1 universidade estadual de santa cruz...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
GISELLE DE SOUZA RODRIGUES
ANTAGONISMO DE Trichoderma spp. E LEVEDURAS À Ceratocystis
cacaofunesta
ILHÉUS – BAHIA
2016
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GISELLE DE SOUZA RODRIGUES
ANTAGONISMO DE Trichoderma spp. E LEVEDURAS À Ceratocystis
cacaofunesta
Dissertação apresentada para obtenção do título de
mestre em Produção Vegetal à Universidade
Estadual de Santa Cruz.
Área de concentração: Proteção de Plantas
Orientadora: Edna Dora Martins Newman Luz
Co-orientadora: Andréa Miura da Costa
ILHÉUS – BAHIA
2016
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GISELLE DE SOUZA RODRIGUES
ANTAGONISMO DE Trichoderma spp. E LEVEDURAS À Ceratocystis
cacaofunesta
Ilhéus, 23 de Fevereiro de 2016.
_________________________________________ Edna Dora Martins Newman Luz
Eng. Agrônoma, PhD em Fitopatologia, Fiscal Federal Agropecuário CEPLAC/ PPGPV – UESC
(Orientadora)
_________________________________________ Stela Dalva Vieira Midlej Silva
Agrônoma, DSc. em Agronomia (Fitopatologia) CEPLAC
_________________________________________ José Luiz Bezerra
Biólogo, PhD em Fitopatologia PPGPV – UESC
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Aos meus pais Rita e Almiro, pessoas que mais amo e que sempre me apoiaram,
dando-me muito carinho e amor. A eles que me mostraram os valores da vida, me
ajudaram em minhas decisões mais importantes e me ensinaram a procurar sempre
em Deus a força maior.
Dedico
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“Os pássaros e os índios sumindo... sumindo... sumindo
como fora o macaco jupará semeando a roxa amêndoa nas matas aprovando o cacau que os homens trouxeram para as Terras do Sem Fim.”
(José Delmo)
AGRADECIMENTOS
Agradecer faz parte do vocabulário e da atitude de quem percebeu que
sempre precisa de algo ou de alguém para levar avante suas tarefas, das mais
simples às mais complexas. Enumerar a tudo e a todos é algo difícil. Mencionar
alguns não significa que outros não estiveram presentes nessa caminhada. A
todos, os registrados ou não, minha súplica ao Deus de meu coração, a fim de que
a compreensão, a humildade, a paz, a tolerância, a generosidade e a justiça sejam
esteios de suas vidas. Assim, agradeço:
Primeiramente à Deus, que me deu o dom da vida e perfeição para seguir
em frente e lutar pelos meus objetivos. Ele que me livra de todos os males e
perigos, guia meus passos e ilumina meus caminhos. Sou grata por todos os dons
que me confere.
À Universidade Estadual de Santa Cruz pela oportunidade que tive de cursar
mestrado nesta instituição. Ao colegiado da pós-graduação em Produção Vegetal,
em nome de Caroline (secretária), todos os professores que tive a oportunidade de
conviver durante as disciplinas e todos os coordenadores que assumiram este
cargo durante meu mestrado.
À Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira pela concessão do
local de realização dos experimentos, material e acolhimento.
À minha orientadora Edna Dora por ter me orientado com tanto carinho,
atenção, com conselhos construtivos. Agradeço também pela confiança, pelo apoio
e pela grande e fundamental ajuda na construção deste trabalho.
À minha co-orientadora Andreia por disponibilizar espaço para realização do
meu trabalho, doar isolados e fornecer ideias de como conduzir o meu trabalho.
Aos funcionários da CEPLAC que me ajudaram na realização do trabalho,
cada um com sua contribuição: Tita, Lurdinha, Sr. Orlando, Sr. Ananias, Sr.
Elenísio, Sr. Valdir, Dilze, Virgínia, Ana Rosa, Denise, Dr. Bezerra, Maguinaldo,
Catarino, Sr. Edmundo, George Sodré e Cenilda.
À Alessandro que me ajudou desde o trabalho pesado na autoclavagem de
solo à correção da dissertação.
Aos meus companheiros e amigos os quais convivi durante estes anos e me
ofereceram ajuda quando precisei: Elisângela, Francis, Carol, Neto, Silvia, Tamira,
Nathally, Mateus e também àqueles que eu porventura não citei, agradeço a cada
um pelas suas contribuições na minha vida pessoal e profissional.
À Lindolfo e Carol pela ajuda com as análises estatísticas.
À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado.
A todos estes citados e não citados, minha imensa gratidão!
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Sintomas da murcha de ceratocystis em cacaueiro. Planta adulta
com folhas secas ainda aderidas (A), cancro e lesão necrótica no tronco (B) e
necrose interna atingindo o lenho (C) (Fotos: OLIVEIRA; LUZ,
2012)....................................................................................................................
CAPÍTULO 1
Figura 1 – Repicagem dos isolados de Trichoderma spp. para confronto após
três (A), quatro (B) e cinco (C) dias do desenvolvimento das colônias de
Ceratocystis cacaofunesta...................................................................................
Figura 2 – Corte dos discos de folhas em cortador semiautomático (A); Corte
superficial na nervura central das folhas (B); Discos de folhas imersos na
suspensão de um dos antagonistas (C); Inoculação do Ceratocystis
cacaofunesta nos discos de folhas 24 h após a imersão na suspensão dos
antagonistas (D). .................................................................................................
Figura 3 – Mudas de cacaueiro cultivadas sob condições de casa de
vegetação no Sefit / Cepec / Ceplac..................................................................
Figura 4 – Incisão no caule da muda de cacaueiro (A); Inoculação do
Ceratocystis cacaofunesta no ferimento (B); Câmara úmida no local da
inoculação (C)......................................................................................................
Figura 5 – Crescimento radial das colônias de Ceratocystis cacaofunesta
(isolado Cc20) em quatro meios de cultura diferentes a cada 24 horas. SAB:
sabouraud; AM: ágar-malte; BDAb: batata-dextrose-ágar preparado com
batatas e; BDAc: preparado a partir de meio desidratado comercializado.........
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Figura 6 – Colônias de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20) nos meios
de cultura batata-dextrose-ágar preparado com batatas (BDAb) (A) meio
desidratado (BDAc) (B), sabouraud (SAB) (C) e ágar-malte (AM) (D)................
Figura 7 – Colônias de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20)
confrontadas ou não com isolados de Trichoderma spp. Isolado Pc4c1 (A);
isolado 312 (B); isolado ALF247 (C); isolado 2927 (D); e isolado Tc26 (E) no
terceiro dia de pareamento; e testemunha aos 10 dias (F).................................
Figura 8 – Porcentagem de inibição do crescimento de colônias de
Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20) por antagonistas do gênero
Trichodema..........................................................................................................
Figura 9 – Padrão de crescimento micelial observado no confronto de
patógeno isolado Cc20 x antagonista Trichoderma atroviride (isolado 7CC) no
primeiro (A), segundo (B) e terceiro (C) dia de pareamento...........................
Figura 10 – Número de peritécios de Ceratocystis cacaofunesta formados
após quatro dias nos discos de folhas tratados com os antagonistas e
inoculados com o patógeno e percentagem de inibição em relação a
testemunha.........................................................................................................
Figura 11 – Número de peritécios de Ceratocystis cacaofunesta formados
sobre discos de folhas de cacaueiro e percentuais de inibição provocados
pela ação combinada de antagonistas em relação à testemunha (T1= T68+Tc26;
T2= T68+2927; T3= T68+7CC; T4= Tc26+2927; T= Tc26+7CC; T6= 2927+7CC; T7=
T68+Tc26+2927; T8= T68+Tc26+7CC; T9= T68+2927+7CC; T10= Tc26+2927+7CC;
T11= T68+Tc26+2927+7CC; T12= T68; T13= 7CC; T14= Tc26; T15= 2927).......................
Figura 12 – Plântulas de cacaueiro do experimento com tratamento de
sementes: saudáveis (A); Mortas por Ceratocystis cacaofunesta (B); Detalhe
das folhas murchas (C)........................................................................................
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Figura 13 – Lesão interna causada por Ceratocystis cacaofunesta em mudas
de cacaueiro inoculadas em ferimento no caule..................................................
CAPÍTULO 2
Figura 1 – Confronto do patógeno com uma das leveduras antagonistas.........
Figura 2 – Mudas estaqueadas na câmara de nebulização para enraizamento.
Figura 3 – Diâmetro médio das colônias de Ceratocystis cacaofunesta
(isolado Cc20) confrontadas em placas de Petri com isolados de leveduras e
da testemunha (sem confronto) durante treze dias de avaliação........................
Figura 4 – Colônias de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20) em
confronto com isolados de leveduras no 13º dia de avaliação. Isolado LEV 92
(A); Isolado LEV 170 (B); Testemunha (C)..........................................................
Figura 5 – Número de peritécios de Ceratocystis cacaofunesta e percentual
de inibição provocado pelos antagonistas.........................................................
Figura 6 – Porcentagem de mudas enraizadas de cacaueiro mortas por
Ceratocystis cacaofunesta mediante a presença dos isolados de leveduras.....
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LISTA DE QUADROS E TABELAS
CAPÍTULO 1
Quadro 1 – Agentes de biocontrole utilizados nos experimentos......................
Quadro 2 – Escala de notas para avaliação do teste de confronto direto entre
antagonistas e Ceratocystis cacaofunesta (BELL et al.,1982)..........................
Quadro 3 – Tratamentos do experimento 2 para as suspensões dos
antagonistas, isolados e as combinações.........................................................
Tabela 1 – Inibição da germinação de esporos de Ceratocystis cacaofunesta
quando tratados com seis concentrações de secretoma dos antagonistas do
gênero Trichoderma..........................................................................................
Tabela 2 – Porcentagem de plantas vivas dos tratamentos com os
antagonistas ao 22º dia após a inoculação de Ceratocystis cacaofunesta em
relação as testemunhas inoculada e absoluta...................................................
Tabela 3 – Peso médio do sistema radicular e da parte aérea das plantas
tratadas com os antagonistas e sobreviventes a inoculação com Ceratocystis
cacaofunesta e testemunha absoluta................................................................
Tabela 4 – Valores médios das variáveis avaliadas no tratamento com
ferimentos após 35 dias de inoculação de Ceratocystis cacaofunesta.............
CAPÍTULO 2
Quadro 1 – Leveduras utilizadas como agentes de biocontrole........................
Tabela 5 – Percentual de inibição da germinação de esporos de Ceratocystis
cacaofunesta quando tratados com seis concentrações de secretoma das
leveduras..........................................................................................................
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SUMÁRIO
EXTRATO.................................................................................................
EXTRACT...............................................................................................
1 INTRODUÇÃO GERAL...................................................................................
2 REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................
2.1 Cacauicultura..................................................................................................
2.2 Ceratocystis cacaofunesta..............................................................................
2.3 Controle biológico ..........................................................................................
2.3.1 Trichoderma spp. como Agentes de Controle Biológico (ABC) ......................
2.3.2 Utilização de leveduras como ABCs............................................................
3 CAPÍTULO 1 – Antagonismo de Trichoderma spp. ao agente
etiológico da murcha de ceratocystis em cacaueiro...........................
RESUMO....................................................................................................
ABSTRACT.................................................................................................
3.1 INTRODUÇÃO...............................................................................................
3.2 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................
3.2.1 Obtenção do Fitopatógeno e dos Agentes de Controle Biológico (ABC)........
3.2.2 Verificação do crescimento dos antagonistas e do patógeno em
diferentes meios de cultura.......................................................................
3.2.3 Confronto dos agentes de controle biológico com o patógeno...................
3.2.4 Avaliação do potencial dos agentes de biocontrole como inibidores da
germinação dos esporos de C.cacaofunesta..................................................
3.2.4.1 Obtenção dos secretomas dos antagonistas.............................................
3.2.4.2 Obtenção da suspensão de esporos de C. cacaofunesta e testes de
germinação de esporos .............................................................................
3.2.5 Efeito dos biocontroladores sobre a infecção e formação de peritécios
em discos de folhas de cacaueiro ................................................................
3.2.5.1 Experimento 1.................................................................................................
3.2.5.2 Experimento 2................................................................................................
3.2.6 Efeito dos antagonistas no controle da murcha de ceratocystis através
da inoculação em plantas de cacaueiro ........................................................
3.2.6.1 Tratamento de sementes.............................................................................
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3.2.6.2 Efeito dos antagonistas quando aplicados diretamente no ferimento
realizado para inoculação do patógeno em mudas de cacaueiro .................
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................
3.3.1 Verificação do crescimento dos antagonistas e do patógeno em
diferentes meios de cultura...........................................................................
3.3.2 Confronto dos agentes de controle biológico com o patógeno......................
3.3.3 Avaliação do potencial dos agentes de biocontrole como inibidores da
germinação dos esporos de C. cacaofunesta..............................................
3.3.4 Efeito dos biocontroladores sobre a formação de peritécios em discos
de folhas de cacaueiro................................................................................
3.3.5 Efeito dos antagonistas no controle in vivo da murcha de ceratocystis..........
3.3.5.1 Tratamento de sementes..............................................................................
3.3.5.2 Tratamento de ferimentos..............................................................................
4 CAPÍTULO 2 – Antagonismo de leveduras ao agente etiológico da
murcha de ceratocystis em cacaueiro..........................................................
RESUMO...............................................................................................................
ABSTRACT..............................................................................................................
4.1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................
4.2 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................
4.2.1 Obtenção do Fitopatógeno e dos Agentes de Controle Biológico................
4.2.2 Confronto dos agentes de controle biológico com o patógeno.................
4.2.3 Avaliação do potencial dos agentes de biocontrole como inibidores da
germinação dos esporos de C. cacaofunesta...............................................
4.2.3.1 Obtenção dos secretomas dos antagonistas................................................
4.2.3.2 Obtenção da suspensão de esporos de C. cacaofunesta e testes de
germinação de esporos.................................................................................
4.2.4 Efeito dos biocontroladores sobre a infecção e formação de peritécios
em discos de folhas de cacaueiro ...............................................................
4.2.5 Teste de antagonismo provocado por leveduras em mudas
estaqueadas enraizadas em espuma fenólica.............................................
4.2.6 Ação dos antagonistas no controle da murcha de ceratocystis através
da inoculação em plantas de cacaueiro.......................................................
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................
4.3.1 Confronto das leveduras testadas como ABCs com o patógeno...................
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4.3.2 Avaliação do potencial de isolados de leveduras como inibidores da
germinação dos esporos de C. cacaofunesta.................................................
4.3.3 Efeito dos biocontroladores sobre a infecção e formação de peritécios
em discos de folhas de cacaueiro...........................................................
4.3.4 Teste de antagonismo provocado por leveduras em mudas
estaqueadas enraizadas em espuma fenólica.............................................
4.3.5 Ação ou efeito dos antagonistas no controle da murcha de ceratocystis
através da inoculação em plantas de cacaueiro.........................................
5 CONCLUSÕES GERAIS..................................................................................
REFERÊNCIAS................................................................................................
