universidade estadual de santa cruz programa de pÓs...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

GIOVANNA ALCÂNTARA QUEIROZ

PROPAGAÇÃO, COLHEITA, SECAGEM E ATIVIDADES FUNGITÓXICAS

DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides Kunth.

ILHÉUS – BAHIA

2018




Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Produção Vegetal, da

Universidade Estadual de Santa Cruz, como

parte dos requisitos para a obtenção do título

de Doutor em Produção Vegetal.

Área de concentração: Cultivos em

Ambiente Tropical Úmido.

Orientadora: Profª. Drª. Larissa Corrêa

do Bomfim Costa

Co-orientador: Prof. Dr. George

Andrade Sodré

ILHÉUS – BAHIA

2018




Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Produção Vegetal, da

Universidade Estadual de Santa Cruz, como

parte dos requisitos para a obtenção do título

de Doutor em Produção Vegetal.

Ilhéus, 22 de fevereiro de 2018.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. George Andrade Sodré

(UESC/DCAA/CEPLAC)

(Co-orientador)

Prof.ª Dr.ª Ariana Reis Messias Fernandes de Oliveira

(IFBA/Uruçuca)

Prof.ª Dr.ª Carla da Silva Sousa

(IFBA/Uruçuca)

Prof. Dr. Ernane Ronie Martins

(UFMG/ICA)

Profª Drª Edna Dora Martins Newman Luz

(UESC/CEPLAC)

Aos meus amados pais José Clício e Marli,

Dedico.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pelo dom da vida, amparo e por todas as

graças alcançadas.

Aos meus pais José Clício e Marli, pelo amor incondicional, todas as orações,

apoio, carinho e compreensão nos momentos de ausência. Meus exemplos!

Aos meus irmãos Flávio e Marcelo, pelas lições de vida, amor e apoio

constante.

Aos meus sobrinhos Pedro e Júlia, meus amores, e a minha cunhada Mariana

pelo carinho e alegria a mim prestados.

Ao meu companheiro Pedro Henrique Lopes Silva, pela confiança,

compreensão, por toda ajuda, apoio e amor em todos os momentos, um grande

parceiro na pesquisa e na vida.

À minha avó Corinta Pereira de Jesus, pelas orações durante toda

caminhada. Exemplo de fé!

À minha orientadora Profa Larissa, pela oportunidade e conhecimentos

repassados.

Ao meu orientador Prof. George Andrade Sodré, pela amizade, confiança,

pelos ensinamentos científicos e de vida que foram muito importantes para meu

crescimento pessoal e profissional, serei eternamente grata.

Às professoras Rosilene Aparecida de Oliveira e Edna Dora M. Newman Luz

e a pesquisadora Dilze Maria Argôlo, pela grande colaboração e confiança neste

trabalho, pela doçura nas palavras e amizade.

Aos professores Eduardo Gross, Rafael Marani, Fábio Pinto e Alex-Alan pelas

contribuições.

Ao PPGPV/UESC pela oportunidade, em especial a funcionária Carol, pela

disponibilidade, paciência e amizade.

Aos funcionários da Uesc Roberto e Jaci Freitas pelos momentos de atenção,

carinho, conversa e apoio. Pessoas especiais que Deus colocou em meu caminho.

À Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC) pela

oportunidade de desenvolver esta pesquisa.

Aos funcionários da Ceplac, agradeço imensamente ao seu Reinaldo, Ércio,

Renato Novais, Nino, João Purcino, Campinho, Arnaldo, Tal, Nani, Crispim,

Magnaldo, Perreche, Antônio pela ajuda e pela amizade que tornou os dias de

trabalho mais leves.

Às companheiras do Laboratório de Fitopatologia da Ceplac: Cenilda, Tita,

Lurdinha, Ana, Virgínia, Avassir, Francis, Giselle, Elis e Vanusa, pela colaboração,

pelos ensinamentos, por trazer alegria para meus dias de luta. Amizade eterna.

À amiga muito especial, Patrícia Casaes Alves pela confiança, amizade e

carinho.

Aos amigos do PPGPV Joedson e Viviane, Adeilma, Rafaela, Elaine, Viviane

B. e Luiz pelos momentos de trabalho e descontração e aos demais colegas do

curso.

Às amigas que tive o prazer de conhecer durante a caminhada acadêmica:

Jordany, Nath, Leyde, Dani, Nai, Érika, Ana, Geysi pelos momentos de apoio e

alegria.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa e Ensino Superior (CAPES)

pela bolsa concedida.

vii

RESUMO GERAL

A Lippia origanoides é uma espécie medicinal e aromática da flora brasileira e destaca-se por apresentar alto potencial econômico, por ser rica em óleo essencial que apresenta diversas aplicações. Entretanto, a produção em larga escala tem sido limitada pelas lacunas do conhecimento relacionadas às formas de propagação e cultivo dessa espécie e procedimentos de colheita para máxima produtividade de óleo. Assim, foram realizados experimentos para avaliar propagação, horário e época de colheita, processamento pós-colheita de Lippia origanoides, (secagem de folhas), efeito em fungos causadores das doenças Podridão Parda e Murcha de Ceratocystis do cacaueiro. Para avaliar formas de propagação, foram utilizados três substratos (espuma fenólica, “ellepot”, areia lavada) e três tipos de estacas classificadas conforme a sua posição no ramo (apical, mediana e basal). Avaliou-se o tempo de extração do óleo essencial, horário e época de colheita em três experimentos, sendo o primeiro com seis tratamentos (30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos); o segundo experimento com cinco horários de colheita (9:00 h, 11:00 h, 13:00 h, 15:00 h e 17:00 h), e o terceiro, quatro intervalos entre o plantio e a colheita (150, 210, 270 e 330 dias). Foram avaliados: produção, teor e composição química do óleo essencial e análise de crescimento das plantas. Para a secagem de folhas em estufa, foram avaliadas as temperaturas (40 ºC, 50 ºC, 60 ºC e 70 ºC). A atividade antifúngica do óleo essencial foi analisada por meio de avaliações in vivo e in vitro, em Phytophthora palmivora, Phytophthora citrophthora e Ceratocystis cacaofunesta. Para todos os experimentos, observou-se efeito significativo dos tratamentos, com exceção do tipo de estaca na propagação vegetativa. Recomenda-se o uso de estaca apical, mediana ou basal em substrato areia para propagação de L. origanoides. Para obtenção de maior teor de óleo, produção e composto majoritário (timol), recomenda-se a colheita de folhas aos 240 dias após o transplantio no horário entre 9 e 11h da manhã. A secagem das folhas deve ser realizada na temperatura de 40 ºC, em estufa, e a extração do óleo por hidrodestilação em tempo de 150 minutos. O crescimento micelial dos patógenos foi inibido em 100 % a partir da concentração mínima de 0,6 µL mL-1 do óleo de Lippia origanoides para os três patógenos nos testes in vitro. Em discos foliares, as concentrações de 0,3 μl mL-1 e 0,9 μl mL-1 inibiram em 50 % a formação de sintomas de P. palmivora e P. citrophthora, respectivamente, e 0,6 μl mL-1 inibiu a formação de peritécios de C. cacaofunesta, demonstrando a atividade antifúngica do óleo essencial de L. origanoides frente aos patógenos avaliados.

viii

ABSTRACT

Lippia origanoides is a medicinal and aromatic species of the Brazilian flora and

stands out because it presents high economic potential, because it is rich in essential

oil that presents several applications. However, its large-scale production has been

limited by knowledge gaps related to the best way of cultivating this species and

procedures regarding its harvest in search of maximum yield of this oil. Thus,

experiments were carried out to evaluate propagation, time and harvesting time,

post-harvest processing of Lippia origanoides, (drying of leaves), effect on fungi

causing brown rot and wilt ceratocystis. Three substrates (phenolic foam, “ellepot”,

washed sand) and three types of cuttings were classified according to their position

in the branch (apical, median and basal). It was evaluated the time of extraction of

essential oil, time and harvest time in three experiments, the first one with six

treatments (30, 60, 90, 120, 150 and 180 minutes); the second experiment with five

harvest times (9:00 a.m., 11:00 a.m., 1:00 p.m., 3:00 p.m. and 5:00 p.m.), and the

third, four intervals between planting and harvesting (150, 210, 270 and 330 days).

The production, content and chemical composition of essential oil and plant growth

analysis were evaluated. For the drying of leaves in greenhouse, the temperatures

(40 ºC, 50 ºC, 60 ºC and 70 ºC) were evaluated. The antifungal activity of essential

oil was evaluated by in vivo and in vitro tests on Phytophthora palmivora,

Phytophthora citrophthora and Ceratocystis cacaofunesta. For all the experiments, a

significant effect of the treatments was observed, with the exception of the type of

cuttings in the vegetative propagation. It is recommended the use of apical, median

or basal cuttings in sand substrate for propagation of L. origanoides. In order to

obtain a higher oil content, production and major compound (thymol), it is

recommended to harvest leaves at 240 days after transplanting in the time between

9:00 a.m. and 11:00 a.m. in the morning. The drying of the leaves must be carried

out at a temperature of 40 ºC, in an oven, and the extraction of the oil by

hydrodistillation in a time of 150 minutes. Mycelial growth of fungi was inhibited by

100% from the minimum concentration of 0.6 μL mL-1 of L. origanoides oil to three

pathogens in the in vitro tests. In leaf disks, the concentrations of 0.3 μl mL-1 and 0.9

μl mL-1 inhibited 50% symptoms caused by P. palmivora and P. citrophthora,

respectively, and 0.6 μl mL-1 the perithecia formation of C. cacaofunesta,

demonstrating the antifungal activity of essential oil of L. origanoides in front of the

pathogens evaluated.

LISTA DE FIGURAS

2 REVISÃO DE LITERATURA

Figura 1 - Planta adulta de Lippia origanoides Kunth (A) folhas (B) e inflorescências

(C). Seta indicando inflorescência. Ilhéus, BA. 2017. .................................................. 5

Figura 2 - Biossíntese do metabolismo secundário em plantas. ............................... 11

Figura 3 - Rotas metabólicas envolvidas na biossíntese dos compostos fenólicos... 12

Figura 4 - Estrutura química de alguns compostos fenólicos. ................................... 13

4 DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE HIDRODESTILAÇÃO DO ÓLEO, HORÁRIO E

ÉPOCA DE COLHEITA DE FOLHAS DE SALVA-DE-MARAJÓ (Lippia

origanoides Kunth)

Figura 1 - Esquema de instalação do experimento. .................................................. 45

Figura 2 - Teor de óleo essencial de L. origanoides Kunth em função do tempo de

extração por hidrodestilação. Médias seguidas de mesma letra não diferem

estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. DMS = 0,43.

CV= 9,75%. ............................................................................................................... 47

Figura 3 - Teores médios do óleo essencial de folhas secas de Lippia origanoides

Kunth em função dos horários de colheita (9:00h, 11:00h,13:00h, 15:00h, 17:00h).

Ilhéus, BA. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si

pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. DMS = 0,25. CV= 7,4%. ..................... 49

Figura 4 - Dados médios de temperatura (ºC) e umidade relativa do ar (%) nos

horários de colheita das folhas de Lippia origanoides, em julho de 2016. ................ 50

Figura 5 - Porcentagem relativa de timol de folhas de Lippia origanoides colhidas em

cinco horários de colheita. Ilhéus - BA, 2016. Médias seguidas de mesma letra

minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 %

de probabilidade. DMS = 0,07. CV= 2,1%. ................................................................ 52

Figura 6 - Altura e diâmetro (a), massa seca foliar (msf) e massa seca do caule

(msc) (b), área foliar (c), teor e produção (d) de óleo essencial extraído de folhas

secas de Lippia origanoides em função da época de colheita. Ilhéus – BA. ............. 53

Figura 7 - Teor de óleo essencial (%) e percentagem relativa de timol extraído de

folhas secas de Lippia origanoides colhidas em quatro épocas de colheita. Ilhéus -

BA, 2016. CVteor = 9,7%. CVtimol= 2,4%. .................................................................... 56

5 EFEITO DA TEMPERATURA DE SECAGEM SOBRE TRICOMAS, TEOR E

COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO DE Lippia origanoides Kunth.

Figura 1 - Teor de óleo essencial e taxa de integridade de tricomas de folhas de

Lippia origanoides Kunth. em função de temperaturas de secagem. Ilhéus - BA,

2016. CV= 11,3%. .................................................................................................... 65

Figura 2 - Microscopia eletrônica de varredura de tricomas glandulares de folhas de

Lippia origanoides submetidas a temperaturas de secagem (40 ºC, 50 ºC, 60 ºC e 70

ºC): rompidos (A); murchos (B); intactos (C). Barra = 50 µm. ................................... 66

Figura 3 - Correlações lineares entre temperatura de secagem e integridade de

tricomas glandulares: rompidos (a); murchos (b) e intactos (c), em folhas de Lippia

origanoides Kunth. .................................................................................................... 66

6 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides

Kunth (IN VITRO E IN VIVO) NO CONTROLE DA PODRIDÃO-PARDA

Figura 1 - Efeito do óleo essencial de L. origanoides sobre Phytophthora palmivora

(A) e Phytophthora citrophthora (B). Concentrações: 0 µL mL-1 (1); 0,30 µL mL-1 (2);

0,60 µL mL-1 (3); 0, µL mL-1 (4); 1,20 µL mL-1 (5) e 1,50 µL mL-1 (6). Barra = 5 cm. .. 82

7 USO DE ÓLEO DE Lippia origanoides Kunth NO CONTROLE (IN VITRO E IN

VIVO) DE MURCHA-DE-CERATOCYSTIS.

Figura 1 - (A) Cortes dos discos de folhas com o auxílio do cortador semiautomático;

(B) Discos foliares com a face abaxial voltada para cima, acondicionados, em caixas

plásticas formando câmara úmida (C) Inoculação nas nervuras dos discos com 20

μL de suspensão; (C) Contagem dos peritécios usando um estereomicroscópio (D).

Ilhéus – BA. ............................................................................................................... 96

Figura 2 - Porcentagem de inibição do crescimento miceliano (ICM) de Ceratocystis

cacaofunesta após interação com óleo essencial de L. origanoides Kunth. Ilhéus -

BA, 2017. DMS= 6,94. CV= 4,6%. ............................................................................ 98

Figura 3 - Efeito de doses do óleo essencial de L. origanoides sobre crescimento

micelial de Ceratocystis cacaofunesta. Concentrações: 0 µL mL-1 (1); 0,3 µL mL-1 (2);

0,6 µL mL-1 (3); 0,9 µL mL-1 (4); 1,2 µL mL-1 (5) e 1,5 µL mL-1 (6). Barra = 5 cm. ...... 99

Figura 4 - (A) Discos foliares de cacaueiro tratados com óleo essencial de L.

origanoides, quatro dias após a inoculação de C. cacaofunesta. Concentrações: 0 µL

mL-1 (1); 0,3 µL mL-1 (2); 0,6 µL mL-1 (3); 0,9 µL mL-1 (4); 1,2 µL mL-1 (5) e 1,5 µL mL-1

(6); (B) Disco representando a concentração 0 µL mL-1 (1), com os peritécios mais

desenvolvidos e formação de ascósporos; (C) disco representando os demais

tratamentos com coloração mais esverdeada e formação de menor número de

peritécios. ................................................................................................................ 101

LISTA DE TABELAS

3 “EVALUATION OF THE TYPE OF CUTTINGS AND SUBSTRATES IN THE

ROOTING OF SALVA-DE-MARAJÓ”. (SUBMETIDA À REVISTA PESQUISA

AGROPECUÁRIA BRASILEIRA - PAB).

Table 1. Effect of substrate and type of percentage cuttings in rooting (CRP), shoot number

(SN), the longest shoot length (LSL), shoot dry mass (SDM), the longest root length (LRL),

root dry mass (RDM), and total dry mass (TDM) in Lippia origanoides cuttings (apical,

medial, and basal) propagated in substrates (phenolic foam, ellepot, and sand). Ilhéus, Bahia

State, 2016. ................................................................................................................. 34

4 DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE HIDRODESTILAÇÃO DO ÓLEO, HORÁRIO E

ÉPOCA DE COLHEITA DE FOLHAS DE SALVA-DE-MARAJÓ (Lippia

origanoides Kunth)

Tabela 1. Dados climatológicos de temperatura média, radiação, precipitação e

umidade relativa do município de Ilhéus - BA, de abril de 2015 a fevereiro de 2016.43

Tabela 2. Características químicas do solo coletado, antes da instalação do

experimento, na Estação Experimental Arnaldo Medeiros – ESARM (análise

realizada no Laboratório de Solos – CEPLAC/CEPEC), nas profundidades (P) de 0 a

20 cm (1) e de 20 a 40 cm (2). Ilhéus - BA, 2015. ..................................................... 44

5 EFEITO DA TEMPERATURA DE SECAGEM SOBRE TRICOMAS, TEOR E

COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO DE Lippia origanoides Kunth.

Tabela 1. Composição química do óleo essencial de folhas de Lippia origanoides

obtidos em quatro temperaturas de secagem. Ilhéus – BA, 2016. ............................ 68

6 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides

Kunth (IN VITRO E IN VIVO) NO CONTROLE DA PODRIDÃO-PARDA

Tabela 1. Composição química completa e porcentagens dos compostos do óleo

essencial de folhas de Lippia origanoides. Ilhéus – BA, 2017. .................................. 81

Tabela 2. Porcentagem de inibição dos fungos e concentração inibitória mínima

(CIM) após interação com óleo essencial de L. origanoides Kunth, Ilhéus - BA, 2017.

................................................................................................................................ 81

Tabela 3. Comparação de médias de infecção1 e percentagem de inibição em

relação à testemunha, nos discos de folhas de cacaueiro tratados com óleo

essencial de L. origanoides, após sete dias de inoculação. ...................................... 83


VIVO) DE MURCHA-DE-CERATOCYSTIS.

Tabela 1. Composição química completa e porcentagens dos compostos do óleo

essencial de folhas de Lippia origanoides. Ilhéus – BA, 2017. .................................. 97

Tabela 2. Número de peritécios de Ceratocystis cacaofunesta formados após quatro

dias nos discos de folhas tratados com óleo essencial de L. origanoides e inoculados

com o patógeno e percentagem de inibição em relação à testemunha. ................... 99

SUMÁRIO

RESUMO GERAL ..................................................................................................... vii

ABSTRACT .............................................................................................................. viii

1 INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................ 1

2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 4

2.1 Lippia origanoides Kunth. .................................................................................. 4

2.1.1 Características gerais e botânicas ................................................................. 4

2.1.2 Composição química e usos do óleo essencial ............................................ 6

2.2 Propagação vegetativa ....................................................................................... 6

2.2.1 Substratos ......................................................................................................... 8

2.2.2. Tipos de estacas ............................................................................................. 9

2.3 Metabolismo secundário .................................................................................. 11

2.3.1 Compostos fenólicos ..................................................................................... 12

2.3.2 Terpenos ......................................................................................................... 13

2.4 Colheita e secagem de espécies medicinais e aromáticas ........................... 14

2.4.1 Época de colheita ........................................................................................... 14

2.4.2 Horário de colheita ......................................................................................... 15

2.4.3 Temperatura de secagem .............................................................................. 16

2.5 Extração de óleos essenciais ........................................................................... 17

2.6 Atividades antifúngicas dos óleos essenciais ............................................... 18

2.7 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 19

3 “EVALUATION OF THE TYPE OF CUTTINGS AND SUBSTRATES IN THE

ROOTING OF SALVA-DE-MARAJÓ”. (SUBMETIDA À REVISTA PESQUISA

AGROPECUÁRIA BRASILEIRA - PAB). ................................................................. 30

References .................................................................................................................. 37

4 TEMPO DE HIDRODESTILAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL, HORÁRIO E ÉPOCA

DE COLHEITA DE FOLHAS DE Lippia origanoides Kunth. ................................. 39

4.1 Introdução .......................................................................................................... 40

4.2 Material e Métodos ............................................................................................ 41

4.2.1 Experimento 1 - Determinação do tempo de extração ................................ 42

4.2.2 Experimento 2 - Determinação do horário de colheita ................................ 42

4.2.3 Experimento 3: Determinação da época de colheita ................................... 43

4.2.3.1 Produção de mudas e plantio .................................................................... 43

4.2.3.2 Clima ............................................................................................................. 43

4.2.3.3 Instalação e condução do experimento .................................................... 44

4.2.3.4 Análise química cromatográfica do óleo essencial ................................. 46

4.2.3.5 Análises estatísticas ................................................................................... 47

4.3 Resultados e Discussão ................................................................................... 47

4.3.1 Experimento 1: Tempo de extração .............................................................. 47

4.3.2 Experimento 2: Horário de colheita .............................................................. 48

4.3.3 Experimento 3: Época de colheita ................................................................ 52

4.4 Conclusões ........................................................................................................ 56

4.5 Referências ........................................................................................................ 56

5 TEMPERATURA DE SECAGEM ALTERA INTEGRIDADE DE TRICOMAS, TEOR

E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO DE Lippia origanoides Kunth. ................. 60

5.1 Introdução .......................................................................................................... 61


5.2.1 Material vegetal .............................................................................................. 62

5.2.2 Secagem do material...................................................................................... 62

5.2.3 Determinação da umidade ............................................................................. 63

5.2.4 Extração e análise do óleo essencial ........................................................... 63

5.2.5 Análise micromorfológicas ........................................................................... 64

5.2.6 Analise estatística .......................................................................................... 64


5.4 Conclusão .......................................................................................................... 69

5.5 Referências ........................................................................................................ 70

6 ATIVIDADE BIOLÓGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides Kunth

(IN VITRO E IN VIVO) NO CONTROLE DA PODRIDÃO-PARDA ........................... 74

6.1 Introdução .......................................................................................................... 75


6.2.1 Obtenção dos isolados .................................................................................. 76

6.2.2 Extração e análise química do óleo essencial ............................................. 77

6.2.3 Experimento In vitro ....................................................................................... 78

6.2.4 Experimento In vivo ....................................................................................... 78

6.2.4.1 Obtenção da suspensão de zoósporos dos isolados de Phytophthora

spp. ........................................................................................................................... 78

6.2.4.2 Inoculação dos isolados em discos foliares ............................................. 79

6.2.5 Análises estatísticas ...................................................................................... 80


6.4 Conclusão .......................................................................................................... 85

6.5 Referências ........................................................................................................ 86


VIVO) DE MURCHA-DE-CERATOCYSTIS. ............................................................. 90

7.1 Introdução .......................................................................................................... 91


7.2.1 Obtenção do isolado ...................................................................................... 92

7.2.2 Obtenção do óleo essencial .......................................................................... 93

7.2.3 Inibição do crescimento micelial (in vitro) ................................................... 94

7.2.4 Inoculação em discos de folhas (in vivo) ..................................................... 94

7.2.4.1 Obtenção da suspensão do isolado de Ceratocystis cacaofunesta ....... 94

7.2.4.2 Inoculação nos discos de folhas ............................................................... 95

7.2.5 Análises estatísticas ...................................................................................... 96


7.4 Conclusão ........................................................................................................ 101

7.5 Referências ...................................................................................................... 102

8 CONCLUSÕES GERAIS ..................................................................................... 105

1

1 INTRODUÇÃO GERAL

O gênero Lippia L. é o segundo maior da família Verbenaceae com cerca de

200 espécies (TERBLANCHÉ; KORNELIUS, 1996), sendo que, 120 delas

encontram-se no Brasil, distribuídas no cerrado e caatinga (OLIVEIRA et al., 2006).

