei gleicher Lagerungsdauer (p < 0,05)

Anhang

139

Abb. 41: Prozentualer Anteil der Spermien pro Geschwindigkeitsklasse der VAP (velocity average path; in µm/ s) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (Stähr et al., 2009)

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

18%

Ante

il der

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

Geschwindigkeit in µm/ s

VAP

K d0

21-6 d0

32-6 d0

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

18%

Ante

il der

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

Geschwindigkeit in µm/ s

VAP

Kontrolle

32-6

21-6

Kontrolle*-d1

32°C-6h-d1

21°C-6h-d1

Kontrolle*-d0

21°C-6h-d0

32°C-6h-d0

A

B

Anhang

140

Abb. 42: Prozentualer Anteil der Spermien pro Geschwindigkeitsklasse der VSL (velocity straight line; in µm/ s) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (Stähr et al., 2009)

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

18%

20%

Sper

mie

nan

teil

pro

Kla

sse

in %

Geschwindigkeitsklassen in µm/s

VSL

K d0

21-6 d0

32-6 d0

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

18%

20%

Sper

mie

nan

teil

pro

Kla

sse

in %

Geschwindigkeitsklassen in µm/s

VSL

K d1

21-6 d1

32-6 d1

B

A

Kontrolle*-d0

21°C-6h-d0

32°C-6h-d0

Kontrolle*-d1

21°C-6h-d1

32°C-6h-d1

Anhang

141

Abb. 43: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der STR (straightness; VSL/VAP) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (Stähr et al., 2009)

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

9%0

-0,0

4

0,0

5-0

,08

0,0

9-0

,12

0,1

3-0

,16

0,1

7-0

,2

0,2

1-0

,24

0,2

5-0

,28

0,2

9-0

,32

0,3

3-0

,36

0,3

7-0

,4

0,4

1-0

,44

0,4

5-0

,48

0,4

9-0

,52

0,5

3-0

,56

0,5

7-0

,6

0,6

1-0

,64

0,6

5-0

,68

0,6

9-0

,72

0,7

2-0

,76

0,7

7-0

,8

0,8

1-0

,84

0,8

5-0

,88

0,8

9-0

,92

0,9

3-0

,96

0,9

7-1

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

Straightness (VSL/VAP)

STR

K d0

21-6 d0

32-6 d0

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

9%

0-0

,04

0,0

5-0

,08

0,0

9-0

,12

0,1

3-0

,16

0,1

7-0

,2

0,2

1-0

,24

0,2

5-0

,28

0,2

9-0

,32

0,3

3-0

,36

0,3

7-0

,4

0,4

1-0

,44

0,4

5-0

,48

0,4

9-0

,52

0,5

3-0

,56

0,5

7-0

,6

0,6

1-0

,64

0,6

5-0

,68

0,6

9-0

,72

0,7

2-0

,76

0,7

7-0

,8

0,8

1-0

,84

0,8

5-0

,88

0,8

9-0

,92

0,9

3-0

,96

0,9

7-1

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

Straightness (VSL/VAP)

STR

K d1

21-6 d1

32-6 d1

Kontrolle*-d1

21°C-6h-d1

32°C-6h-d1

Kontrolle*-d0

21°C-6h-d0

32°C-6h-d0

A

B

Anhang

142

Abb. 44: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der LIN (linearity; VSL/VCL) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (Stähr et al., 2009)

0%

1%

2%

3%

4%

5%

0-0

,04

0,0

5-0

,08

0,0

9-0

,12

0,1

3-0

,16

0,1

7-0

,2

0,2

1-0

,24

0,2

5-0

,28

0,2

9-0

,32

0,3

3-0

,36

0,3

7-0

,4

0,4

1-0

,44

0,4

5-0

,48

0,4

9-0

,52

0,5

3-0

,56

0,5

7-0

,6

0,6

1-0

,64

0,6

5-0

,68

0,6

9-0

,72

0,7

2-0

,76

0,7

7-0

,8

0,8

1-0

,84

0,8

5-0

,88

0,8

9-0

,92

0,9

3-0

,96

0,9

7-1

Sper

mie

nan

teil

pro

Kla

sse

in %

Linearität (VSL/VCL)

LIN K d0

21-6 d0

32-6 d0

0%

1%

2%

3%

4%

5%

0-0

,04

0,0

5-0

,08

0,0

9-0

,12

0,1

3-0

,16

0,1

7-0

,2

0,2

1-0

,24

0,2

5-0

,28

0,2

9-0

,32

0,3

3-0

,36

0,3

7-0

,4

0,4

1-0

,44

0,4

5-0

,48

0,4

9-0

,52

0,5

3-0

,56

0,5

7-0

,6

0,6

1-0

,64

0,6

5-0

,68

0,6

9-0

,72

0,7

2-0

,76

0,7

7-0

,8

0,8

1-0

,84

0,8

5-0

,88

0,8

9-0

,92

0,9

3-0

,96

0,9

7-1

Sper

mie

nan

teil

pro

Kla

sse

in %

Linearität (VSL/VCL)