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ANTAGONISMO DE Trichoderma spp. E LEVEDURAS À Ceratocystis
cacaofunesta
EXTRATO
A murcha de ceratocystis, causada por Ceratocystis cacaofunesta, é uma das mais importantes doenças do cacaueiro (Theobroma cacao L.) e de difícil controle. Não se tem registro do uso do controle biológico para esta doença, embora esta possa ser uma alternativa viável e promissora. Objetivou-se testar alguns isolados de Trichoderma spp. e leveduras como agentes de biocontrole (ABCs) a C. cacaofunesta isolado Cc20. Os candidatos a antagonistas foram T. martiale (ALF247 e 312), T. atroviride (7CC), T. longibrachiatum (Tc25), T. koningiopsis (Tc26), T. virens (T68 e Pc4c1), T. asperellum (316), T. pseudokoningii (854), T. harzianum (2927 e AR006), T. stromaticum (Ts1092), Sporobolomyces roseus (001), Rhodosporidium paludigenum (023, 034, 092, 174, 169, 101, 165, 166 e 170) e Rhodotorula sp. (161). Para atingir este objetivo avaliou-se: i) o crescimento dos fungos filamentosos em quatro meios de cultura: ágar-malte (AM), sabouraud (SAB), batata-dextrose-ágar comercializado (BDAc) e com caldo de batatas (BDAb); ii) o antagonismo através do confronto in vitro dos ABCs com o patógeno e da inibição da germinação de esporos de C. cacaofunesta pelo secretoma dos antagonistas; iii) efeito dos ABCs na formação de peritécios sobre discos de folhas inoculados com o patógeno; iv) tratamento de sementes e irrigação da rizosfera com suspensão de ABCs; v) aplicação dos ABCs sobre o ferimento no caule antes da inoculação do patógeno em mudas; e vi) atuação dos isolados de leveduras em miniestacas inoculadas com o patógeno. Os dados foram analisados nos softwares SISVAR® e SAS® (p<0,05). O patógeno cresceu melhor em BDAb e BDAc, porém, somente BDAb proporcionou abundante formação de peritécios. No confronto in vitro todos os isolados de Trichoderma spp., a exceção T68 (98%), inibiram 100% o crescimento do patógeno no terceiro dia de avaliação. As leveduras 161, 166, 169, 174, 165, 23 e 92 paralisaram o crescimento do patógeno no 11º dia de avaliação. Todos os ABCs reduziram a germinação de esporos do patógeno. Quando aplicados sobre discos de folhas antes de inoculados com o patógeno, todos os isolados diferiram da testemunha e inibiram em algum grau a formação de peritécios, destacando-se, entre os isolados de Trichoderma spp. T68 (98,5%), seguido de 2927, Tc26 (94,03%) e 7CC (92,34%), e dentre as leveduras LEV170 (89,6%). Em combinações dos quatro melhores isolados de Trichoderma spp. (T68, 7CC, 2927 e Tc26) para o tratamento dos discos de folha, os maiores percentuais de inibição do patógeno foram obtidos para as combinações onde o isolado T68 estava presente. As inoculações em plântulas obtidas de sementes tratadas e também irrigadas com a suspensão dos ABCs
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antes da inoculação com o patógeno aos cinco meses de idade causaram alta mortandade das plantas e apenas o isolado 7CC diferiu da testemunha inoculada e dos demais tratamentos. Quando os ABCs foram aplicados no local do ferimento, antes da inoculação com o patógeno, em plantas aos 12 meses de idade, também não foi comprovada a eficiência esperada para os antagonistas. No entanto, no experimento em mudas estaqueadas, os isolados LEV034 e LEV101 tiveram apenas 15 e 15,9% de plantas mortas, respectivamente, sendo superiores aos demais tratamentos. Houve efeito dos isolados 7CC (T. atroviride), T68 (T. virens), Tc26 (T. koningiopsis), 2729 (T. harzianum) e LEV170 (R. paludigenum) sobre a germinação e a formação de peritécios do patógeno; e das LEV 034 e LEV 101 (R. paludigenum) no controle da murcha de ceratocystis em mudas enraizadas. Assim, a hipótese de encontrar fungos biocontroladores de C. cacaofunesta não deve ser descartada.
Palavras-chave: Ceratocystis cacaofunesta, controle biológico, Theobroma cacao, leveduras, Trichoderma spp.
ANTAGONISM OF Trichoderma spp. AND YEAST TO Ceratocystis cacaofunesta
EXTRACT
The ceratocystis wilt caused by Ceratocystis cacaofunesta, it is one of the most important disease of cacao (Theobroma cacao L.) and difficult to control. There is no record of the use of biological control for this disease, although, this may be a viable and promising alternative. This study aimed to test some Trichoderma spp. and yeasts as biocontrol agents (BCAs) to C. cacaofunesta isolated Cc20. The candidates antagonists were: T. martiale (ALF247 and 312), T. atroviride (7CC), T. longibrachiatum (Tc25), T. koningiopsis (Tc26) T. virens (T68 and Pc4c1), T. asperellum (316), T. pseudokoningii (854), T. harzianum (AR006 and 2927), T. stromaticum (Ts1092), Sporobolomyces roseus (001), Rhodosporidium paludigenum (023, 034, 092, 174, 169, 101, 165, 166 and 170) and Rhodotorula sp. (161). Thus, it was evaluate: i) the growth of filamentous fungi in four culture media: Agar-Malt (AM), Sabouraud (SAB), commercial Potato Dextrose Agar (PDAc) and handmade Potato Dextrose Agar (PDAb); ii) the antagonism by BCAs confronting the pathogen in vitro and inhibiting the spores of C. cacaofunesta germination; iii) the antagonist effect of the BCAs secretomes on perithecia formation over leaf discs inoculated with the pathogen; iv) seeds treatment and irrigation of the soil surface with BCAs spore suspensions; v) application of BCAs on stem injury before the pathogen inoculation in cacao seedlings; and vi) the yeast performance in mini cuttings inoculated with the pathogen. The data were analyzed using the SAS® and SISVAR® software (p<0.05). The pathogen grew better in PDAb and PDAc, but only in BPAb there was abundant perithecia formation. All Trichoderma spp. isolates, except T68 (98%), inhibited 100% the pathogen growth on the third day of culture confront. The yeasts 161, 166, 169, 174, 165, 23 and 92 paralyzed the pathogen growth on the 11th day of evaluation. All BCAs reduced the pathogen spores germination. When applied to the leaf discs before the pathogen inoculation, all isolates inhibited to some extent the pathogen perithecia formation being the best ones among the Trichoderma spp. isolates T68 (98,5%) followed by 2927, Tc26 (94,03%) and 7CC (92,34%) ,and from the yeast, LEV170 (89,6%). In a series of combinations including the four best isolates of Trichoderma spp. (T68, 7CC, 2927 and Tc26) for similar experiment treating leaf discs, the major pathogen inhibition percentages were obtained for combinations where in the isolate T68 was present. The treatment of seeds followed by irrigation of the seedlings with BCA’s inoculum suspensions before inoculation of 5 months-old plants with the pathogen did not control the pathogen and high plant mortality occurred. Only the treatment with isolate 7CC had less number of dead plants than the inoculated control. Even when the BCAs were
applied at the wounded site of 12-monts-old cacao plants 24 hours before the pathogen inoculation, the expected efficiency of the antagonists was not demonstrated. However, in mini cuttings inoculated with the pathogen the yeasts isolates LEV034 and LEV101 had only 15 and 15.9% of dead plants, respectively, controlling better the pathogen. There was effect of isolates 7CC (T. atroviride), T68 (T. virens), Tc26 (T. koningiopsis), 2729 (T. harzianum) and LEV170 (R. paludigenum) on the germination and perithecia formation of the pathogen; and the LEV034 and LEV101 (R. paludigenum) to control ceratocystis wilt in mini cuttings of cacao. Therefore, the hypothesis of making possible the biological control of C. cacaofunesta using antagonist’s fungi is not discharged yet. Keywords: Ceratocystis cacaofunesta, biological control, Theobroma cacao, yeasts, Trichoderma spp.
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1 INTRODUÇÃO GERAL
O cacaueiro, Theobroma cacao L., é uma planta de porte arbóreo, umbrófila
e de ciclo perene pertencente à família MALVACEAE. Ocorre de forma espontânea
desde o Sul do México até a Bolívia e nas margens dos rios da Floresta
Amazônica, que se acredita ser o centro de origem desta espécie. A importância
econômica da cacauicultura deve-se, principalmente, à produção de frutos dos
quais se extraem sementes que servem como matéria-prima para a fabricação de
chocolate (MONTEIRO; AHNERT, 2012), havendo ainda utilização de subprodutos
para outros fins.
Dentre os problemas enfrentados na cacauicultura, destaca-se como uma
das mais severas enfermidades do cacaueiro, a murcha de ceratocystis ou mal do
facão, cujo agente etiológico é o fungo Ceratocystis cacaofunesta Engelbrecht &
T.C. Harrington (2005). O primeiro relato desta doença ocorreu no ano de 1918, no
Equador. No Brasil, foi constatada pela primeira vez em Rondônia, em 1978, e
posteriormente na região sul da Bahia, em 1997. Esta enfermidade destacou-se
economicamente a partir de 1995 devido ao cultivo de plantas suscetíveis à
doença, a exemplo da variedade Theobahia (OLIVEIRA; LUZ, 2012). Acredita-se
que a doença foi introduzida na Bahia juntamente com o plantio de variedades
resistentes à vassoura de bruxa (VB). Após estas introduções foram registrados os
primeiros casos da doença na Bahia.
O patógeno penetra na planta através do uso de ferramentas contaminadas
durante práticas comuns de manejo da cultura como desbrota, colheita e poda
(MARIN et al., 2003) e através do ataque de coleobrocas como as dos gêneros
Xyleborus e Xylosandrus (OLIVEIRA; LUZ, 2005).
Conforme Alarcon (1994), a murcha de ceratocystis é uma enfermidade letal
para o cacaueiro. Os sintomas externos são clorose e murcha das folhas que, por
volta de duas a quatro semanas, secam e morrem, todavia permanecem aderidas à
planta (DELGADO; SUÁREZ, 2003); no estágio mais avançado ocorre o
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escurecimento do caule ou ramo que ficam com uma coloração marrom
acastanhada e internamente a coloração castanha pode ser observada no percurso
da colonização do patógeno no sistema vascular da planta (GUERRERO, 1975).
Estudos para o controle desta enfermidade tem relatado que o controle
genético utilizando genótipos resistentes é o mais eficiente (OLIVEIRA; LUZ, 2005),
porém, o tempo para obter uma planta resistente e com características
agronômicas desejáveis é de médio a longo prazo. O método de controle químico
não tem apresentado resultados satisfatórios visto que quando se detecta a
doença, a mesma já se encontra em estágio avançado, o que torna este método
oneroso e ineficiente. Para o controle cultural, recomenda-se a eliminação das
plantas mortas, queimando-as, a fim de debelar a fonte de inóculo do fitopatógeno.
Se a doença for detectada em fases iniciais deve-se retirar a região afetada e
aplicar pasta ou calda desinfetante (ALARCON, 1994). Guerrero (1975) concluiu
que os métodos de controle químico e cultural não tem dado respostas
satisfatórias.
Ram, Valle e Freitas (2004) concluíram que práticas definidas no manejo
integrado foram eficazes para controlar e evitar a disseminação da doença. Eles
testaram manejo integrado versus testemunha relativa (sem práticas profiláticas
após a retirada de tecidos sintomáticos de uma planta) e testemunha absoluta (não
foi aplicada nenhuma medida de controle da enfermidade). O manejo integrado
incluiu: i) controle químico com mistura de fungicida e inseticida (oxido de cobre a
3% + Metamidofós a 0,5%); ii) controle cultural com erradicação de plantas mortas
e irrecuperáveis que foram amontoadas e queimadas; iii) desinfestação das
ferramentas de trabalho após poda e desbrota com solução de hipoclorito de sódio
a 1% ao passar de uma árvore para outra; iv) em plantas com sintomas iniciais da
doença foi feita uma raspagem da parte lesionada e aplicação de solução de
hipoclorito de sódio no local da raspagem + pasta de óxido de cobre a 10% +
benomyl a 1% em água. Na parcela de aplicação do manejo integrado foram
recuperadas 67% das plantas doentes em relação às testemunhas. Esta
porcentagem de controle pode ser acrescida caso outras práticas de manejo sejam
inseridas no programa. No entanto, estas práticas requerem mão de obra extra e
aumento no custo de produção.
Nesse ínterim, o controle biológico surge como uma alternativa promissora a
ser incluída em um programa de manejo integrado de doenças, visto que para
3
diversos fitopatógenos já foram encontrados inimigos naturais que os controlam
com eficácia. Este método de controle pode ser uma potencial alternativa para
minimizar os prejuízos ocasionados pelas principais doenças e pragas, por
representar uma forma de controle mais duradoura e menos agressiva ao meio
ambiente, sem danos ao ecossistema (MICHEREFF; BARROS, 2001).
Não foram encontrados relatos na literatura revisada sobre estudos para o
controle biológico de C. cacaofunesta. Porém, Ram, Valle e Freitas (2004)
constataram a associação do fungo Gliocladium sp. nas superfícies das lesões de
C. fimbriata Ellis & Halst (nome utilizado pelos autores para o agente da murcha de
ceratocystis) em troncos de cacaueiro, sem observar se havia efeito desse fungo
na inibição das lesões. Sabe-se também que espécies fúngicas pertencentes ao
gênero Trichoderma são eficientes como agentes de controle biológico para
diversos fitopatógenos como Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-
Mora (LOGUERCIO et al., 2012), Rhizoctonia solani J.G. Kühn, Sclerotium rolfsii
Sacc., Fusarium spp., Pythium spp. (FIALHO, 2004). Isolados de Trichoderma
harzianum Rifai e Gliocladium viride Matr. foram eficazes no controle de Botrytis
cinerea Pers. em cultivo do tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) em ambiente
protegido (LISBOA et al., 2007).
A utilização de leveduras no controle de patógenos tem sido pesquisada,
visto que podem ser isoladas diretamente da planta ou do solo, pois integram a
microbiota epifítica e endofítica e agem competindo por nutrientes, colonizando
ferimentos e podem até mesmo induzir resistência (MELLO et al., 2011). Estudos
de microscopia eletrônica confirmaram que as leveduras Sporidiobolus pararoseus,
Pichia spp., P. membranifaciens E.C. Hansen, P. guilliermondii Wick,
Sporobolomyces roseus Kluyver & C.B. Niel, Debaryomyces hansenii (Zopf) Lodder
& Kreger-van Rij e Rhodotorula mucilaginosa (A. Jörg.) F.C. Harrison quando
aplicadas sobre feridas na superfície de frutos de melão, colonizaram a casca,
prejudicaram o crescimento micelial de Fusarium pallidoroseum (Cooke) Sacc. e
diminuíram significativamente a podridão dos frutos do melão (TERAO et al., 2014).
Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman inibiu significativamente o
desenvolvimento de doenças pós-colheita de frutos causados por Penicillium
expansum Link (WANG et al., 2010a), Geotrichum citri-aurantii (Ferraris) E.E. Butler
(LIU et al., 2010), Alternaria alternata (Fr.) Keissl (WANG et al., 2008, 2010a, 2011)
e de Botrytis cinerea Pers. Fr. (WANG et al., 2010b). Fokkema e Meulen (1976)
4
verificaram que S. roseus, Aureobasidium pullulans (de Bary & Löwenthal) G.
Arnaud e Cryptococcus laurentii var. flavescens (Saito) Lodder & Kreger-van,
leveduras nativas da filosfera do trigo, reduziram 50% a infecção de folhas de trigo
por Septoria nodorum Berk.
Seria então viável o uso de leveduras no controle da murcha de
ceratocystis? De que forma leveduras e fungos filamentosos biocontroladores
poderiam ser utilizados para o controle desta doença? Essas indagações
conduziram ao desenvolvimento desta pesquisa. Nada foi encontrado na
bibliografia consultada sobre microrganismos antagônicos a C. cacaofunesta que
pudessem ser utilizados para o controle biológico da doença. Isto, supõe-se, deve-
se ao fato de que se trata de um patógeno vascular e de grande agressividade.
Sendo assim, buscando saber se seria possível encontrar uma alternativa de
controle através do uso de microrganismos antagônicos, realizou-se a presente
pesquisa, objetivando avaliar o antagonismo de doze espécies pertencentes ao
gênero Trichoderma e onze leveduras, extraídas do filoplano do cacaueiro, in vitro
e in vivo a Ceratocystis cacaofunesta, agente causal da murcha de ceratocystis em
cacaueiro, a fim de subsidiar o manejo sustentável na cacauicultura.
5
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Cacauicultura
O cacaueiro foi citado pela primeira vez na literatura botânica por Charles
de L’Êcluse que denominou-o como Cacao fructus. Mais tarde, em 1737 Linneus
redescreveu a espécie como Theobroma fructus. Posteriormente, em 1753, o
próprio Linneus atribuiu outro epíteto específico, ficando a espécie T. cacao L.,
designação que permanece até a atualidade (HERMÈ, 2006). “Theobroma” é uma
palavra de origem grega que significa “alimento dos deuses” (FARROW, 2005).
Segundo Farrow (2005), os maias, por volta dos anos 600 a.C.,
estabeleceram as primeiras plantações de cacau em Yucatan e na Guatemala.