Estudos relacionados a esse gênero estão em andamento, porém, ainda existem

espécies com algumas lacunas a serem estudadas, como é o caso da Lippia

origanoides Kunth. (STACHENKO et al., 2010).

A Lippia origanoides é frequente na América do Sul, sendo também

encontrada na Mesoamérica na Costa Rica, México e Venezuela (O’ LEARY et al.,

2012). Possui ocorrência confirmada na flora brasileira no Norte, Nordeste, Centro-

Oeste, Sudeste e Sul do país (SALIMENA; MÚLGURA, 2015). Na medicina popular

é conhecida pelos epítetos de alecrim-pimenta, orégano do monte, alecrim d’angola,

sendo usada como planta medicinal (OLIVEIRA, 2007; COSTA et al., 2017). É um

arbusto que pode atingir três metros de altura, com folhas ovaladas, aromáticas, e

inflorescências brancas em forma de racemo saindo de suas axilas (GARCIA-

BARRIGA, 1992). O óleo de L. origanoides extraído por hidrodestilação é constituído

principalmente pelo componente majoritário timol (C10H14O) (mais de 50 %) (RUIZ et

al., 2007). No entanto, a composição do óleo desta planta pode variar de acordo

com a genética, técnica de extração, tratamento e armazenamento do material

vegetal e condições edafoclimáticas de crescimento (HENAO et al., 2010).

Para garantir máxima produção de óleo essencial, é necessário avaliar a sua

qualidade, que inicia nos aspectos relacionados à adaptabilidade e ao cultivo da

espécie. Dentre os diversos fatores bióticos e abióticos que podem interferir na

produção e composição química do óleo essencial destacam-se o estádio de

desenvolvimento da planta, sazonalidade, disponibilidade de água e nutrientes

(VERMA; SHUKLA, 2015). Além disso, existem outros fatores mais relacionados

com o cultivo das plantas como a produção de mudas bem estabelecidas, horário de

colheita do material vegetal e processamento pós-colheita que são de suma

importância na produção dos óleos essenciais.

Um dos fatores que interferem no cultivo das plantas medicinais é o bom

estabelecimento em campo. Assim, estudos sobre a propagação de espécies

2

medicinais são de elevada importância, uma vez que servem de base para a

domesticação e o sucesso do cultivo dessas plantas (CARVALHO JÚNIOR et al.,

2009). E o fato de o metabolismo secundário ser regido pelo código genético, e este

interagir com o ambiente faz com que a qualidade do produto sofra influência das

técnicas de cultivo adotadas desde a propagação até a colheita.

A propagação vegetativa de plantas medicinais eleva a qualidade de mudas,

necessário para a viabilização técnica/comercial da produção (MONTANARI, 2002).

Alguns fatores podem contribuir para o sucesso da técnica, tais como o tipo de

substrato utilizado; a posição, o tamanho e o tipo de estaca, além do uso de

reguladores de crescimento. Se utilizados de forma adequada aumentam a

eficiência desta técnica.

Partindo de um estande uniforme, bem estabelecido em campo e manejado, a

colheita é o próximo passo. Em relação ao horário de colheita das plantas

medicinais, sabe-se que é um aspecto muito importante para produção de óleos

essenciais, uma vez que pode interferir no teor e na composição química ao longo

do dia (SOUZA et al., 2006), pois trata-se de um aspecto que envolve não só o

ambiente como também a fisiologia da planta (OLIVEIRA et al., 2012). O horário de

colheita afeta o teor de óleo essencial de Lippia sidoides (alecrim-pimenta), sendo

recomendada a colheita às 10:00 horas da manhã, visando à obtenção do maior teor

de óleo essencial (MELO et al., 2011). Para Mentha x piperita var citrata houve

variação significativa no teor de óleo essencial ao longo do dia, sendo obtido o maior

teor de óleo essencial na colheita realizada às 13:00 h (OLIVEIRA et al., 2012).

A secagem é mais uma etapa importante no processo que contribui para a

manutenção da qualidade da droga vegetal, permitindo a conservação das plantas

medicinais e aromáticas por um período maior, por meio da redução do teor de

umidade e consequentemente da ação enzimática de microrganismos (CORRÊA

JUNIOR et al., 1994). Neste sentido, a temperatura de secagem é variável e estudos

têm apresentado diferenças quanto a esse fator sendo considerada adequada

aquela temperatura na qual se mantém o maior teor de óleos essenciais sem

alteração da sua composição química. Existe uma busca pela determinação de

condições específicas de secagem, pois, cada espécie apresenta características

diferentes quando avaliadas na mesma temperatura que precisam ser conhecidas

(BARBOSA et al., 2006).

3

Após o beneficiamento das plantas, visando quantidade e qualidade do

produto final, deve-se atentar aos processos de extração deste produto do material

vegetal, para que todo o trabalho realizado anteriormente na cadeia de cultivo não

seja em vão. A hidrodestilação ainda é um dos mais utilizados para extração do óleo

essencial (FRASER; WISH, 1997). O tempo de hidrodestilação também pode ser um

fator de interferência na obtenção de óleo essencial. A determinação prévia do

tempo ideal de extração permite otimização do processo evitando o desperdício de

tempo e a elevação dos custos de extração (EHLERT et al., 2006).

Estudos têm sido realizados em relação ao manejo do cultivo e

processamento pós-colheita de plantas medicinais principalmente com intuito de

maximizar a produção de óleo essencial. Além desse enfoque, pesquisas também

vêm sendo realizadas para determinar importantes aplicações para esse óleo, sendo

uma delas, o uso como biocida no controle de doenças agrícolas, principalmente

devido às suas propriedades antimicrobianas. Fungicidas químicos também têm sido

aplicados, mas causam efeito residual e danos ao meio ambiente, assim, a busca

por alternativas como o uso de produtos naturais torna-se mais uma opção de

pesquisa dentro do contexto do manejo integrado de doenças. Estudos demonstram

que óleos essenciais extraídos de diversas espécies medicinais possuem atividade

antifúngica (BEDOYA et al., 2015; OSPINA et al., 2011; LOZADA et al., 2012), o que

aumenta o interesse de indústrias químicas e farmacêuticas por produtos

provenientes dessas espécies.

Desta forma, os objetivos deste trabalho foram avaliar a propagação, horário

e época de colheita, secagem e tempo de hidrodestilação do óleo essencial de

Lippia origanoides, no intuito de contribuir para o manejo adequado e seguro desta

cultura e maior aproveitamento da matéria prima gerada, além de avaliar o efeito

deste óleo em patógenos causadores das doenças Podridão Parda e Murcha de

Ceratocystis do cacaueiro.

4

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Lippia origanoides Kunth.

2.1.1 Características gerais e botânicas

A família Verbenaceae possui cerca de 32 gêneros e 480 espécies, com

distribuição neotropical (ATKINS, 2004). O gênero Lippia L. é o segundo maior da

família Verbenaceae sendo um dos mais representativos na flora brasileira, com 88

espécies no cerrado e caatinga, sendo 68 endêmicas (SALIMENA; MÚLGURA,

2015). Este gênero possui ervas, arbustos e pequenas árvores, muitas vezes

aromáticas, distribuídas por todo o sul e América Central e África Central (BLANK,

2013). Inclui uma variedade de espécies com propriedades medicinais e aromáticas,

e aproximadamente 75% das espécies conhecidas é encontrada no Brasil, o que faz

do país um centro de diversidade para o gênero (VICCINI et al., 2006).

A Lippia origanoides é frequente na América do Sul, crescendo na Bolívia, no

Brasil, Guiana, Paraguai e norte da Argentina, sendo também encontrada na

Mesoamérica na Costa Rica, México e Venezuela (O’ LEARY et al., 2012). Possui

ocorrência confirmada na flora brasileira no Norte (Acre, Amazonas, Pará, Roraima,

Tocantins), Nordeste (Bahia, Ceará, Piauí), Centro-Oeste (Distrito Federal, Goiás,

Mato Grosso), Sudeste (Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo) e

Sul do país (Paraná) (SALIMENA; MÚLGURA, 2015). Na medicina popular é

conhecida pelos epítetos de alecrim-pimenta, orégano do monte, alecrim d’angola,

sendo usada como planta medicinal (OLIVEIRA, 2007; COSTA et al., 2017).

Possui hábito arbustivo, podendo atingir até três metros de altura, com folhas

ovaladas, aromáticas, e inflorescências brancas em forma de racemos (GARCIA-

BARRIGA, et al., 1992; VICUÑA et al., 2010) (Figura 1). Possui caule geralmente

densamente estrigoso, raramente hispido ou ligeiramente estrigoso, entrenós (1-) 2-

9 cm de comprimento. Folhas geralmente opostas, às vezes trifoliadas; pecíolos com

0,1-2,4 cm de comprimento, folhas raramente sésseis, pubescência estrigosa

raramente hispida; lâminas 0,5-6,1 x 0,3-3,5 cm, elípticas ou ovadas, cuneadas na

5

base ou raramente arredondada, ápice agudo raramente obtuso, margem crenada,

venação pinada acrodrodoma raramente perfeito, superfície adaxial estrigosa e

superfície abaxial sericea. Inflorescências frondosas, (dois) 3-6 florescências por

axila, pedúnculos 0,2-2,6 cm de comprimento, estrigosos, raramente hispidos,

inflorescência (0,3-) 0,4-1,2 (-1,5) cm de comprimento, brácteas 0,2-0,5 cm de

comprimento; ápice curvo ou reto; brácteas apicais livres; superfície abaxial

ligeiramente estrigosa apenas na base e sobre a nervura central, raramente

superfície pubescente, superfície adaxial estrigosa. Cálice com 0,1-0,2 cm de

comprimento, superfície externa estrigosa. Corola com 0,2-0,6cm de comprimento,

superfície externa ligeiramente estrigosa. Sementes com 0,1-0,2 cm de comprimento

(O’ LEARY et al., 2012). As folhas e inflorescências (brácteas, sépalas e pétalas)

possuem tricomas glandulares peltados e capitados, produtores e armazenadores

de óleo essencial, o que lhes confere suas propriedades medicinais e aromáticas

(TOZIN et al., 2015).

Figura 1 - Planta adulta de Lippia origanoides Kunth (A) folhas (B) e inflorescências (C). Seta indicando inflorescência. Ilhéus, BA. 2017.

Fonte: Arquivo próprio.

6

2.1.2 Composição química e usos do óleo essencial

A Lippia origanoides apresenta mais de um quimiotipo, ou seja, a mesma

espécie possui diferentes componentes majoritários no óleo essencial produzido.

Dentre esses quimiotipos podemos listar o quimiotipo A, (componentes majoritários

para-cimeno, alfa- e beta-felandreno, limoneno), quimiotipo B (carvacrol) e

quimiotipo C (timol), quimiotipo D (para-cimeno e trans-beta-cariofileno) e quimiotipo

E ((E)-metIl cinamato e (E)-nerolidol) (SANTOS et al., 2004a; ROJAS et al., 2006;

OLIVEIRA et al., 2007; STASHENKO et al., 2010; BETANCUR-GALVIS et al., 2011;

RIBEIRO et al., 2014).

A complexa mistura de componentes químicos do óleo essencial presente em

folhas e flores confere à espécie ação fungicida, acaricida e repelente, sendo usada

tradicionalmente na forma de infusão e também no tratamento de dores de

estômago, indigestão, diarreia, tratamentos respiratórios e como antisséptico geral

para boca, garganta e feridas (PASCUAL et al., 2001; NERIO et al., 2009;

BETANCUR-GALVIS et al., 2011; OSPINA et al., 2011; SIVIRA et al., 2011).

Também possui atividade antibacteriana comprovada no combate a Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 8739 e Salmonella choleraesuis

(QUEIROZ et al., 2014; ALMEIDA et al., 2016). Estes fatores conferem à espécie

potencial interesse da indústria química e farmacêutica.

Além dos fins medicinais, a L. origanoides também é usada na culinária como

aromatizante de pratos regionais, e é espécie pioneira na recuperação de áreas

anteriormente exploradas por minério de ferro na Venezuela (GUEVARA et al.,

2005).

2.2 Propagação vegetativa

A propagação vegetativa ou assexuada consiste na retirada de segmentos de

caule, folha ou raiz da planta-mãe que, sob condições adequadas, emitem raízes,

formando nova planta idêntica àquela que lhe deu origem (HARTMANN et al., 2011).

7

O uso da propagação vegetativa busca um estande mais uniforme, redução da fase

juvenil (fase improdutiva) e perpetuar características de interesse provenientes da

planta matriz (FRANZON et al., 2010). Além disso, a propagação seminal ou

sexuada nem sempre é viável para todas as espécies, pois é necessário que haja

viabilidade da semente e condições ambientais favoráveis (HOFFMANN et al., 1998;

FACHINELLO et al., 2005).

Dentre as vantagens da propagação vegetativa está a menor variabilidade

genética encontrada quando comparada às plantas propagadas por via seminal

(SODRÉ, 2013). Do ponto de vista do cultivo comercial de plantas medicinais, é uma

forma de impedir variações nos teores dos princípios ativos e de manter a qualidade

do produto final (MONTANARI JÚNIOR, 2002; MARCHESE; FIGUEIRA, 2005).

Várias são as técnicas deste tipo de propagação: enxertia, estaquia,

microestaquia, alporquia, mergulhia, cultura de tecidos, sendo a estaquia um dos

principais métodos de propagação vegetativa utilizado para produção de mudas de

espécies medicinais, frutíferas e ornamentais (OLIVEIRA et al., 2011). A técnica

consiste em promover o enraizamento de partes da planta-mãe (caules, raízes,

folhas) para produção de uma nova planta idêntica à matriz (HARTMANN et al.,

2011). Este enraizamento envolve a regeneração de meristemas radiculares a partir

dos tecidos associados com o tecido vascular, ou a partir do tecido caloso formado

na base da estaca, variando a indução da regeneração radicular em função da

espécie, do genótipo e do nível de maturação da planta doadora (WENDLING,

2003).

Entre as principais vantagens desse método de propagação, destaca-se a

possibilidade de obter um grande número de plantas a partir de uma única planta-

matriz, em curto espaço de tempo, ser economicamente viável, de fácil execução e

propiciar a produção de mudas a partir de plantas que não produzem sementes

viáveis, na condição local em que se encontram (FACHINELLO et al., 2005,

CARVALHO, 2015). Por outro lado, a propagação vegetativa possui como

desvantagens o estreitamento da base genética com a perda de variabilidade que

pode acarretar em menor resistência de plantas a pragas e doenças (WENDLING,

2003).

Alguns fatores devem ser considerados para a estaquia bem sucedida, dentre

eles a escolha do método de propagação mais adequado, o substrato, a posição do

8

ramo do qual a estaca é coletada, o uso de reguladores vegetais, a idade e as

condições fisiológicas da planta matriz, a época de coleta, o comprimento e o

diâmetro da estaca (FRANZON et al., 2010; HARTMANN et al., 2011). Esses fatores

ainda variam de acordo com a espécie a ser propagada e as condições ambientais.

Neste contexto, destaca-se a importância de estudos experimentais que possam

estabelecer as condições ideais de propagação vegetativa para cada espécie.

2.2.1 Substratos

O substrato para plantas é o meio em que se desenvolvem as raízes das

plantas cultivadas fora do solo in situ (KÄMPF, 2000a). A escolha do substrato

adequado deve considerar características básicas, como: sustentar as estacas

durante o período de enraizamento, proporcionar umidade (boa capacidade de

retenção de água), proporcionar ambiente escuro, reduzindo a penetração da luz na

base da estaca, e permitir aeração (HARTMANN et al., 2011). Além disso, devem ter

boa porosidade para drenar o excesso de água, serem isentos de patógenos,

possuir baixo teor de sais (CE), disponibilizar nutrientes e serem devidamente

esterilizados (HARTMANN et al., 2011).

Diversas matérias-primas de origem mineral e orgânica são usadas puras ou

em misturas para compor substratos para plantas. A casca de arroz (in natura,

carbonizada ou queimada), areia, vermiculita, subprodutos da madeira como

serragem, fibra de madeira, compostos de lixo domiciliar urbano e de restos de

poda, xaxim e vermicomposto são alguns exemplos (SODRÉ, 2007).

Em geral, os substratos possuem características físicas e químicas específicas.

A areia, por exemplo, apresenta baixo custo, é quimicamente inerte e de fácil

aquisição. Além disso, possui facilidade de limpeza, desinfecção, boa drenagem e

facilidade de remoção das raízes (KÄMPF; FERMINO, 2000).

Outros substratos comerciais também têm sido utilizados na propagação

vegetativa das plantas medicinais, de forma ainda não convencional. Diferente da

areia, os substratos ellepot e espuma fenólica são alguns deles. O ellepot é um tipo

especial de substrato à base de turfa de Sphagnum e perlita envolvidos por tela de

9

celulose em forma de pastilha que se expande ao ser umedecido. Apresenta baixa

densidade entre 150 kg m-3 e 250 kg m-3. A espuma fenólica é um material estável,

orgânico (polifenólica, uréia–formaldeído ou poliestireno), inerte, estéril e de fácil

manuseio (FREITAS et al., 2005). É também constituída de material estéril, que não

interfere na nutrição das plantas e tem capacidade de prover boa sustentação para a

muda, além de alta capacidade de retenção de umidade e aeração (SILVA et al.,

2012).

2.2.2. Tipos de estacas

Os tipos de estacas ou posição da estaca nos ramos, em geral influenciam o

seu enraizamento. Podem ser classificadas em apical, mediana e basal, pelo grau

de lignificação, quantidade de reservas e diferenciação dos tecidos. Estacas apicais

possuem menor lignificação e maior atividade meristemática do que as estacas

basais (HARTMANN et al., 2011). Todavia, as estacas apicais também apresentam

a epiderme com a cutícula menos desenvolvida, o que ocasiona maior perda de

umidade, exigindo o uso de nebulizadores, câmaras úmidas e sombrite, por

exemplo, para manter os tecidos hidratados (LIMA et al., 2006).

O substrato e tipo de estaca podem influenciar o enraizamento e

desenvolvimento inicial de mudas, e quando utilizados de forma adequada, podem

aumentar a eficiência da propagação vegetativa. Estudos foram realizados com

algumas espécies do gênero Lippia e evidenciam a variedade de recomendações de

substratos (misturas e/ou isolados) e tipos de estaca para essas espécies, havendo

interação entre esses fatores ou individualmente. Alguns autores recomendam a

mistura de substratos para proporcionar níveis intermediários de retenção de água,

de aeração e de disponibilidade de água, favorecendo o enraizamento de estacas

(SOUZA et al., 2006).

Para Lippia origanoides, em estudo comparando proporções de substrato

comercial Biomix ® e vermiculita expandida, concluiu-se que o uso desses

substratos na proporção de 1:1 propicia maior produção de folhas, raízes e de

massa seca, em estacas apicais (SILVA et al., 2015). Estacas apicais e basais

10

podem ser utilizadas na propagação vegetativa de Lippia alba (quimiotipos I, II e III)

em misturas de substrato comercial com palha de arroz carbonizada e substrato

comercial com esterco bovino curtido (TAVARES et al., 2012). Os autores

destacaram o incremento da massa seca da raiz nas estacas propagadas com

matéria orgânica (esterco bovino) presente no substrato. Em outro trabalho realizado

com Lippia origanoides e Lippia alba, Herrera-Moreno et al., (2013), ao testarem

substratos e concentração de hormônio AIB, afirmaram que o uso do hormônio

reduziu de forma significativa a porcentagem de enraizamento dessas espécies. Os

autores ainda recomendam a estaquia dessas espécies em substrato composto de

fibra de coco fina.

Oliveira et al. (2008) sugerem o uso de estacas apicais e areia como

substrato, na propagação vegetativa de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.). Na

propagação vegetativa de Lippia gracilis Schauer, recomenda-se o uso tanto de

estacas da porção mediana e basal dos ramos e, como substrato, uma composição

de argila + húmus ou areia + húmus, ambos na proporção de 1:1 (SANTOS et al.,

2016). No entanto, os autores relatam que a espécie, ainda assim, apresenta baixo

percentual de enraizamento.

Outras espécies medicinais também apresentam essa variação nas

características morfológicas conforme o substrato e tipo de estaca, a exemplo da

alfavaca-cravo (Ocimum gratissimum), em que a estaca basal em substrato com

terra vegetal propiciou melhor produção de massa seca e enraizamento do que as

estacas apicais e medianas (SOUSA et al., 2005). Bona et al. (2005), em trabalhos

com Baccharis articulata, Baccharis trimera e Baccharis stenocephala, obtiveram

melhores resultados com o uso de substrato comercial, não indicando para a

produção destas espécies, o uso de solo, areia, vermiculita ou casca de arroz

carbonizada. Estacas basais com duas folhas foram recomendadas na propagação

de Turnera subulata em substrato areia, não sendo recomendada a retirada de todas

as folhas em quaisquer tipos de estaca para a espécie (COELHO et al.,2016).

Em geral não há um consenso sobre substrato e tipo de estaca para

propagação de espécies medicinais, ainda que esses fatores sejam importantes no

enraizamento e estabelecimento das mudas em campo.