LIN 21-6 d1

32-6

K-d1

21°C-6h-d1

32°C-6h-d1

Kontrolle*-d1

Kontrolle*-d0

21°C-6h-d0

32°C-6h-d0

A

B

Anhang

143

Abb. 45: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der WOB (wobble; VAP/VCL) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (Stähr et al., 2009)

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%0

-0,0

4

0,0

5-0

,08

0,0

9-0

,12

0,1

3-0

,16

0,1

7-0

,2

0,2

1-0

,24

0,2

5-0

,28

0,2

9-0

,32

0,3

3-0

,36

0,3

7-0

,4

0,4

1-0

,44

0,4

5-0

,48

0,4

9-0

,52

0,5

3-0

,56

0,5

7-0

,6

0,6

1-0

,64

0,6

5-0

,68

0,6

9-0

,72

0,7

2-0

,76

0,7

7-0

,8

0,8

1-0

,84

0,8

5-0

,88

0,8

9-0

,92

0,9

3-0

,96

0,9

7-1

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

Wobble (VAP/VCL)

WOB

K d0

21-6 d0

32-6 d0

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

0-0

,04

0,0

5-0

,08

0,0

9-0

,12

0,1

3-0

,16

0,1

7-0

,2

0,2

1-0

,24

0,2

5-0

,28

0,2

9-0

,32

0,3

3-0

,36

0,3

7-0

,4

0,4

1-0

,44

0,4

5-0

,48

0,4

9-0

,52

0,5

3-0

,56

0,5

7-0

,6

0,6

1-0

,64

0,6

5-0

,68

0,6

9-0

,72

0,7

2-0

,76

0,7

7-0

,8

0,8

1-0

,84

0,8

5-0

,88

0,8

9-0

,92

0,9

3-0

,96

0,9

7-1

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

Wobble (VAP/VCL)

WOB

K d1

21-6 d1

32-6 d1

Kontrolle*-d1

21°C-6h-d1

32°C-6h-d1

A

B

Kontrolle*-d0

21°C-6h-d0

32°C-6h-d0

Anhang

144

Abb. 46: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der ALH (amplitude of lateral head displacement; µm) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (Stähr et al.,2009)

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

18%

20%

0-0,5 0,5-1 1-1,5 1,5-2 2-2,5 2,5-3 3-3,5 3,5-4 4-4,5 4,5-5 5-5,5 5,5-6

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

amplitude of lateral head displacement (µm)

ALH

K d0

21-6 d0

32-6 d0

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

18%

20%

0-0,5 0,5-1 1-1,5 1,5-2 2-2,5 2,5-3 3-3,5 3,5-4 4-4,5 4,5-5 5-5,5

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

amplitude of lateral head displacement (µm)

ALH

K d1

21-6 d1

32-6 d1

Kontrolle*-d1

21°C-6h-d1

32°C-6h-d1

Kontrolle*-d0

21°C-6h-d0

32°C-6h-d0

A

B

Anhang

145

Abb. 47: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der BCF (beat cross frequency; Hz) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. *Kontrolle: 15 min bei 32 °C, Verarbeitung nach ZDS-Empfehlung (Stähr et al., 2009)

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

9%

0-4 6,1-8 10,1-12 14,1-16 18,1-20 22,1-24 26,1-28 30,1-32 34,1-36 38,1-40 42,1-44 46,1-48

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

beat cross frequency (Hz)

BCF K d0

21-6 d0

32-6 d0

0%

1%

2%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

9%

0-4 6,1-8 10,1-12 14,1-16 18,1-20 22,1-24 26,1-28 30,1-32 34,1-36 38,1-40 42,1-44 46,1-48

Sperm

ien p

ro K

lasse in %

beat cross frequency (Hz)

BCF K d1

21-6 d1

32-6 d1

Kontrolle*-d1

21°C-6h-d1

32°C-6h-d1

Kontrolle*-d0

21°C-6h-d0

32°C-6h-d0

A

B

Anhang

146

9.2 Chemikalien

Substanz Bezugsquelle Artikelnummer

A23187 (Calcimycin) Alexis Chemicals, Lausen (CH) 52665-69-7

Adenylatkinase Sigma Aldrich, Steinheim M 3003

ATP-Bioluminescent-Assay-Kit Sigma Aldrich, Steinheim FLAA

BSA, Fraction V SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg

1193-03

Calciumchlorid Merck, Darmstadt 102393

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe 4720.4

DNA Control UV Partec GmbH, Münster 05-4018

FITC-PNA Axorra, Lörrach C-FL-1071-M01

Fluo-3 AM ultra pure grade Biomol, Hamburg ABD-21011

Formaldehyd 37% Roth, Karlsruhe 4980.2

HEPES PUFFERAN® Roth, Karlsruhe HN78

Hoechst 33342 Invitrogen™/ Life Technologies Carlsbad (USA)