Com as colheitas de cacau, esse povo que era tido como importante comerciante
na América Central, aumentou ainda mais sua riqueza. Houve uma época que as
sementes de cacau eram usadas como dinheiro e representavam riqueza
(FRANCO, 2001). Na região Sul da Bahia, as primeiras sementes de cacau
chegaram no século XVIII. Com o clima quente e úmido da região, sob a Mata
Atlântica, deu-se início ao desenvolvimento da cacauicultura baiana (FRANCO,
2001).
O cacaueiro é uma planta pertencente à família MALVACEAE. Possui porte
arbóreo, ciclo perene e é umbrófila. Esta última característica permite que as
plantas sejam cultivadas em regiões sombreadas pela mata, no tradicional sistema
“cabruca”, em que o sub-bosque da mata nativa é raleado e as árvores mais altas
são mantidas com o objetivo de sombrear o cultivo. Esse sistema contribuiu para a
conservação de várias espécies de árvores nativas nas plantações, bem como da
biodiversidade nos fragmentos florestais remanescentes (SAMBUICHI; MIELKE;
PEREIRA, 2009).
6
Uma planta de cacau chega a atingir 20 m de altura em condições silvestres,
contudo, sob condições de cultivo, a altura desejada está entre 3 e 5 m, visto que
facilita os tratos culturais. O cacaueiro ocorre de forma espontânea desde o Sul do
México até a Bolívia e nas margens dos rios da Floresta Amazônica, onde se
acredita ser seu centro de origem. Como uma típica planta tropical, o cacaueiro é
muito sensível a baixas temperaturas, razão pela qual, a maior parte das
plantações comerciais encontra-se nos trópicos, entre as latitudes 20ºN e 20ºS.
Sua importância econômica deve-se, principalmente, à produção de frutos dos
quais se extraem sementes que servem como matéria-prima para a fabricação do
chocolate (MÜLLER; VALLE, 2012).
As variedades cultivadas de cacau estão agrupadas em três complexos
genéticos: Criollo, Forastero e Trinitário. Todos os tipos possuem ampla
variabilidade, por este motivo, o reconhecimento das variedades se dá pelo
conjunto geral de características (PIRES, 2003).
Nas variedades “Criollo”, os frutos são grandes, geralmente apresentam a
casca fina e rugosa, coloração verde-escuro quando imaturos, passando para
amarelo ou alaranjado quando amadurecem. Possuem sementes grandes, de cor
branca a rósea clara, com muita polpa, dando um produto de superior qualidade
conhecido como cacau fino. As plantas e os frutos são menos resistentes ao
ataque de pragas e infecção de doenças (DIAS, 2001). O grupo “Forastero”
apresenta frutos de casca verde quando novos, que variam da forma de cabaça ao
amelonado, possuem sementes achatadas, de cor violeta intenso. Da variedade
“comum”, amplamente cultivada na zona cacaueira da Bahia, houve uma mutação,
dando origem ao cacau Catongo e cacau Almeida, que se caracterizam por
possuírem sementes brancas. O grupo “Trinitário” é um híbrido resultante do
cruzamento entre os Criollos e os Forasteros, e as variedades deste grupo
produzem sementes de coloração que varia desde o amarelo pálido até o roxo
escuro, e apresentam um produto de características morfológicas e qualidade
comercial intermediárias. Na zona cacaueira da Bahia, a CEPLAC foi a responsável
pela introdução dos clones, para os programas de melhoramento genético dos
cacaueiros baianos (MONTEIRO; AHNERT, 2012).
A cacauicultura sul baiana já passou por várias crises em sua história, seja
por limitações da tecnologia, assistência técnica, infraestrutura, baixos preços do
produto, elevação dos custos, política de crédito etc. (ROCHA, 2008). Dentre os
7
problemas enfrentados destaca-se uma das mais prejudiciais enfermidades do
cacaueiro, a vassoura de bruxa (VB), cujo agente etiológico é o fungo
Moniliophthora perniciosa. A crise provocada pela VB iniciou-se em 1989 com a
constatação da doença em território baiano (PEREIRA et al., 1989). As
consequências desta crise refletiram-se na perda de produtividade do cacau,
endividamento dos produtores e empobrecimento da população regional, intenso
êxodo rural, degradação dos recursos naturais renováveis e desvalorização
patrimonial. O nome “vassoura de bruxa” deve-se aos sintomas da doença no
cacaueiro, caracterizados pelo superbrotamento de lançamentos foliares, com
proliferação de gemas laterais e a hipertrofia dos tecidos infectados em
desenvolvimento, sobretudo os meristemáticos (OLIVEIRA; LUZ, 2005). Desde o
início da epidemia, em 1989, buscam-se maneiras de controle desta e de outras
doenças através de melhoramento genético, controle cultural, controle biológico e
manejo integrado, a fim de aumentar a produtividade e recuperar a lavoura do
cacau (ARÉVALO; RAM; VALLE, 2012).
As principais doenças do cacaueiro são a monilíase (M. roreri Cif & Paren),
que não ocorre no Brasil, a vassoura de bruxa (M. perniciosa), a podridão parda
(Phytophthora spp.), a murcha de ceratocystis (C. cacaofunesta) e a murcha de
verticillium (Verticillium dahliae Kleb.), existindo ainda outras como podridão negra
da raiz (Rosellinia spp.), podridão vermelha [Ganoderma philippii (Bres. et Henn.)
Bres.], podridão castanha da raiz [Phellinus noxius (Corner) Cunn.], podridão
branca da raiz [Rigidoporus lignosus (Klotzsch) Imazeki], podridão radicular de
mycoleptodiscus [Mycoleptodiscus terrestris (Gerd.) Ostazeski], cancro de
phytophthora (Phytophthora spp.), cancro de lasiodiplodia [Lasiodiplodia
theobromae (Pat.) Griff.], mal rosado [Erythricium salmonicolor (Berk. & Br.)
Burdsall], galha floral [Fusarium decemcellulare Brick. (teleomorfo: Albonectria
rigidiuscula (B. & Br.) Rossman & Samuels)] e antracnose [Colletotrichum
gloeosporioides Penz., (teleomorfo: Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H.
Schrenk)] (OLIVEIRA; LUZ, 2005).
O manejo integrado de doenças do cacaueiro tem ganho destaque nos
últimos anos, adequando técnicas que, em harmonia com o ambiente, reduzem a
incidência de doenças a níveis abaixo do dano econômico. Neste programa,
preconiza-se a redução da quantidade e frequência de aplicação de fungicidas e a
8
utilização de plantas tolerantes ou resistentes que é a parte fundamental do
programa. Dentre as práticas culturais, inclui-se, controle de plantas invasoras,
poda, desbrota, tratamento de restos de colheita, fertilização, bem como práticas
fitossanitárias como remoção de tecidos enfermos e tratamento de casqueiros
(ARÉVALO; RAM; VALLE, 2012). O controle biológico tem sido cada vez mais
estudado para que seja inserido neste programa de manejo, já havendo estudos
com bons resultados. Villamil, Viteri, e Villegas (2015) concluíram que Trichoderma
sp. e Bacillus sp. são potencialmente eficientes no controle biológico de M. roreri
em T. cacao em condições de campo. O fungo Paecilomyces sp. também
demonstrou um alto potencial antagônico frente a M. roreri. (CONTRERAS; RIAÑO,
2013). Hoyos et al. (2008) verificaram que Clonostachys rosea (Preuss) Mussat
tem potencial para controlar M. perniciosa e que existem outros fungos endófitos
associados às primeiras fases de crescimento das plântulas de cacau com igual
capacidade.
As pesquisas quanto ao CB estão avançadas, visto que já existe um produto
biológico registrado no Ministério da Agricultura brasileiro para utilização em
cacauais, o Tricovab®, à base do fungo T. stromaticum Samuels & Pardo-Schulth,
antagônico ao M. perniciosa. Observou-se que o T. stromaticum é capaz de
colonizar vassouras secas e frutos infectados. Mediante os resultados obtidos nas
pesquisas, em 1999 foi instalada na CEPLAC a Unidade de Biocontrole, em Ilhéus,
Bahia, com o objetivo de produzir formulações do fungo para ser distribuído aos
cacauicultores da região (LOGUERCIO et al., 2012).
2.2 Ceratocystis cacaofunesta
Ceratocystis fimbriata Ellis & Halst. (1890) foi considerado o agente
etiológico da murcha de ceratocystis em cacaueiro até o ano de 2005, quando
Engelbrecht e Harrington (2005) criaram a espécie C. cacaofunesta para designar o
agente causal da murcha de ceratocystis. O epíteto específico significa que o fungo
é funesto para o cacaueiro, causando-lhe a morte, ou seja “matador de cacau”.
Segundo a pesquisa de Engelbrecht e Harrington (2005), técnicas de biologia
molecular permitiram separar filogeneticamente C. cacaofunesta de C. fimbriata,
além de outras características como a patogenicidade ao T. cacao e a rara
produção de endoconidios doliformes. Atualmente a classificação do patógeno é a
9
seguinte: reino Fungi, filo Ascomycota, subfilo Pezizomycotina, classe
Sordariomycetes, ordem Microascales, família Ceratocystidaceae e gênero
Ceratocystis (MYCOBANK.ORG, 2016).
A doença murcha de ceratocystis, conhecida também como mal do facão,
teve sua primeira descrição feita em 1965, no Equador (ALARCON, 1994). E
posteriormente foi relatada em outros países: Colômbia, Equador, Peru, Venezuela,
Costa Rica, Guatemala, México, República Dominicana, Trinidad e Haiti
(THOROLD, 1975 apud OLIVEIRA; LUZ, 2005). No Brasil, o primeiro relato foi no
estado de Rondônia (BASTOS; EVANS, 1978), e na região sul da Bahia foi
constatada oficialmente no ano de 1997 em mudas propagadas para enxertia com
sintomas de cancro em Ilhéus (BEZERRA, 1997). No ano seguinte, a murcha de
ceratocystis foi constatada em cacaueiros adultos clonados em Ituberá (BEZERRA
et al., 1998). Esta doença foi procurada na Bahia na década de 60 por Arnaldo
Gomes de Medeiros e não foi encontrada, sendo registrada somente quando
apareceu em material clonal e seminal selecionado para resistência a VB, dede
então passou a ter importância econômica na região. Após o início da crise da
vassoura de bruxa, em 1989, passou-se a selecionar variedades resistentes a esta
doença, e como a murcha de ceratocystis não havia se manifestado na região, era
desconhecida a suscetibilidade da variedade Theobahia, resultante do cruzamento
de Scavina-6 com ICS-1, à murcha de ceratocystis (OLIVEIRA;LUZ, 2012). Há
relatos de que alguns produtores, no desespero para acabar com a VB, utilizaram
as sementes de Theobahia para formação total de plantios comerciais, o que
acarretou em vasta destruição das lavouras devido ao ataque da murcha de
ceratocystis (SANCHES, 2007).
O fungo na fase sexuada produz peritécios superficiais ou imersos no
substrato, com base globosa, de coloração marrom escura a preta, com 95 –
305 µm de largura e 100 – 275 µm de altura; o rostro é longo e retilíneo,
apresentando a mesma cor da base, possui fímbrias na extremidade, com 310 –
1010 µm de comprimento e 20 – 45 µm de largura. O ostíolo na extremidade do
rostro é marrom claro a hialino, não septado, variando de 30 a 125 µm de
comprimento. Os ascos são evanescentes. Os ascósporos em massa formam uma
massa gelatinosa na ponta do peritécio de cor creme a alaranjada, são
unicelulares, elipsoides, hialinos, com aparência de chapéu, medindo 4,5 – 6,5 µm
de comprimento; 3,5 – 5,5 µm de largura e; 3,0 – 4,0 µm de altura. Na fase
10
assexuada, endoconidióforos emergem lateralmente da hifa, dispersos ou
agrupados, com 0 – 12 septos, possuindo 40 – 295 µm de comprimento, incluindo
as células basais, e 2,0 – 8,0 µm de largura na base. Formam fiálides hialinas a
castanho claro, com 12 – 85 µm de comprimento, 2,0 – 9,0 µm de largura no meio
e 2,0 – 6,5 µm de largura na ponta. O endoconidio unicelular tem a superfície lisa,
possui formato cilíndrico com extremidades achatadas, coloração hialina a marrom
claro, apresentando 8 – 40 x 2,5 – 5,0 µm, disposto em cadeias de comprimento
variável. Aleurioconidióforos emergem lateralmente a partir da hifa, são septados e
os aleuroconídios são marrons, globosos a piriformes, medindo entre 5 – 25 x 3,5 –
11,5 µm, ocorrendo individualmente ou em cadeias curtas (ENGELBRECHT;
HARRINGTON, 2005). Os clamidósporos são terminais, catenulados, obovatos a
ovais, com paredes espessas e coloração castanha (OLIVEIRA; LUZ, 2005).
A penetração do fungo ocorre de forma indireta, e, em condições de campo,
principalmente através de cortes efetuados por ferramentas durante os tratos
culturais como colheita, poda, desbrota, enxertia etc., mas, também pode decorrer
do ataque de coleópteros, como os dos gêneros Xyleborus e Xylosandrus
(Coleóptera; Scolytidae) (OLIVEIRA; LUZ, 2005) que abrem galerias no caule da
planta, podendo levar propágulos do fungo para o interior da planta aderidos ao
corpo ou em estruturas da região frontal do abdome chamadas de micângias, de
onde já foi isolado C. fimbriata (GOITIA; ROSALES, 2001); Além disso, a serragem
acumulada no solo próximo à planta, proveniente das galerias abertas na planta
pelo inseto, pode também conter partes do fungo, em especial clamidósporos, que
serão dispersas pelo vento, chuva, animais ou até o próprio homem. É possível
ainda que nematoides e ácaros sejam agentes de disseminação (OLIVEIRA; LUZ,
2012).
A murcha de ceratocystis é uma doença vascular que se manifesta
principalmente no xilema das plantas. Apresenta como sintoma externo clorose,
seguida de murcha das folhas, devido a perda da turgidez, que secam e
apresentam leve encarquilhamento, porém permanecem aderidas à planta por volta
de duas a quatro semanas (Figura 1A). Ocorre também externamente, em um
processo mais avançado, o escurecimento do caule ou ramo que ficam com uma
coloração marrom acastanhada (Figura1B). Internamente, observa-se, a partir do
local de penetração do fungo, lesões necróticas deprimidas ou cancros de
coloração escura, estendendo-se desde a região próxima ao coleto até as
11
bifurcações dos galhos (Figura1C). Devido à tendência ascendente do xilema, o
crescimento da lesão ocorre de forma mais rápida no sentido do ápice da planta
(OLIVEIRA; LUZ, 2005). Contudo, Albelaez (1957) pontua que há uma colonização
quase uniforme também no sentido horizontal. Fungos secundários podem penetrar
oportunamente provocando variações na coloração e, às vezes, manifestando-se
em forma de estrias.
Figura 1 – Sintomas da murcha de ceratocystis em cacaueiro. Planta adulta com
folhas secas ainda aderidas (A), cancro e lesão necrótica no tronco
(B) e necrose interna atingindo o lenho (C) (Fotos: OLIVEIRA; LUZ,
2012).
O método de controle mais pesquisado no mundo para as doenças
causadas por Ceratocystis é a seleção de materiais resistentes, baseando-se no
fato de que o tipo de doença, de caráter vascular, provocada pelo fungo, é de difícil
controle através de outros métodos utilizados, principalmente o uso de produtos
químicos. Assim, isto também ocorreu em relação à cacauicultura no sul da Bahia.
Diversos materiais foram testados para resistência à murcha de ceratocystis e há
várias indicações de clones e variedades que, na Bahia, tem boas perspectivas de
plantio devido a essa característica (LUZ et al., 2013; SANCHES, 2007). Santos
(2015) selecionou 22 novas fontes de resistência a C. cacaofunesta que também
são resistentes à VB, dentre eles CP-41, CP-40, CP-55, CEPEC-2002 e HB-07. O
controle cultural é recomendado principalmente como prevenção e redução da
A
A B C
12
disseminação do fungo, através de práticas como minimização de ferimentos nas
plantas e esterilização das ferramentas com solução de hipoclorito de sódio a 1%
ao utilizar a mesma ferramenta (OLIVEIRA; LUZ, 2005); erradicação com queima
das plantas mortas; ao detectar sintomas iniciais deve-se efetuar a retirada, com
instrumento esterilizado, de toda a parte afetada com aplicação de uma pasta ou
calda desinfetante ao final (ALARCON, 1994; GUERRERO, 1975). Para esta última
recomendação é necessário que haja pessoas que conheçam bem a doença
executem inspeções frequentes, visto que quando os sintomas externos mais
notáveis começam a aparecer, a doença já se encontra em estágio avançado. O
controle químico tanto do inseto disseminador quanto do fungo tem demonstrado
ser oneroso e ineficiente, principalmente quando utilizado fungicidas de contato.