11

2.3 Metabolismo secundário

O metabolismo é o conjunto de reações presentes no interior das células dos

seres vivos. No caso das plantas, esse metabolismo divide-se em dois tipos: o

metabolismo primário e o metabolismo secundário. Os metabólitos primários estão

presentes em todo o reino vegetal e possuem função essencial para o

desenvolvimento e reprodução da espécie, como por exemplo, aminoácidos,

açúcares, nucleotídeos, clorofila e lipídios (TAIZ; ZEIGER, 2013).

O metabolismo secundário é aquele que não afeta diretamente a sobrevivência

da planta, não sendo essencial para que complete o ciclo de vida. No entanto, é

importante na interação planta-ambiente por meio de diversas funções: dá suporte

estrutural para a planta como a lignina, contribui para a defesa da espécie contra

herbívoros e patógenos, favorece a dispersão da espécie pela atração de

polinizadores, possui papel importante na competição entre espécies, proteção

contra a radiação ultravioleta, etc (BOURGAUD et al., 2001; TAIZ; ZEIGER, 2013).

São chamados de metabólitos secundários os produtos provenientes desse

metabolismo. Dentre eles fenóis, alcaloides e terpenos, oriundos de diferentes rotas

metabólicas, sendo que os terpenos são expressivamente mais abundantes e os

fenilpropanóides, quando ocorrem, são geralmente os principais responsáveis pelo

odor e sabor (TAIZ; ZEIGER, 2013) (Figura 2).

Figura 2 - Biossíntese do metabolismo secundário em plantas.

Fonte: Verma e Shukla, (2015).

12

2.3.1 Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são aqueles metabólitos secundários sintetizados a

partir de duas rotas: a via do ácido chiquímico e a via do ácido malônico, sendo

assim um grupo muito heterogêneo do ponto de vista metabólico. A via do ácido

chiquímico é responsável pela biossíntese da maioria dos compostos fenólicos

vegetais (TAIZ; ZEIGER, 2013) (Figura 3). Quimicamente, os compostos fenólicos

são definidos como substâncias que possuem anel aromático com um ou mais

substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais (LEE et al., 2005).

Figura 3 - Rotas metabólicas envolvidas na biossíntese dos compostos fenólicos.

Fonte: Taiz e Zeiger, (2013).

A principal enzima da via do ácido chiquímico é a fenilalanina amônio liase

(PAL). Essa enzima causa a desaminação da fenilalanina formando o ácido

cinâmico (Figura 3). A PAL é regulada por fatores ambientais como o nível

nutricional, a luz (efeito do fitocromo) e ataque de fungos e patógenos. Nas plantas,

os compostos fenólicos também têm a função de fotoproteção (filtro de UV), sendo

acumulados, especialmente, nos tecidos superficiais, pois esses metabólitos

absorvem a radiação UV-B sem influenciar na radiação fotossinteticamente ativa

(GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

A rota do ácido chiquímico converte precursores de carboidratos derivados da

glicose e da rota pentose fosfato em aminoácidos aromáticos, sendo um dos

intermediários dessa rota o ácido chiquímico (HERRMANN; WEAVER, 1999). O

13

ácido chiquímico é formado pela condensação de dois metabólitos da glicose, ou

seja, o fosfoenolpiruvato e a eritrose-4-fosfato. Em seguida, ocorre a formação do

ácido corísmico por meio da junção do ácido chiquímico e uma molécula de

fosfoenolpiruvato. O ácido corísmico gera aminoácidos aromáticos que são

precursores de vários alcaloides. No entanto, um dos primeiros grupos fenólicos

formados a partir desse ácido é o fenilpropanóide. Juntamente com os

monoterpenos, os fenilpropanóides costumam ser voláteis, sendo considerados

óleos essenciais (SHAHIDI; NACZK, 2004). Como exemplo de fenilpropanóides tem-

se o timol, para-cimeno, ácido transcinâmico, para-cumárico (Figura 4).

Existem cerca de cinco mil fenóis, dentre eles, destacam-se os flavonoides,

ácidos fenólicos, fenóis simples, cumarinas, taninos, ligninas entre outros (SHAHIDI;

NACZK, 1995).

Figura 4 - Estrutura química de alguns compostos fenólicos.

2.3.2 Terpenos

Os terpenos, também conhecidos como terpenóides, são compostos

provenientes da via do ácido mevalônico (MEV), quando ocorre no citoplasma, ou

via metil-eritritol-fosfato (MEP), nos cloroplastos, do qual obtém-se a unidade

isoprênica, ou seja, o pirofosfato de isopentenil (ALVES, 2001). O isopreno é

produzido naturalmente, mas não está envolvido diretamente na formação dos

produtos pertencentes a estas classes, sendo as unidades bioquimicamente ativas

de isopreno o dimetilalil pirofosfato (DMAPP) e o isopentenil pirofosfato (IPP)

(NIERO; MALHEIROS, 2007). A união de unidades isoprênicas, composta por cinco

14

carbonos (C5), orientadas em sentido inverso (cabeça-cauda), produz diversas

classes de terpenos, entre os quais os monoterpenos, compostos com dez átomos

de carbono (C10), os sesquiterpenos, com 15 átomos de carbono (C15), diterpenos

(C20), triterpenos (C30) e caroterpenos (C40) (ALVES, 2001; OLIVEIRA et al.,2003).

Os monoterpenos, formados pela união de duas unidades isoprênicas (C10),

apresentam baixo peso molecular, sendo, portanto, compostos muito voláteis e

estão presentes nos óleos essenciais, atuando principalmente na atração de

polinizadores (OLIVEIRA et al., 2003). Atualmente são conhecidos mais de 1.000

monoterpenoides naturais (OLIVEIRA et al., 2003).

Outros exemplos de compostos pertencentes a este grupo são os hormônios

vegetais (ex. giberelina) (diterpenóide), componentes de resina, látex, ceras,

cutículas das plantas, esteroides (triterpenóides), carotenoides e xantofilas

(caroterpenóides) (PERES, 2004).

2.4 Colheita e secagem de espécies medicinais e aromáticas

2.4.1 Época de colheita

A época da colheita de plantas medicinais e aromáticas é um dos fatores de

grande relevância na cadeia produtiva, uma vez que os metabólitos secundários

presentes das espécies podem variar não só quantitativamente, mas também em

relação à natureza dos constituintes químicos (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Tais

variações podem ocorrer de forma sazonal durante todo o ano, como também variar

com a idade da planta. Assim efeitos da sazonalidade podem ser facilmente

confundidos com alterações hormonais internas advindas do desenvolvimento da

planta (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).

A idade da planta influenciou a composição química e o teor de óleo essencial

em folhas de Mentha x piperita var. citrata, em que o maior teor do óleo essencial

ocorreu aos 120 dias e o maior teor dos compostos majoritários α-fenchol e cis-

mirtanol, aos 120 e 150 dias após o transplantio, respectivamente (OLIVEIRA et al.,

2012). Situação semelhante acontece com Mentha arvensis L., em que os autores

15

observaram diferença significativa para o teor de óleo essencial na primeira colheita,

sendo recomendada aos 100 dias. Já a segunda colheita deve ser realizada mais

precocemente, dos 60 aos 75 dias (CHAGAS et al., 2011).

2.4.2 Horário de colheita

Além das variações na produção de metabólitos secundários ao longo do ano

e ciclo de vida da planta, essas alterações também podem ocorrer ao longo do ciclo

dia/noite, sendo chamadas de variações circadianas (GOBBO-NETO; LOPES,

2007). Foi observada, por exemplo, a variação do constituinte eugenol em mais de

80% entre os horários de 12h e 17h no óleo essencial da alfavaca (Ocimum

gratissimum L.) (SILVA et al., 1999), e para outras espécies como Mentha x piperita

var citrata (Ehrh.) Briq. e Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt & Smith, que apresentaram

maior produção de óleo às 13 h e 14 h, respectivamente (OLIVEIRA et al., 2012a;

SANTOS et al., 2012).

Por outro lado, algumas espécies não apresentam alterações no teor do

metabólito secundário, no entanto, sua composição química é influenciada, como

por exemplo, a erva-cidreira [Lippia alba (Mill.) N. E. Br.]. Entre os compostos

majoritários do óleo essencial das folhas, a maior produtividade de carvona da

espécie foi obtida às 10:00 h, em matéria seca (2,1 L ha-1), e para o limoneno às

16:00 h, em matéria seca (1,1 L ha-1) (EHLERT et al., 2013).

Fatores abióticos possuem grande influência nessas variações, uma vez que

várias mudanças climáticas ocorrem ao longo do dia, como temperatura, umidade,

radiação solar, etc. A temperatura pode influenciar na fisiologia da planta. Altas

temperaturas acarretam na redução da condutividade estomática fazendo com que

haja redução da fotossíntese e crescimento das plantas, o que afeta na produção de

metabólitos secundários. Além disso, o cultivo de plantas medicinais em

temperaturas mais elevadas normalmente ocasiona a volatilização dos óleos

essenciais (HERTWIG, 1991).

A radiação solar é um componente abiótico essencial para as plantas, que

interfere na fotossíntese e, consequentemente, no crescimento (VERMA; SHUKLA,

16

2015). Além da influência na biomassa, influencia o acúmulo e a qualidade dos

metabólitos secundários. Cada espécie está adaptada a certa intensidade luminosa

e à quantidade dessa incidência luminosa (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Em

Lippia origanoides, por exemplo, o aumento da intensidade luminosa resultou no

aumento da densidade estomática e de tricomas e consequentemente, aumento do

teor de óleo essencial (GOMES, 2014). Assim como para Lippia alba, em que o

maior teor de óleo na estação seca foi atribuído à maior intensidade luminosa e

temperatura que atuam diretamente em processos primários, como fotossíntese e

respiração, e indiretamente na produção de metabólitos secundários (SANTOS et

al., 2004b).

2.4.3 Temperatura de secagem

A secagem de espécies medicinais pode ser realizada natural ou

artificialmente. O processo natural pode ser feito em locais ripados ou em telados,

geralmente ao abrigo do sol. Tem como vantagem o menor custo de investimento e

maior possibilidade de conservação de propriedades organolépticas, como cheiro e

coloração evidenciando menor alteração da sua composição química (CORRÊA et

al., 2004), porém, é um método lento, eficiente apenas em regiões que apresentem

baixa umidade. A secagem artificial dá-se por meio de equipamentos com

temperatura, umidade e velocidade do ar controladas. Essas variáveis são limitadas

de acordo com a sensibilidade dos compostos voláteis presentes nessas plantas e

suas estruturas armazenadoras (CARVALHO et al., 2010). Nesse caso, é possível

que se obtenha produtos de boa qualidade em intervalos mais curtos de tempo e em

grande quantidade, porém com alto investimento financeiro.

Pesquisas com a secagem em espécies medicinais têm demonstrado

influência da temperatura no teor e composição química do óleo essencial. Por

exemplo, para o óleo essencial de Ocimum gratissimum houve influência da

temperatura de secagem, reduzindo o teor e alterando os compostos químicos em

temperaturas acima de 60 ºC (SANTANA et al., 2014). O componente majoritário do

manjericão (linalol) apresentou maiores rendimentos nas temperaturas de 50 e 60 ºC

17

(SOARES et al., 2007). Esses resultados corroboram com aqueles encontrados por

Pereira et al. (2000) e Radunz et al. (2012) que obtiveram maior rendimento de

cumarina nas folhas de guaco (Mikania glomerata Sprengel) secas a 50 ºC,

concluindo que o conteúdo de cumarina é afetado pelo aumento da temperatura de

secagem. O teor de cariofileno, presente no óleo, apresentou aumento significativo

quando as folhas foram submetidas às temperaturas de 50, 60 e 70ºC (RADUNZ et

al., 2002).

Abaas et al. (2013) avaliaram o efeito da temperatura de secagem (35ºC,

40ºC e 45ºC) no teor de óleo essencial de Achillea frayrantissima L. e Artemisia

herb-alba L. e relataram que, quanto maior a temperatura utilizada, maior a redução

nos teores desse princípio ativo de ambas espécies. Isso pode ser explicado pela

volatilização dos óleos essenciais em altas temperaturas, a depender da sua

localização e estruturas secretoras (RADUNZ et al., 2010).

2.5 Extração de óleos essenciais

A extração de óleos essenciais pode ser feita por diversos métodos a

depender do tipo de metabólito secundário, como por hidrodestilação, enfloração,

maceração, gases supercríticos, extração por solvente, dentre outros. Entre as

técnicas para extração de óleos essenciais mais usuais destaca-se a

hidrodestilação, a qual possui registros de 3000 a.C (FRASER; WISH, 1997). A

hidrodestilação é um método em que o material vegetal é imerso em água e

aquecido até que entre em ebulição e os vapores de água carreguem consigo o óleo

essencial que possui natureza volátil.

Tão importante quanto os métodos de extração é o tempo a que deve ser

submetida cada espécie para que se obtenha a máxima extração do óleo essencial.

Esse tempo pode variar de acordo com a espécie, local e estrutura especializada

onde se encontra o princípio ativo (COSTA et al., 2013).

Oliveira et al. (2012) constataram que para Mentha x piperita var citrata, o

maior teor de óleo foi obtido aos 60 minutos de extração, sendo posteriormente

estável. O maior teor de óleo essencial também foi obtido aos 130 minutos de

18

extração para Cymbopogon citratus, 150 minutos para as espécies: Cymbopogon

winterianus, Aristolochia sp, Hyptis pectinata e Hyptis fruticosa; 160 minutos para

Lippia sidoides e 230 minutos para Eucalyptus globulus (EHLERT et al., 2006).

Mattana et al. (2015) estudando o melhor tempo de extração para pariparoba

[Pothomorphe umbellata (L.) Miq.] observaram que aos 180 minutos, obtinha-se o

maior teor do óleo. Para coentro (Coriandum sativum L.), lavanda (Lavandula

angustifolia Mill.), funcho (Foeniculum vulgare Mill) e orégano (Origanum vulgare)

foram determinados os tempos de extração de 40 a 160 minutos, 60, 160 e 240

minutos, respectivamente (ZHELJAZKOV et al., 2012; ZHELJAZKOV et al., 2013a;

ZHELJAZKOV et al., 2013b; ZHELJAZKOV et al., 2014).

2.6 Atividades antifúngicas dos óleos essenciais

Várias espécies de plantas possuem substâncias comprovadamente

antimicrobianas e têm sido utilizadas no controle alternativo de doenças. O uso

indiscriminado de pesticidas químicos e por um longo período traz consequências ao

ambiente e ao homem. Neste contexto, o uso de produtos naturais, que possuam

baixa toxicidade no controle de fitopatógenos é importante, principalmente por serem

menos agressivos ao ambiente (SILVA; BASTOS, 2007).

Estudos têm sido desenvolvidos com óleos essenciais provenientes de

plantas no controle de fitopatógenos, a exemplo de Lippia sidoides e Lippia gracilis

(CARVALHO et al., 2013), Piper callosum, Piper marginatum var. anisatum e Piper

enckea (SILVA; BASTOS, 2007); Ocimum selloi (COSTA et al., 2015), Hyptis

marrubioides, Aloysia gratissima e Cordia verbenacea (SILVA et al., 2012a; SILVA et

al., 2012b), Erigeron ramosus (RAHMAN et al., 2010). A atividade antifúngica

dessas plantas é atribuída à ação das substâncias presentes na composição dos

óleos essenciais ou extratos brutos, como os compostos fenólicos, monoterpenos e

terpenos (GILLES et al., 2010).

Alguns autores discutem que a atividade antifúngica dos óleos essenciais é

proveniente da sua natureza lipofílica (BAKKALI et al., 2008). Essa atividade é,

provavelmente, resultado da penetração da quitina nas paredes celulares dos

19

fungos, prejudicando a lipoproteína da membrana citoplasmática, o que leva ao

extravasamento do citoplasma, esvaziamento e murcha das hifas (ZAMBONELLI et

al., 1996; CACCIONI; GUIZZARDI, 1994; DOS SANTOS et al., 2013). A propriedade

hidrofóbica do óleo essencial e composição química também permite uma interação

entre o óleo e os lipídeos da membrana celular, o que interfere na permeabilidade e

causa alterações em sua estrutura (COSTA et al. 2011).

O óleo essencial de Lippia origanoides tem eficiência fungicida já

comprovada no controle de Phytophthora infestans (BEDOYA et al., 2015),

Moniliophthora perniciosa (OLIVEIRA et al., 2014), e Sclerotium cepivorum

(OSPINA et al., 2011). Devido ao amplo espectro dos óleos essenciais e ao

potencial fungicida deste óleo, novos estudos são necessários para ampliar a

possibilidade de utilização como controle alternativo de doenças em plantas.

2.7 REFERÊNCIAS

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30

3 “EVALUATION OF THE TYPE OF CUTTINGS AND SUBSTRATES IN THE ROOTING OF SALVA-DE-MARAJÓ”. (SUBMETIDA À REVISTA PESQUISA AGROPECUÁRIA BRASILEIRA - PAB).

NOTA CIENTÍFICA

Evaluation of the type of cuttings and substrates in the rooting of salva-de-marajó

Giovanna Alcântara Queiroz (1) *

, Pedro Henrique Lopes Silva (1)

, George Andrade

Sodré (1)

and Larissa Corrêa do Bomfim Costa

(1)

1Universidade Estadual de Santa Cruz, Campus Soane Nazaré de Andrade - Rod. Jorge

Amado, km 16 - Salobrinho, Ilhéus - BA, 45662-900. Email: [email protected],

[email protected], [email protected], [email protected].

Abstract - The objective of this study was to evaluate the rooting of basal, medial, and

apical cuttings in substrates (sand, ellepot, and phenolic foam) in the vegetative propagation

of Lippia origanoides. The experiment was conducted in a completely randomized 3 x 3

factorial design with three replications and 10 cuttings per experimental plot. Forty days after

rooting, rooting percentage, shoot number, shoot length, root length, shoot and root dry matter

as well as total were analyzed. It is recommended to use cutting (apical, median and basal) in

the substrate sand to obtain the best of this species.

Index terms: Lippia origanoides, medicinal plant, cutting, asexual propagation.

Avaliação de tipo de estacas e substratos no enraizamento de salva-de-marajó

Resumo - O objetivo do trabalho foi avaliar o enraizamento de estacas das porções

basal, mediana e apical em substratos (areia, ellepot e espuma fenólica) na propagação

vegetativa de Lippia origanoides. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado em

esquema fatorial 3 x 3 com três repetições e 10 estacas por parcela experimental. Quarenta

dias após o enraizamento foi avaliada a porcentagem de enraizamento, número de brotos,

31

comprimento da maior brotação e da maior raiz, massa seca dos brotos, raízes e total.

Recomenda-se o uso de estaca apical, mediana ou basal em substrato areia para obter o

melhor enraizamento dessa espécie.

Termos para indexação: Lippia origanoides, planta medicinal, estaquia, propagação

assexuada.

Lippia is the second largest genus of the Verbenaceae family with approximately 200

species (TERBLANCHÉ & KORNELIUS, 1996), of which 120 are found in Brazil. In folk

medicine, it is known as Salva-de-Marajó, Orégano-do-Monte as well as Capim d’angola.

The leaves and flowers are traditionally used in the form of infusion in the treatment of

stomach pain, indigestion, diarrhea, respiratory treatments, and as a general antiseptic for the

mouth, throat, and sores (PASCUAL et al., 2001).

Some species of the genus Lippia cannot be propagated by seeds, including Lippia

lupulina, Lippia sidoides, and Lippia rosella, as they lose viability during storage (PIMENTA

et al., 2007). In the case of Lippia origanoides, its seeds are very small and of "low

perceptibility" (HERRERA-MORENO et al., 2013), making vegetative propagation its main

alternative for multiplication. Vegetative propagation of medicinal plants is another way to

prevent variations in the levels of active ingredients, to maintain the quality of the final

product as well as reduce the time they take to reach adulthood (MARCHESE & FIGUEIRA,

2005).

The type or position of cutting in the branches influences rooting. Apical cuttings have less

lignification and greater meristematic activity than basal cuttings (HARTMANN et al., 2011),

although they also feature the epidermis with less developed cuticle. This may increase

moisture loss and require, for example, the use of nebulizers to keep tissues hydrated (LIMA

et al., 2006).

32

Substrates for rooting should have as their main characteristics the ability to support

cuttings during rooting, provide moisture, reduce light penetration at the base of the cuttings,

and favor aeration (HARTMANN et al., 2011). In general, raw materials of mineral and

organic origin are used pure or in mixtures as substrate in the vegetative propagation of

plants, in addition to having specific characteristics. Sand, for example, has low cost, is

chemically inert, and easy to acquire (KÄMPF & FERMINO, 2000).

Other substrates can be used to propagate medicinal species, such as ellepot and phenolic

foam. Ellepot is a perlite and sphagnum peat-based substrate insured by a cellulose screen that

expands upon moistening and exhibits low density (150 to 250 kg m-3

). Phenolic foam is a

stable and organic material (polyphenolic, urea-formaldehyde or polystyrene) with high

moisture and aeration retention capacity, inert and sterile, and does not interfere with plant

nutrition (SILVA et al., 2012). Thus, the aim of this study was to evaluate rooting cuttings of

the basal, medial, and apical regions in three types of substrates (sand, ellepot, and phenolic

foam) in the vegetative propagation of Lippia origanoides.

The experiment was conducted in the Executive Committee of Cocoa Plantation (Ceplac),

Ilhéus, Bahia State. The cuttings were obtained from the segmentation of branches located in

the medial part of two-year-old Lippia origanoides Kunth parent plants grown in the

Medicinal Plant Garden of the State University of Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia State.

The voucher specimen is stored in the UESC Herbarium under registration number 21282.

The experiment was conducted in a completely randomized 3 x 3 factorial design

comprised of three types of cuttings (apical, medial, and basal) and three substrates (sand,

phenolic foam, and ellepot) totaling nine treatments with three replicates of 10 cuttings per

experimental plot. After cutting, the branches were immediately packed in polystyrene boxes

and transported to the rooting site in order to avoid water loss by perspiration. The time

between collection and cutting was approximately one hour. Cuttings were about 11 cm in

33

length, 1.8, 2.4, and 3.1 mm in diameter for the apical, medial and basal cuttings, respectively.

All cuttings were maintained with one pair of leaves at the apex, cut in half and received a

bevel cut at the base.

The sand was obtained from the bottom of a river and initially sieved in a 4 mm mesh.