H-1399

JC-1 iodide Enzo Lifescience, Lörrach ALX-620-053-M005

Kaliumchlorid AppliChem GmbH, Darmstadt A3582

Kaliumhydroxid AppliChem GmbH, Darmstadt A3871

Magnesiumsufat Sigma Aldrich, Schnelldorf M5921

Magnesiumchlorid Roth, Karlsruhe 2189

Natriumchlorid Roth, Karlsruhe 3957

Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma Aldrich, Steinheim P5725

Anhang

147

Phosphoenolpyruvat Sigma Aldrich, Steinheim P7022

Propidiumiodid (PI) Sigma Aldrich, Schnelldorf P-4170-100MG

Pyruvatkinase Sigma Aldrich, Steinheim P1506

Tricin Sigma Aldrich, Schnelldorf T 0377

Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Roth, Karlsruhe 3580.3

α-D(+)-Glucose-Monohydrat Roth, Karlsruhe 6780

9.3 Rezepte

9.3.1 Formolcitrat

9,86 mmol tri-Natriumcitrat-Dihydrat

ad 100 ml aqua dest

4 ml der Lösung verwerfen, durch 4 ml 37 %-iges Formalin ersetzen und vermischen.

Die Aufbewahrung der Lösung erfolgte aliquotiert (300 µl) bei 4 °C

9.3.2 HBS (HEPES®- buffered saline)

137,0 mmol NaCl

20,0 mmol HEPES®

10,0 mmol α-D(+)-Glucose-Monohydrat

2,5 mmol KOH

ad 1000 ml aqua dest

Osmolarität: 300 mOsmol/kg

pH 7,4 bei Gebrauchstemperatur von 38 °C (Titration mit 1 M NaOH)

Die Aufbewahrung erfolgte für höchstens 24 h in einem verschlossenen Glaskolben

im Kühlschrank

Anhang

148

9.3.3 Tyrode basierte Medien

9.3.3.1 Herstellung der Stammlösungen

NaCl 0,5 M

KCl 0,5 M

MgSO4 * 7H2O 0,1 M

Glucose * H2O 0,5 M

NaHCO3 0,3 M

CaCl2 0,5 M

KH2PO4 0,1 M

Hepes 0,2 M (pH 7,55 bei 20 °C mit NaOH (1 M) eingestellt)

Gentamycinsulfat 20 mg/ ml

9.3.3.2 Herstellung der Tyr BikCa-Vormischung

Je 96,0 mmol NaCl-Stammlösung

3,1 mmol KCl-Stammlösung

0,4 mmol MgSO4 * 7H2O-Stammlösung

5,0 mmol Glucose * H2O-Stammlösung

15,0 mmol NaHCO3-Stammlösung

2,0 mmol CaCl2-Stammlösung

0,3 mmol KH2PO4-Stammlösung

20,0 mmol Hepes-Stammlösung

wurden in eine Eberflasche pipettiert und bei -20 °C bis zum Gebrauch gelagert. Am

Versuchstag wurde die Vormischung aufgetaut und wie unter … beschrieben

komplettiert.

Anhang

149

9.3.3.3 Herstellung der TyrCa-Vormischung

Je 111,0 mmol NaCl-Stammlösung

3,1 mmol KCl-Stammlösung

0,4 mmol MgSO4 * 7H2O-Stammlösung

5,0 mmol Glucose * H2O-Stammlösung

2,0 mmol CaCl2-Stammlösung

0,3 mmol KH2PO4-Stammlösung

20,0 mmol Hepes-Stammlösung

wurden in eine Eberflasche pipettiert und bei -20 °C bis zum Gebrauch gelagert. Am

Versuchstag wurde die Vormischung aufgetaut und wie unter … beschrieben

komplettiert.

9.3.3.4 Komplettierung der Medien

Tyr BikCa - bzw. TyrCa –Vormischung

21,7 mmol Na-Lactat

1,0 mmol Na-Pyruvat

0,5 ml Gentamycin-Stammlösung

0,002 g Phenolrot

ad 100 ml Aqua dest

Die Osmolarität der Lösungen lag bei 300 ± 5 mOsmol/ kg. Der pH des

Kapazitationsmediums wurde auf 7,6 (+20 °C) eingestellt, der pH-Wert des nicht

kapazitierenden Mediums lag bei 7,55 (+20 °C). Nach Sterilfiltration wurden die

beiden Medien mit jeweils 3 mg/ ml BSA versetzt.