Todavia, alguns fungicidas sistêmicos tem sido testados com bons resultados em
outros países como Equador e Venezuela, a citar o tiofanato metílico e o benomil
(já não mais comercializado) (OLIVEIRA; LUZ, 2005), contudo, no Brasil não há
registro de produtos para este fungo no Ministério da Agricultura (AGROFIT, 2016).
2.3 Controle biológico
Em virtude da crescente percepção pública acerca da necessidade de
maximizar o uso da agricultura baseada nos princípios da sustentabilidade nas
relações socioambientais, lança-se mão de novas alternativas para o controle de
doenças e pragas que não utilizem ou que procurem minimizar o uso de
agrotóxicos. Dentre os métodos de controle viáveis, o controle biológico se constitui
em uma alternativa potencial dentro de um programa de manejo de doenças de
plantas (LOGUERCIO et al., 2012).
Baker e Cook (1974 apud BERGAMIN FILHO; KIMATI; AMORIM, 1995)
conceituaram controle biológico, ou biocontrole, de doenças como “a redução da
densidade de inóculo ou das atividades determinantes da doença, por um ou mais
organismos sobre um fitopatógeno ou parasita nos seus estados de atividade ou
dormência, realizada naturalmente ou através da manipulação do ambiente,
hospedeiro ou antagonista, ou pela introdução em massa de um ou mais
antagonistas”. Nove anos depois os autores reformularam este conceito, afirmando
que o controle biológico seria a diminuição do inóculo ou da atividade deletéria de
um determinado agente etiológico de uma doença por meio de um ou mais
13
organismos, acentuando que o homem teria uma participação ativa neste processo,
contudo, sem ser este organismo referido (BERGAMIN FILHO; KIMATI; AMORIM,
1995).
Os organismos utilizados no biocontrole são denominados agentes de
controle biológico (ABC), biocontroladores ou antagonistas. Os ABCs interferem
nas atividades deletérias dos patógenos, na sua sobrevivência ou podem agir
aumentando a resistência da planta hospedeira ao patógeno (AGRIOS, 2005).
Desta forma, os mecanismos por eles utilizados são: parasitismo; produção de
compostos antibióticos e enzimas extracelulares deletérios ao patógeno;
interferência nos fatores de patogenicidade; indução de resistência na planta
hospedeira; e, competição por nutrientes e nichos de colonização (HOWELL,
2003). É essencial que este antagonista sobreviva nas mesmas condições
ambientais do patógeno, apresente um padrão de antagonismo satisfatório, que
não cause danos de reflexo econômico nos cultivos agrícolas, que seja de fácil
produção e inócuo aos seres humanos e animais (FIPKE; PAZINI; ETHUR, 2015).
Mediante alguns resultados promissores de controle biológico, diversos
organismos tem sido amplamente explorados como agentes de controle de
doenças de plantas. Geralmente os antagonistas encontram-se distribuídos na
natureza e, por vezes, são adversários naturais dos patógenos. Assim, o homem
aumentando a população de antagonista, reduz a do patógeno (CORABI-ADELL,
2004).
O gênero fúngico Trichoderma tem sido vastamente estudado e utilizado no
controle biológico de uma gama de fitopatógenos (MACHADO; SILVA, 2013), bem
como algumas leveduras tem sido promissoras e eficientes biocontroladores de
doenças de plantas (VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000).
2.3.1 Trichoderma spp. como Agentes de Controle Biológico (ABC)
O gênero Trichoderma está classificado como pertencente ao reino Fungi,
filo Ascomycota, subfilo Pezizomycotina, classe Sordariomycetes, ordem
Hypocreales e família Hypocreaceae (MYCOBANK.ORG, 2016).
As espécies do gênero Trichoderma spp. tem elevado, nos últimos anos, sua
importância econômica na agricultura, uma vez que são capazes de atuar como
agentes de controle de doenças de diversas plantas cultivadas (MORANDI;
14
BETTIOL, 2009). Além de possuírem propriedades antagônicas baseadas em
mecanismos variados, outras características contribuem para sua ampla utilização,
tais como: presença em ambientes diversificados e sob condições variadas,
facilidade de cultivo e observação, crescimento rápido em diversos substratos, bem
como a importante condição de não serem patógenos de plantas superiores
(SAMUELS, 2006).
A constatação do potencial antagônico de espécies do gênero Trichoderma
foi apontada pela primeira vez em 1932, por Weindling, que sugeriu seu uso no
controle de doenças (SPIEGEL et al., 1998). No ano de 1987, como resultado de
pesquisas no Centro Nacional de Pesquisa de Fruteiras de Clima Temperado da
Embrapa, foi desenvolvido o primeiro produto comercial para controle biológico no
Brasil, tendo Trichoderma viride como ingrediente ativo para a redução da
população de Phytophthora cactorum, causador da podridão de raízes e colo de
macieira (Malus domestica Borkh.) (VALDEBENITO-SANHUEZA, 1987). Desde
então, diversos trabalhos já foram publicados utilizando diferentes espécies de
Trichoderma para biocontrole de doenças de plantas. Atualmente, espécies do
gênero Trichoderma são, reconhecidamente, os fungos agentes de biocontrole
(ABCs) mais importantes e mais estudados no Brasil e na América Latina, exibindo
variabilidade entre linhagens em relação às atividades de biocontrole (SILVA; LUZ,
2000; MORANDI; BETTIOL, 2009).
Dentro do gênero Trichoderma spp. existe uma grande variabilidade
genética, e isto contribui para que se encontre isolados com características
morfológicas e fisiológicas bastante distintas, responsáveis pelo amplo espectro de
ação antagônica do gênero (SAMUELS, 2006). Os mecanismos de ação
antagônica que podem apresentar são: parasitismo, antibiose, competição por
nutrientes e nichos de colonização, indução de defesa do hospedeiro e
modificações na rizosfera (SILVA; LUZ, 2000; MACHADO; SILVA, 2013). Algunas
cepas de Trichoderma produzem trichodermina, dermadina, suzukacilina, viridina,
alameticina e richotoxina, metabólitos que atuam também no processo de
antagonismo (VINALE et al., 2006).
O parasitismo é um tipo de interação ecológica em que um parasito
alimenta-se do hospedeiro (GALLO, 2002). Parasitas atacam hifas e estruturas de
reprodução e sobrevivência dos fitopatógenos, reduzindo os potenciais de infecção
e de produção de inóculo destes. A ação de enzimas, como quitinases, glucanases
15
e proteases, é frequente, visto que a alimentação dos fungos é por absorção a
partir da ação de enzimas secretadas (HARMAN et al., 2004). O parasitismo
realizado por Trichoderma spp. ocorre sobre diversos fungos, e um caso clássico
no cacaueiro é o de T. stromaticum sobre M. perniciosa, a partir da secreção de
quitinase, endoglucanase e amilase (LOGUERCIO et al., 2012). Fusarium
oxysporum E.F. Sm. & Swingle é controlado por T. longibrachiatum Rifai através do
enrolamento de hifas, colonização dos sítios de penetração, invasão de hifas e
crescimento intracelular (MELO, 1991). Sanchez et al. (2007) verificaram que T.
longibrachiatum apresentou parasitismo a Thielaviopsis paradoxa (De Seynes)
Höhn por meio de produção de enzimas que degradam as células do patógeno e
produção de metabólitos não voláteis. Santos et al. (2014) observaram através de
Microscopia Eletrônica de Varredura o hiperasitismo de T. harzianum, T. virens e T.
atroviride P. Karst. sobre isolados de P. palmivora, P. nicotianae Haan, P.
cinnamomi Rands e P. bisheria Abad, J.A. Abad & Louws.
Antibiose pode ser definida como a interação entre organismos em que um
ou mais metabolitos produzidos por um deles surte efeito deletério sobre o outro
(MORANDI; BETTIOL, 2009). Algumas espécies de Trichoderma produzem
metabolitos tóxicos voláteis e não volateis com ação antagônica ao fitopatógeno.
Alguns destes metabólitos são: ácido harzianico, alameticinas, tricholinas,
antibioticos, 6-pentil-pirano, massoilactona, viridinas, gliovirinas, glisopreninas e
acido heptelidico (BETTIOL, 1991).
Outro tipo de interação ecológica que ocorre com Trichoderma spp. é a
competição. Neste caso, os organismos envolvidos competem pelos nutrientes
disponíveis ou mesmo pelo espaço. A população mais adaptada tende a eliminar a
outra com o passar do tempo (GALLO, 2002). Segundo Howell (2003), a
competição é uma das principais características de isolados de Trichoderma spp.
como agentes de biocontrole, pois, no ambiente da rizosfera, em que comumente é
encontrado, existem diversos macro e microrganismos para competir com eles. Em
experimentos in vitro acontece muito esse tipo de interação que já foi observada
por diversos autores, a citar isolados de Trichoderma spp. (Tc25, Tc26, Tc35, Tc54,
291, 312, 905, 2995, ES5, ES6, ET2, T.atro, SF04 e 7CC) inibindo o crescimento
micelial de Phytophthora palmivora E.J. Butler (TOCAFUNDO, 2008); isolados de
Trichoderma spp. bloquearam o desenvolvimento de T. paradoxa (SANTOS et al.,
2012); Fusarium sp. foi inibido por isolados de Trichoderma sp. (HOFFMANN et al.,
16
2015); e o isolado TI-2 de Trichoderma spp. sobre Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de
Bary (FIPKE; PAZINI; ETHUR, 2015).
A indução dos sistemas de defesa da planta como mecanismo de agentes
de biocontrole ocorre quando as plantas tratadas com um agente indutor tem seus
mecanismos de defesa ativados, não apenas no sitio de indução como também em
locais reflexo (ROMEIRO, 1999). Amorim e Itamar (1999) constataram esta
interação utilizando isolados de T. harzianum, T. koningii Oudem e uma suspensão
de rizobactérias (Pseudomonas putida, P. fluorescens e Bacillus subtilis) em raízes
de mudas de Citrus sp., infestadas com P. parasitica e P. citrophthora (patógenos).
Silva et al. (2011) relataram promoção de crescimento e indução de resistência à
antracnose [Colletotrichum lagenarium (Pass.) Ellis & Halst.] por Trichoderma spp.
em pepineiro (Cucumis sativus L.).
Espécies de Trichoderma frequentemente são associadas às raízes e
rizosfera de plantas. São organismos avirulentos, oportunistas, com capacidade de
estabelecer relação de simbiose com plantas, colonizando as raízes por meio de
mecanismos semelhantes às micorrizas, produzindo combinações que estimulam
tanto o crescimento como os mecanismos de defesa nas plantas. Podem também
influenciar na microbiota local (HARMAN et al., 2004). Estes fungos podem
colonizar primeiro algumas camadas das raízes e estimular a resistência ao ataque
por agentes patogênicos, quer seja nas raízes, ou em outros tecidos da planta
(SAMUELS, 2006).
O Ministério da Agricultura brasileiro tem registrado e estão disponíveis para
compra e venda no mercado alguns produtos do grupo biológico em que os
ingredientes ativos são cepas de Trichoderma spp. São eles: Quality® e
Trichodermax EC® (T. asperellum) para algodão, feijão e soja; Ecotrich WP®,
Predatox® e Trichodermil SC 1306® (T. harzianum) para a cultura do feijão; e,
Tricovab® (T. stromaticum) para o cacaueiro (AGROFIT, 2016).
Trichoderma é um gênero que engloba diversas espécies com excelente
potencial de biocontrole e que podem ser utilizados na agricultura de forma
sustentável. Portanto, mais estudos acerca do potencial desses organismos como
agentes de controle biológico para fitopatógenos tornam-se necessários a fim de
haver um melhor aproveitamento dos mesmos ampliando as suas possibilidades de
uso na agricultura orgânica.
17
2.3.2 Utilização de leveduras como ABCs
Leveduras são fungos unicelulares e não se reproduzem em corpos de
frutificação, tendo o processo reprodutivo baseado em fissão binária ou brotamento
(AGRIOS, 2005). Estas espécies fúngicas integram a microbiota epifítica e
endofítica da planta, incluindo folhas, frutos, flores, caule, solo e rizosfera
(VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000). Este é um fator de vantagem, visto que são
fenotipicamente mais adaptadas aos nichos e mais hábeis na colonização e
competição por nutrientes (FIALHO, 2004).
Espécies de leveduras tem sido estudadas quanto ao potencial para controle
biológico de doenças de plantas. O antagonismo de leveduras à fitopatógenos tem
demonstrando bons resultados, especialmente no controle de patógenos que
penetram em frutos via ferimentos (DROBY et al., 2009).
As leveduras são consideradas por muitos autores como promissores
agentes de controle biológico, utilizando atributos de: competição por nutrientes,
colonização de ferimentos, parasitismo, produção de enzimas hidrolíticas,
compostos antibióticos e toxinas killer, bem como indução de resistência nas
plantas a agentes patogênicos. A competição por nutrientes e espaço é um dos
mecanismos antagônicos mais importantes desempenhados por leveduras, isto
porque elas possuem rápido processo reprodutivo e de assimilação de nutrientes
do meio (COELHO, 2013). Além das substâncias antibióticas e tóxicas, ROSA et al.
(2010) citam que os gêneros Candida e Rhodotorula podem produzir sideróforos,
compostos quelantes de íons de ferro, o que confere vantagens competitivas
especiais aos isolados que os produzem.
Sporobolomyces roseus Kluyver & C.B. Niel e algumas leveduras dos
gêneros Rhodosporidium e Rhodototula tem demonstrado um elevado potencial
como agentes de biocontrole (ALVES, 2007). Para estas leveduras, o mecanismo
mais frequentemente associado à capacidadade de controle da deterioração de
frutos pós-colheita tem sido a competição por nutrientes (ZHANG et al., 2008;
SPADARO et al., 2002), todavia, há possibilidade também de que ajam por
antibiose (FILONOW, 1998). Sugere-se que no processo de antagonismo também
está envolvida a produção de ácido rodotorulico e de β-1,3-glucanase para
Rhodotorula glutinis (Fresen.) F.C. Harrison (LIMA; MARCO; FELIX, 2000;
18
FILONOW, 1998) ou a utilização de acetato de butilo por S. roseus, um composto
que estimularia a deterioração de frutos (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002).
Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman está entre as leveduras citadas
pelo potencial de biocontrole, possuindo ampla faixa de ações contra fungos (LU et
al., 2014), sendo caracterizada, principalmente, por mecanismos de competição por
espaço e nutrientes (WANG et al., 2008, 2011), bem como por indução de
resistência (LU et al., 2013a, b). Além disso, tem-se relatado que esta levedura
apresenta grande eficácia em seu crescimento populacional e adaptação quanto à
salinidade (WANG et al., 2010a), acidez (WANG et al., 2013), e quitina (LU et al.,
2014). Zhao et al. (2008) afirmam que muitas dessas ações inibitórias de R.
paludigenum são promovidas por enzimas do grupo das β-1,3-glucanase (GLU),
fenilalanina amônioliase (PAL), peroxidase (POD), e polifenoloxidase (PPO). Tais
enzimas são estudadas na área de biocontrole de póscolheita por estarem
envolvidas na resistência a doenças de plantas. Esta levedura é comumente
testada na pós-colheita de frutos, e quando aplicada antes da colheita é capaz de
reduzir significativamente a decadência dos frutos, aumentando o tempo de
prateleira destes (LU et al., 2014). Aplicações de R. paludigenum antes da colheita
dos frutos de tangerina (Citrus reticulata Blanco cv. ponkan) reduziu
significativamente a doença, bem como a severidade desta causada por Penicillium
digitatum e Penicillium italicum (LU et al., 2013a). Lu et al. (2014) forneceram
evidências de que o tipo de controle biológico da levedura R. paludigenum sobre P.
digitatum em tangerina está relacionado com o aumento da resistência pela defesa
expressada em torno das infecções superficiais, após a inoculação devido ao
etileno e via de sinalização de mecanismos dependentes. Wang et al. (2010c)
testaram, in vitro e in vivo, R. paludigenum quanto à sua eficácia na redução do
mofo cinzento do tomate cereja, causado por Botrytis sp. e provou que este
antagonista reduziu significativamente a incidência da doença provavelmente pela
competição por nutrientes.