Then, the sand was washed in a 10% sodium hypochlorite solution to remove biological

contaminants and afterwards in distilled water. After the washing process, the sand was dried

in the shade and packed in polypropylene tubes with a capacity of 50 cm³.

The phenolic foam (Green up®) is an inert substrate adjusted in consonance with the need

of the plant. According to the manufacturer, it has a maximum electrical conductivity (EC) of

0.5 μs cm-1

, minimum water retention capacity of 45 to 55%, and density of 10-12 kg m-3

. For

the present experiment, 2.5 x 2.5 x 10 cm foams were used.

The ellepot was 3 cm in diameter and 5 cm in length, tablet-type, and obtained from the

commercial brand Jiffy®. When immersed in water films (50 to 60°C), this substrate fully

expands reaching up to 10 cm in length. Additionally, it has as raw materials Sphagnum peat,

calcium and magnesium carbonate, perlite and surfactant, EC of 1.2 μs cm-1

, pH of 5.1 (±

0.5), water retention capacity of 350%, and density of 250 kg m-3

. The cuttings were placed in

the substrates at the depth of 3 cm and immediately transferred to the nebulization chamber.

The cuttings were rooted in an intermittent nebulization chamber with controlled

environment by means of 10 second sprayings at 5 minute intervals between 8:00 a.m. and

5:00 p.m. The internal chamber temperature in the experimental period varied between 27 and

31ºC.

After 40 days, the cuttings were removed from the chamber and the following variables

evaluated: cutting rooting percentage (CRP), in which rooted cuttings longer than 1 cm were

considered regardless of the existing amount; shoot number (SN); the longest shoot length

(LSL); the longest root length (LRL); shoot (SDM) and root dry mass (RDM); and total dry

34

mass (TDM = SDM + RDM). In order to obtain the dry mass, a forced air circulation oven at

65°C for 72 hours and a precision balance were used.

Before beginning the experiment, the substrates were analyzed for water holding capacity

(WHC) by using the centrifugation method adapted from SODRÉ (2007), in which the sand,

the foam, and the ellepot presented 0.30 mm-3

, 0.48 mm-3

, and 0.83 mm-3

of WHC,

respectively.

Data were submitted to analysis of variance by the F test and the comparison of means

using the Tukey test at 5% probability. The percentage data were transformed to

.The variables were analyzed using the software Sisvar®

(FERREIRA,

2011).

There was a significant isolated effect of the substrates for variables CRP, LSL, SDM,

LRL, RDM as well as TDM, and types of cuttings for the variables SN, LSL, SDM, and LRL.

In general, for the variables related to growth and RDM, the apical and medial cuttings that

propagated in sand substrate showed higher averages. On the other hand, for the

characteristics referring to sprouting and TDM, the best results were observed for basal

cuttings propagated in the ellepot (Table 1).

Table 1. Effect of substrate and type of percentage cuttings in rooting (CRP), shoot number (SN), the longest shoot length

(LSL), shoot dry mass (SDM), the longest root length (LRL), root dry mass (RDM), and total dry mass (TDM) in Lippia

origanoides cuttings (apical, medial, and basal) propagated in substrates (phenolic foam, ellepot, and sand). Ilhéus, Bahia

State, 2016.

SUBSTRATES CRP

(%)

SN LSL (cm) SDM(mg) LRL (cm) RDM (mg) TDM (mg)

FOAM 76.6 ab 3.0 a 1.8 b 25.1 b 7.0 b 17.2 b 42.3 b

ELLEPOT 70.0 b 3.0 a 3.7 a 35,4 a 5.2 c 11.5 b 47.0 b

SAND 96.7 a 3.1 a 1.9 b 27.0 b 10.5 a 45.7 a 72.8 a

CUTTINGS CRP

(%)

SN LSL (cm) SDM(mg) LRL (cm) RDM (mg) TDM (mg)

APICAL 93.3 a 2.7 c 1.7 b 17.6 c 8.3 a 31.4 a 49.0 a

MEDIAL 87.8 a 3.0 b 2.7 a 30.4 b 7.9 a 24.8 a 55.2 a

BASAL 81.1 a 3.5 a 3.0 a 39.4 a 6.5 b 18.3 a 57.7 a

MEAN 87.4 3.0 2.5 29.2 7.6 24.8 54.0

CV (%) 11.6 8.6 25.7 23.3 12.9 44.2 28.8

SDM (%) 12.2 0.3 0.8 8.2 1.2 13.2 18.7

* Averages followed by the same letters in the column do not differ from each other by the Tukey test at 5% probability.

35

The sand was observed to have less WHC when compared to the other substrates, which

benefited root development, as observed in the values of LRL and RDM (Table 1). Elevated

WHC values can mean reduced aeration space, hence reduced available oxygen for root

development (ALLAIRE et al., 2004).

Rooting was high (up to 70%), regardless of the type of cuttings and substrates used, which

facilitates the process of domestication of the specie (Table 1). Other species, such as Lippia

gracilis, showed significant difference in rooting between types of cuttings (SANTOS et al.,

2016), thus highlighting the importance of choosing the branch region for propagation of this

specie.

For the substrate factor, a higher CRP of L. origanoides was observed, although with no

significant difference between sand and phenolic foam (Table 1). Considering that the

substrates were subjected to the same humid environment formed by the intermittent

nebulization, this difference can be attributed to the different drainage capacities of the

substrates, which may have reduced aeration of the ellepot substrate and interfered in root

growth (Table 1). Nevertheless, sand, which is composed of inert mineral particles with low

water retention capacity, enabled rapid and efficient drainage as well as good aeration

(KÄMPF & FERMINO, 2000). In a study of sand and coconut fiber mixtures as a substrate in

the propagation of Lippia origanoides (HERRERA-MORENO et al., 2013) as well as Lippia

gracilis (OLIVEIRA et al., 2011; SANTOS et al., 2016), no differences were found for the

percentage of rooting of cuttings.

For longest root length (LRL), the sand substrate differed significantly from the foam and

ellepot, being 1.5 and 2.0 times higher, respectively (Table 1). HARTMANN et al. (2011)

suggest that the ideal rooting substrate should be sufficiently porous to enable efficient gas

exchange since increased oxygen availability at the base of the cuttings promotes cellular

activity during the callus forming process and subsequent root emission. Regarding porosity,

36

the type of porosity is more important than the quantity. As reported by FERMINO (2002), in

substrates with high proportions of particle sizes between 0.1 to 0.25 mm and smaller, there is

reduced water mobilization, hence increased WHC as well as low oxygenation of the roots.

For longest root length (LSL) and SDM, the averages of the ellepot substrate were

significantly higher than the others. Considering that fertilization of the substrates was not

carried out and that sand and phenolic foam are chemically inert and lack available nutrients

(KÄMPF & FERMINO, 2000).

Furthermore, SN, LSL, and SDM for basal cuttings were statistically higher to apical

cuttings and medial and basal cuttings did not differ for LSL (Table 1). Similar results were

obtained by SANTOS et al. (2016) for SDM in studies with Lippia gracilis. According to

TAIZ & ZEIGER (2013), in the development of plants propagated by cutting, there is a

spatial gradient of juvenility along the axis of the branch, where, at the apex, meristematic

cells in the juvenile state pass to the vegetative and reproductive adult phase (floral evocation)

whereas the tissues of the base of the branch stay longer in the juvenile state and thus possess

greater sprouting capacity. These authors also pointed out that the growth of lateral buds

usually occurs when the stem apex is removed, which explains the increased sprouting in the

medial and basal cuttings of the present study.

Although no significant differences were observed for LRL between the apical and medial

cuttings, LRL was significantly superior for the basal cutting (Table 1). In line with (TAIZ &

ZEIGER, 2013), the endogenous auxins present in the cuttings stimulate rooting, and the

cytokines, which are produced in the roots, stimulate cell division. Thus, the possible

presence of higher amounts of endogenous auxins would have provided apical and medial

cuttings with greater root growth.

Lippia origanoides has a high rooting capacity (over 70%). The use of the sand substrate,

regardless of the type of stake used, provides a higher percentage of rooting and accumulation

37

of total dry matter. Therefore, it is recommended to use cutting (apical, median and basal) in

the substrate sand to obtain the best rooting for this specie.

Acknowledgements

To the Comissão Executiva de Planejamento da Lavoura Cacaueira (CEPLAC) and

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) for the financial

support.

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39

4 TEMPO DE HIDRODESTILAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL, HORÁRIO E ÉPOCA DE COLHEITA DE FOLHAS DE Lippia origanoides Kunth.

RESUMO: O objetivo deste estudo foi determinar o tempo de hidrodestilação, a

época e o horário de colheita que maximize o teor e produção do óleo essencial de

Lippia origanoides priorizando o composto majoritário da espécie. Para isso foram

conduzidos três experimentos, sendo dois em delineamento inteiramente

casualizado para determinar o tempo de extração por hidrodestilação (30, 60, 90,

120, 150 e 180 minutos), horário de colheita (9:00 h, 11:00 h, 13:00 h, 15:00 h e

17:00 h) e época de colheita, em delineamento de blocos casualizados, sendo os

tratamentos quatro intervalos entre o plantio e a colheita (150, 210, 270, 330 dias).

Para o experimento de tempo de extração, foi avaliado o teor de óleo essencial.

Para experimento de horário e época de colheita além do teor foram avaliados a

composição química do óleo e percentagem relativa do composto químico timol.

Para época de colheita ainda foi realizada análise de crescimento com medições

mensais (massa seca do caule, massa seca foliar, altura da planta, diâmetro do

caule da planta, área foliar). Os resultados foram submetidos a análise de variância

(ANOVA), e testes de média, para variáveis qualitativas, e teste de regressão, para

variáveis quantitativas. O tempo de 150 minutos de hidrodestilação resultou em

maior teor de óleo extraído. A época de colheita ideal para folhas de L. origanoides

foi aos 240 dias após o transplantio das mudas, enquanto que o horário entre 9:00h

e 11:00h foi o que resultou em maior teor de óleo essencial. O maior teor relativo do

componente majoritário timol coincidiu com os resultados dos teores de óleo

encontrados no horário e época de colheita.

Palavras-chave: planta medicinal, extração, colheita, timol.

ABSTRACT: The objective of this study was to determine the time of

hydrodistillation, harvest time and harvest season that maximize the content and

production of the essential oil of Lippia origanoides prioritizing the major compound

of the species. For this, three experiments were carried out, two of them in a

completely randomized design to determine the hydrodistillation extraction time (30,

60, 90, 120, 150 and 180 minutes), harvest time (9:00 a.m., 11:00 a.m., 1:00 p.m.,

3:00 p.m. e 5:00 p.m.) and harvest season, in randomized block design, with four

treatments between planting and harvesting (150, 210, 270, 330 days). For the

extraction time experiment, the essential oil content was evaluated. The chemical

composition of the oil and the relative percentage of the chemical compound thymol

were evaluated for the time and the harvest season, and for the latter, growth

analysis with monthly measurements (stem dry mass, leaf dry mass, plant height,

stem diameter of the plant and leaf area). The results were analyzed by means of

analysis of variance (ANOVA), and means test for qualitative variables, and the

regression test for quantitative variables. The hydrodistillation time of 150 minutes

showed the highest oil content. The ideal harvesting time for leaves of L. origanoides

40

was 240 days after transplanting, from 9:00 a.m. to 11:00 p.m. to obtain the highest

essential oil content. The higher relative content of the thymol major component

coincided with the oil content results found in the harvest time and harvest season,

and it was therefore possible to optimize the harvest.

Keywords: medicinal plant, extraction, harvest, thymol.

4.1 Introdução

A extração do óleo essencial das plantas medicinais pode ser feita por

diferentes métodos, utilizando o arraste a vapor, a compressão, fluídos supercríticos

e enfloração (enfleurage), contudo, a hidrodestilação ainda é um dos métodos mais

comuns, usada desde 3000 a. C. (FRASER; WISH, 1997), sendo o método

recomendado pela Farmacopéia Brasileira. A escolha do método de extração de

óleo varia de acordo com diversos fatores, dentre eles o órgão onde é encontrado,

além do tipo de estrutura que secreta e armazena o óleo essencial, além da

finalidade de uso. O tempo de hidrodestilação também pode interferir na máxima

extração do produto (EHLERT et al., 2006). Assim, a determinação prévia do tempo

ideal de extração permite otimização do processo evitando o desperdício de tempo e

a elevação dos custos de extração.

Outro fator de elevada importância na produção de óleos essenciais é o

horário de colheita, pois, é um fator que pode interferir não só no teor de óleo na

planta, quanto na composição química que varia ao longo do dia (SOUZA et al.,

2006). Trata-se de um aspecto que envolve não só aspectos climatológicos do dia

como também a fisiologia da planta (OLIVEIRA et al., 2012). Estudos relatam que o

horário de colheita afeta o teor de óleo essencial de Lippia sidoides (alecrim-

pimenta) (MELO et al., 2011), Mentha x piperita var citrata (OLIVEIRA et al., 2012) e

pariparoba (Pothomorphe umbellata ) (MATTANA et al., 2015). Assim como o horário

de colheita, estudos mostram que a temperatura, pluviosidade, vento, solo, latitude,

altitude e época estacional, interferem, no teor e produção de óleo essencial. Além

disso, há uma variação significativa, na elaboração e composição química do óleo

(PINTO; BERTOLUCCI, 2002). Portanto, a melhor época de colheita deve ser

determinada para obtenção de melhor rendimento do óleo essencial, qualidade e

maior produção de biomassa.

41

A Lippia origanoides, é uma espécie medicinal da flora brasileira, conhecida

popularmente como alecrim-pimenta, orégano-do-monte e capim d’angola

(OLIVEIRA, 2007; SALIMENA; MÚGURA, 2015). As folhas e flores são usadas

tradicionalmente na forma de infusão e no tratamento de dores de estômago,

indigestão, diarreia, tratamentos respiratórios e como antisséptico geral para boca,

garganta e feridas (PASCUAL et al., 2001), e também como fungicida e repelente

(NERIO et al., 2009; OSPINA et al., 2011). Os principais constituintes químicos do

óleo essencial são o timol, carvacrol e monoterpenos oxigenados (STASHENKO et

al., 2010; VICUÑA et al., 2010), o que desperta o potencial interesse da indústria

química e farmacêutica sobre o óleo essencial desta planta.

Neste contexto, o objetivo deste estudo foi determinar o tempo de

hidrodestilação, bem como o horário e época de colheita que maximizem o teor e

produção do óleo essencial de Lippia origanoides priorizando o composto majoritário

da espécie, o timol.

4.2 Material e Métodos

Foram conduzidos três experimentos. Os experimentos 1 e 2 foram

conduzidos na Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) localizada no

município de Ilhéus (14º 47’ 48’’ S; 39º 10’ 26’’ W; 12 m de altitude), em maio de

2015 e julho de 2016, respectivamente. Esses experimentos foram conduzidos

utilizando amostras foliares de plantas matrizes presentes no Horto de Plantas

Medicinais da UESC.

O experimento 3 foi realizado em área experimental da Estação Experimental

Arnaldo Medeiros – ESARM, localizada na Comissão Executiva do Plano da Lavoura

Cacaueira (CEPLAC), nas coordenadas geográficas 14º45’28,0”S e 39º13’49,5”W, e

foi conduzido no período de abril de 2015 a fevereiro de 2016.

Para todos os experimentos, a espécie foi taxonomicamente identificada e

exsicatas do material botânico foram depositadas no Herbário UESC, sob registro nº

21282.

42

4.2.1 Experimento 1 - Determinação do tempo de extração

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com seis

tratamentos (30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos) e quatro repetições. Para a

extração de óleo essencial foi utilizado o método de hidrodestilação em aparelho de

Clevenger. A contagem do tempo de extração foi realizada após a condensação da

primeira gota de óleo observada no aparelho Clevenger.

Para extração do óleo foram coletadas folhas às 9:00 horas da manhã,

pesadas 50 g de biomassa foliar fresca, para cada repetição, e colocadas em balões

de 1 L contendo 0,5 L de água destilada. Ao final de cada período de extração, o

óleo essencial e hidrolato foram coletados em funil de separação de líquidos. Em

seguida o óleo foi separado do hidrolato (3 x 10 mL) com diclorometano (solvente

orgânico), e seco com sulfato de sódio anidro e concentrado. Após a obtenção do

óleo essencial, a massa e o teor de óleo foram calculados pela fórmula: T% =

(Massa do óleo (g) / 50 g) x 100.

4.2.2 Experimento 2 - Determinação do horário de colheita

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco

tratamentos, que foram definidos pelos horários de colheita (9:00 h, 11:00 h, 13:00 h,

15:00 h e 17:00 h), e quatro repetições (uma planta por repetição). Após a coleta, as

folhas foram secas em estufa de circulação forçada de ar a 40 ºC até obtenção da

massa constante. Após a secagem, as extrações do óleo essencial foram realizadas

por hidrodestilação em aparelho Clevenger, por 150 minutos, utilizando-se quatro

repetições de 100 g de biomassa foliar fresca em balão de 1 L contendo 0,5 L de

água destilada, para cada tratamento. O óleo essencial foi separado do hidrolato

usando diclorometano, seco com sulfato de sódio anidro e concentrado.

Foram avaliados o teor e composição química do óleo essencial e percentual

relativo do composto majoritário. Determinou-se o teor pela fórmula: T% = (Massa do

óleo (g) /100 g) x 100. O percentual relativo do composto majoritário foi calculado

em relação ao teor de óleo essencial de cada horário de colheita, pela fórmula: (Teor

de óleo do tratamento (%) x Porcentagem do composto) /100.

43

4.2.3 Experimento 3: Determinação da época de colheita

4.2.3.1 Produção de mudas e plantio

As mudas de L. origanoides foram produzidas a partir de matrizes de um ano

de idade, cultivadas no Horto de Plantas Medicinais da Universidade Estadual de

Santa Cruz (UESC), utilizando-se estacas apicais de 7 cm propagadas em tubetes

de 50 cm³ contendo areia de rio lavada. Após 60 dias, essas mudas já enraizadas

foram acondicionadas em sacos de polietileno de 2 litros e cultivadas em casa de

vegetação com 50% de sombreamento até atingirem 50 cm de altura, tomada a

partir do coleto da planta. Em seguida foram aclimatizadas por 15 dias e conduzidas

a área de campo da ESARM/CEPLAC.

4.2.3.2 Clima

Os dados climatológicos coletados durante a condução do experimento

encontram-se na tabela 1, em que é possível observar a ocorrência de seca entre os

anos de 2015 e 2016. Nesse período a precipitação registrada entre setembro de

2015 e fevereiro de 2016 foi 75% inferior às médias desses meses em anos

anteriores.

Tabela 1 - Dados climatológicos de temperatura média, radiação, precipitação e umidade relativa do município de Ilhéus - BA, de abril de 2015 a fevereiro de 2016.

Mês/ano DAP (dias)

Temperatura média (ºC)

Radiação (kJ/m)

Precipitação (mm)

Umidade relativa

(%)

Abril/15 30 24,5 933,9 48,4 85 Maio/15 60 22,6 795,2 115,2 88 Junho/15 90 20,3 693,1 465,2 69 Julho/15 120 20,5 805,4 160,4 90 Agosto/15 150 19,9 915,8 163,4 88 Setembro/15 180 21,6 1120,6 21,8 84 Outubro/15 210 22,0 1136,5 33,2 84 Novembro/15 240 24,2 1168,8 17,8 80 Dezembro/15 270 25,2 1330,1 25,6 77 Janeiro/16 300 26,3 1071,6 133,2 81 Fevereiro/16 330 26,1 1309,3 38,0 79

Fonte: INMET, 2016. DAP = dias após o plantio.

44

4.2.3.3 Instalação e condução do experimento

Antes da instalação do experimento foram coletadas amostras compostas do

solo da área de cultivo para realização de análises químicas. Na tabela 2 é possível

verificar a boa fertilidade do solo até 40 cm de profundidade, com destaque para

elevada CTC e saturação de bases e também a disponibilidade de micronutrientes

(Cu, Fe, Mn e Zn).

Tabela 2 - Características químicas do solo coletado, antes da instalação do

experimento, na Estação Experimental Arnaldo Medeiros – ESARM (análise

realizada no Laboratório de Solos – CEPLAC/CEPEC), nas profundidades (P) de 0 a

20 cm (1) e de 20 a 40 cm (2). Ilhéus - BA, 2015.

P (cm)

pH C Na Al H+Al K Ca Mg SB CTC (t)

V P Cu Fe Mn Zn

HH2O

(g dm

-3)

(cmolc dm-3)

((%)

(mg dm-3)

1 5,5 16,9 0,12 0,3 5,9 0,13 7,6 6,1 14 14,3 70 7 6 139 101 4

2 5,6 10,4 0,15 0,5 5,5 0,08 6,6 5,0 12 12,5 69 6 3 163 124 3

As mudas de L. origanoides foram transplantadas no campo em espaçamento

de 2 x 2 m, em covas de 30 cm x 30 cm x 40 cm adubadas anteriormente (15 dias)

com 150 g de superfosfato simples. O delineamento experimental foi em blocos

casualizados, composto de quatro épocas de colheita (150, 210, 270 e 330 dias

após o plantio) e cinco repetições, com duas plantas por unidade experimental,

sendo consideradas parcelas úteis as 40 plantas centrais (Figura 1). Durante o

período experimental de cultivo realizou-se controle de plantas espontâneas com

quatro capinas. A irrigação foi feita manualmente apenas nos períodos de estiagem.

Foram realizadas medições mensais para análise de crescimento das

seguintes variáveis: altura da planta (h), em metros e diâmetro do caule da planta a

10 cm do solo (d), em mm, de todas as plantas até a respectiva colheita. A colheita

do material iniciou aos 150 dias após o plantio (DAP) das mudas. Cada colheita foi

realizada entre 9:00 h e 10:00 h, cortando-se as plantas a 10 cm do solo, sendo o

material colhido separado cuidadosamente em caule e folhas. Após cada colheita,

as folhas eram acondicionadas em sacos de papel, identificados e levados ao

laboratório para estimativa de área foliar (AF, em cm³), por meio de medidor de área

LI-3100 (Li-Cor, inc. Lincoln, Nebraska, USA). Posteriormente, o material do caule e

45

folhas foi levado à estufa de circulação forçada de ar a 40 °C, até massa constante,

para se obter a massa seca do caule (MSC) e massa seca foliar (MSF), em gramas.