Anhang

150

9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien

96 well Mikrotiterplatte

white wall, clear bottom

Fa. Biohit, Rosbach

CO2-Inkubator MCO-17AC Sanyo, Bad Nenndorf

Deckgläser 18 x 18 mm Interessengemeinschaft der

Laborfachhändler (IDL) GmbH & Co KG,

Nidderau

Durchflusszytometer Dako Galaxy Partec GmbH, Münster

Ebersamenflaschen mit Verschluss Fa. Minitüb GmbH & Co KG, Tiefenbach

Einmalhandschuhe

Manuplast

Nobaglove Latex

Nobaglove Nitril

Vinyl 2000 PF

Landgraf Laborsysteme, Langenhagen

NOBA Verbandmittel Danz GmbH & Co

KG, Wetter

Meditrade, Kiefersfelden

Einmalspritzen, steril 20 ml Fa. Braun, Melsungen

Filter; PES Membran; 0,22 µm

Porendurchmesser

Milipore, Irland

Gefrierpunktosmometer, Osmomat 030 Gonotec, Berlin

Glas-Filtrationsgerät mit Glasfilterplatte Interessenfachgemeinschaft der

Laborfachhändler (IDL) GmbH & Co KG,

Nidderau

Heizplatten

HT 50

HT 200

Fa. Minitüb GmbH & Co KG, Tiefenbach

Klimaschränke mit Digitalregler Fa. Minitüb GmbH & Co KG, Tiefenbach

Anhang

151

Laborwaagen

PT 12

ALC-80

Sartorius AG, Göttingen

Laborzentrifuge

Universal 30 RF

Sepatech Biofuge 13

Megafuge 2.0 R

Fa.Hettich, Tuttlingen

Fa. Heraeus, Hanau

Fa. Heraeus, Hanau

Magnetrührer, MR3001K Heidolph, Schwabach

Messgefäße Osmomat 030 Gonotec, Berlin

Mikromec multisens Fa. Minitüb GmbH & Co KG, Tiefenbach

NaCl-Röhrchen Sarstedt, Nürnbrecht

Objektträger 76 x 26 mm Gerhard Menzel GmbH, Braunschweig

Parafilm Landgraf Laborsysteme, Langenhagen

Phantom für Eber Fa. Minitüb GmbH & Co KG, Tiefenbach

Phasenkontrastmikroskope

Anxiostar Plus

Zeiss 4713849

Zeiss, Jena

pH-Meter, Multiplex 3000/ pmx WTW, Weilheim

Pipette, elektronisch

Biohit eLine E 1000

Fa. Biohit, Rosbach

Pipettenspitzen Nerbe plus, Winsen/ Luhe

Plattenphotometer

Tecan GENios pro plate reader

Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz

Anhang

152

Reagenzröhrchen 3,5 ml mit

Eindrückstopfen

Sarstedt, Nürnbrecht

Reaktionsgefäße 1,5 ml

schwarz und transparent

Landgraf Laborsysteme, Langenhagen

Samenauffangbecher Fa. Minitüb GmbH & Co KG, Tiefenbach

Samenauffangbeutel, US Bag™ Fa. Minitüb GmbH & Co KG, Tiefenbach

Spritzenansatzfilter, PES-Membran,

0,22 µm Porendurchmesser, steril

Carl Roth GmbH & Co KG, Karlsruhe

Thermomixer 5436 Fa. Eppendorf, Hamburg

Variable Einkanalpipetten Eppendorf, Hamburg

Vortex, Reax top Heidolph, Schwabach

Wärmeschränke Memmert, Schwabach

Wasserbäder

Typ 1013

WNB 745

GFL, Burgwedel

Memmert, Schwabach

Wasserstrahlpumpe Landgraf Laborsysteme, Langenhagen

Zählkammer „Leja“

20 micron, 4-chamber-slide

Leja Products B.V., Nieuw-Vennep,

Niederlande

Zählkammer nach Thoma, „neu“ Fa. Jürgens, Hannover

Abbildungsverzeichnis

153

10 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Übersicht aller durchgeführten Experimente .............................................................17

Abb. 2: Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in Experiment 1. Vergleich von

hypothermer und isothermer Verdünnung mit Haltezeiten bei zwei Haltetemperaturen (21 °C/

32 °C) und zwei Verdünnungsstufen (10 x 106 Spermien/ ml; 20 x 106 Spermien/ ml). .........23

Abb. 3: Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in Experiment 2. Vergleich von

Haltezeiten bei verschiedenen Haltetemperaturen (21 °C/ 32 °C) bei zweistufig isothermer

Verdünnung. .........................................................................................................................26

Abb. 4: Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in Experiment 3. Vergleich

zweistufig isothermer und zweistufig hyperthermer Verdünnung nach Haltezeiten bei 21 °C.

.............................................................................................................................................28

Abb. 5: Temperatur- und Zeitregime der zweistufig hypothermen Samenverarbeitung in

Experiment 4 a. Vergleich von Haltezeiten bei verschiedenen Haltetemperaturen (21 °C/

32 °C) des ausverdünnten Samens nach zweistufig hypothermer Verdünnung. ...................30

Abb. 6: Temperatur- und Zeitregime der einstufig isothermen Samenverarbeitung in

Experiment 4 b. Vergleich von Haltezeiten bei verschiedenen Haltetemperaturen

(21 °C/ 32 °C) des ausverdünnten Samens nach einstufig isothermer Verdünnung. ............31