Também entre as leveduras mais testadas, encontram-se as do gênero
Rhodotorula, devido aos bons resultados apresentados em experimentações
(MELO, 2012). A utilização de Rhodotorula sp. proporcionou uma redução
considerável da podridão mole causada por Pectobacterium carotovorum subsp.
carotovorum (Jones) Hauben et al. em tomateiro (Solanum lycopersicum L.)
(GOMES; SILVEIRA; MARIANO, 2005). Coelho et al. (2011) concluíram que
19
Rhodotorula mucilaginosa (A. Jörg.) F.C. Harrison controlou Penicillium expansum
Link em maçãs através da competição por nutrientes. O isolado Rh1 de
Rhodotorula spp. foi eficiente no controle da podridão mole em couve chinesa em
casa de vegetação e em campo (MELLO et al., 2011). Melo (2012) constatou que
R. aurantiaca (isolado LMA1), Pichia anomala (E.C. Hansen) Kurtzman (isolado
CC-2) e R. glutinis (Fresen.) F.C. Harrison (isolado LMS) conseguiram reduzir a
severidade da mancha aquosa (causada por Acidovorax citrulli Schaad et al.) em
plântulas de meloeiro (Cumumis melo L.), e as duas primeiras espécies
mantiveram a eficiência também no tratamento de sementes. R. mucilaginosa (A.
Jörg.) F.C. Harrison e Candida oleophila Montrocher são as mais citadas leveduras
como eficientes para controle de doenças na pós-colheita de citros
(VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000).
Vários estudos tem sugerido que a levedura S. roseus atue principalmente
pelos mecanismos de competição por espaço e nutrientes, embora não se descarte
a possibilidade da eventual produção de metabólitos com atividade antifúngica
(FILONOW, 1998; JANISIEWICZ, 1996). Devido ao elevado consumo de açúcares
por S. roseus sugere-se que o antagonismo a B. cinerea seja oriundo da
competição entre esses dois fungos pelos açúcares no meio (FILONOW, 1998).
Entretanto, em lesões na superfície de frutos, competição por outros nutrientes
devem ocorrer, tal como compostos ricos em nitrogênio, presentes em muito menor
quantidade (SPADARO; GULLINO, 2002). Sporobolomyces roseus é capaz de usar
acetato de butilo, composto volátil da maçã que estimula a deterioração do fruto,
como fonte de nutrientes. Ao consumir o acetaro de butilo, S. roseus diminui a
germinação dos conídios de B. cinerea (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002). Alves
(2007) prospectou várias leveduras para o controle biológico de Penicillium
expansum em maçãs e concluiu que muitas leveduras demonstraram potencial
como agentes de biocontrole, tendo-se destacado Rhodosporidium lusitaniae,
Sporobolomyces roseus, Rhodosporidium toruloides, três leveduras de
pigmentação rosada, que apresentaram elevada capacidade de controle da
deterioração de maçãs, apresentando os valores de severidade de infecção mais
baixos.
Os estudos para encontrar e testar agentes de controle biológico a fim de
incluí-los em programas de manejo integrado tem representado um grande
progresso na agricutura, principalmente no âmbito sustentável. As investigações
20
científicas na fitopatologia avançam e, por meio de tecnologia, tem surgido
respostas-chave sobre as interações planta x ambiente x patógeno, envolvendo
genética, bioquímica, biologia e outras ciências. O objetivo desta pesquisa foi
extender o conhecimento existente sobre o biocontrole de doenças de plantas ao
manejo do fungo C. cacaofunesta, agente causal da doença murcha de
ceratocystis em cacaueiro.
21
3 CAPÍTULO 1
ANTAGONISMO DE Trichoderma spp. AO AGENTE ETIOLÓGICO DA MURCHA
DE CERATOCYSTIS EM CACAUEIRO
RESUMO
O controle biológico da murcha de ceratocystis do cacaueiro (Ceratocystis cacaofunesta) pode ser uma alternativa promissora e ainda inexplorada para este fungo. Doze isolados de Trichoderma spp. foram testados como agentes de biocontrole (ABCs) de C. cacaofunesta, avaliando-se: i) o crescimento dos fungos filamentosos em quatro meios de cultura: ágar-malte (AM), sabouraud (SAB), batata-dextrose-ágar comercializado (BDAc) e com caldo de batatas (BDAb); ii) o antagonismo através do confronto in vitro dos ABCs com o patógeno e da inibição da germinação de esporos de C. cacaofunesta pelo secretoma dos antagonistas; iii) efeito dos ABCs na formação de peritécios sobre discos de folhas inoculados com o patógeno; iv) tratamento de sementes e irrigação da rizosfera com suspensão de ABCs; v) aplicação dos ABCs sobre o ferimento no caule antes da inoculação do patógeno em mudas. O patógeno se desenvolveu melhor nos meios de cultura com batata. Todos os ABCs inibiram 100% do crescimento do patógeno no terceiro dia, exceto T68 (98%); reduziram a germinação de esporos do patógeno; e, em discos de folhas, T68, 2927, Tc26 e 7CC inibiram entre 98,5 e 92,3% a formação de peritécios do patógeno. Em combinações de ABCs, maior inibição ocorreu nos tratamentos com T68. Não se comprovou a eficiência esperada dos antagonistas nos testes com plantas de cacaueiro aos cinco ou aos 12 meses de idade quando tratadas com os antagonistas nas sementes e aplicados ao solo ou diretamente nos ferimentos 24 h antes da inoculação com o patógeno. Os isolados 7CC, T68, Tc26 e 2729, T. atroviride, T. virens, T. loningiopsis e T. harzianum são promissores como ABCs por atuarem sobre o patógeno.
Palavras-chave: mal do facão, Ceratocystis cacaofunesta, murcha de ceratocystis, controle biológico, Trichoderma.
22
3 CHAPTER 1
ANTAGONISM OF Trichoderma spp. TO THE ETIOLOGICAL AGENT OF
CERATOCYSTIS WILT IN COCOA
ABSTRACT
Biological control of ceratocystis wilt (Ceratocystis cacaofunesta) of cacao may be a promising and yet unexploited alternative for this fungus. Twelve isolates of Trichoderma spp. were tested as biocontrol agents (BCAs) of C. cacaofunesta evaluating: i) the growth of filamentous fungi in four culture media: Agar-Malt (AM), Sabouraud (SAB), commercial Potato Dextrose Agar (PDAc) and handmade Potato Dextrose Agar (PDAb); ii) the antagonism by BCAs confronting the pathogen in vitro and inhibiting the spores of C. cacaofunesta germination; iii) the antagonist effect of the BCAs secretomes on perithecia formation over leaf discs inoculated with the pathogen; iv) seeds treatment and irrigation of the soil surface with BCAs spore suspensions; v) application of BCAs on stem injury before the pathogen inoculation in cacao seedlings The fungus grew better in mediums with potato. All Trichoderma spp. isolates, except T68 (98%), inhibited 100% the pathogen growth on the third day of culture confront, reduced the pathogen spores germination; and T68, 2927, Tc26 and 7CC inhibited between 98.5 and 92.3% of the pathogen perithecia formation over the inoculated leaf disks. In combinations of BCAs, greater inhibition occurred in treatments were T68 was present. The antagonists did not control the disease as was expected when tested on five or 12 month-old cacao plants obtained of seeds treated with the antagonists and irrigated with then or applied directly to the wounds 24 hours before inoculation with the pathogen. The isolates 7CC (T. atroviride), T68 (T. virens), Tc26 (T. harzianum) and 2729 (T. loningiopsis) are promising as BCAs for acting over the pathogen. Keywords: Ceratocystis cacaofunesta, ceratocystis wilt, biocontrol, Trichoderma spp.
23
3.1 INTRODUÇÃO
O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma dicotiledônea arbórea incluída na
família MALVACEAE, nativa das florestas tropicais úmidas das Américas Central e
do Sul (MÜLLER; VALLE, 2012). Cultivado na região tropical, produz frutos para
produção de polpa e, principalmente, para utilização das sementes secas para
produção de chocolate.
A maior parte das perdas causadas por pragas e doenças em cacaueiros
são causadas por doenças fúngicas, dentre as quais se sobressaem a monilíase,
causada por Moniliophthora roreri Cif & Paren, que não ocorre no Brasil; a
vassoura de bruxa cujo agente etiológico é a M. perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-
Mora; a podridão parda decorrente do ataque de Phytophthora spp.; a murcha de
ceratocystis ocasionada pelo fungo Ceratocystis cacaofunesta Engelbr. & T.C.
Harr.; e murcha de verticillium provocada por Verticillium dahliae Kleb
(LOGUERCIO et al., 2012).
No ano de 1746 deu-se início à cacauicultura na Bahia, que passou a ser o
principal estado produtor de cacau no Brasil (GRAMACHO et al., 1992), quando
constatou-se a doença vassoura de bruxa, em 1989 (PEREIRA et al., 1989). Esta
doença causou grandes perdas, com decréscimo de mais de 60% na produção de
amêndoas secas de cacau na região (SODRÉ; MARROCOS; LEITE, 2012),
acarretando em danos socioeconômicos e ambientais (LUZ et al. 2013).
Mediante este cenário de baixa produtividade, o Centro de Pesquisas do
Cacau (Cepec), da Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (Ceplac),
investiu em pesquisas na tentativa de controlar a doença. Dentre as tecnologias
recorridas estava a implantação de variedades clonais com alta produtividade e
resistência à M. perniciosa (MONTEIRO; ANHERT, 2012). Resultantes dessa
seleção, distribuiu-se aos produtores da região variedades como a Theobahia,
resistente à vassoura de bruxa e, sem que se soubesse, suscetível à murcha de
ceratocystis. Por este motivo, esta doença causou a morte de um número
24
significativo de plantas a partir de 1995. As enxertias para clonagem e as podas
para remoção de vassouras são apontados como contribuintes para a
disseminação da doença, visto que essas práticas provocam ferimentos para a
entrada do fungo nas plantas, visto que C. cacaofunesta um patógeno de
ferimentos, havendo ainda coleobrocas como as dos gêneros Xyleborus e
Xylosandrus que podem dispersar e inocular o fungo ao penetrar em cacaueiros
(OLIVEIRA; LUZ, 2005).
Ceratocystis cacaofunesta é um patógeno que quando penetra na planta,
destrói os vasos do xilema e os raios medulares impedindo o transporte da água
absorvida pelo sistema radicular para a parte aérea da planta, resultando em
amarelecimento, murcha e leve encarquilhamento das folhas. As folhas
permanecem aderidas por volta de duas a quatro semanas após a morte da planta
(ALBUQUERQUE et al., 2005; OLIVEIRA; LUZ, 2005; ALARCON, 1994).
Por destruir o sistema vascular da planta, o controle desta enfermidade
torna-se muito difícil, porque quando os sintomas aparecem na parte aérea, a
planta já está muito comprometida (TUMURA et al., 2012). Recomenda-se, então:
i) o monitoramento constante da área cultivada, com a finalidade de detectar e
erradicar plantas mortas ou doentes, evitando a disseminação do patógeno; ii) o
controle de insetos vetores; iii) o uso de ferramentas desinfestadas em hipoclorito
de sódio a 1% durante as práticas culturais (RAM et al., 2012; OLIVEIRA et al.,
2009; ALBUQUERQUE et al., 2005). Vários autores concordam que a utilização de
materiais genéticos resistentes é o método mais eficiente e econômico para o
controle da enfermidade (SANCHEZ, 2007; SILVA et al., 2007; ALBUQUERQUE et
al., 2005; OLIVEIRA; LUZ, 2005; RAM et al., 2004).
Na literatura não foram encontrados relatos do uso de controle biológico
para a murcha de ceratocystis em cacaueiro, embora para outros fitopatógenos o
biocontrole seja recomendado. No Brasil, as espécies de antagonistas mais
testadas pertencem ao gênero Trichoderma (MORANDI; BETTIOL, 2009). Inclusive
algumas espécies de Trichoderma mostraram-se promissoras para o controle de
doenças do cacaueiro como a monilíase (VILLAMIL; VITERI; VILLEGAS, 2015;
RENE, 2003; BERNALES, 2001), a podridão parda (SANTOS et al., 2014; RENE,
2003) e a vassoura de bruxa (LOGUERCIO et al., 2012; HOYOS et al., 2008;
RENE, 2003; BERNALES, 2001).
25
Diante disso, propõe-se avaliar o antagonismo de doze isolados
pertencentes ao gênero Trichoderma, in vitro e in vivo, contra Ceratocystis
cacaofunesta, com o propósito de contribuir para o manejo integrado da murcha de
ceratocystis do cacaueiro.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Fitopatologia e na
casa de vegetação da Seção de Fitopatologia (Sefit) do Cepec (14º75’54,23 S,
39º23’11,35 W), na Ceplac, município de Ilhéus – Bahia. O clone de cacaueiro
CCN 51, susceptível ao patógeno (SILVA; PAIM; CASTRO, 2004), foi empregado
para execução dos testes in vivo.
Todos os experimentos foram repetidos, para conferir confiança aos
resultados.
3.2.1 Obtenção do Fitopatógeno e dos Agentes de Controle Biológico (ABC)
O isolado do fitopatógeno Ceratocystis cacaofunesta utilizado nos
experimentos foi o Cc20, proveniente da coleção de Ceratocystis do Cepec. Este
isolado foi escolhido por ser altamente virulento e apresentar bom crescimento em
meio de cultura e nos tecidos das plantas suscetíveis; bem como por esporular
farta e rapidamente, sendo, por isso, amplamente utilizado nas pesquisas do
Cepec.
Os isolados candidatos a antagonistas utilizados nos testes foram
Trichoderma martiale (ALF247), T. atroviride (7CC), T. longibrachiatum (Tc25), T.
koningiopsis (Tc26), T. virens (T68), T. martiale (312), T. asperellum (316), T.
pseudokoningii (854) e T. harzianum (2927) obtidos como endófitos de cacaueiro
em quatro municípios da Bahia e pertencentes à coleção do Laboratório de
Biocontrole do Cepec; T. harzianum (AR006) e T. stromaticum (Ts1092)
concernidos da coleção da Prof. Andréa Miura na Agroindústria da Universidade
Estadual de Santa Cruz (UESC); e T. virens (Pc4c1) oriundo da coleção micológica
de Feira de Santana (Quadro 1).
26
Quadro 1 – Agentes de biocontrole utilizados nos experimentos.
Isolados Espécie Local
2927 Trichoderma harzianum Arataca
7CC T. atroviride Mucugê
T68 T. virens Eunápolis
312 T. martiale Ilhéus
316 T. asperellum Ilhéus
Tc25 T. longibrachiatum Ilhéus
854 T. pseudokoningii Ilhéus
Tc26 T. koningiopsis Ilhéus
ALF 247 T. martiale Ilhéus
AR 006 T. harzianum Ilhéus
Ts1092 T. stromaticum Ilhéus
Pc4c1 T. virens Feira de Santana
3.2.2 Verificação do crescimento dos antagonistas e do patógeno em
diferentes meios de cultura
A fim de selecionar o melhor meio de cultura para o desenvolvimento das
colônias dos fungos filamentosos em meio artificial, testou-se quatro meios: ágar-
malte (AM), sabouraud-dextrose-ágar (SAB) e batata-dextrose-ágar preparado a
partir de meio desidratado comercializado (BDAc), bem como, preparado
diretamente do caldo de batata em condições de laboratório (BDAb). Foi utilizado o
meio extrato de malte da marca Himedia®; ágar Acumedia®; o meio Sabouraud da
marca DifcoTM; o meio BDA desidratado comercializado da marca Himedia®; e o
BDA preparado em laboratório a partir de caldo de batatas foi preparado com 200 g
de batata, 20 g de dextrose (Himedia®), 17 g de ágar (Acumedia®) e 1000 ml de
água destilada. Todos os meios de cultura foram preparados segundo Michereff
(2001).