Figura 1 - Esquema de instalação do experimento.

Fonte: Elaborado pelo autor.

A extração do óleo essencial foi realizada por hidrodestilação em aparelho

Clevenger. Para isso, cinco amostras de 100 g de folhas secas (repetições) de cada

tratamento foram submetidas à hidrodestilação por 150 minutos, utilizando-se balões

de volume de 3L contendo 1,5 L de água destilada. Em seguida o óleo foi separado

do hidrolato realizando-se três lavagens com 10 mL de diclorometano (solvente

orgânico), e seco com sulfato de sódio anidro e concentrado. O teor de óleo foi

determinado por T% = (Massa do óleo (g) /100 g) x 100. A produção do óleo

essencial foi obtida pela massa total de óleo extraído das folhas de cada tratamento

(g planta-1). O percentual relativo do composto majoritário foi calculado em relação

ao teor de óleo essencial de cada época de colheita e a percentagem do composto

46

encontrado no óleo essencial, pela fórmula: (Teor de óleo do tratamento (%) x

Porcentagem do composto) /100.

4.2.3.4 Análise química cromatográfica do óleo essencial

Foi avaliada a composição química do óleo obtido em diferentes épocas e

horários de colheita. Para tanto, foi usada a cromatografia gasosa acoplada ao

detector de ionização de chama (GC-FID) usando o cromatográfo a gás Varian

Saturm® 3800 equipado com coluna capilar de sílica fundida VF5-ms (30 m X 0,25

mm) com fase estacionária 5% fenil-95% dimetilpolisiloxano (0,25 μm de espessura

de filme), tendo hélio 6.0 como gás arraste e fluxo de 1,2 mL.min-1 (10 psi). As

temperaturas do injetor e detector foram de 250°C e 280°C, respectivamente. Foi

injetado 1,0 μL de solução em CHCl3 a 10 % no modo split (1:10). A temperatura da

coluna teve início a 60 ºC, sendo acrescida de 8 ºC/min. até 240 ºC sendo mantida

nessa temperatura por 5 minutos perfazendo o tempo de 27,5 minutos. A

quantificação dos componentes foi obtida por integração eletrônica dos picos

detectados no FID por normatização. As injeções foram realizadas em triplicatas.

A análise qualitativa foi realizada em espectrômetro de massas Varian®

Saturno 2000, a coluna e as condições de temperaturas foram idênticas as usadas

na analise CG-FID sendo a temperatura da transferline 250°C, manifold 50 ºC e trap

150 °C. O modo de operação foi o impacto elétrico de 70eV à velocidade de

varredura de 1/segundo (s) dentro da faixa de 40 a 450 Da a uma taxa de

amostragem de 1.2 varredura/s. A identificação dos componentes dos óleos foi

realizada pela análise dos padrões de fragmentação observado nos espectros de

massa, tendo sido confirmada por comparação dos seus espectros de massas com

aqueles presentes na base de dados fornecidos pelo equipamento (NIST 08), bem

como por meio da comparação dos seus índices de retenção com os compostos

conhecidos, obtidos por injeção de uma mistura de padrões contendo uma série

homóloga de alcanos C8 – C26 (sigma – USA), e dados da literatura (ADAMS, 2007).

47

4.2.3.5 Análises estatísticas

Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), e em

seguida as médias submetidas ao teste de Tukey a 5 % de probabilidade, para

análises qualitativas, e ao teste de regressão, para análises quantitativas, sendo

aceitos os modelos que apresentaram todos os coeficientes significativos a até 5 %,

pelo teste F, e o maior coeficiente de determinação ajustado com o uso do software

Sisvar (FERREIRA, 2011).

4.3 Resultados e Discussão

4.3.1 Experimento 1: Tempo de extração

Os maiores teores de óleo foram obtidos aos 150 e 180 minutos que não

diferiram entre si e foram significativamente diferentes dos demais tempos de

extração (Figura 2).

Figura 2 - Teor de óleo essencial de L. origanoides Kunth em função do tempo de extração por hidrodestilação. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. DMS = 0,43. CV= 9,75%.

As variações no teor de óleo essencial extraído de plantas medicinais e

aromáticas podem estar relacionadas à colheita, tempo e método de secagem,

processamento, método de extração, entre outros (COSTA et al., 2013), podendo

48

haver diferenças até mesmo intraespecíficas, como é o caso de Mentha x piperita,

em que foram encontrados diferentes tempos de extração: 60 minutos, 90 minutos,

120 minutos e 150 minutos de extração (SOUZA et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2012;

DAVID; BOARO, 2009; GARLET, 2009; VALMORBIDA et al., 2006).

Para outras espécies foram observados tempos variados de 130 minutos para

capim-limão (Cymbopogon citratus DC. (Stapf.)); 150 minutos para as espécies

capim-citronela (Cymbopogon winterianus Jowitt.), cipó-mil-homens (Aristolochia sp),

sambacaita (Hyptis pectinata (L.) Poit) e alecrim-de-tabuleiro (Hyptis fruticosa

Salzm.) e 230 minutos para eucalipto (Eucalyptus globulus Labill.) (EHLERT et al.,

2006). Em gabiroba (Campomanesia adamantium (Cambess.) O.Berg), o teor

máximo de óleo essencial extraído foi de 0,31% após 120 minutos de extração

(OLIVEIRA et al., 2017). Para pariparoba (Pothomorphe umbellata (L.) Miq.),

Mattana et al. (2015) recomendam extração em 180 minutos para obtenção de

maiores rendimentos do óleo essencial (0,42%) com posterior estabilização. No

entanto, algumas espécies, como patchouli (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) não

apresentaram diferença estatística significativa entre os tempos de extração entre 1h

e 8h, podendo ser extraído o óleo essencial com 60 minutos (COSTA et al., 2013).

As diferenças relatadas para cada espécie também podem estar

relacionadas à estrutura foliar e estrutura secretora e armazenadora do óleo

(tricomas, canais e ductos secretores) que facilitam ou dificultam a saída do óleo

essencial dos tecidos, das características de solubilidade ou volatilidade,

principalmente dos compostos terpênicos (monoterpenos, sesquiterpenos,

carotenoides).

4.3.2 Experimento 2: Horário de colheita

Verificou-se diferença significativa entre os horários de colheita tanto em

relação ao teor de óleo essencial, quanto à percentagem relativa do constituinte

majoritário timol (p<0,01) (Figura 3). Os maiores teores de óleo foram encontrados

pela manhã entre 9:00h e 11:00h, não diferindo estatisticamente do horário de

49

17:00h. Os menores valores de teor foram observados para os horários de 13:00h e

15:00h da tarde, sendo que estes não diferiram estatisticamente entre si (Figura 3).

Figura 3 - Teores médios do óleo essencial de folhas secas de Lippia origanoides Kunth em função dos horários de colheita (9:00h, 11:00h,13:00h, 15:00h, 17:00h). Ilhéus, BA. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. DMS = 0,25. CV= 7,4%.

Neste estudo, o maior teor de óleo nas folhas ocorreu pela manhã, seguido do

decréscimo no meio do dia, e posterior aumento desses valores ao final da tarde

(Figura 3). Os resultados sugerem que a temperatura, umidade relativa do ar e

período de exposição ao sol que também influenciam a fotossíntese, foram

fundamentais e interferiram diretamente na produção dos metabólitos secundários e

consequentemente o teor do óleo extraído. De acordo com Taiz e Zeiger (2013),

tanto a biossíntese de terpenos quanto a de compostos fenólicos são reações

dependentes de produtos da fotossíntese, através da via metil-eritritol-fosfato (MEP).

Os menores teores de óleo essencial ocorreram nas horas mais quentes do dia,

período em que a fotossíntese líquida é reduzida. As taxas fotossintéticas mais altas

ocorrem quando as etapas da fotossíntese estão equilibradas em temperaturas

ótimas, no entanto, em temperaturas mais elevadas ou muito baixas, estas etapas

são limitadas (TAIZ; ZEIGER, 2013).

Na figura 4, são apresentados os dados de temperatura e umidade onde se

verifica aumento da temperatura e redução da umidade durante o período da tarde,

o que provavelmente favoreceu a perda dos componentes do óleo por volatilização.

Por outro lado, nas primeiras horas do dia, as temperaturas estavam mais baixas, o

50

que contribui para a não volatilização do óleo essencial das folhas (BRANT et al.,

2008). Além disso, esses resultados podem estar relacionados ao fato de que as

plantas acumulam óleo essencial durante a noite e, ao longo do dia, ocorrem perdas

por volatilização (MELO et al., 2011).

Figura 4 - Dados médios de temperatura (ºC) e umidade relativa do ar (%) nos horários de colheita das folhas de Lippia origanoides, em julho de 2016.

Fonte: INMET, 2016.

Algumas espécies medicinais mostram respostas positivas com aumento do

teor de óleo em relação direta a elevação da temperatura, devido ao estresse

provocado por este fator, como por exemplo, Mentha x piperita var citrata e Alpinia

zerumbet, que apresentaram maior produção de óleo às 13 h e 14 h,

respectivamente (OLIVEIRA et al., 2012a; SANTOS et al., 2012). Esses autores

atribuíram às diferenças encontradas à composição química de cada espécie, além

das condições climáticas em que foram colhidas.

Outras espécies aparentemente mostram-se indiferentes a horários de

colheita, como a erva-cidreira brasileira [Lippia alba (Mill.) N. E. Br.] (EHRLERT et

al., 2013), alecrim-de-tabuleiro (Lippia gracilis) (BITU et al., 2015). Nesse caso o

quantitativo não importa, devendo-se, priorizar o horário de maior produção do

composto majoritário da espécie.

Com relação à análise química do óleo, foram identificadas 12 compostos

químicos, dentre eles fenilpropanóides, em sua maioria, monoterpenos,

monoterpenos oxigenados, sesquiterpenos e sesquiterpenos oxigenados (Tabela 3).

51

Tabela 3 - Composição química e porcentagens dos compostos do óleo essencial de Lippia origanoides obtidos em cinco horários de colheita do dia.

Composto Classe IRa IR

lit.b

Composição (%)c

9h 11h 13h 15h 17h

-pineno monoterpeno 989 980 0.90 1.00 0.49 - 0.55

para-cimeno fenilpropanóide 1032 1026 8.30 8.67 5.63 3.48 6.31

- terpineno monoterpeno 1065 1062 2.50 2.86 1.43 1.09 1.74

4-tujanol monoterpeno

oxigenado 1102 1097 0.19 0.11 0.12 - -

Acetato de artemisil

monoterpeno oxigenado

1177 1173 0.41 0.47 0.45 0.26 -

terpin-4-ol monoterpeno

oxigenado 1189 1174 0.74 0.78 0.83 0.70 0.62

para-cimen-7-ol fenilpropanóide 1279 1287 7.67 7.81 7.99 8.03 7.57 timol fenilpropanóide 1288 1290 70.05 68.19 73.68 75.11 72.28

cariofileno sesquiterpeno 1428 1418 3.29 3.16 2.91 4.31 3.75

-humuleno sesquiterpeno 1464 1454 - - 0.58 - -

terc-butil-4-metoxifenol

fenilpropanóide 1484 1488 2.72 2.46 3.12 4.15 3.75

óxido de cariofileno sesquiterpeno

oxigenado 1593 1581 1.78 1.45 2.16 1.91 2.63

Total identificado (%)

98.57 96.97 99.40 99.06 99.20

aIR: índices de retenção relativo experimental: n-alcanos C8-C26 foram usados como pontos

de referência no cálculo de índice de retenção relativo. bIR lit: índices de retenção relativo da literatura (ADAMS, 2007).

c. Valores obtidos através de normatização das áreas. Realizada em triplicata.

-:não detectado.

O percentual relativo de timol variou ao longo do dia, sendo maior às 9:00 h e

11:00 h (Figura 5). Verificou-se que os horário de 9:00 h e 11:00 h, seguido do

horário de 17:00 h foram os mais adequados, dentre os estudados, para obtenção

dos maiores valores de teor de óleo. Entretanto, quando se trata de maior extração

do componente timol, o horário das 17:00 h foi significativamente inferior às 9:00h

(Figuras 4 e 5). Esse resultado indica que a quantidade total de óleo da espécie L.

origanoides não pode ser diretamente relacionada com a quantidade do seu

componente majoritário. E que 9:00 h é o horário recomendado para colheita de

folhas com maior teor do timol.

52

Figura 5 - Porcentagem relativa de timol de folhas de Lippia origanoides colhidas em cinco horários de colheita. Ilhéus - BA, 2016. Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. DMS = 0,07. CV= 2,1%.

Existem relatos de alterações nos compostos químicos do óleo essencial ao

longo do dia, como Lantana camara Linn (SOUSA et al., 2010), erva-cidreira (Lippia

alba) (EHLERT et al., 2013), pariparoba [Pothomorphe umbellata (L.) Miq.]

(MATTANA et al., 2015), erva-baleeira (Varronia curassavica Jaqc.) (QUEIROZ et

al., 2016). A composição do óleo essencial é variável, havendo inclusive

interconversões dos seus constituintes como reações de oxidação, redução,

desidratação, hidratação, isomerização e ciclização (BRITO, 2007). Os resultados

desse estudo mostram a importância de conhecer o horário de colheita para cada

espécie, especialmente quando se tratar de cultivos em escala agroindustrial para

que se obtenha o melhor aproveitamento do produto final e dos princípios ativos de

interesse.

4.3.3 Experimento 3: Época de colheita

Foram observadas diferenças significativas e ajustados modelos lineares e

quadráticos entre as épocas de colheita para todas as variáveis analisadas (Figura

6).

53

Figura 6 - Altura e diâmetro (a), massa seca foliar (msf) e massa seca do caule (msc) (b), área foliar (c), teor e produção (d) de óleo essencial extraído de folhas secas de Lippia origanoides em função da época de colheita. Ilhéus – BA.

Quanto as variáveis de crescimento, os valores máximos foram estimados

aos 330 DAP, a partir das equações para MSC (876 g), MSF (272 g), AF (34161

cm²), h (2,57 m), d (28 mm). Verificou-se durante o experimento, acúmulo de massa

seca foliar e do caule, sendo esse aumento na ordem de aproximadamente 4,5 e 6

vezes entre a primeira e a última colheita, respectivamente, mesmo próximo ao

florescimento, ocorrido na época da última colheita (aos 330 dias) (Figura 6b). A

MSF apresentou ponto mínimo aos 204 DAP, período que coincide com a menor

precipitação durante o experimento (Figura 6b e Tabela 1).

Para o teor de óleo essencial, observou-se aumento após os 150 dias de

plantio (DAP), sendo o pico máximo encontrado aos 240 DAP (1,70 %) (Figura 6 d).

Posteriormente, observa-se redução de aproximadamente 0,33 % deste teor, aos

330 DAP, o que evidencia a preferência da planta pela produção de metabólitos

54

primários em detrimento aos produtos do metabolismo secundário na última colheita.

Esse indício também fica evidente na Figura 6 b, ao observar o aumento da

produção de massa seca da parte aérea. Há uma correlação inversa entre alta

atividade metabólica e produção de aleloquímicos, isto é, um decréscimo na

produção de metabólitos secundários (notadamente derivados fenólicos) em

períodos de crescimento tecidual rápido (GOBBO-NETO; LOPES 2007).

Verificou-se que o período de florescimento da planta aos 330 DAP

influenciou na redução do teor de óleo essencial, uma vez que com o florescimento

ocorre a translocação de fotoassimilados das regiões de síntese (folhas) para os

locais onde serão consumidos, no caso as inflorescências (LARCHER, 2000). Essa

redução no teor de óleo essencial também foi observada em outras espécies

aromáticas, em relação à idade da planta, como foi descrito para Cymbopogon

citratus (LEAL et al., 2003) e Mentha x piperita var. citrata (OLIVEIRA et al., 2012b).

O envelhecimento da planta causa a redução proporcional dos processos

biossintéticos e a síntese de metabólitos secundários pode ser suavizada (MATOS;

INNECCO, 2002).

A idade da planta, aliada às condições ambientais de redução da

precipitação, pode proporcionar aumento no teor de óleo essencial, como observado

neste estudo (Tabela 1 e Figura 6 d), uma vez que a síntese e o acúmulo dos óleos

essenciais nos vegetais podem ser influenciado pelo estresse provocado pela

redução da disponibilidade de água (OLIVEIRA et al, 2012b). O aumento na

biossíntese do óleo essencial e dos constituintes majoritários pode ser uma resposta

fisiológica da planta ao estresse hídrico, como já comprovado em estudos anteriores

em Ocimum basilicum e Ocimum americanum submetidas a estresse hídrico

(KHALID, 2006; MORAIS et al., 2009).

A produção de óleo essencial (g planta-1) apresentou comportamento

semelhante à massa seca foliar, o que devido a maior produção de massa seca

foliar aos 330 DAP, compensaria o menor teor de óleo essencial encontrado nesse

mesmo período (Figura 6 d).

Foram identificadas 11 substâncias químicas no óleo essencial de L.

origanoides nas épocas de colheita estudadas, classificadas em fenilpropanóides

(5,26 - 71,25 %), em sua maioria, seguidos de monoterpenos (0,35 – 1,38 %),

sesquiterpenos (3,53 – 6,68 %), sesquiterpenos oxigenados (1,35 – 1,89 %) e

55

monoterpenos oxigenados (0,15 – 0,82 %) (Tabela 4). Aos 150 dias não foi

observada a produção de dois componentes: -terpineno e hidrato de cis-sabineno.

Os compostos - terpineno, terpin-4-ol e cariofileno praticamente dobraram de valor

quando comparados àqueles encontrados na primeira e última colheita.

Tabela 4 - Composição química e porcentagens dos compostos do óleo essencial de folhas de Lippia origanoides obtidos em diferentes épocas de colheita. Ilhéus - BA.

Composto Classe aIR

bIR lit.

Composição (%)c

150 dias

210 dias

270 dias

330 dias

-pineno Monoterpeno 989 980 0.36 0.68 0.96 1.38

-terpineno Monoterpeno 1023 1018 - 0.35 0.61 0.79

ρ-cimeno Fenilpropanóide 1033 1026 5.26 6.00 9.78 12.27

- terpineno Monoterpeno 1065 1062 2.55 2.60 2.97 4.12

Hidrato de cis-sabineno

monoterpeno oxigenado

1078 1068 - 0.27 0.36 0.15

terpin-4-ol monoterpeno

oxigenado 1190 1174 0.39 0.60 0.82 0.80

para-cimen-7-ol Fenilpropanóide 1279 1287 8.26 7.92 7.36 8.01 Timol Fenilpropanóide 1291 1290 71.65 70.28 68.08 64.28

cariofileno Sesquiterpeno 1425 1418 6.68 5.74 3.59 3.53 terc-butil-4-metoxifenol

Fenilpropanóide 1476 1488 2.63 3.23 2.85 1.88

oxido de cariofileno sesquiterpeno

oxigenado 1595 1581 1.35 1.48 1.89 1.79

Total identificado (%)

99.13 99.15 99.27 99.00

aIR: índices de retenção relativo experimental: n-alcanos C8-C26 foram usados como pontos



-: não detectado.

Observou-se que o componente químico timol, de importância econômica

para a espécie, apresentou diferenças significativas entre as épocas de colheita

(p<0,01), sendo o pico máximo aos 240 DAP (1,28 %). Também houve redução de

15,9 % entre a primeira (150 DAP) e a última colheita (330 DAP) (Figura 7). Os

componentes químicos, assim como o teor de óleo essencial, variam de acordo com

fatores ambientais, como condições climáticas e idade da planta, como verificado

para Mentha x piperita var. citrata (OLIVEIRA et al., 2012b).

56

Figura 7 - Teor de óleo essencial (%) e percentagem relativa de timol extraído de folhas secas de Lippia origanoides colhidas em quatro épocas de colheita. Ilhéus - BA, 2016. CVteor = 9,7%. CVtimol= 2,4%.

4.4 Conclusões

O tempo de hidrodestilação encontrado para máxima extração do óleo

essencial de Lippia origanoides Kunth é de 150 minutos.

O maior teor do óleo foi observado em folhas coletadas às 9:00 h e 11:00 h,

coincidindo com a maior porcentagem relativa do constituinte majoritário timol.

A época de colheita em que o maior teor de óleo e composto majoritário timol

foi observado é aos 240 dias após o plantio. No entanto, a maior produção deste

óleo foi obtida aos 330 dias após o plantio.

Agradecimentos

À Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC) e a

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo

suporte financeiro.

4.5 Referências

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60

5 TEMPERATURA DE SECAGEM ALTERA INTEGRIDADE DE TRICOMAS, TEOR E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO DE Lippia origanoides Kunth.

RESUMO: As plantas medicinais quando comercializadas devem apresentar baixo teor de umidade, evitando a deterioração. Para tanto, é necessário estabelecer a forma correta de secagem deste material para garantir a qualidade final do produto. A Lippia origanoides possui no óleo essencial, o timol, componente majoritário de importância econômica na indústria química e farmacêutica e que se encontra armazenado em tricomas glandulares. O objetivo do trabalho foi estudar o efeito da temperatura de secagem de folhas de L. origanoides na integridade dos tricomas, teor e composição química do óleo essencial. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro tratamentos definidos por temperaturas de secagem em estufa (40 ºC, 50 ºC, 60 ºC e 70 ºC) e quatro repetições. Foram realizadas extrações e determinação dos teores dos óleos essenciais por hidrodestilação, análise de composição química do óleo por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas e microscopia eletrônica de varredura para determinação da integridade dos tricomas. Os dados do teor e compostos químicos foram submetidos à análise de variância e à análise de regressão à 5% de probabilidade. Foram obtidas correlações entre os valores médios de tricomas glandulares e temperaturas de secagem. Folhas de L. origanoides secas em temperatura de 60 e 70 ºC exibiram maior porcentagem de tricomas rompidos e redução do teor de óleo essencial. A secagem das folhas em estufa de ventilação forçada a 40 ºC minimizou a perda do teor de óleo essencial extraído e porcentagem relativa de timol.

Palavras-chave: planta medicinal, estruturas secretoras, beneficiamento, timol.