Abb. 7: Temperatur- und Zeitregime der einstufig isothermen Samenverarbeitung in

Experiment 5. Vergleich von einer beschleunigten Abkühlrate ohne Haltezeit zur

Standardabkühlung mit 90 min Haltezeit nach einstufig isothermer Verdünnung. .................32

Abb. 8: Prozesskette der Samenverarbeitung in einer Besamungsstation. Die grauen

Flächen stellen Zeitpunkte für mögliche Verzögerungen in der Verarbeitung dar, aus denen

sich Haltezeiten unterschiedlicher Länge ergeben. ...............................................................35

Abb. 9: Vergleich von Temperatur- und Zeitregime der Samenverarbeitung in der

Besamungsstation mit Laborstandard in Experiment 6. ........................................................37

Abb. 10: Beispiel einer Standardkurve des ATP-Assays ......................................................55

Abb. 11: Temperaturverlauf während der zweistufig hypothermen (blaue Linie) und

isothermen (rote Linie) Samenverarbeitung bei Experiment 1. Mittelwerte von je 3

Samenproben. Die Samenproben wurden im Verhältnis 1:1 (200 ml: 200 ml) mit Beltsville

Thawing Solution (BTS, 32 °C) verdünnt. Für die zweistufig isotherme Verdünnung wurde

eine Hälfte des vorverdünnten Samen für ca. 15 min bei 32 °C (Wasserbad) gehalten um

dann mit BTS (32 °C) auf die Endkonzentration in Ebersamenflaschen verdünnt zu werden.

Abkühlung der Proben 90 min bei 21 °C anschließend weitere Abkühlung und Lagerung in

einen auf 17 °C temperierten Klimaschrank verbracht. Für zweistufig hypotherme

Verarbeitung wurde nach der Vorverdünnung die andere Hälfte der Probe für 20 min bei


154

21 °C gehalten. Die weitere Verdünnung erfolgte mit auf 21 °C temperierter BTS, wodurch

der schnelle Abfall der Probentemperatur zu erklären ist. Die weitere Verarbeitung entsprach

den zweistufig isotherm verarbeiteten Proben. .....................................................................60

Abb. 12: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der Art der

zweistufigen Verdünnung (isotherm vs. hypotherm), Verdünnungsgrad (20 x 106 und

10 x 106 Spermien/ ml) und Lagerungsdauer (d 1, d 3, d 6) bei 17 °C; n = 6 Ejakulate. ........61

Abb. 13: Prozentualer Anteil membranintakter (PI und FITC-PNA negativer) Spermien (MW +

SD) in Abhängigkeit von der Art der zweistufigen Verdünnung (isotherm vs. hypotherm),

Verdünnungsgrad (20 x 106 und 10 x 106 Spermien/ ml) und Lagerungsdauer (d 1, d3, d 6)

bei 17 °C; n = 6 Ejakulate. ....................................................................................................63

Abb. 14: Temperaturverlauf der bei Experiment 2 bei 21 °C gehaltenen Proben. Mittelwerte

von je 3 Samenproben. Diese wurden im Verhältnis 1:1 (200 ml: 200 ml) mit Beltsville

Thawing Solution (BTS, 32°C) verdünnt und zweistufig isotherm weiterverarbeitet. Je 200ml

des vorverdünnten Samen wurden bei 32 °C bzw. 21 °C gehalten (für 30 min, 60 min, 3 h

und 6 h), danach ausverdünnt (in 100 ml Ebersamenflaschen), für weitere 90 min bei 21 °C

gehalten und anschließend bei 17 °C gelagert. ....................................................................66

Abb. 15: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit von der

Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Die

gestreifte Säule entspricht der Kontrolle*, rote Säulen den Proben mit Haltetemperatur von

32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C. Farbabstufungen: unterschiedlichen

Haltezeiten (30 min – 6 h); ...................................................................................................67

Abb. 16: Prozentualer Anteil der Spermien pro Geschwindigkeitsklasse der VCL (velocity

curvilinear; in µm/ s) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der

Kontrollprobe*, die grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der

für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. ......................................................................................69

Abb. 17: Prozentualer Anteil membranintakter (PI und FITC-PNA negative) Spermien (MW +

SD) in Abhängigkeit von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des

vorverdünnten Samens. Die gestreifte Säule entspricht der Kontrolle*, rote Säulen den

Proben mit Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C. Die

Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=12 Ejakulate für d0 – d3;

n=6 Ejakulate für d6). ...........................................................................................................70

Abb. 18: Prozentualer Anteil der PI-negativen (Plasmamembran-intakten) Spermien mit

mehrheitlich hohem Mitochondrienmembranpotential (MMP) in Abhängigkeit von der

Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Die

gestreifte Säule entspricht der Kontrolle*, rote Säulen den Proben mit Haltetemperatur von

32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C. Die Farbabstufungen:

unterschiedlichen Haltezeiten; n=6 Ejakulate. ......................................................................71


155

Abb. 19: Mittlere Fluoreszenzintensität (orange Jagg) aller Spermien (MW + SD) in

Abhängigkeit von der Lagerungsdauer, Haltetemperatur und der Haltezeit des vorverdünnten

Samens. Die gestreifte Säule entspricht der Kontrolle*, rote Säulen den Proben mit

Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C.

Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten;n=6 Ejakulate. ...........................................72

Abb. 20: ATP – Gehalt der Spermien in pmol/ 50000 Spemien (MW + SD) in Abhängigkeit

von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Die

grüne Säule entspricht dem ATP – Gehalt der unbehandelten Samenprobe, die gestreifte

Säule der Kontrolle*. Rote Säulen entsprechen den Proben mit einer Haltetemperatur von

32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C. Farbabstufungen: unterschiedlichen

Haltezeiten (30 min – 6 h); n=6 Ejakulate. ............................................................................73

Abb. 21: Energieladung (EC) der Spermien in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer, Halte-

temperatur und der Haltezeit des vorverdünnten Samens. Die grüne Säule entspricht der EC

der unbehandelten Samenproben, die gestreifte Säule der Kontrollen*. Rote Säulen

entsprechen den Proben mit einer Haltetemperatur von 32 °C und die blauen Säulen Proben

mit einer Haltetemperatur von 21 °C. Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten

(30 min – 6 h); n=6 Ejakulate. ...............................................................................................74

Abb. 22: Gesamtkeimzahlen (GKZ) der Samenproben in KbE/ ml (MW + SD) in Abhängigkeit

von der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens (n =

4). .........................................................................................................................................75

Abb. 23: Gesamtkeimzahlen (GKZ) der Samenproben in KbE/ ml (MW + SD) der Proben an

Tag 0 bei 32 °C (A) und 21 °C Haltetemperatur (B) in Abhängigkeit der Eber und der

Haltezeit des vorverdünnten Samens. Rote Säulen entsprechen den Proben mit einer

Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C (je 60 min und 6

h); n=4 Ejakulate ..................................................................................................................77

Abb. 24: Gesamtkeimzahlen (GKZ) der Samenproben in KbE/ ml (MW * SD) der Proben an

Tag 3 bei 32 °C (A) und 21 °C Haltetemperatur (B) in Abhängigkeit der Eber und der

Haltezeit des vorverdünnten Samens. Rote Säulen entsprechen den Proben mit einer

Haltetemperatur von 32 °C und blaue Säulen der Haltetemperatur von 21 °C (je 60 min und 6

h); n=4 Ejakulate. .................................................................................................................78

Abb. 25: Temperaturverlauf der bei Experiment 3 bei 21 °C gehaltenen und anschließend

hypertherm verdünnten Proben. Mittelwerte von je 3 Samenproben. Diese wurden im

Verhältnis 1:1 (200ml: 200 ml) mit Beltsville Thawing Solution (BTS, 32 °C) verdünnt und

zweistufig hypertherm bzw. isotherm weiterverarbeitet. Beide vorverdünnte Proben wurden

bei 21 °C gehalten (für 30 min, 60 min 3 h und 6 h), danach hypertherm (BTS, 32 °C) bzw.

isotherm ausverdünnt, für weitere 90 min bei 21 °C gehalten und anschließend bei 17 °C

gelagert. ...............................................................................................................................80


Verdünnertemperatur im zweiten Verdünnungsschritt, der Haltezeit des vorverdünnten


156

Samens und der Lagerungsdauer. Dargestellt sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen),

hypertherm ausverdünnte Proben (rote Säulen) und isotherm ausverdünnte Proben (blaue

Säulen). Farbabstufungen: unterschiedliche Haltezeiten; n=6 Ejakulate. ..............................81

Abb. 27: Prozentualer Anteil membranintakter (PI und FITC-PNA negative) Spermien (MW +

SD) in Abhängigkeit von der Verdünnertemperatur im zweiten Verdünnungsschritt, der

Haltezeit des vorverdünnten Samens und der Lagerungsdauer; n=6 Ejakulate ....................83

Abb. 28: Temperaturverlauf der bei Experiment 4a zweistufig hypotherm verdünnten und

anschließend bei 32 °C gehaltenen Proben. Mittelwerte von je 3 Samenproben. Diese

wurden im Verhältnis 1:1 (200 ml: 200 ml) mit Beltsville Thawing Solution (BTS 32 °C)

verdünnt 20 min bei 21 °C gehalten und schließlich mit BTS (21 °C) hypotherm ausverdünnt.