Cada um dos meios de cultura foi distribuído em placas de Petri com
dimensões de aproximadamente 80 x 15 mm. Após 24 horas do meio vertido,
discos de 5 mm de cultura contendo estruturas tanto dos candidatos a antagonistas
27
quanto patógeno foram depositados no centro de cada placa de Petri. As placas
foram vedadas e incubadas em BOD, com temperatura de 28ºC, no escuro, em
delineamento inteiramente casualizado (DIC). Cada fungo foi testado nos quatro
meios, com seis repetições. A cada 24 horas media-se o diâmetro das colônias
verticalmente e horizontalmente (tomando-se a primeira leitura como parâmetro do
local para as demais), com régua milimetrada, até ser atingida uma das
extremidades da placa. Anotou-se, também, a forma e aspecto das colônias. A
comparação dos meios foi realizada através do software Sisvar® versão 5.6. O
percentual de inibição foi determinado aplicando-se a fórmula:
em que:
Pinib = percentual de inibição (%);
Test = média da testemunha;
Trat = média do tratamento.
3.2.3 Confronto dos agentes de controle biológico com o patógeno
No segundo experimento in vitro utilizou-se a técnica de cultivo pareado
(DENNIS; WEBSTER, 1971) em placas de Petri contendo o melhor meio de cultura
resultante do experimento anterior.
Para o teste com os antagonistas do gênero Trichoderma, discos de micélio
de 5 mm do antagonista e do fitopatógeno foram colocados em posição
diametralmente oposta em placas de Petri. Devido ao lento crescimento do
patógeno (Cc20), ele foi colocado três (Figura 1A), quatro (Figura 1B) e cinco
(Figura 1C) dias antes dos antagonistas nas placas de Petri. Para a testemunha
colocou-se um disco de ágar-água no lugar do disco de micélio do antagonista. As
placas foram vedadas e incubadas em BOD, com temperatura de 28ºC, no escuro,
em delineamento inteiramente casualizado (DIC), com seis replicatas por
tratamento.
28
O crescimento médio radial das colônias do patógeno a cada 24 h foi
utilizado para medir a inibição provocada pelo antagonista em função do
crescimento nas placas sem o antagonista. Foi avaliado também o tipo de reação
entre o fitopatógeno e os possíveis agentes biocontroladores segundo a
classificação de Bell et al. (1982) (Quadro 2).
Figura 1 – Repicagem dos isolados de Trichoderma spp. para confronto após três
(A), quatro (B) e cinco (C) dias do desenvolvimento das colônias de
Ceratocystis cacaofunesta.
Quadro 2 – Escala de notas para avaliação do teste de confronto direto entre antagonistas e Ceratocystis cacaofunesta (BELL et al.,1982).
Nota Descrição
1 Antagonista cresce e ocupa toda a placa de Petri
2 Antagonista cresce sobre 2/3 da placa de Petri
3 Antagonista e patógeno crescem até a metade da placa
4 Patógeno cresce sobre 2/3 da placa de Petri
5 Patógeno cresce e ocupa toda a placa de Petri
3.2.4 Avaliação do potencial dos agentes de biocontrole como inibidores da
germinação dos esporos de C. cacaofunesta
Para avaliar a inibição da germinação de esporos do patógeno, uma
suspensão de esporos de C. cacaofunesta ajustada para a concentração de
A B C
29
3x104 esporos/ml foi misturada ao secretoma dos antagonistas em cinco
proporções mais a testemunha que continha apenas o fitopatógeno.
3.2.4.1 Obtenção dos secretomas dos antagonistas
Foram preparadas suspensões de Trichoderma spp. na concentração de
1x107 esporos/ml e colocadas em meio de cultura líquido batata-dextrose. As
suspensões foram armazenadas em tubos de penicilina vedados e incubadas em
BOD, com temperatura de 28ºC, no escuro. Após sete dias, as culturas
desenvolvidas foram filtradas em gaze e papel filtro, centrifugadas a 7000 rpm por
15 minutos e retirado o sobrenadante para ser utilizado no experimento.
3.2.4.2 Obtenção da suspensão de esporos de C. cacaofunesta e testes de
germinação de esporos
A suspensão do patógeno foi preparada a partir da raspagem superficial de
colônias de C. cacaofunesta em meio BDAb, em placas após 10 dias de
crescimento e a concentração foi calibrada em hemocitômetro para 3x104
esporos/ml.
Para o teste de germinação, placas de Petri contendo ágar-água foram
divididas em seis quadrantes. Alíquotas da suspensão do patógeno e do secretoma
do antagonista, conforme as concentrações utilizadas, foram colocadas em tubos
Eppendorf de 2 ml e agitadas por 30 s manualmente e, posteriormente, colocou-se
uma alíquota de 10 µl da mistura em cada quadrante. As concentrações testadas
foram 90, 75, 50, 25, 10 e 0% do secretoma do antagonista (a testemunha foi o
tratamento 0%).
As placas foram incubadas em BOD, a 28ºC, no escuro por 6 h, quando
então se colocou uma gota de lactofenol + azul de algodão para paralisar as
atividades dos fungos. Posteriormente procedeu-se a contagem em microscópio
ótico dos esporos de C. cacaofunesta germinados e não germinados, perfazendo
um total de 100 esporos por campo, utilizando a objetiva de 10x. Posteriormente
calculou-se o percentual de inibição pela mesma fórmula do experimento 2.2. A
análise estatística foi realizada no software Sisvar® versão 5.6, realizando testes de
Scoot-knott a 5% de probabilidade para agrupamento das médias dos tratamentos.
30
3.2.5 Efeito dos biocontroladores sobre a infecção e formação de peritécios
em discos de folhas de cacaueiro
3.2.5.1 Experimento 1
A metodologia utilizada para inoculação em discos de folha com C.
cacaofunesta foi descrita por Magalhães et al. (2013) e utilizada também com
sucesso para testar resistência de cacaueiro ao patógeno (SANTOS, 2015). Folhas
de cacaueiro foram coletadas de plantas saudáveis e conduzidas ao laboratório,
onde foram sanitizadas com álcool 70%, hipoclorito de sódio 2,5% e água estéril,
respectivamente. Com o auxílio de um bisturi, fez-se um ferimento no sentido
longitudinal da nervura central, retirando a parte mais superficial (Figura 2B).
Com um cortador semiautomático, foram cortados discos de 1,5 cm de
diâmetro da folha ao longo da nervura (Figura 2A). Os discos foram imersos por
cinco minutos nas suspensões dos antagonistas com concentrações ajustadas
para 1x107 esporos/ml, obtidas de culturas com sete dias de incubação (Figura 2C)
e posteriormente arrumados com a nervura central para cima em caixas contendo
espuma umedecida com água estéril (Figura 2D), para formar uma câmara úmida e
proporcionar condições favoráveis ao desenvolvimento dos fungos.
As caixas foram fechadas e incubadas a 28ºC em BOD, no escuro por 24 h;
passado este período, ocorreu a inoculação de uma suspensão de esporos e
fragmentos de micélio com concentração ajustada para 3x104 UFC/ml, espalhando-
se uma gota de 20 µl pela nervura central do disco. Novamente, sob as mesmas
condições, incubaram-se as caixas. Os discos controle foram imersos em água
estéril 24 h antes da inoculação com o Cc20.
O experimento foi montado em DIC, com 21 tratamentos, 10 repetições de 6
unidades experimentais (cada disco de folha representa uma Unidade
Experimental, UE). Quatro dias depois da inoculação do patógeno, procedeu-se,
sob microscópio estereoscópio binocular com aumento de 400 x, a contagem do
número de peritécios formados na superfície dos discos. A análise estatística foi
realizada no software Sisvar® versão 5.6, realizando testes de Scoot-knott a 5% de
probabilidade, para agrupamento das médias.
31
Figura 2 – Corte dos discos de folhas em cortador semiautomático (A); corte
superficial na nervura central das folhas (B); discos de folhas
imersos na suspensão de um dos antagonistas (C); inoculação do
Ceratocystis cacaofunesta nos discos de folhas 24 h após a
imersão na suspensão dos antagonistas (D).
3.2.5.2 Experimento 2
Os resultados obtidos no experimento 1 motivaram a realização deste,
visando testar o efeito combinado dos quatro antagonistas que apresentaram os
melhores percentuais de inibição da formação de peritécios nos discos de folhas
quando testados de per se. Desta forma, um novo experimento com inoculação do
A B
C
D
32
patógeno em discos de folhas tratados com suspensões dos antagonistas foi
montado, entretanto, os 15 tratamentos utilizados para imersão dos discos de
folhas (Quadro 3) foram as suspensões dos quatro antagonistas sozinhos,
combinados dois a dois, três a três e os quatro juntos, volume a volume.
Quadro 3 – Tratamentos do experimento 2 para as suspensões dos antagonistas, isolados e as combinações.
Tratamentos Suspensões de isolados
T0 Testemunha (apenas patógeno) T1 T68+Tc26 T2 T68+2927 T3 T68+7CC T4 Tc26+2927 T5 Tc26+7CC T6 2927+7CC T7 T68+Tc26+2927 T8 T68+Tc26+7CC T9 T68+2927+7CC
T10 Tc26+2927+7CC T11 T68+Tc26+2927+7CC T12 T68 T13 7CC T14 Tc26 T15 2927
O experimento foi montado em DIC, com 16 tratamentos, 10 repetições de 6
unidades experimentais (cada disco de folha representa uma UE). A avaliação e
análise foram similares ao experimento 1.
3.2.6 Efeito dos antagonistas no controle da murcha de ceratocystis através
da inoculação em plantas de cacaueiro
3.2.6.1 Tratamento de sementes
As sementes de cacaueiro foram provenientes da área de produção de
sementes e da Estação Experimental Arnaldo Medeiros (ESARM) do
CEPEC/CEPLAC, bem como da Biofábrica de cacau de Ilhéus. As sementes
tiveram a mucilagem removida em peneiras com o auxílio de serragem, foram
despeletizadas e colocadas para pré-germinar em água corrente por 24 h. Após
33
este período, as sementes foram mergulhadas por 12 horas nas suspensões dos
antagonistas ajustadas para a concentração de 1x107 esporos/ml. Com a radícula
emitida, as sementes foram plantadas em sacos de 1,5 kg contendo a mistura solo
e substrato na proporção de 2:1, previamente esterilizada em autoclave durante
uma hora, por duas vezes consecutivas com intervalo de 24 h. Este experimento foi
conduzido em casa de vegetação, com delineamento em blocos casualizados
(DBC), com 14 tratamentos, sendo: 12 antagonistas, uma testemunha inoculada e
uma testemunha absoluta, nove blocos e cada bloco com cinco plantas por
tratamento (Figura 3).
Figura 3 – Mudas de cacaueiro cultivadas sob condições de
casa de vegetação na Sefit / Cepec / Ceplac.
Duas doses de 10 ml da suspensão de cada antagonista na mesma
concentração anteriormente citada foram aplicadas no solo da rizosfera das
plantas, respectivamente, aos 15 e aos 30 dias antes da inoculação do patógeno.
Estando as mudas com 5 meses de idade, procedeu-se a inoculação de 30 µl de
C. cacaofunesta [3x104 UFC/ml] no caule das plantas, conforme metodologia de
inoculação em mudas de cacaueiro (LUZ et al., 2000), em que foi feita uma incisão
com bisturi, no sentido diagonal cerca de 10 cm acima do coleto (Figura 4A). No
ferimento depositou-se uma alíquota de 30 µL do inóculo com uma pipeta
automática (Figura 4B). Abaixo da incisão colocou-se um pedaço de algodão
umedecido em água estéril e envolveu-se com fita de vedação o local de
inoculação, a fim de compor uma câmara úmida, criando condições favoráveis à
34
penetração e colonização do hospedeiro (Figura 4C). Para melhorar a aeração do
local inoculado, quarenta e oito horas após a inoculação do patógeno, o algodão e
a fita de vedação foram removidos (SILVA et. al., 2012).
Figura 4 – Incisão no caule da muda de cacaueiro (A); Inoculação do
Ceratocystis cacaofunesta no ferimento (B); Câmara úmida no
local da inoculação (C).
Vinte e dois dias depois da inoculação do fitopatógeno avaliou-se o número
de plantas mortas (NPM), e nas plantas sobreviventes a área da lesão (AL), o peso
da parte aérea (PPA) e do sistema radicular (PSR), bem como a altura (AC) e o
diâmetro das plantas (DC) 0,5 cm acima do local de inoculação. Os dados foram
analisados através dos softwares SISVAR® versão 5.6, realizando testes de Scoot-
knott a 5% de probabilidade e SAS® 1987, para os testes de Dunnett (p<0,05).
3.2.6.2 Efeito dos antagonistas quando aplicados diretamente no ferimento
realizado para inoculação do patógeno em mudas de cacaueiro
Mudas de cacaueiro seminais do clone CCN51 foram cultivadas em
condições de casa de vegetação por um ano. Faltando sete dias para completarem
12 meses, as plantas destinadas a cada um dos tratamentos (exceto a testemunha)
foram irrigadas para atingir as raízes superficiais e a rizosfera de cada uma delas
A B C
35
com 10 ml da suspensão de cada antagonista, na mesma concentração
anteriormente citada. Uma semana depois foi realizada uma incisão com o auxílio
de bisturi, no sentido diagonal descendente acima do primeiro entrenó e neste local
inoculou-se 1 ml da suspensão de cada antagonista. No dia seguinte, 20 µl de
Cc20 [3x104 UFC/ml] foi inoculado no local do ferimento e procedeu-se como
mencionado no item 2.6.1. O experimento constou de seis tratamentos, sendo T1 a
testemunha, que foi inoculada somente com o patógeno, os quatro isolados que
obtiveram individualmente melhores resultados no experimento de discos de folhas
[T2 (isolado T68), T3 (2927), T4 (Tc26) e T5 (7CC)] e o sexto (T6) aplicação
simultânea das suspensões dos quatro isolados juntos, volume a volume. Cada
tratamento possuía 12 repetições, com as plantas dispostas em DIC. A avaliação
dos mesmos parâmetros do experimento citado anteriormente foi realizada 35 dias
após a inoculação do patógeno. Os dados foram analisados através dos softwares
SISVAR® versão 5.6, realizando testes de Scoot-knott a 5% de probabilidade e
SAS® 1987, para os testes de Dunnett (p<0,05).
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1 Verificação do crescimento dos antagonistas e do patógeno em
diferentes meios de cultura
Dentre os meios de cultura artificiais testados, o BDA tanto preparado com
caldo de batatas (BDAb) como o comercializado pronto (BDAc) apresentou
estatisticamente melhor desenvolvimento do patógeno, diferindo do SAB e AM, que
foram inferiores e estatisticamente iguais pelo teste de Skoot-Knott a 5% de
probabilidade. O BDAb propiciou crescimento micelial do patógeno (isolado Cc20)
superior aos demais meios em todos os dias de avaliação até tomar toda a placa,
seguido pelo BDAc e SAB, e, aquém em todos os dias de avaliação, esteve o AM
(Figura 5).
Quanto à morfologia das colônias de C. cacaofunesta observou-se que
houve variação das culturas nos dois meios BDA testados. No meio de cultura
BDAb a formação de peritécios foi maior do que nos demais meios e isto é
importante para que se obtenha ascósporos visando o preparo de suspensões.
Houve ainda formação de micélio subsuperficial (Figura 6A), demonstrando que
36
pode ser usado para isolamento de C. cacaofunesta com maior eficiência que os
outros meios. Por este motivo, foi selecionado para crescimento do patógeno nos
demais experimentos.
Apesar de teoricamente possuírem a mesma composição e não haver
diferença significativa quanto ao desenvolvimento das colônias, observou-se
diferenças na aparência das colônias entre os dois meios a base de batata
testados. Visualmente, no BDAc as colônias pareciam um pouco menos
desenvolvidas do que no BDAb, com formação densa de micélio superficial de
coloração negro esverdeada e poucos peritécios (Figura 6B). Isto pode ter ocorrido
pelo fato de que no processo de desidratação da infusão de batata algum
composto tenha sido perdido, o que não acontece quando se utiliza o caldo de
batata fresco.