ABSTRACT: Medicinal plants when marketed must have a low moisture content, avoiding deterioration. For this, it is necessary to establish the correct method of drying this material to ensure the final quality of the product. The Lippia origanoides contains in the essential oil, thymol, a major component of economic importance in the chemical and pharmaceutical industry and is stored in glandular trichomes. The objective of this work was to study the effect of drying temperatures of L. origanoides leaves on the integrity of the trichomes, the chemical content and composition of the essential oil. The experimental design was completely randomized, with four treatments defined by oven drying temperatures (40ºC, 50ºC, 60ºC and 70ºC) and four replications. Extraction and determination of the essential oils contents by hydrodistillation, analysis of the chemical composition of the oil by gas chromatography coupled to mass spectrometry and scanning electron microscopy were performed to determine the integrity of the trichomes. The data of the chemical content and compounds were submitted to analysis of variance and regression analyses to 5%.Correlations were obtained between mean values of glandular trichomes and drying temperatures. Leaves of L. origanoides dried at temperatures of 60 and 70 ºC exhibited a higher percentage of trichomes ruptured and reduction of essential oil content. Drying the leaves in a forced ventilation oven at 40 ° C minimized the loss of extracted essential oil content and relative percentage of thymol. Keywords: medicinal plant, secretory structures, processing, thymol.

61

5.1 Introdução

O processo de secagem em plantas medicinais interfere na quantidade e

qualidade do material vegetal usado para extração de óleo essencial, reduzindo o

teor de água na planta e consequentemente, a ação enzimática de microrganismos,

causando inibição das reações de hidrólises, oxidação e fermentação, além de

facilitar o armazenamento e a redução dos custos de transporte (CORRÊA JÚNIOR;

SCHEFFER, 2013; ROCHA et al., 2012; COSTA et al., 2005). Com isso, a umidade

do material vegetal dentro de padrões farmacopéicos de qualidade deve variar de 8

a 12 % (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010).

As temperaturas de secagem para plantas medicinais são variáveis e

dependem fundamentalmente da espécie, tecido vegetal e condições do ambiente.

Nesse contexto, estudos têm demonstrado que a temperatura adequada é aquela

que mantém o maior teor de óleos essenciais sem alteração significativa da

composição química. Em espécies do gênero Lippia têm-se verificado a influência de

processos de secagem, na qualidade e quantidade do óleo essencial (BARBOSA et

al., 2006), assim como outras espécies medicinais como manjericão (Ocimum

basilicum L.), tomilho (Thymus vulgaris L.), guaco (Mikania glomerata Sprengel),

Achillea frayrantissma L. e Artemisia herb-alba Asso (SOARES et al., 2007; ROCHA

et al., 2012; RADÜNZ et al., 2010; ABAAS et al., 2013).

A Lippia origanoides é uma espécie medicinal da flora brasileira (SALIMENA;

MÚRGURA, 2015), sendo conhecida popularmente como alecrim-pimenta e

orégano-do-monte (OLIVEIRA et al.,2007). Apresenta óleo essencial rico em timol e

carvacrol, substâncias de importância para indústria química e farmacêutica devido

às suas propriedades antimicrobianas, sendo usadas para produção de cremes

dentais, antissépticos bucais, além de pomadas descongestionantes e pastilhas

como Euthymol®, Listerine®, Vick Vaporub® e Valda®. Na medicina popular, a L.

origanoides é usada no tratamento de dores de estômago, indigestão, diarreia,

tratamentos respiratórios e como antisséptico geral para boca, garganta e feridas

(PASCUAL et al., 2001). Além disso, apresenta ação fungicida, bactericida e

repelente (NERIO et al., 2009; OSPINA et al., 2011; ALMEIDA et al., 2016). O óleo

essencial de L. origanoides encontra-se armazenado em tricomas glandulares,

estruturas externas e sensíveis, presentes de maneira significativa na superfície de

62

folhas e flores (TOZIN et al., 2015), o que pode causar alterações do teor e

composição química do material, como verificado para Melissa officinalis e Ocimum

gratissimum (ARGYROPOULOS; MÜLLER, 2014; SANTANA et al., 2014).

Embora a espécie L. origanoides tenha sido estudada quanto à sua

composição química (VICUÑA et al., 2010; SOARES et al., 2013; ALMEIDA et al.,

2016), pouco é conhecido sobre o efeito da temperatura de secagem na qualidade

da matéria-prima a ser comercializada. Portanto, o objetivo do trabalho foi avaliar o

efeito da temperatura de secagem de folhas de L. origanoides na integridade de

tricomas glandulares, o teor e composição química do óleo essencial.


O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com

quatro tratamentos, definidos por temperaturas de secagem em estufa de circulação

forçada de ar (40 ºC, 50 ºC, 60 ºC e 70 ºC) e quatro repetições.

5.2.1 Material vegetal

O experimento foi conduzido na Universidade Estadual de Santa Cruz

(UESC) em Ilhéus – BA, em outubro de 2016. As amostras foram obtidas de plantas

matrizes com 2 anos de idade, cultivadas no Horto de Plantas Medicinais da UESC.

Exsicatas do material botânico estão depositadas no Herbário UESC, sob registro nº

21282.

As folhas inteiras foram coletadas da porção mediana das plantas matrizes,

entre 9h e 9h 30 min, cuidadosamente destacadas, sendo em seguida colocadas em

bandejas e encaminhadas ao laboratório. Foi realizada a seleção de folhas,

descartando aquelas doentes e atacadas por insetos.

5.2.2 Secagem do material

63

Para o processo de secagem, 1,6 kg de folhas foram homogeneizados e

separados por unidade experimental (100 g de folha fresca), perfazendo um total de

400 g de folhas por tratamento. As folhas inteiras foram dispostas em bandejas da

estufa de circulação forçada de ar, em camada de 1,5 cm de espessura. A secagem

das amostras foi concluída quando o material atingiu a massa final equivalente à

umidade desejada (10% b.u.), calculada conforme metodologia de BARBOSA et al.,

(2006). Após a secagem, as amostras foram acondicionadas em sacos de papel

kraft e armazenadas em sacos de polietileno para posterior extração do óleo

essencial.

5.2.3 Determinação da umidade

Para determinação da umidade inicial, amostras de 25 g de folhas foram

colocadas para secar, imediatamente após a coleta, em estufa a 105 ºC por 24

horas, metodologia recomendada pela ASAE STANDARDS, (2000) para forrageiras

e similares.

5.2.4 Extração e análise do óleo essencial

As extrações do óleo essencial foram realizadas por hidrodestilação em

aparelho Clevenger no tempo de extração determinado pela curva de tempo de

extração (150 minutos). O óleo foi separado do hidrolato com diclorometano (3 x 10

mL) e seco com sulfato de sódio anidro e concentrado. Os teores de óleo foram

expressos por g kg-1 de matéria seca. A massa do óleo obtido foi determinada por

pesagem em balança analítica.

A composição química quantitativa foi avaliada por meio da cromatografia

gasosa acoplada ao detector de ionização de chama (GC-FID) usando o

cromatógrafo a gás Varian Saturm 3800 equipado com coluna capilar de sílica

fundida VF5-ms (30 m X 0,25 mm) com fase estacionária 5% fenil-95%

dimetilpolisiloxano (0,25 μm de espessura de filme), tendo hélio 6.0 como gás

arraste e fluxo de 1,2 mL.min-1 (10 psi). As temperaturas do injetor e detector foram

de 250°C e 280°C, respectivamente. Foi injetado 1,0 μL de solução em CHCl3 a 10

% no modo split (1:10). A temperatura da coluna teve início a 60 ºC, sendo acrescida

64

de 8 ºC/min. até 240 ºC sendo mantida nessa temperatura por 5 minutos perfazendo

o tempo de 27,5 minutos. A quantificação dos componentes foi obtida por integração

eletrônica dos picos detectados no FID por normatização. As injeções foram

realizadas em triplicatas.

A análise qualitativa foi realizada em espectrômetro de massas Varian



150 °C. O modo de operação foi o impacto elétrico de 70eV a uma velocidade de

varredura de 1/segundo (s) dentro de uma faixa de 40 a 450 Da a uma taxa de





como através da comparação dos seus índices de retenção com os compostos



5.2.5 Análise micromorfológicas

Análises micromorfológicas da superfície foliar foram realizadas no Centro

de Microscopia Eletrônica (CME) da UESC. Amostras da porção mediana de folhas

secas totalmente expandidas foram fixadas em suporte de metal recoberta com fita

de carbono e metalizada com ouro (BAL-TEC SCD 050) para observação e registro

no microscópio eletrônico de varredura (QUANTA 250, FEI COMPANY). Foram

selecionadas cinco repetições (imagens) da face abaxial das folhas com ampliação

de 300 x para determinar a porcentagem de tricomas glandulares rompidos,

murchos e intactos (metodologia adaptada de SANTANA et al., 2014).

5.2.6 Analise estatística

Os dados do teor e porcentagem relativa de compostos químicos foram

submetidos à análise de variância, sendo os valores quantitativos de temperatura de

secagem submetidos à análise de regressão, com coeficientes linear e quadrático,

65

usando o programa estatístico Sisvar (Ferreira, 2000). Foram aceitos os modelos

que apresentaram todos os coeficientes significativos a até 5 %, pelo teste F, e o

maior coeficiente de determinação ajustado. Foram obtidas correlações entre os

valores médios de tricomas glandulares e temperaturas de secagem.


Os tempos máximos para a secagem de folhas de L. origanoides atingirem

massa constante foram de 380 minutos para temperatura de 40°C, seguidos de 195,

140 e 100 minutos para as temperaturas de 50 °C, 60 °C e 70 °C, respectivamente.

Houve redução de, em média, 70 %, da massa fresca para a massa seca.

Observou-se que a elevação da temperatura de secagem reduziu

linearmente o teor de óleo essencial (p<0,01), sendo que as temperaturas de 50 ºC,

60 ºC e 70 ºC reduziram o teor de óleo em 12,1%, 23,0 % e 34,5 % em relação à

secagem a 40 ºC (Figura 1).

Figura 1 - Teor de óleo essencial e taxa de integridade de tricomas de folhas de Lippia origanoides Kunth. em função de temperaturas de secagem. Ilhéus - BA, 2016. CV= 11,3%.

Essa redução pode ser atribuída a alterações dos tricomas glandulares

peltados localizados na epiderme abaxial das folhas (Figura 2), sendo o percentual

de tricomas rompidos proporcional ao aumento da temperatura. Este rompimento

ocorreu de forma geral na base ou ápice da cabeça dos tricomas (Figura 2A).

66

Figura 2 - Microscopia eletrônica de varredura de tricomas glandulares de folhas de Lippia origanoides submetidas a temperaturas de secagem (40 ºC, 50 ºC, 60 ºC e 70 ºC): rompidos (A); murchos (B); intactos (C). Barra = 50 µm.

Foi verificada correlação positiva e significativa (p<0,01) entre as

temperaturas de secagem e a quantidade de tricomas rompidos e murchos (Figura

3a e 3b) e correlação negativa com tricomas intactos (Figura 3c). A secagem das

folhas em temperaturas acima de 40 ºC causou maior rompimento dos tricomas e

elevou a volatilização do óleo.

Figura 3 - Correlações lineares entre temperatura de secagem e integridade de tricomas glandulares: rompidos (a); murchos (b) e intactos (c), em folhas de Lippia origanoides Kunth.

A sensibilidade dos compostos químicos do óleo somado às mudanças

estruturais nos tricomas glandulares, provocados pela temperatura de secagem,

podem ter induzido a perda de óleo (ARGYROPOULOS; MÜLLER, 2014; SANTANA

et al., 2014). Espécies como Melissa officinalis L. e Ocimum gratissimum também

apresentaram redução significativa de teor de óleo influenciada pela ruptura dos

tricomas secretores e volatilização dos componentes químicos quando submetidos a

temperaturas de secagem (ARGYROPOULOS; MÜLLER, 2014; SANTANA et al.,

2014). SANTANA et al., (2014) verificaram a fragilidade dos tricomas em plantas

medicinais e recomendaram atenção aos processos de colheita, beneficiamento e

de secagem, principalmente quando essas estruturas estão presentes na superfície

67

foliar. Para manjericão (Ocimum basilicum L.) foi sugerida a secagem das folhas a

40 ºC (SOARES et al., 2007), enquanto que para Achillea frayrantissma e Artemisia

herb-alba, a secagem deve ser realizada na temperatura de 35 ºC (ABAAS et al.,

2013).

Para outras espécies do gênero Lippia a temperatura de secagem das folhas

não interfere no teor de óleo. A exemplo de Lippia alba que mesmo em processo de

secagem com temperaturas entre 30 ºC e 70 ºC não apresentou diferença

significativa no teor de óleo essencial extraído, porém, quando comparados à planta

fresca, houve redução significativa entre 12 % e 17 % (BARBOSA et al., 2006).

Esses autores relataram que não houve efeito da secagem porque o óleo em L. alba

está armazenado não apenas em estruturas da epiderme foliar (tricomas

secretores), mas também internamente contido em células do parênquimas

paliçádico e lacunoso (BARBOSA et al., 2006).

Em espécies como capim-limão (Cymbopogon citrates (DC) Stapf.) e guaco

(Mikania glomerata Sprengel), a temperatura de 50 ºC proporcionou o aumento

significativo do teor do óleo extraído quando comparado à temperatura de 40 ºC, e

estes resultados foram atribuídos à localização das estruturas armazenadoras do

óleo (bolsas ou canais secretores) presentes nos tecidos do parênquima foliar e,

portanto, são menos susceptíveis aos efeitos da temperatura, quando comparados à

estruturas externas como tricomas glandulares (BUGGLE et al., 1999; RADÜNZ et

al., 2010).

Os resultados dessa pesquisa indicam que a espécie L. origanoides

apresenta respostas diferentes no teor de óleo extraído em função da temperatura

de secagem de folhas. Essa diferença na sensibilidade à temperatura de secagem

do material vegetal entre as espécies pode ser atribuída a estruturas secretoras e

sua localização nas plantas, bem como à composição química do óleo essencial

(ARGYROPOULOS; MÜLLER, 2014).

No óleo essencial de L. origanoides foram identificados dez componentes

químicos (Tabela 1). Esses compostos foram agrupados em fenilpropanóides,

compostos majoritários (2,64 – 71,52 %), sesquiterpenos (5,40 – 6,38 %),

monoterpenos (0,17 – 4,04 %), monoterpenos oxigenados (0,34 – 0,82 %) e

sesquiterpenos oxigenados (0,97 – 1,29 %).

68

Tabela 1 - Composição química do óleo essencial de folhas de Lippia origanoides

submetidas a quatro temperaturas de secagem. Ilhéus – BA, 2016.

Composto Classe IRa

IR lit.b

Composição (%)c

40°C 50°C 60°C 70°C

-pineno monoterpeno 989 980 0,17 0,97 0,77 0,18

para-cimeno fenilpropanóide 1032 1026 4,67 8,33 7,32 5,20

- terpineno monoterpeno 1065 1062 2,03 4,04 3,54 2,74

Acetato de artemisila monoterpeno oxigenado

1177 1173 0,62 - 0,52 0,34

terpin-4-ol monoterpeno oxigenado

1189 1174 0,82 0,64 0,82 0,70

para-cimen-7-ol fenilpropanóide 1279 1287 9,19 8,49 8,72 9,53 timol fenilpropanóide 1288 1290 71,52 65,81 67,24 69,20 cariofileno sesquiterpeno 1428 1418 5,40 5,68 5,43 6,38 terc-butil-4-metoxifenol fenilpropanóide 1484 1488 2,96 2,91 2,54 2,66 Óxido de cariofileno sesquiterpeno

oxigenado 1593 1581 1,14 1,29 1,17 0,97

Total identificado (%) 98,52 98,16 98,07 97,90 aIR: índices de retenção relativo experimental: n-alcanos C8-C26 foram usados como pontos



Na Figura 4 é apresentado o modelo estatístico obtido entre as

porcentagens relativas de timol e temperaturas de secagem (p<0,01). O timol foi

extraído em maiores quantidades nas folhas quando se usou a temperatura de 40 °C

(1,26 %), enquanto que a 70 ºC houve redução de aproximadamente 66 % do teor

relativo (Figura 4). Observa-se que o modelo foi bem ajustado indicando perdas

significativas do componente timol, o que em termos práticos em processamento

industrial significariam grandes perdas econômicas.

Figura 4 - Porcentagem relativa de timol de folhas secas de L. origanoides submetidas a temperaturas de secagem. Ilhéus - BA, 2016. **significativo a 1 % de probabilidade. CV= 1,3%.

69

Em geral, a secagem convectiva (usando ar quente) leva à perda por

volatilidade significativa, com perdas proporcionais ao aumento da temperatura do ar

(DÍAZ-MAROTO et al., 2004; FIGIEL et al., 2010). No que se refere à qualidade do

óleo, Sunthonvit et al. (2005) destacaram que não só a temperatura de secagem

interfere no teor de óleo extraído, mas também recomendaram observar a síntese ou

degradação de compostos voláteis relacionados a essa temperatura e em qual

temperatura o componente majoritário de interesse econômico se apresenta em

maior concentração.

Pesquisas têm demonstrado que plantas medicinais apresentam

modificações em componentes químicos por efeito da temperatura de secagem, a

exemplo da alfavaca-cravo (Ocimum gratissimum L.) (SANTANA et al., 2014),

orégano (Origanum vulgare) (FIGIEL et al., 2010), guaco (Mikania glomerata

Sprengel) (RADÜNZ et al., 2012), arruda (Ruta chalepensis L.) (MEJRI et al., 2010).

Isso, entretanto não ocorre para todos os componentes como observado por Rocha

et al., (2012), trabalhando com secagem em tomilho (Thymus vulgaris L.) em que

não observaram diferença significativa para os compostos timol, para-cimeno e

trans-cariofileno.

5.4 Conclusão

A temperatura de secagem influencia na ruptura de tricomas glandulares de

folhas de Lippia origanoides, alterando o teor e composição química do óleo

essencial. Temperaturas acima de 60 ºC levam a perdas significativas do

constituinte majoritário (timol). Recomenda-se a secagem das folhas a 40 ºC para

extrair maior teor de óleo essencial e composto majoritário.

AGRADECIMENTOS

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes),

pela concessão da bolsa e financiamento da pesquisa e ao Centro de Microscopia

Eletrônica (CME/UESC) e funcionários pela colaboração na pesquisa.

70

5.5 Referências

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74

6 ATIVIDADE BIOLÓGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides Kunth (IN VITRO E IN VIVO) NO CONTROLE DA PODRIDÃO-PARDA

RESUMO: A Podridão Parda dos frutos de cacaueiros é uma das principais doenças

desta cultura, com ocorrência em vários países produtores, sendo causada por

espécies do gênero Phytophthora De Bary. Como alternativa ao uso de fungicidas

sintéticos, os produtos de origem natural têm vantagens por serem menos

prejudiciais ao ambiente e à saúde do homem. A Lippia origanoides é uma espécie

medicinal com grande potencial antifúngico, devido às substâncias encontradas no

óleo essencial da espécie. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro e in vivo a

ação biológica do óleo essencial de folhas de L. origanoides, contra Phytophthora

palmivora e Phytophthora citrophthora. Os tratamentos consistiram das doses do

óleo essencial (0 µL mL-1 (testemunha), 0,30 µL mL-1, 0,60 µL mL-1, 0,90 µL mL-1,

1,20 µL mL-1 e 1,50 µL mL-1) para experimentos in vitro e in vivo. Foram avaliadas a

porcentagem de inibição dos patógenos e a concentração inibitória mínima, além da

ação do óleo sobre os discos de folhas inoculados. As variáveis foram submetidas à

análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste Tukey a 5 % de

probabilidade. O crescimento micelial dos patógenos foi inibido em 100 % a partir da

concentração mínima de 0,60 µL mL-1 do óleo de Lippia origanoides. Em discos

foliares, observou-se que houve inibição de 50 % dos sintomas a partir das

concentrações de 0,60 µL mL-1 para P. palmivora e 0,9 µL mL-1 para P. citrophthora,

demonstrando a atividade antifúngica promissora deste óleo no combate aos

fitopatógenos causadores da podridão-parda no cacaueiro.

Palavras-chave: Phytophthora spp., controle, antifúngico natural, timol.

ABSTRACT: The black pod disease of cacao fruit is one of the main diseases of this

crop, occurring in several producing countries, being caused by species of the genus

Phytophthora. As an alternative to the use of synthetic fungicides, the natural

products becomes less harmful to the environment and human health. Lippia

origanoides is a medicinal species with high antifungal potential due to the

substances found in the essential oil of the species. The objective of this work was to

evaluate in vitro and in vivo the biology action of the essential oil of leaves of L.

origanoides, against the fungi Phytophthora palmivora and Phytophthora

citrophthora. The treatments consisted of the doses of essential oil (0 µL mL-1

(control), 0.30 µL mL-1, 0.60 µL mL-1, 0.90 µL mL-1, 1.20 µL mL-1, 1.50 µL mL-1) for in

vitro and in vivo experiments. The percentage of inhibition of fungi and the minimum

inhibitory concentration were evaluated, as well as its active on leaves discs

inoculation. The results were submitted to analysis of variance (ANOVA) and means

were compared by Tukey test at 5% probability. Mycelial growth of the pathogens

were inhibited by 100% from the minimum concentration of 0.60 μL mL-1 of L.

origanoides oil. In leaf disks, 50% inhibition was observed from the concentrations of

0.60 μL mL-1 for P. palmivora and 0.9 μL mL-1 for P. citrophthora, demonstrating the

75

promising antifungal activity of this oil in the control of phytopathogens that causing

black pod disease.

Keywords: Phytophthora spp., control, natural antifungal, thymol.

6.1 Introdução

O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma importante espécie cujas

sementes são usadas para a fabricação do chocolate. Esta espécie é cultivada

principalmente em países da África, América e Ásia (DIAS, 2001). Oomicetos do

gênero Phythophora sp. são responsáveis pela Podridão Parda dos frutos, requeima

das folhas e cancro no tronco de cacaueiros em produção (LUZ et al., 2003), sendo

as espécies P. palmivora (E. J. Butl.) E. J. Butler, P. citrophthora (R. E. S. m & E. H.

S. m.) Leonian e P. capsici Leonian ocorrentes no Brasil (SANTOS et al., 2009). A

Podridão Parda dos frutos do cacaueiro é uma das principais doenças dessa cultura,

com ocorrência em todos os países produtores (FALEIRO et al., 2004).