Die ausverdünnten Proben (in 100 ml Ebersamenflaschen) wurden bei 32 °C bzw. 21 °C

gehalten (für 30 min, 60 min, 3 h und 6 h), und danach für weitere 90 min bei 21 °C gehalten

und anschließend bei 17 °C gelagert. ...................................................................................85


Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Dargestellt

sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), Proben mit Haltetemperatur 32 °C (rote Säulen), und

Proben mit Haltetemperatur 21 °C (rote Säulen). Farbabstufungen: unterschiedlichen


Abb. 30: Prozentualer Anteil membranintakter (PI und FITC-PNA negativer) Spermien (MW +

SD) in Abhängigkeit von der der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des

vorverdünnten Samens. Dargestellt sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), Proben mit

Haltetemperatur 32 °C (rote Säulen), und Proben mit Haltetemperatur 21 °C (rote Säulen). 87

Abb. 31: Temperaturverlauf der bei Experiment 4b einstufig isotherm verdünnten und

anschließend bei 21 °C gehaltenen Proben. Mittelwerte von je 3 Samenproben. Diese

wurden einstufig isotherm mit Beltsville Thawing Solution (BTS, 21 °C) ausverdünnt und in

100 ml Ebersamenflaschen abgefüllt. Die ausverdünnten Proben wurden bei 32 °C bzw. 21

°C gehalten (für 30 min, 60 min, 3 h und 6 h), und danach für weitere 90 min bei 21 °C

gehalten und anschließend bei 17 °C gelagert. . ..................................................................89


Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des vorverdünnten Samens. Dargestellt

sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), Proben mit Haltetemperatur 32 °C (rote Säulen), und

Proben mit Haltetemperatur 21 °C (rote Säulen). Farbabstufungen: unterschiedlichen


Abb. 33: Prozentualer Anteil membranintakter (PI- und FITC-PNA negativer) Spermien (MW

* SD) in Abhängigkeit von der der Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer des

vorverdünnten Samens. Dargestellt sind die Kontrolle* (gestreifte Säulen), Proben mit

Haltetemperatur 32 °C (rote Säulen), und Proben mit Haltetemperatur 21 °C (rote Säulen).

Farbabstufungen: unterschiedlichen Haltezeiten (30 min – 6 h); n=6 Ejakulate. ...................91


157

Abb. 34: Temperaturverlauf der bei Experiment 5 durchgeführten beschleunigten Abkühlung

(32 °C – 17 °C) und der Abkühlung gemäß ZDS-Empfehlungen (32 °C – 21 °C – 17°C) der

verdünnten Samenproben in 100 ml Ebersamenflaschen. Mittelwerte von je 3 Samenproben.

Die Samenproben einstufig isotherm mit 32 °C warmer Beltsville Thawing Solution (BTS) auf

die Endkonzentration 20 x 106 verdünnt. Anschließend kühlte ein Teil der Proben nach ZDS-

Empfehlungen 90 min bei 21 °C ab (blaue Kurve) und wurden bei 17 °C gelagert. Der andere

Teil kühlte direkt nach der Verdünnung bei 17 °C ab (rote Kurve). .......................................93

Abb. 35: Prozentualer Anteil motiler Spermien (MW + SD) in Abhängigkeit der Abkühlraten

und Lagerungsdauer; n=6 Ejakulate. Blaue Säulen: Abkühlung laut ZDS Empfehlungen;

Nach Verdünnung mit 32 °C 90 min Abkühlung bei 21 °C, anschließend weitere Abkühlung

und Lagerung bei 17 °C. .......................................................................................................94


+ SD) in Abhängigkeit der Abkühlrate und Lagerungsdauer. Blaue Säulen: Abkühlung laut

ZDS Empfehlungen; Nach Verdünnung mit 32 °C 90 min Abkühlung bei 21 °C, anschließend

Lagerung bei 17 °C. .............................................................................................................95

Abb. 37: Temperaturverlauf während der einstufig isothermen (Standard TiHo, schwarze

Linie) und zweistufig hypothermen (Station, rote und blaue Linie) Samenverarbeitung bei

Experiment 6. Beim Standard wurden die Proben direkt isotherm ausverdünnt, 90 min bei 21

°C einzeln gehalten und anschließend bei 17 °C gelagert. Bei der simulierten Verdünnung

der Besamungsstation fand eine isotherme Vorverdünnung (1:1) statt, anschließend eine

Haltezeit von 30 min bei 21 °C und mit BTS (26 °C) ausverdünnt. Nach der Abfüllung wurden

40 Tuben zusammen für 2,5 h in einer Plastikbox bei 21 °C gehalten und danach bei 17 °C

gelagert. Die rote Linie zeigt den Temperaturverlauf mittig liegender Tuben, die blaue Line

die Temperatur außen liegender Tuben; n=4 Ejakulate. .......................................................97


Verarbeitungsart und Lagerungsdauer; n=6 Ejakulate. .........................................................98


+ SD) in Abhängigkeit von der Verarbeitungsart und Lagerungsdauer; n=6 Ejakulate. .........99

Abb. 40: Spezifische Reaktivität auf Bicarbonat berechnet anhand der Propidiumiodid-

negativen (PI-neg.) und Fluo-3-negativen (Fluo-3-neg) Spermienpopulation nach 60 min

Inkubationsdauer; n=6 Ejakulate. Darstellung der Werte (MW + SD) in Abhängigkeit von der

Verarbeitungsart und Lagerungsdauer. .............................................................................. 100

Abb. 41: Prozentualer Anteil der Spermien pro Geschwindigkeitsklasse der VAP (velocity

average path; in µm/ s) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der


für 6h bei 32 °C gehaltenen Probe. .................................................................................... 139