Ocorreu crescimento micelial superficial abundante no meio SAB, e as
colônias ficaram com coloração esbranquiçada (Figura 6C). No meio AM tanto
produção de micélio superficial e subsuperficial quanto de peritécios foi escassa
(Figura 6D). A observação da formação dos peritécios foi visual, atribuindo-se
notas pela quantidade de peritécios formados (Figura 6).
Para os antagonistas do gênero Trichoderma, todos os meios testados foram
eficientes e não houve diferença significativa quanto ao seu crescimento, visto que
cresceram de forma similar em todos os meios testados, tomando completamente a
superfície do meio de cultura com três a quatro dias após a repicagem.
Santos et al. (2011) constataram que o meio BDA proporcionou crescimento
mais homogêneo entre os isolados de Ceratocystis fimbriata por eles testados.
Para condições de cultivo monospórico in vitro de Chalara paradoxa, os meios AV
(aveia em flocos) e BDA em regime escuro contínuo foram os mais eficientes
(SANTOS, 2013).
A composição do meio de cultura é um dos fatores determinantes para a
quantidade e qualidade do crescimento micelial e esporulação dos microrganismos
em condições artificiais. Além dos meios de cultura, a fisiologia, temperatura e
luminosidade são fatores essenciais para estimular a esporulação (DHINGRA;
SINCLAIR, 1994). Quando um fungo cresce bem em um substrato e não em outro,
atribui-se ao envolvimento de metabólitos e nutrientes específicos e necessários
para o desenvolvimento do fungo (CARNAÚBA et al., 2006).
37
Ribeiro, Ito e Rosetto (1987) descreveram que C. fimbriata em BDAb, exibiu
desenvolvimento inicial de micélio esbranquiçado, que foi escurecendo com o
passar do tempo até ficar de coloração castanha e escura; formavam-se peritécios
negros com longo rostro e base globosa, superficiais ou parcialmente imersos e, na
sua extremidade, uma pequena gota alaranjada identificada como a massa de
ascósporos. A cultura exala um odor característico de banana madura. Na verdade,
este odor assemelha-se mais ao óleo de banana. Isto também ocorreu com C.
cacaofunesta no presente experimento.
O meio BDA é rico em carbono e composto majoritariamente de amido, e
várias fontes são utilizadas na suplementação deste meio, como frutose, maltose,
sacarose, além de glucose ou dextrose (PIMENTA NETO, 2012).
As fontes de alimentação influenciam diretamente o crescimento do fungo,
tanto na extensão linear quanto no aumento da massa celular (HOHL, 1983).
Conforme informações do fabricante (HIMEDIA, 2011), o BDAc é um meio
de utilização geral para fungos filamentosos e leveduriformes, recomendado para
contagem em placas em exame de alimentos e produtos lácteos. É rico
nutricionalmente por conter infusão de batata desidratada, o que incentiva o
crescimento fúngico e a esporulação de diversas espécies, bem como a
manutenção de certos dermatófitos possibilitando também a diferenciação da
variabilidade dos isolados em cultura com base na produção de pigmentos.
Segundo Nozaki et al. (2004), as condições que favorecem o crescimento do
fungo nem sempre são as mesmas que favorecem a esporulação, e alguns meios
de cultura propiciam melhor esporulação do que outros.
Sabouraud dextrose ágar é um meio seletivo utilizado principalmente para o
isolamento de dermatófitos, fungos e leveduras, mas também podem crescer as
bactérias filamentosas, tais como Nocardia spp. O pH deste meio é ácido (pH
próximo a 5,0) inibe o crescimento da maioria das bactérias. Este meio é composto
por digestão enzimática de caseína e tecidos de animais, que fornecem uma fonte
nutritiva de aminoácidos e compostos azotados para o crescimento de fungos e
leveduras (DIFCO™; BBL™, 2016). Como observado nos dados apresentados
(Figura 5, 6B) este meio embora tenha propiciado o crescimento superficial
abundante de C. cacaofunesta, não estimulou a sua esporulação.
38
Figura 5 – Crescimento radial das colônias de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20) em quatro meios de cultura
diferentes a cada 24 horas. SAB: sabouraud; AM: ágar-malte; BDAb: batata-dextrose-ágar preparado com
batatas e; BDAc: preparado a partir de meio desidratado comercializado.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312
Diâ
me
tro
das
co
lôn
ias
(cm
)
Tempo (horas)
SAB
AM
BDAb
BDAc
39
Figura 6 – Colônias de Ceratocystis cacaofunesta (isolado
Cc20) nos meios de cultura batata-dextrose-ágar
preparado com caldo de batatas (BDAb) (A)
meio desidratado (BDAc) (B), sabouraud (SAB)
(C) e ágar-malte (AM) (D).
3.3.2 Confronto dos agentes de controle biológico com o patógeno
No experimento de confronto entre patógeno e antagonistas observou-se
que todos os isolados de Trichoderma spp. tiveram rápido crescimento micelial, e,
inibiram o crescimento do patógeno em 100% no terceiro dia de avaliação (Figura
7), exceto o isolado T68 (T. virens) que apresentou 98% de inibição do patógeno.
Já no segundo dia de avaliação, os isolados 312 (T. martiale), 7CC (T.
atroviride), AR006 (T. harzianum), Pc4c1 (T. virens), Tc26 (T. koningiopsis) e
Ts1092 (T. stromaticum) inibiram totalmente o desenvolvimento do patógeno.
Alguns isolados, no primeiro dia de avaliação, apresentaram percentuais de
inibição negativos, visto que o crescimento do patógeno pareado foi maior que o da
A B
C D
40
testemunha, são: eles 316, 854, 2927, 7CC, ALF247, AR006, T68, Tc25, Tc26 e
Ts1092; e no segundo dia de avaliação ainda continuaram sem inibir o patógeno os
isolados: 854 e T68. Os isolados 312 e Pc4c1 foram os únicos que no primeiro dia
de avaliação já apresentaram algum nível de inibição. O isolado T68 foi o único que
não inibiu o desenvolvimento do Cc20 completamente, mas causou 98% de
inibição (Figura 8).
Não houve diferença significativa entre os dias de vantagens atribuídos ao
patógeno, pois os antagonistas inibiram o desenvolvimento das colônias de C.
cacaofunesta independente de seu tamanho inicial. Conforme a escala de Bell et
al. (1982), todos os isolados de Trichoderma se enquadram no conceito número
um, em que o antagonista cresce e ocupa toda a placa (Figura 9).
Oliveira, Silva e Santos (2013) constataram que a velocidade de crescimento
micelial dos isolados de Trichoderma spp. testados foi rápida, em três dias já
haviam tomado toda a placa de Petri e os isolados 910 (T. harzianum), 4088 (T.
longibrachyatum), 1052 (T. pseudokoningii) e 905 (T. viride) se destacaram pela
sobreposição total e rápida das colônias de C. cacaofunesta.
Bomfim (2007) concluiu que todos os isolados testados de Trichoderma spp.
apresentaram rápido crescimento micelial em BDA e com 3 dias de incubação
inibiram o desenvolvimento de Rhizopus stolonifer. Assim como Santos et al.
(2012) verificaram que todos os dez isolados de Trichoderma spp. testados inibiram
o crescimento micelial de Thielaviopsis paradoxa.
Melo (2015) mostrou que, do total de 50 isolados de Trichoderma spp.
testados, todos foram capazes de inibir, significativamente, o crescimento de P.
nicotianae, com valores de inibições que variaram de 29 a 83% no tamanho da
colônia do fitopatógeno, e acrescentou que os isolados de Trichoderma spp.
cresceram sobre o fitopatogeno.
Corrêa et al. (2011) concluíram que Trichoderma pseudokoningii (isolado
ACB-37) e T. virens (ACB-32) foram os que mais inibiram o desenvolvimento de P.
parasitica por meio do cultivo pareado e pela produção de metabólitos tóxicos ao
patógeno. Sugerindo, assim que os mecanismos responsáveis pelo antagonismo,
provavelmente, são competição e antibiose, uma vez que os mesmos não
apresentaram atividade celulolítica. Com relação a T. aureoviride (ACB-33), houve
inibição do crescimento micelial de P. parasitica, em cultivo pareado e produção de
41
enzimas capazes de degradar a celulose presente no meio de cultura, indicando a
ocorrência dos mecanismos de ação por competição, antibiose e parasitismo.
Figura 7 – Colônias de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20)
confrontadas ou não com isolados de Trichoderma spp.
Isolado Pc4c1 (A); isolado 312 (B); isolado ALF247 (C);
isolado 2927 (D); e isolado Tc26 (E) no terceiro dia de
pareamento; e testemunha aos 10 dias (F).
Souza (2013) relatou que quatro isolados de Trichoderma spp. desafiados
exerceram ação inibitória sobre o desenvolvimento de Guignardia citricarpa sem
diferenças significativas entre eles (p<0,05), obtendo entre 58% e 62% de inibição.
Os antagonistas cresceram sobre o patógeno tomando toda a placa cinco dias
após o pareamento.
Santos et al. (2013) demonstraram a eficiência de Trichoderma harzianum
no controle in vitro de Fusarium oxysporum f. sp. licopersici, agente causal da
murcha de tomateiro, iniciando o processo de inibição do patógeno a partir do
quarto dia.
A B C
D E F
42
Figura 8 – Porcentagem de inibição do crescimento de colônias de Ceratocystis
cacaofunesta (isolado Cc20) por antagonistas do gênero Trichodema.
Figura 9 – Padrão de crescimento micelial observado no confronto de
patógeno isolado Cc20 x antagonistas Trichoderma atroviride
(isolado 7CC) no primeiro (A), segundo (B) e terceiro (C) dia de
pareamento.
Santos et al. (2012), com o cultivo pareado, verificaram que todos os
isolados de Trichoderma spp. por eles testados inibiram o crescimento micelial de
T. paradoxa, anamorfo de uma espécie de Ceratocysts, C. paradoxa.
É possível que mecanismos de antagonismo iguais aos citados na literatura
consultada tenham sido utilizados pelos isolados de Trichoderma spp.
presentemente estudados, embora não tenha sido este o objetivo deste trabalho.
-40
-20
0
20
40
60
80
100P
erc
en
tual d
e in
ibiç
ão
(%
)
Isolados de Trichoderma spp.
DIA 1
DIA 2
DIA 3
A B C
43
3.3.3 Avaliação do potencial dos agentes de biocontrole como inibidores da
germinação dos esporos de C. cacaofunesta
Para avaliar-se a germinação dos esporos de C. cacaofunesta em
suspensão com os secretomas dos antagonistas em diferentes concentrações,
volume a volume, foram contados os conídios e ascósporos germinados e não
germinados. A ANOVA realizada demonstrou que houve variação significativa entre
as concentrações de secretoma utilizadas para cada isolado de Trichoderma spp.,
bem como entre isolados na mesma concentração em relação à inibição da
germinação dos esporos do patógeno.
Não foi possível estabelecer-se uma concentração padrão do secretoma
para todos os isolados, uma vez que a variação do comportamento inibidor das
concentrações usadas diferiu muito entre eles (Tabela 1). No entanto, para todos
os isolados, houve um decréscimo na inibição dos esporos do patógeno na
concentração de 90% do secretoma de Trichoderma spp., em relação à
concentração em que maior inibição foi causada por aquele determinado agente.
Todos os isolados de antagonistas inibiram, em maior ou menor
porcentagem, a germinação de esporos do patógeno. Os percentuais variaram
entre 81% com o isolado AR 006 à 10% da concentração do secretoma a 48% com
o isolado Ts1092 à 90% do secretoma do antagonista.
Na concentração de 10% de secretoma do antagonista destacaram-se os
isolados 316, Pc4C1, AR 006 e Tc26. A 25% vários isolados ficaram no grupo A e
apenas os isolados 316, 854, 7CC, ALF 247, AR 006, Pc4c1, Tc25 e Tc26 foram
estatisticamente superiores aos demais isolados testados. Os isolados 312, 2927,
T68 e Ts1092 ficaram no grupo B. Quando colocados na proporção 1:1, três grupos
foram formados, o A com o isolado 854 foi superior aos demais, o B intermediário
com isolado 316 e 73% de inibição e os demais no grupo C. Na concentração de
75% do antagonista, os isolados 312, 316, 854, 7CC, AR006 e Tc25 inibiram a
germinação de esporos do patógeno mais do que os demais. A 90% de
concentração secretomas dos antagonistas, somente Tc25 foi superior aos demais
inibindo 70% da germinação e Ts1092 com a menor inibição para esta
concentração, 48%. Os isolados AR 006, 316, Tc25 e 854 – T. harzianum, T.
asperellum, T. longibrachiatum e T. pseudokoningii, respectivamente –
44
sobressaíram-se aos demais por terem conseguido em três concentrações
diferentes, com percentuais de inibição de germinação entre 81 a 64,4%.
Os melhores percentuais de inibição para cada isolado nas seguintes
concentrações do secretoma: 312 em 75%, 316 em 10%, 854 em 50%, 2927 em
10%, 7CC em 10%, ALF 247 em 25, 50 e 75%, AR 006 em 10%, Pc4c1 em 10%,
T68 em 50%, Tc25 em 10 e 75%, Tc26 em 10% e Ts1092 em 10 e 50%.
Tabela 1 – Inibição da germinação de esporos de Ceratocystis
cacaofunesta quando tratados com seis concentrações de
secretoma dos antagonistas do gênero Trichoderma.
Isolado Concentrações do antagonista (%)
10 25 50 75 90
312 72,2 b B 55,5 b B 61 b C 73,3 a A 52 b D
316 80,2 a A 72 b A 73 b B 71,7 b A 65 c B
854 74,3 b B 68,5 b A 79,2 a A 74 b A 62 c C
2927 69,3 a B 52,8 b B 62,5 b C 58 b B 60,5 b C
7CC 72,7 a B 64,8 b A 66 b C 67,7 b A 61 b C
ALF247 49,2 b D 63 a A 62,7 a C 55,5 a B 46 b E
AR006 81 a A 69,8 b A 64,3 b C 66,5 b A 61 b C
PC4C1 77,8 a A 61,2 b A 67,3 b C 63,3 b B 64,5 b B
T68 57,3 b C 55 b B 70,2 a C 52,8 b B 51 b D
Tc25 74,5 a B 64,4 b A 68,8 b C 79,5 a A 70 b A
Tc26 76,5 a A 63,2 b A 63,5 b C 53,3 b B 57,3 b C
Ts1092 58,5 a C 50,3 b B 66,2 a C 54,5 b B 48 b E *Médias seguidas pela mesma letra, minúscula na linha e maiúscula na coluna, não diferem entre si pelo teste de Scoot-Knott (p<0,05).
Os resultados obtidos sugerem que cada isolado tem o seu melhor
desempenho em concentrações específicas, sem padronização de comportamento
quando comparados. À concentração de 90% do antagonista houve destaque
apenas para um dos isolados de antagonistas, sugerindo-se que, ao contrário do
que se concluiria, segundo a lógica, de que quanto maior a concentração do
antagonista presente, menor seria a germinação do patógeno. Porém, nenhum dos
isolados nas concentrações do secretoma testados inibiu 100% a germinação dos
esporos do patógeno.
Zivković et al. (2010) com suspensões de esporos de isolados de T.
harzianum e Gliocladium roseum contra Colletotrichum acutatum e C.
gloeosporioides, verificaram que os antagonistas inibiram de 86% e 89% a
45
germinação de conídios dos dois isolados de Colletotrichum testados. Esses dados
corroboram que T. harzianum é um bom inibidor da germinação de esporos.A
concentração de esporos do patógeno e dos antagonistas foi de 50%.
3.3.4 Efeito dos biocontroladores sobre a formação de peritécios em discos
de folhas de cacaueiro
Nas inoculações do patógeno em discos de folhas destacou-se como
biocontrolador o isolado T68 (T. virens), que causou 98,52% de inibição na
formação de peritécios pelo patógeno, seguido de 2927 e Tc26 com 94,03% e 7CC
com 92,34% (Figura 10). Os isolados 312, Pc4c1, Ts1092 e AR006 não diferiram
entre si, com percentuais de inibição entre 92,34 e 77,85%. Os isolados 316, Tc25
e ALF247 foram estatisticamente iguais, causando inibições entre 76,42 a 74,53%.