No Brasil, a podridão parda é responsável por perdas em torno de 20 a 30 %

da produção, sendo que em algumas regiões da Bahia que apresentam condições

propícias ao desenvolvimento dos fungos, estes danos podem comprometer 70 a 80

% da produção (LUZ et al., 1997; FALEIRO et al., 2004). Assim, no intuito de evitar

essas perdas, alguns métodos de controle são comumente utilizados, entre eles o

uso de fungicidas sintéticos. No entanto, o uso indiscriminado desses produtos pode

causar problemas ambientais, à saúde de consumidores, além de promover

resistência nos microrganismos patogênicos (MURILLO et al., 2012). Deste modo, o

uso de produtos de origem natural constitui-se num paradigma na agricultura, pois

são fontes promissoras de princípios ativos contra fitopatógenos. Além disso, tais

produtos causam menor impacto ao ambiente e à saúde de humanos e animais.

A atividade antifúngica e antibacteriana dos óleos essenciais em fungos e

bactérias patogênicas e fitopatogênicas é amplamente discutido e documentado

(GUIMARÃES et al., 2014), sendo inúmeras as espécies de plantas que apresentam

óleos essenciais com alguma atividade biológica. Dentre as espécies, com potencial,

encontra-se a Lippia origanoides Kunth. (Verbenaceae), que é uma espécie

76

medicinal da flora brasileira (SALIMENA; MÚRGURA, 2015), conhecida

popularmente como alecrim-pimenta e orégano-do-monte (OLIVEIRA et al.,2007).

Apresenta óleo essencial rico em timol e carvacrol, substâncias utilizadas para

indústria química e farmacêutica devido às suas propriedades antimicrobianas, para

produção de cremes dentais, antissépticos bucais, além de pomadas

descongestionantes e pastilhas. Na medicina popular, a L. origanoides é usada no

tratamento de dores de estômago, indigestão, diarreia, tratamentos respiratórios e

como antisséptico geral para boca, garganta e feridas (PASCUAL et al., 2001). Além

disso, apresenta ação repelente, fungicida e bactericida comprovada (NERIO et al.,

2009; OSPINA et al., 2011; ALMEIDA et al., 2016).

Estudos comprovaram que o óleo essencial de L. origanoides apresenta

atividade biológica sobre Phytophthora infestans (Mont.) De Bary (BEDOYA et al.,

2015), Moniliophthora roreri (Cif.) Evans (LOZADA et al., 2012), Sclerotium

cepivorum Berk. (OSPINA et al., 2011), porém a atividade desta espécie sobre

outros fitopatógenos do gênero Phytophthora ainda não é conhecida, principalmente

em testes in vivo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a ação fungitóxica

do óleo essencial de folhas de Lippia origanoides, contra os fungos Phytophthora

palmivora e Phytophthora citrophthora, agentes da podridão parda, in vitro e in vivo.


Os experimentos foram realizados no Laboratório de Phytophthora, Seção

de Fitopatologia do Centro de Pesquisa do Cacau (Ceplac/Cepec), Bahia, Brasil.

6.2.1 Obtenção dos isolados

Foram utilizados os isolados de P. palmivora (2261) e P. citrophthora, (1983)

cedidos pela Coleção de Phytophthora Arnaldo Gomes Medeiros, sediada no Cepec.

Os isolados foram repicados para placas de Petri (9 cm Ø), contendo meio seletivo

PARPH (KANNWISCHER; MITCHELL, 1978) e mantidos por cinco dias a 25 ± 2 ºC

ao abrigo da luz. Posteriormente foram repicados discos de 5 mm de diâmetro

77

destas culturas para o meio de cultura cenoura-ágar (CA). As placas foram mantidas

sob luz contínua a 25 ± 2 ºC, durante nove dias, visando à esporulação.

6.2.2 Extração e análise química do óleo essencial

Para obtenção do óleo essencial, amostras de folhas de Lippia origanoides

foram coletadas de plantas matrizes presentes no Horto de Plantas Medicinais da

Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC). Exsicatas do material botânico estão

depositadas no Herbário UESC, sob registro nº 21282.


Clevenger no tempo de extração determinado pela curva de tempo de extração (150

minutos). O óleo foi separado do hidrolato com diclorometano (3 x 10 mL) e seco

com sulfato de sódio anidro e concentrado.



cromatográfo a gás Varian Saturm 3800 equipado com coluna capilar de sílica



arraste e fluxo de 1,2 mL min-1 (10 psi). As temperaturas do injetor e detector foram









na análise CG-FID sendo a temperatura da transferline 250°C, manifold 50 ºC e trap

150 °C. O modo de operação foi o impacto elétrico de 70eV à velocidade de

varredura de 1/segundo (s) dentro da faixa de 40 a 450 Da a uma taxa de

78



massa, tendo sido confirmada por comparação dos espectros de massas com


como através da comparação dos índices de retenção com os compostos

conhecidos, obtidos por injeção de mistura de padrões contendo uma série


6.2.3 Experimento In vitro

Nos testes de inibição do crescimento micelial dos oomicetos, foram usadas

alíquotas dos óleos incorporadas ao meio de cenoura dextrose ágar (CDA) fundente,

de modo a se obter concentrações de 0 µL mL-1 (testemunha), 0,30 µL mL-1, 0,60 µL

mL-1, 0,90 µL mL-1, 1,20 µL mL-1 e 1,50 µL mL-1 e, vertido em placas de Petri (Ø = 9

cm), perfazendo seis tratamentos e cinco repetições, em delineamento inteiramente

casualizado. Após a solidificação do meio, discos (Ø = 5 mm) um disco de micélio,

de cada um dos oomicetos, foi transferido para o centro das placas. Estas foram

incubadas em câmara de crescimento com temperatura controlada para 25±1 °C,

em ausência de luz.

Foi calculada a porcentagem de inibição do crescimento micelial usando a

fórmula: % inibição = [(Dc - Dt) x 100] / Dc, em que Dc e Dt representam os

diâmetros do micélio no controle e no tratamento, respectivamente, como também a

concentração inibitória mínima (CIM), que é o intervalo entre as concentrações do

produto testado, capaz de inibir 100 % o crescimento do fungo.

6.2.4 Experimento In vivo

6.2.4.1 Obtenção da suspensão de zoósporos dos isolados de Phytophthora spp.

Para o preparo dos inóculos, foram utilizadas 10 placas de Petri para cada

isolado (P. palmivora e P. citrophthora), crescidas em meio de cenoura- ágar (CA),

sólido e líquido, respectivamente, sendo após a repicagem, mantidas sob iluminação

constante à temperatura de 25 °C por sete dias e dez dias, respectivamente (LUZ;

79

SILVA, 2001). Apenas as placas de P. citrophthora foram então, “lavadas” com água

corrente, para retirada de todo meio de cenoura-ágar, permanecendo somente as

colônias dos isolados, que foram colocadas em BOD, em temperatura de 25 ºC, por

24 h. Em seguida, após a observação ao microscópio para visualização das colônias

esporuladas, foram adicionados 8 mL de água estéril gelada em cada placa de

ambos isolados, transferindo-as para geladeira por 20 minutos. As placas foram

então retiradas e colocadas sobre a bancada em temperatura ambiente por 25

minutos com o intuito de acelerar a liberação de zoósporos através do choque

térmico proporcionado. Obtida a suspensão, foi retirada uma alíquota de

aproximadamente 1 mL e adicionada uma gota de FAA (Formol; Álcool; Ácido

Acético Glacial) para imobilizar os zoósporos liberados, permitindo, assim, a

contagem dos mesmos. A leitura da concentração da suspensão foi realizada com

auxílio da Câmara de Newbauer, ajustando-se a concentração final da suspensão

para 3,0 x 105 zoósporos/ mL.

6.2.4.2 Inoculação dos isolados em discos foliares

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com seis

tratamentos (0 µL mL-1 (testemunha), 0,30 µL mL-1, 0,60 µL mL-1, 0,90 µL mL-1, 1,20

µL mL-1 e 1,50 µL mL-1), quatro repetições com 10 discos de folha por repetição,

totalizando 40 discos/tratamento, para cada isolado, separadamente. Antes da

inoculação foram realizados pré-testes de fitotoxicidade das concentrações do óleo

em discos foliares do clone utilizado no experimento, observando se haveria

alterações nas folhas, durante sete dias.

Posteriormente, foram coletadas folhas do clone de cacaueiros SIC-23

(considerado susceptível à podridão parda) em estágio intermediário de maturação

(perceptível pela mudança de coloração do pecíolo de verde a marrom) na parte da

manhã, visando a manutenção da turgescência foliar. Em seguida as folhas foram

limpas com o auxílio de algodão embebido em água destilada e secas ao ar livre.

Após a limpeza, foram submetidas a cortes circulares de 1,5 cm de diâmetro, com

um cortador de discos semiautomático.

80

O óleo essencial de Lippia origanoides foi emulsionado com Tween 80, na

proporção de 1:1, e dissolvido em água destilada para obtenção de soluções nas

concentrações correspondentes aos tratamentos. Posteriormente, os discos de

folhas foram mergulhados em cada concentração por 10 segundos e acondicionados

com a face abaxial voltada para cima, em caixas plásticas forradas contendo

espuma esterilizada úmida.

Após 24 h, cada disco foliar recebeu o inóculo de 10 μL de suspensão na

concentração 3,0 x 105 zoósporos/mL obtida de cada um dos isolados. Após a

inoculação, as caixas foram fechadas, visando manter a umidade relativa em torno

100%, e acondicionadas a 25 ºC, por sete dias, ao abrigo da luz.

As avaliações foram realizadas após sete dias da inoculação, em que foram

atribuídas notas para cada nível de patogenicidade, de acordo com escala de notas

do método patométrico de Nyassé et al., (1995). Para cada disco foi dada uma nota

de 0 a 5, e assim feita a média dos 40 discos. Os dados foram submetidos à análise

de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade

para cada patógeno, separadamente.

6.2.5 Análises estatísticas

Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) para teste in

vitro e in vivo, seguido da comparação de médias pelo teste Tukey a 5 % utilizando o

programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011).


A composição química do óleo essencial de Lippia origanoides apresentou

dez componentes químicos, sendo o timol o composto majoritário com 71,52 %,

seguido pelo para-cimeno-7-ol (9,19 %), cariofileno (5,40 %) e para-cimeno (4,67 %)

(Tabela 1).

81

Tabela 1 – Composição química completa e porcentagens dos compostos do óleo essencial de folhas de Lippia origanoides. Ilhéus – BA, 2017.

Composto Classe IRa

IR lit.b

Composição (%)c

pineno monoterpeno 989 980 0,17

para-cimeno fenilpropanóide 1032 1026 4,67

terpineno monoterpeno 1065 1062 2,03

acetato de artemisila monoterpeno oxigenado 1177 1173 0,62

terpin-4-ol monoterpeno oxigenado 1189 1174 0,82

para-cimen-7-ol fenilpropanóide 1279 1287 9,19

timol fenilpropanóide 1288 1290 71,52

cariofileno sesquiterpeno 1428 1418 5,40

terc-butil-4-metoxifenol fenilpropanóide 1484 1488 2,96


oxigenado 1593 1581 1,14

Total identificado (%) 98,5

aIR: índices de retenção relativo experimental: n-alcanos C8-C26 foram usados como pontos de referência

no cálculo de índice de retenção relativo. bIR lit: índices de retenção relativo da literatura (ADAMS, 2007).


O óleo essencial de L. origanoides inibiu o crescimento micelial dos dois

patógenos testados (Tabela 2 e Figura 1), havendo diferença significativa entre as

concentrações testadas (p<0,01). O crescimento micelial de Phytophthora palmivora

e P. citrophthora foram inibidos em 100 % a partir da concentração mínima de 0,6 µL

mL-1 do óleo de L. origanoides (Tabela 2). O efeito inibitório total foi registrado

quando as testemunhas cobriram completamente as placas de Petri (após cinco

dias).

Tabela 2- Porcentagem de inibição dos fungos e concentração inibitória mínima (CIM) após interação com óleo essencial de L. origanoides Kunth, Ilhéus - BA, 2017.

Fungo Concentração (µL mL-1)

0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 CIM DMS

P. palmivora

P. citrophthora

0 a

0 a

92,9 b

97,3 b

100 c

100 c

100 c

100 c

100 c

100 c

100 c

100 c

≥ 0,6

≥ 0,6

1,1

0,5

Médias seguidas da mesma letra na linha não diferem significativamente pelo teste Tukey a

5 % de probabilidade.

82

Figura 1 - Efeito do óleo essencial de L. origanoides sobre Phytophthora palmivora (A) e Phytophthora citrophthora (B). Concentrações: 0 µL mL-1 (1); 0,30 µL mL-1 (2);

0,60 µL mL-1 (3); 0, µL mL-1 (4); 1,20 µL mL-1 (5) e 1,50 µL mL-1 (6). Barra = 5 cm.

A atividade biológica de L. origanoides foi comprovada no controle do

crescimento micelial dos fitopatógenos em concentrações variadas, de acordo com o

fungo e o componente químico majoritário da espécie (quimiotipo). No caso da L.

origanoides, o óleo essencial tem mais de um quimiotipo já relatados na literatura

(ROJAS et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2007; STASHENKO et al., 2010; BETANCUR-

GALVIS et al., (2012). Esses compostos podem variar de acordo com fatores

ambientais (solo, água, luminosidade), fatores ligados a colheita (época, idade e

horário de colheita), pós-colheita (processos de secagem do material e extração do

óleo) (ARANGO et al., 2012; STASCHENKO et al., 2010).

O óleo essencial de L. origanoides, quimiotipo timol (73 %) e para-cimeno

(10,5 %), reduziu o crescimento micelial de Phytophthora infestans, em mais de 50

% na dose de 50 µg mL-1, sendo a dose letal de 150 µg mL-1 (BEDOYA et al., 2015).

Outros fungos que atacam o cacaueiro também sofreram efeito da ação antifúngica

do óleo essencial de espécies do gênero Lippia (L. origanoides, L. alba e L.

citriodora), a exemplo de isolados do agente causal de Monilíase (Moniliophthora

spp.) que tiveram inibição de 100% da germinação e crescimento micelial quando

foram utilizados em concentrações entre 800 e 1000 µg mL-1 (LOZADA et al., 2012).

Esses autores destacam também que o óleo essencial de L. origanoides é aspirante

para uso como biofungicida no possível controle da monilíase. Inibição do

crescimento micelial de Sclerotium cepivorum, fungo causador da podridão em

cebola, foi relatado por três acessos de L. origanoides coletados na Colombia

(OSPINA et al., 2013). Os autores destacaram inibição total do fungo na

83

concentração do óleo de 0,12 µL mL-1, sendo este o único acesso com timol como

composto majoritário (45 % em folhas e 33,1 % em flores).

Em relação à toxicidade do óleo de L. origanoides, as concentrações

testadas neste estudo não apresentaram fitotoxicidade aos discos foliares do clone

SIC 23, não interferindo nos resultados experimentais.

O óleo essencial de L. origanoides também apresentou ação fungicida no

combate aos agentes causadores da podridão parda, P. palmivora e P. citrophthora,

quando testado em discos de folhas que haviam sido tratados com concentrações

do óleo (in vivo). Observou-se que houve diferença significativa entre as

concentrações testadas no controle dos patógenos (p<0,05) (Tabela 3).

Tabela 3 - Comparação dos níveis médios de infecção1 e percentagem de inibição dos sintomas em relação à testemunha, nos discos de folhas de SIC-23 tratados com óleo essencial de L. origanoides, sete dias após a inoculação. Ilhéus – BA.

Concentração (µL mL-1)

Phytophthora palmivora Phytophthora citrophthora

Médias Inibição (%) Médias Inibição (%)

0,00 3,50 b 0,00 b 3,45 d 0,00 c 0,30 1,18 a

1,13 a 66,8 a 2,60 c 39,2 ab

0,60 67,9 a 2,48 b 30,3 b 0,90 1,13 a 67,9 a 1,65 a 52,2 a 1,20 1,13 a 68,9 a 1,63 a 53,9 a

1,50 1,05 a 70,4 a 1,58 a 53,8 a

DMS 0,55 1,11 0,81 0,50

CV (%) 20,6 0,7 23,5 0,3

Médias seguidas da mesma letra na coluna, não se diferem estatisticamente pelo teste de

Tukey a 5 % de probabilidade. 1Escala de notas (0 a 5) por Nyassé et al. (1995).

Verificou-se inibição superior a 50 % da infecção pelos fitopatógenos P.

palmivora e P. citrophthora em discos foliares, quando comparado à testemunha,

nas concentrações de 0,3 µL mL-1 e 0,9 µL mL-1, respectivamente (Tabela 3). O que

demonstra o uso promissor deste óleo essencial no controle in vivo destes

patógenos.

Para P. palmivora, não houve diferença significativa com o aumento das

doses testadas, sendo que na dose máxima, a redução chega a 70 %. Por outro

lado, P. citrophthora apresentou inibição máxima de 54 %. Das espécies que

ocorrem no Brasil, P.citrophthora é a mais virulenta, seguida por P. palmivora e P.

capsici (LUZ et al., 2003; OLIVEIRA, 2017). Logo, o óleo essencial de L. origanoides

84

foi mais eficaz frente a P. palmivora. Este controle, ainda que parcial, poderá

contribuir para o manejo das doenças em casos que os fungicidas sintéticos não são

permitidos, como na agricultura orgânica.

Em estudo sobre a severidade de Phytophthora infestans em duas cultivares

de batatas (cv Ágatha e Catucha) submetidas ao tratamento com óleo essencial de

Tagetes minuta, foi observada a redução significativa do crescimento micelial e

esporulação de P. infestans nos discos de folha de ambas as cultivares quando

submetidos às doses de 500 ppm e 1000 ppm do óleo comparado à severidade

verificada nos discos foliares das mesmas cultivares imersos apenas em água

(SCHELEE et al., 2012).

Diversas espécies aromáticas e medicinais já tiveram atividade biológica

testada. Pinto et al. (2006) avaliaram a atividade antifúngica do óleo essencial de

Thymus pulgioides L. (contendo 26 % de timol e 21 % de carvacrol), e constataram

atividade antifúngica em 16 fungos que tiveram lesões na membrana citoplasmática

e considerável redução de ergosterol, que é o principal componente esterol da célula

fúngicas, responsável pela manutenção da função e integridade celular

(RODRIGUEZ et al., 1985). O principal mecanismo de ação dos fármacos

antifúngicos está na interrupção das vias biossintéticas de esterol levando assim à

redução da síntese de ergosterol (KELLY et al., 1995).

Embora haja grande variedade de compostos presentes no óleo essencial

de L. origanoides, o timol apresenta alto teor em relação aos demais componentes,

e na formulação sintética, possui potencial antifúngico contra alguns fungos

fitopatogênicos comprovados, o que sugere que ele seja o principio ativo

responsável pela inibição do crescimento micelial (Tabela 1). Morcia et al. (2013)

avaliaram o efeito antifúngico de cinco componentes sintéticos que também estão

presentes em óleos essenciais e constataram a eficácia antifúngica em 12

patógenos de plantas in vitro de todos os componentes testados, em função da

concentração utilizada, sendo o timol o componente de maior potencial, seguido pelo

eugenol, carvona, terpinen-4-ol e cineole.

Svircev et al. (2007), tratando ameixas infectadas com Monilia fructiosa com

vapores de timol (sintético) observaram por meio da microscopia eletrônica de

transmissão que conídios, hifas e tubos germinativos apresentaram desorganização

e perda das estruturas celulares deixando claro que estes conídios e hifas não

85

teriam a capacidade de germinar e re-infectar um novo tecido. Morcia et al. (2013)

observaram que o timol afetou a morfologia do micélio, com mudança na localização

da quitina dentro das hifas.

Entretanto não se pode descartar a possível atividade antifúngica das

substâncias minoritárias presentes no óleo essencial da espécie estudada. Estudos

experimentais utilizando concentrações de timol próximas às encontradas neste

estudo devem ser testados no crescimento micelial de P. palmivora e P. citrophthora

para maiores afirmações.

6.4 Conclusão

O óleo essencial de Lippia origanoides apresentou ação fungitóxica contra

Phytophthora palmivora e Phytophthora citrophthora em condições in vitro.

A concentração do óleo essencial de L. origanoides permitiu a inibição de

mais de 50 % dos fitopatógenos a partir das doses de 0,3 µL mL-1 e 0,9 µL mL-1 para

P. palmivora e P. citrophthora, respectivamente, sendo promissor no uso do controle

integrado da podridão parda do cacaueiro.

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes),

pela concessão da bolsa e financiamento da pesquisa, à Comissão Executiva do

Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC), ao PPGPV/UESC e aos funcionários da

CEPLAC/ CEPEC/SEFIT, colaboradores nessa pesquisa.

86

6.5 Referências

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90

7 USO DE ÓLEO DE Lippia origanoides Kunth NO CONTROLE (IN VITRO E IN VIVO) DE MURCHA-DE-CERATOCYSTIS.

RESUMO: A Murcha de Ceratocystis ou mal do facão é uma doença vascular de

grande importância econômica na cacauicultura do Brasil e de outros países por

causar a morte das plantas e acarretar perdas em plantações de cacau. A Lippia

origanoides é uma espécie que possui potencial antifúngico devido aos

componentes do óleo essencial. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito

fungitóxico do óleo essencial de folhas de L. origanoides in vitro e in vivo, sobre

Ceratocystis cacaofunesta, fungo causador da Murcha de Ceratocystis em

cacaueiros. Para isso, foram realizados dois experimentos. Para o teste in vitro,

foram usadas concentrações de 0 µL mL-1 ( testemunha); 0,30 µL mL-1; 0,60 µL mL-1;

0,90 µL mL-1; 1,2 µL mL-1 e 1,5 µL mL-1, perfazendo seis tratamentos e cinco

repetições. Para avaliação in vivo, foram utilizados discos foliares do clone de

cacaueiro SJ-02 tratados com as mesmas concentrações do óleo e inoculados com

suspensão do patógeno. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente

casualizado, com os mesmos tratamentos do teste in vitro, 12 repetições e 10 discos

de folha por repetição. Foram avaliadas a porcentagem de inibição do fungo e a

concentração inibitória mínima, além da ação do óleo sobre os discos de folhas

inoculados. Os resultados dos testes in vitro e in vivo foram submetidos à análise de

variância (ANOVA) e posteriormente as médias comparadas pelo teste Tukey a 5%.