Abb. 42: Prozentualer Anteil der Spermien pro Geschwindigkeitsklasse der VSL (velocity

straight line; in µm/ s) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der


158



Abb. 43: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der STR (straightness;

VSL/VAP) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die

grüne Linie der für 6 h bei 21 °C gehaltenen Probe und die rote Linie der für 6h bei 32 °C

gehaltenen Probe. .............................................................................................................. 141

Abb. 44: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der LIN (linearity;

VSL/VCL) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die



Abb. 45: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der WOB (wobble;

VAP/VCL) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die



Abb. 46: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der ALH (amplitude of

lateral head displacement; µm) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der



Abb. 47: Prozentualer Anteil der Spermien pro Bewegungsklasse der BCF (beat cross

frequency; Hz) an Tag 0 (A) und Tag 1 (B). Die blaue Linie entspricht der Kontrollprobe*, die



Tabellenverzeichnis

159

11 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 1 in Abhängigkeit der

Verdünnungsart, des Verdünnungsgrades und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber) .............. 122

Tabelle 2: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 1 in Abhängigkeit

der Verdünnungsart, des Verdünnungsgrades und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber) ........ 123


Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 12 Eber) ............................... 124

Tabelle 4: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen in % (MW ± SD) von

Experiment 2 in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n

= 12 Eber) .......................................................................................................................... 126

Tabelle 5: Ergebnisse der Analyse des Energiestoffwechsels (MW + SD) von Experiment 2 in

Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 12 Eber) ... 127


Haltezeit, der Verdünnertemperatur und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber) ........................ 128

Tabelle 7: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 3 in Abhängigkeit der

Haltezeit, der Verdünnertemperatur und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber) ........................ 130

Tabelle 8: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 4 a in Abhängigkeit der

Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber) ....................................... 131

Tabelle 9: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 4 a in Abhängigkeit

der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber) .......................... 132

Tabelle 10: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 4 a in Abhängigkeit


Tabelle 11: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 4 b in Abhängigkeit der

Haltetemperatur, Haltezeit und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber) ....................................... 134

Tabelle 12: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 4 b in Abhängigkeit


Tabelle 13: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 5 in Abhängigkeit vom

Abkühlregime und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber) .......................................................... 137

Tabelle 14: Membranintakte Spermien in % (MW ± SD) von Experiment 5 in Abhängigkeit


Tabelle 15: CASA Motilitätsparameter (MW ± SD) von Experiment 6 in Abhängigkeit von der

Art der Verarbeitung und der Lagerungsdauer (n = 6 Eber) ................................................ 138

Tabellenverzeichnis

160

Tabelle 16: Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen in % (MW ± SD) von

Experiment 6 in Abhängigkeit der Haltezeit, der Haltetemperatur und der Lagerungsdauer (n

= 12 Eber) .......................................................................................................................... 138

Danksagung

161

Danksagung

Zuerst möchte ich mich herzlich bei Frau Prof. Dagmar Waberski für die Überlassung

des interessanten Themas und die stets gewährte Unterstützung und Motivation

bedanken, sowie für die Möglichkeit des eigenständigen wissenschaftlichen

Arbeitens.

Der Firma Minitüb und dem Förderverein Biotechnologieforschung (FBF) danke ich

für die finanzielle Unterstützung der Arbeit.

Ein besonderer Dank geht an Herrn Dr. Heiko Henning für die Begleitung der

Dissertation vor Ort und aus der Ferne mit vielen Hilfestellungen sowie fachlichen

Anregungen.

Ich möchte auch den Mitarbeitern der Reproduktionsmedizinischen Einheit, vor allem

Anja, Xuyên und Quynh, allen Tierpflegern und meinen Mitdoktoranden, allen voran

Sabine und Annett, für ihre Hilfe danken.

Ein weiterer Dank geht an Frau Dr. Marion Piechotta aus der Klinik für Rinder für die

Bereitstellung der Räumlichkeiten und Geräte für die Nukleotid-Analyse.

Außerdem danke ich Frau Dr. Anja Riesenbeck und ihrem Team für die

Unterstützung auf der Besamungsstation.

Speziell möchte ich Thomas Willer danken. Er hat mich mit viel Geduld unterstützt,

mich mit seiner ruhigen Art immer wieder auf den Boden der Tatsaschen zurück

gebracht, und ist immer da, wenn ich ihn brauche. Außerdem haben unsere Ausflüge

für unvergessliche Erlebnisse und gelungene Abwechslung gesorgt.

Ganz herzlich bedanke ich mich bei meiner Familie, meiner Schwester Eva mit ihrer

Familie und ganz besonders bei meinen Eltern für ihre Geduld und Unterstützung in

jeglicher Hinsicht während des Studiums, der Promotion und darüber hinaus. Danke!

tierärztliche hochschule hannover · jahrestagung physiologie und pathologie der fortpflanzung,...

Documents