O crescimento micelial de C. cacaofunesta foi inibido em 100 % a partir da

concentração mínima de 0,6 µL mL-1 do óleo de L. origanoides para experimento in

vitro. Em discos foliares, observou-se que houve inibição de aproximadamente 57%

da formação de peritécios na concentração de 0,6 µL mL-1, demonstrando o

potencial do óleo de L. origanoides frente ao fungo causador da Murcha de

Ceratocystis no cacaueiro. Conclui-se que há possibilidade de uso deste óleo no

controle do Ceratocystis cacaofunesta.

Palavras-chave: Ceratocystis cacaofunesta, Theobroma cacao, controle natural,

timol.

ABSTRACT: Ceratocystis wilt is a vascular disease of economic importance in Brazil

and other countries causing the death of plants and consequently losses in cacao

plantations. Lippia origanoides is a species that has an antifungal potential due to the

components of its essential oil. The objective of this work was to evaluate the

fungitoxic effect of the essential oil of leaves of L. origanoides in vitro and in vivo on

the Ceratocystis cacaofunesta, a fungus that causes Ceratocystis wilt in cacao trees.

For this, two experiments were carried out. For in vitro testing, concentrations of 0 μL

mL-1 (control); 0.30 μL mL-1; 0.60 μL mL-1; 0.90 μL mL-1; 1.2 μL mL-1 and 1.5 μL mL-1

were tested, using six treatments and five replicates. For in vivo evaluation, leaf discs

of cacao clone SJ 02 treated with oil concentrations and inoculated with pathogen

suspension were used. The percentage of inhibition of fungi and the minimum

inhibitory concentration were evaluated, as well as its active on leaves discs

91

inoculation. The experimental design was a completely randomized, using the same

concentrations than the in vitro test, with 12 replicates and 10 leaf discs per replicate.

The results of in vitro and in vivo tests were submitted to analysis of variance

(ANOVA) and averages compared by the Tukey test at 5%. The mycelial growth of C.

cacaofunesta was inhibited in 100% from the minimum concentration of 0.6 μL mL-1

of L. origanoides oil for in vitro experiment. In leaf discs, it was observed that there

was inhibition of approximately 57% of perithecia formation for the concentration of

0.6 μL mL-1, demonstrating the potential of oil to the fungus causing the Ceratocystis

wilt of the cacao tree. It is concluded that there is the possibility of using this oil to

control the Ceratocystis cacaofunesta.

Keywords: Ceratocystis cacaofunesta, Theobroma cacao, natural control, thymol.

7.1 Introdução

A Murcha de Ceratocystis ou mal do facão (Ceratocystis cacaofunesta

Engelberecht & T.C. Harrington) é uma doença vascular importante na cacauicultura

do Brasil e de outros países como Equador, Venezuela e Colômbia, por causar a

morte das plantas e acarretar perdas em plantações de cacau (OLIVEIRA, 2017).

Justamente por destruir o sistema vascular da planta, o controle desta enfermidade

se torna muito difícil, pois quando há sinais dos sintomas na parte aérea, a planta já

está comprometida (TUMURA et al., 2012). Assim, estudos vêm sendo realizados

em busca de alternativas eficientes no combate a esta doença.

De acordo com Zambolim et al. (1997), o manejo das doenças em qualquer

cultura deve ser realizado para atenuar os danos provocados a níveis

economicamente aceitáveis, sem prejuízos para os agroecossistemas, mantendo o

seu equilíbrio. Estudos têm evidenciado o controle de doenças por extratos e óleos

essenciais de plantas aromáticas e medicinais, seja no controle preventivo ou

curativo, como espécies do gênero Piper contra Crinipellis perniciosa, Phytophthora

palmivora e P. capsici (SILVA; BASTOS, 2007), cravo-da-índia (Syzygium

aromaticum L.) sobre o crescimento de Rhizoctonia solani, Fusarium solani,

Fusarium oxysporum (COSTA et al., 2011), Ocimum selloi na germinação de

esporos de Colletotrichum gloeosporioides e Moniliophthora perniciosa (COSTA et

92

al., 2015), Origanum vulgare L. em Monilinia laxa, M. fructigena e M. fructicola

(ELSHAFIE et al., 2015).

Dentre as espécies, com potencial fungicida, encontra-se a Lippia

origanoides Kunth (Verbenaceae), uma espécie medicinal arbustiva da flora

brasileira conhecida pelo epíteto de “alecrim-pimenta”, “orégano do monte” e “salva-

de-marajó”, que possui óleo essencial rico em timol e carvacrol, presente em flores e

folhas (OLIVEIRA et al., 2007; SALIMENA; MÚRGURA, 2015; TOZIN et al., 2015).

Na medicina popular é usada no tratamento de cólicas menstruais, dores no

estômago, doenças respiratórias, bem como anti-inflamatória e antisséptico oral

(SARRAZIN et al. 2015; OLIVEIRA et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2007; DOS

SANTOS et al., 2004; PASCUAL et al., 2001). Possui atividade antifúngica já

comprovada frente aos fitopatógenos Moniliophthora roreri, Phytophthora infestans e

Sclerotium cepivorum (LOZADA et al., 2012; BEDOYA et al., 2015; OSPINA et al.,

2011).

Estudos já foram realizados em relação ao uso de controle biológico à Murcha

de Ceratocystis com espécies do gênero Trichoderma spp. (RODRIGUES et al.,

2018). No entanto, considerando a escassez de trabalhos usando óleos essenciais

no controle do fitopatógeno causador da doença, o objetivo deste trabalho foi avaliar

in vitro e in vivo a ação fungitóxica do óleo essencial de folhas de Lippia origanoides,

no controle do Ceratocystis cacaofunesta.


O experimento foi realizado no Laboratório de Ceratocystis, Seção de

Fitopatologia do Centro de Pesquisa do Cacau (Ceplac/Cepec), Bahia, Brasil.

7.2.1 Obtenção do isolado

Foi utilizado o isolado Cc20 de Ceratocystis cacaofunesta da Micoteca de

Ceratocystis, do Centro de Pesquisa do Cacau (Cepec/Ceplac). A suspensão de

93

inóculo foi obtida a partir de culturas com 10 dias de idade crescidas em meio de

cultura batata dextrose ágar (BDA) mantido a 24 ± 1 ° C.

7.2.2 Obtenção do óleo essencial

Para obtenção do óleo essencial, amostras de folhas de Lippia origanoides

foram coletadas de plantas matrizes presentes no Horto de Plantas Medicinais da

Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC). Exsicatas do material botânico estão

depositadas no Herbário UESC, sob registro nº 21282.


Clevenger no tempo de extração determinado pela curva de tempo de extração (150

minutos). O óleo foi separado do hidrolato com diclorometano (3 x 10 mL) e seco

com sulfato de sódio anidro e concentrado.



cromatográfo a gás Varian Saturm 3800 equipado com coluna capilar de sílica



arraste e fluxo de 1,2 mL.min-1 (10 psi). As temperaturas do injetor e detector foram








Saturno ® 2000, a coluna e as condições de temperaturas foram idênticas as usadas


150 °C. O modo de operação foi o impacto elétrico de 70eV a uma velocidade de

varredura de 1/segundo (s) dentro de uma faixa de 40 a 450 Da a uma taxa de




94


como através da comparação dos seus índices de retenção com os compostos



7.2.3 Inibição do crescimento micelial (in vitro)

Nos testes de inibição do crescimento micelial do fungo, o delineamento

utilizado foi inteiramente casualizado, sendo usadas alíquotas do óleo incorporado à

batata dextrose ágar (BDA) fundente, de modo a se obter concentrações

correspondentes aos tratamentos (0 µL mL-1 - testemunha; 0,3 µL mL-1; 0,6 µL mL-1;

0,9 µL mL-1; 1,2 µL mL-1 e 1,5 µL mL-1), vertidos em placas de Petri (Ø = 9 cm),

perfazendo seis tratamentos e cinco repetições. Após a solidificação do meio, discos

(Ø = 5 mm) contendo micélio de cada um dos fungos, foram transferidos para o

centro das placas. Estas foram incubadas em temperatura de 28°C, em B.O.D

durante 10 dias.

Foram realizadas avaliações diárias do crescimento micelial, sendo a

avaliação final realizada no décimo dia, quando o crescimento micelial da

testemunha cobriu totalmente a superfície do meio de cultura. Foi calculada a

porcentagem de inibição do crescimento micelial por meio da fórmula: % inibição =

[(Dc - Dt) x 100] / Dc, em que Dc e Dt representam os diâmetros do micélio no

controle e no tratamento, respectivamente, e a concentração inibitória mínima (CIM),

que é o intervalo entre as concentrações do produto testado, capaz de inibir 100 %

do crescimento do fungo.

7.2.4 Inoculação em discos de folhas (in vivo)

O experimento in vivo foi realizado em discos foliares do clone de cacaueiro

SJ-02, padrão de suscetibilidade a Ceratocystis cacaofunesta.

7.2.4.1 Obtenção da suspensão do isolado de Ceratocystis cacaofunesta

95

O isolado Cc 20 de C. cacaofunesta foi repicado para placas de Petri com

Batata Dextrose Ágar (BDA) e mantido em BOD na temperatura de 24°C, por 10

dias. Em seguida, 10 mL de água destilada estéril foram acrescidos a cada placa. A

suspensão obtida foi filtrada com gaze estéril, agitada em vortex a 2000 rpm durante

dois minutos e, logo após, avaliada a concentração em câmara de Neubauer e

ajustada para 3x104 UFC/mL, contendo três gotas/mL de Tween 20 (OLIVEIRA et

al., 2009).

7.2.4.2 Inoculação nos discos de folhas

Foram coletadas folhas de cacaueiros do clone SJ-02, em estágio

intermediário de maturação (pecíolos mudando da coloração esverdeada a marrom)

na parte da manhã, visando a manutenção da turgescência foliar e levadas ao

laboratório. Em seguida foram higienizadas com o auxílio de algodão embebido em

água destilada e cortes superficiais foram feitos ao longo da nervura central das

folhas. Após a incisão, discos de 1,5 cm de diâmetro foram realizados ao longo da

nervura central, com o auxílio do cortador semiautomático (Figura 1A).

Posteriormente, os discos foliares foram mergulhados em cada concentração

correspondente aos tratamentos durante 10 segundos e acondicionados com a face

abaxial voltada para cima, em caixas plásticas contendo espuma esterilizada úmida

(Figura 1 B).

Após 24 h, cada disco foliar foi cuidadosamente inoculado na região da

nervura com 20 μL de suspensão de inóculo na concentração 3,0 x 104 UFC/mL de

C. cacaofunesta (Figura 1 C) (MAGALHÃES et al., 2016). Em seguida, as caixas

foram fechadas, visando manter a umidade relativa em torno 100 %, e

acondicionadas a 24 ºC, por quatro dias, ao abrigo de luz. As avaliações foram

realizadas quatro dias após a inoculação, fazendo-se a contagem dos peritécios

completamente desenvolvidos usando um estereomicroscópio (400 X) (Figura 1 D) e

o cálculo da porcentagem de inibição (BASTOS, 2007) com a fórmula:

Porcentagem de inibição =

96

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, utilizando as

mesmas concentrações do experimento in vitro (0 µL mL-1 - testemunha; 0,3 µL mL-1;

0,6 µL mL-1; 0,9 µL mL-1; 1,2 µL mL-1 e 1,5 µL mL-1), quatro repetições e 30 discos

de folha por repetição, totalizando 120 discos/tratamento.

Figura 1 - (A) Cortes dos discos de folhas com o auxílio do cortador semiautomático; (B) Discos foliares com a face abaxial voltada para cima, acondicionados, em caixas plásticas formando câmara úmida (C) Inoculação nas nervuras dos discos com 20 μL de suspensão; (C) Contagem dos peritécios usando um estereomicroscópio (D). Ilhéus – BA.

7.2.5 Análises estatísticas

Os dados obtidos dos experimentos in vitro e in vivo foram submetidos à

análise de variância (ANOVA) e comparação de médias pelo teste Tukey a 5% de

significância, utilizando o programa estatístico Sisvar (FERREIRA, 2011).

97


Foram identificados dez componentes químicos no óleo essencial de Lippia

origanoides, sendo o timol o composto majoritário com 71,52%, seguido pelo para-

cimeno-7-ol (9,19%), cariofileno (5,40%) e para-cimeno (4,67%) (Tabela 1).

Tabela 1 - Composição química completa e porcentagens dos compostos do óleo essencial de folhas de Lippia origanoides. Ilhéus – BA, 2017.

Composto Classe IRa

IR lit.b

Composição (%)c

pineno monoterpeno 989 980 0,17

para-cimeno fenilpropanóide 1032 1026 4,67

terpineno monoterpeno 1065 1062 2,03

acetato de artemisila monoterpeno oxigenado 1177 1173 0,62

terpin-4-ol monoterpeno oxigenado 1189 1174 0,82

para-cimen-7-ol fenilpropanóide 1279 1287 9,19

timol fenilpropanóide 1288 1290 71,52

cariofileno sesquiterpeno 1428 1418 5,40

terc-butil-4-metoxifenol fenilpropanóide 1484 1488 2,96


oxigenado 1593 1581 1,14

Total identificado (%) 98,5

aIR: índices de retenção relativo experimental: n-alcanos C8-C26 foram usados como pontos de referência

no cálculo de índice de retenção relativo. bIR lit: índices de retenção relativo da literatura (ADAMS, 2007).


O óleo essencial de Lippia origanoides inibiu o crescimento micelial de C.

cacaofunesta após o décimo dia de avaliação (Figuras 2 e 3). Verificou-se diferença

significativa das concentrações em relação à inibição do crescimento do patógeno

(p<0,01), sendo que a concentração de 0,3 µL mL-1 causou inibição de mais de 50

%. Houve inibição total do crescimento micelial do patógeno na concentração

inibitória mínima de 0,6 µL mL-1.

A ação antifúngica dos óleos essenciais é explicada pelos danos à membrana

celular e degeneração das hifas que causam a liberação do conteúdo celular,

inclusive exposição do núcleo (ZAMBONELLI et al.,1996). O óleo essencial, devido à

hidrofobicidade, interage com os lipídios da parede celular, membrana celular e

98

mitocôndria, alterando a permeabilidade, causando distúrbios nestas estruturas

(COSTA et al., 2011).

Pesquisas têm relatado a atividade antimicrobiana de espécies do gênero

Lippia, por serem ricas em compostos fenólicos como timol e carvacrol, a exemplo

de L. graveolens (SALGUEIRO et al., 2003) e L. origanoides (DOS SANTOS et al.,

2004; BEDOYA et al., 2015). Em estudo realizado com L. origanoides contra

Phytophthora infestans, BEDOYA et al. (2015), atribuíram o controle do fungo ao

timol, uma vez que esse composto tem comprovada ação antifúngica alterando a

morfologia do micélio, com mudança na localização da quitina dentro das hifas

(BRAGA et al., 2009; MORCIA et al., 2013).

Romero et al. (2009) avaliaram o potencial de Thymus vulgaris no controle de

bactérias e fitopatógenos in vitro, e ressaltaram a eficiência do óleo no controle de

Sclerotinia minor (10 µL mL-1), Colletotrichum musae (5 µl mL-1) e Fusarium

moniliforme (10 µL mL-1). Dentre os compostos químicos identificados em T. vulgare

estão o timol (50 %), p-cimeno (20%) e γ-terpineno (18%). Observa-se que apesar

da composição semelhante, no presente estudo foram usadas concentrações mais

baixas e que tiveram efeito sobre o patógeno testado. A concentração a ser utilizada

depende não só das substâncias presentes no óleo, que é uma mistura muito

complexa, mas também do fitopatógeno a ser controlado.

Figura 2 - Porcentagem de inibição do crescimento miceliano (ICM) de Ceratocystis cacaofunesta após interação com óleo essencial de L. origanoides Kunth. Ilhéus - BA, 2017. DMS= 6,94. CV= 4,6%.

99

Figura 3 - Efeito de doses do óleo essencial de L. origanoides sobre crescimento micelial de Ceratocystis cacaofunesta. Concentrações: 0 µL mL-1 (1); 0,3 µL mL-1 (2); 0,6 µL mL-1 (3); 0,9 µL mL-1 (4); 1,2 µL mL-1 (5) e 1,5 µL mL-1 (6). Barra = 5 cm.

Em relação ao experimento em discos de folhas (in vivo), as concentrações

testadas apresentaram diferença significativa tanto para número de peritécios

formados como para porcentagem de inibição (p<0,01) (Tabela 2).

Tabela 2 - Número de peritécios de Ceratocystis cacaofunesta formados após a inoculação nos discos de folhas tratados com óleo essencial de L. origanoides, após quatro dias, e percentagem de inibição em relação à testemunha.

Concentração (µl mL-1) C. cacaofunesta

nº de peritécios Inibição (%)

0,00 29,63 b 0,00 c 0,30 24,13 b 37,1 b 0,60 19,83 a 57,3 a 0,90 11,88 a 62,1 a 1,20 10,45 a 68,9 a 1,50 13,50 a 69,1 a

DMS 0,79 12,7 Médias seguidas da mesma letra, na mesma coluna, não diferem estatisticamente pelo teste

de Tukey a 5% de probabilidade.

Verificou-se efeito do óleo essencial de L. origanoides na concentração

mínima utilizada, demonstrando o potencial do óleo no controle preventivo ao fungo

causador da Murcha de Ceratocystis. A inibição foi diretamente proporcional ao

aumento das concentrações, sendo a concentração de 0,6 µL mL-1 inibidora de mais

100

de 50 % do número de peritécios desenvolvidos em relação à testemunha (Tabela

2), não diferindo estatisticamente das concentrações de 0,9 µL mL-1, 1,2 µL mL-1 e

1,5 µL mL-1. Ainda que o óleo tenha apresentado apenas inibição parcial do

patógeno, este controle permite contribuir para o manejo da doença podendo ser

utilizado como tratamento dos cancros causados em cacaueiros cultivados na

agricultura orgânica. Para tentativa de inibição total dos peritécios, estudos

posteriores com maiores concentrações do óleo devem ser realizados.

Observou-se também, visualmente, nos discos foliares, que a testemunha

apresentou o ressecamento das nervuras e do limbo foliar, maior escurecimento dos

discos e abundante formação de micélio quando comparado aos outros tratamentos

(Figura 4 A), além do maior número de peritécios e estes mais desenvolvidos, com

formação e liberação de ascósporos (Figura 4 B). Todavia, nos tratamentos

correspondentes às maiores concentrações (0,9 µL mL-1, 1,2 µL mL-1 e 1,5 µL mL-1),

os discos apresentaram coloração mais esverdeada e formação de menor número

de peritécios e pouco micélio (Figura 4 C). Pode-se inferir que o óleo de L.

origanoides atuou preventivamente à infecção do fungo. Estudos futuros devem ser

realizados no intuito de produzir formulações que possibilitem a aplicação do produto

natural em condições de campo.

Algumas pesquisas vêm sendo realizadas com uso de compostos

secundários de plantas em fungos, com resultados promissores, a exemplo do óleo

essencial da sucupira (Pterodon emarginatus Vog.) que na concentração de 10 %

inibe o desenvolvimento micelial de Ceratocystis fimbriata, Alternaria brassicae,

Fusarium oxysporum e Rhizoctonia solani, in vitro (SILVA et al., 2005). Espécies de

Piper também apresentaram atividade fungitóxica no controle de fungos diversos,

como a inibição total do crescimento micelial de Moniliophthora perniciosa causada

pelo óleo essencial de P. callosum (0,75 µL mL-1) e P. marginatum var. anisatum (1

µL mL-1) e para Phytophthora capsici, com o uso do óleo de P. callosum (0,75 µL

mL-1). Para P. palmivora, os óleos de P. callosum (1 µL mL-1) e P. enckea (1 µL mL-

1) mostraram-se mais efetivos (SILVA; BASTOS, 2007).

101

Figura 4 - (A) Discos foliares de cacaueiro tratados com óleo essencial de L. origanoides, quatro dias após a inoculação de C. cacaofunesta. Concentrações: 0 µL mL-1 (1); 0,3 µL mL-1 (2); 0,6 µL mL-1 (3); 0,9 µL mL-1 (4); 1,2 µL mL-1 (5) e 1,5 µL mL-1

(6); (B) Disco representando a concentração 0 µL mL-1 (1), com os peritécios mais desenvolvidos e formação de ascósporos; (C) disco representando os demais tratamentos com coloração mais esverdeada e formação de menor número de peritécios.

7.4 Conclusão

O óleo essencial de Lippia origanoides na concentração de 0,6 µL mL-1

apresentou ação fungitóxica e inibiu o crescimento micelial (ICM) (in vitro) e

formação de peritécios (in vivo) do fungo fitopatogênico Ceratocystis cacaofunesta,

tendo uso potencial no controle da doença Murcha de Ceratocystis.

102

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes),

pela concessão da bolsa e financiamento da pesquisa, à Comissão Executiva do

Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC), aos funcionários do Laboratório de

Ceratocystis da Sessão de Fitopatologia, do Centro de Pesquisa do cacau,

colaboradores nessa pesquisa.

7.5 Referências

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105

8 CONCLUSÕES GERAIS

A espécie Lippia origanoides Kunth. possui alta porcentagem de

enraizamento (acima de 80 %) se propagada vegetativamente por estacas apicais,

medianas ou basais em substrato areia. Possui em seu perfil cromatográfico a

predominância de compostos fenólicos, além de terpenos, que variam de acordo

com a idade da planta e horário de colheita, apresentando maiores teores de óleo e

componente majoritário, timol, aos 240 dias após o plantio, no horário entre 9 h e 11

h da manhã. No entanto, a maior produção deste óleo foi obtida aos 330 dias após o

plantio. É recomendada a secagem das folhas em estufa 40 ºC pelo tempo de 380

minutos e posterior extração por hidrodestilação no tempo de 150 minutos para

obtenção dos maiores teores do óleo essencial.

O óleo essencial de L. origanoides apresenta atividade biológica contra os

fitopatógenos Phytophthora palmivora, Phytophthora citrophthora e Ceratocystis

cacaofunesta, causando inibição de mais de 50 % dos fitopatógenos, in vivo, a partir

das doses de 0,3 µL mL-1; 0,9 µL mL-1 e 0,6 µL mL-1, respectivamente.

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