O menor percentual foi do isolado 854 com 43,49%. Todos os isolados diferiram
estatisticamente da testemunha e causaram inibições ao patógeno, conforme teste
de Skoot-Knott a 5% de probabilidade.
No experimento seguinte, visando comparar a atuação de per se de cada um
dos quatro melhores isolados de biocontroladores – T68, Tc26, 2927 e 7CC –, com
as combinações entre eles, todos os quinze tratamentos com antagonistas inibiram
a formação de peritécios de C. cacaofunesta em porcentagens entre 67 e 100%
pelo teste de Tukey (p<0,05). Três grupos foram formados com base na
porcentagem de inibição da formação de peritécios pelos tratamentos. No primeiro
grupo (a), ficaram sete tratamentos que apresentaram porcentagem de inibição
entre 96,5 e 100%, incluindo o isolado T68 (T. virens) ou ele de per se, são eles:
T68+Tc26+2927+7CC (T11) e T68+Tc26+7CC (T8) com 100% de controle (não
houve formação de peritécios na superfície da folha); T68 (T12) com 99,85%;
T68+Tc26+2927 (T7), T68+2927 (T2), T68+Tc26 (T1) e Tc26+2927 (T4). Apenas
duas das combinações envolvendo o isolado de T. virens ficaram no segundo
grupo (b), os tratamentos T9 (T68+2927+7CC) e T3 e (T68+7CC) causando
92,3 e 91,6% de inibição, respectivamente. Os tratamentos que ficaram
neste grupo [T68+2927+7CC (T9), T68+7CC (T3), Tc26 (T14), Tc26+2927+7CC
(T10), Tc26+7CC (T5), 7CC (T13) e 2927 (T15)] causaram entre 79,9 a 92,3% de
inibição na formação de peritécios. O menor percentual de inibição (66,97%) foi
46
pela combinação 2927+7CC (Figura 11). Todos os tratamentos diferiram
estatisticamente da testemunha (teste de Tukey p<0,05).
Como é possível notar pelos dados dos dois experimentos aqui apresentados,
o isolado de T. virens (T68) foi capaz de inibir sozinho acima de 99% a formação
de peritécios de C. cacaofunesta quando os discos de folhas foram imersos por
cinco minutos na suspensão de esporos do antagonista, 24 h antes da inoculação
com o patógeno. Quando em combinação com outros isolados a inibição chegou a
100%. O isolado T68 tem a habilidade de produzir alguma substância inibidora da
formação de peritécios de C. cacaofunesta ou de colonizar rapidamente a
superfície dos discos, impedindo o estabelecimento do patógeno e a sua
esporulação. Sua performance como inibidor pode ser melhorada em combinação
com outras espécies do mesmo gênero como foi demonstrado para combinação
quádrupla com isolados de T. koningiopsis (Tc26), T. harzianum (2927), T.
atroviride (7CC) ou sem o isolado de T. harzianum.
Figura 10 – Número de peritécios de Ceratocystis cacaofunesta formados após
quatro dias nos discos de folhas tratados com os antagonistas e
inoculados com o patógeno e percentagem de inibição em relação à
testemunha.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
5
10
15
20
25
30
35
Perc
entu
al
de inib
ição
Núm
ero
de p
erité
cio
s
Antagonistas
NPER
%INIB
a a a a b b
b
c
d
b b b b
a
47
Figura 11 – Número de peritécios de Ceratocystis cacaofunesta formados
após quatro dias sobre discos de folhas de cacaueiro e
percentuais de inibição provocados pela ação combinada de
antagonistas em relação à testemunha (T1= T68+Tc26; T2=
T68+2927; T3= T68+7CC; T4= Tc26+2927; T= Tc26+7CC; T6= 2927+7CC;
T7= T68+Tc26+2927; T8= T68+Tc26+7CC; T9= T68+2927+7CC; T10=
Tc26+2927+7CC; T11= T68+Tc26+2927+7CC; T12= T68; T13= 7CC; T14=
Tc26; T15= 2927).
3.3.5 Efeito dos antagonistas no controle in vivo da murcha de ceratocystis
3.3.5.1 Tratamento de sementes
No experimento de tratamento de sementes com os candidatos a
biocontroladores e posterior inoculação do patógeno no caule das plantas, em casa
de vegetação, aos 22 dias após a inoculação do patógeno, o número de plantas
mortas e com sintomas da murcha de ceratocystis já era elevado em todos os
tratamentos, à exceção da testemunha absoluta. Não houve diferença significativa
entre os tratamentos com os antagonistas testados em relação à testemunha
inoculada, exceto o isolado 7CC. Todos os tratamentos, sem exceção, diferiram da
testemunha absoluta pelo teste de Dunnett a 5% de probabilidade. Foi baixa a
porcentagem de plantas sobreviventes em todos os tratamentos, variando de 2,27
0
20
40
60
80
100
T11 T8 T12 T7 T2 T1 T4 T9 T3 T14 T10 T5 T13 T15 T6
Núm
ero
de p
erité
cio
s
Perc
entu
al
de I
nib
ição
Combinações dos isolados
% INIB
NPER
a a a a a a a b b b b b b b
c
48
a 28,21% para o tratamento com o isolado 7CC (Tabela 2). Nenhuma planta da
testemunha absoluta apresentou sintomas ou morreu (Figura 12A).
Tabela 2 – Porcentagem de plantas vivas dos tratamentos com os antagonistas ao
22º dia após a inoculação de Ceratocystis cacaofunesta em relação às
testemunhas inoculada e absoluta.
Isolado Plantas vivas (%) Comparação com as testemunhas
Absoluta Inoculada
AR006 15,56 *** 7CC 28,21 *** ***
ALF247 11,63 *** 854 7,50 *** 312 13,95 *** T68 4,76 *** 316 2,27 *** Ts1092 9,09 *** PC4C1 10,00 *** 2927 13,51 *** Tc25 12,12 *** Tc26 11,76 *** Test inoculada 0,00 *** Test absoluta 100,00
***
***Médias não diferem entre si pelo teste de Dunnett (p<0,05).
Como o número de plantas sobreviventes foi pequeno, a avaliação das
demais variáveis – área da lesão (AL), peso da parte aérea (PPA) e do sistema
radicular (PSR), altura (AC) e o diâmetro do caule das plantas (DC) – ficou
prejudicada. No entanto, para as variáveis peso do sistema radicular e peso da
parte aérea (Tabela 3), o isolado 7CC distinguiu-se estatisticamente dos demais,
apresentando valores médios de 0,86 e 4,9 g, respectivamente, porém inferiores e
distintos das médias da testemunha absoluta (1,32 e 9,02 g, respectivamente).
Em plântulas de cacaueiro aos cinco meses de idade os antagonistas
aplicados nas sementes e, posteriormente, no solo da rizosfera das plântulas 15 e
30 dias antes da inoculação com o patógeno não tiveram o efeito esperado e não
controlaram a doença como era esperado, pelo menos na concentração em que
foram testados (1 x 107 esporos/ml).
49
Para o tratamento com o isolado 7CC, 28% das plantas sobreviveram, mas
para esta porcentagem de sobrevivência não compensaria os gastos extras com o
tratamento das sementes antes do plantio.
Tabela 3 – Peso médio do sistema radicular e da parte aérea das
plantas tratadas com os antagonistas e sobreviventes
à inoculação com Ceratocystis cacaofunesta e da
testemunha absoluta.
Isolado PSR (g) PPA (g)
316 0.070889 a 0.465778 a
Ts1092 0.224444 a 1.184.667 a
T68 0.259333 a 1.520.444 a
ALF247 0.264000 a 1.848.000 a
Test inoculada 0.2553.333 a 1.876.000 a
AR006 0.294222 a 1.985.111 a
312 0.319556 a 2.299.333 a
854 0.332889 a 2.409.333 a
PC4C1 0.424444 a 2.570.444 a
2927 0.494889 a 3.073.333 a
Tc25 0.674222 a 4.016.000 a
Tc26 0.694222 a 4.120.222 a
7CC 0.867556 b 4.940.889 b
Test absoluta 1.326.667 c 9.026.667 c * Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scoot-
Knott (p<0,05).
Tocafundo et al. (2010) também não encontraram efeito dos isolados de
Trichoderma spp., testados no controle de P. palmivora em mudas de mamoeiro, e
nem ação positiva deles no crescimento das mudas tratadas em relação às plantas
testemunha que não foram tratadas com os antagonistas.
Porém, há resultados em que isolados de Trichoderma demonstraram
eficiência no controle das doenças em plantas. Venturini (2012) verificou que os
isolados 4006b (T. harzianum), 78 (Trichoderma sp.), T70 (T. harzianum) e T68 (T.
virens) propiciaram 75, 59, 53 e 47% de controle da podridão do pé (causada por
50
P. palmivora) em plântulas de mamoeiro e podem ser indicados para controle
biológico da doença.
O isolado 2995 de T.stromaticum e SF04 de T. asperellum foram
promissores no controle de P. palmivora em frutos (TOCAFUNDO, 2008). T.
harzianum, no tratamento de sementes de milho, reduziram os sintomas de
antracnose causada por Colletotrichum graminicola (HARMAN et al., 2004). Howell
(2003) observou que T. virens, foi capaz de controlar o tombamento em plântulas
de algodoeiro, causado por Rhyzopus oryzae e Pythium sp.
Segundo Oliveira e Luz (2005), os sintomas da murcha de ceratocystis, na
parte aérea da planta, são caracterizados por murcha, amarelecimento e seca de
folhas, que perdem a turgidez, pendem verticalmente, encarquilham-se, secam,
permanecendo aderidas aos ramos por algumas semanas, mesmo após a morte
aparente da planta. Este quadro sintomático foi observado nas mudas inoculadas
com C. cacaofunesta, todavia, as folhas nas plantas inoculadas não chegaram a
amarelecer, penderam verticalmente e secaram rapidamente, seguindo-se a morte
das plantas (Figura 12B, C).
Figura 12 – Plântulas de cacaueiro do experimento com tratamento de sementes:
saudáveis (A); mortas por Ceratocystis cacaofunesta (B); detalhe das
folhas murchas (C).
A B C
51
Quanto à descrição dos sintomas internos relatados por Oliveira e Luz
(2005), correspondem perfeitamente aos sintomas observados nos experimentos.
Os autores descrevem que sobre o lenho, a lesão apresenta-se com coloração
castanha estendendo-se para cima e para baixo em torno do ponto de infecção e
diminuindo em intensidade, em direção aos tecidos sadios (Figura 13).
Figura 13 – Lesão interna causada por Ceratocystis cacaofunesta em mudas de
cacaueiro inoculadas em ferimento no caule.
3.3.5.2 Tratamento de ferimentos
Como foi observado que nenhum dos tratamentos, na forma como foram
aplicados, conseguiu controlar efetivamente o desenvolvimento da doença no
experimento de tratamento de sementes de cacaueiro com ABCs – que indica que
não houve translocação do efeito antagônico para proteção do local de infecção –,
uma segunda metodologia foi testada.
O ferimento nas plantas foi realizado e tratado com os ABCs que
apresentaram melhores desempenhos nos experimentos anteriores
individualmente e combinando-os (isolados T68, 7CC, Tc26 e 2927) 24 h antes de
fazer a inoculação com o patógeno.
Como as plantas já estavam mais velhas (um ano de idade), o número de
plantas mortas foi bem inferior ao do experimento anterior, um total de 19,4% de
mortalidade, sendo que 4,16% das plantas da testemunha morreram (Tabela 4).
Nos tratamentos com os isolados 7CC (T5), 2927 (T3) e todos os isolados
combinados (T6) os percentuais de plantas mortas foram iguais aos da
52
testemunha. O isolado Tc26 (T4) obteve 5,55% e o T68 (T2) 1,38% de mortalidade.
Verificou-se que houve diferença significativa entre os tratamentos apenas quanto à
altura do caule, em que os tratamentos T2 e T4 se destacaram dos demais e
diferiram estatisticamente da testemunha. Não houve diferença significativa entre
os tratamentos e a testemunha para as demais variáveis. Entretanto, os valores da
área da lesão da testemunha foram ligeiramente maiores, assim como foram
menores do que dos tratamentos com os antagonistas para diâmetro do caule e
peso do sistema radicular embora sejam distintos estatisticamente.
Tabela 4 – Valores médios das variáveis avaliadas no tratamento com ferimentos
após 35 dias da inoculação de Ceratocystis cacaofunesta.
Tratamento PV (%) AL (cm) AC (cm) DC (mm) PPA (g) PSR (g)
1 95,84 a 2.05 a 50.94 a 6.66 a 25.21 a 5.90 a 2 95,84 a 1.80 a 54.68 a 7.28 a 30.17 a 6.75 a 3 98,62 a 0.97 a 61.98 b 7.40 a 32.99 a 7.67 a 4 95,84 a 1.52 a 55.16 a 7.05 a 25.04 a 6.25 a 5 94,45 a 0.84 a 62.49 b 7.80 a 31.22 a 7.95 a 6 95,84 a 1.68 a 50.45 a 7.40 a 28.89 a 6.54 a
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). AL: área da lesão; AC: altura do caule; DC: diâmetro do caule; PPA: peso da parte aérea; PSR: peso do sistema radicular. Tratamentos: T1= testemunha; T2= T68; T3= 2927; T4= Tc26; T5= 7CC; T6= T68+2729+Tc26+7CC.
Mediante os resultados obtidos neste experimento, indaga-se o porque de
não haver efeito antagônico ao patógeno quando inoculado via ferimento no caule,
contrariamente aos resultados obtidos com inoculação em discos de folhas. O
tempo entre tratamento com antagonistas e inoculação do patógeno pode não ter
sido adequado. Sugere-se, então, que devem ser testadas outras metodologias de
aplicação dos antagonistas in vivo para o controle biológico da murcha de
ceratocystis a fim de se demonstrar eficiência dos agentes de biocontrole conforme
foi observado nos experimentos anteriores, com destaque para a inoculação em
discos de folhas de cacaueiro.
53
4 CAPÍTULO 2
ANTAGONISMO DE LEVEDURAS AO AGENTE ETIOLÓGICO DA MURCHA DE
CERATOCYSTIS EM CACAUEIRO
RESUMO
O fungo Ceratocystis cacaofunesta causa a murcha de ceratocystis em cacaueiro, doença vascular de difícil controle. Devido à forma indireta de penetração do fungo na planta, cogita-se tratar as injúrias com agentes de biocontrole (ABCs) antes da chegada do patógeno utilizando leveduras, pois são excelentes colonizadoras de ferimentos. Objetivou-se testar o potencial antagonista de 11 leveduras isoladas do filoplano de cacaueiro contra C. cacaofunesta. Para tal avaliou-se: i) pareamento dos ABCs com o patógeno em placas de Petri; ii) inibição da germinação de esporos de C. cacaofunesta pelo secretoma dos antagonistas; iii) efeito dos ABCs na formação de peritécios em discos de folhas; iv) tratamento de sementes e irrigação do solo com ABCs antes da inoculação do patógeno em mudas; v) antagonismo em mudas estaqueadas. As leveduras 161, 166, 169, 174, 165, 23 e 92 paralisaram o crescimento do patógeno no 11º dia de avaliação. No teste de germinação, todos os ABCs reduziram a germinação de esporos do patógeno. Nos testes em discos de folhas, todos os isolados diferiram da testemunha e inibiram em algum grau a formação de peritécios. Quando as mudas tiveram as sementes e o solo da rizosfera tratados com ABCs, nenhum tratamento diferiu da testemunha inoculada e todos diferiram da testemunha absoluta. No experimento em mudas estaqueadas, os isolados LEV034 e LEV101 tiveram apenas 15 e 15,9% de plantas mortas, respectivamente, sendo superiores aos demais tratamentos. Os resultados demonstram existir possibilidade de utilizar as leveduras LEV034 and LEV101 (Rhodosporidium paludigenum) como ABCs para C. cacaofunesta, devendo ser pesquisadas melhores formas de aplicação.
Palavras-chave: Ceratocystis cacaofunesta, controle biológico, Sporobolomyces
roseus, Rhodosporidium paludigenum, Rhodototula spp.
54
4 CHAPTER 2
ANTAGONISM OF YEAST ISOLATES TO THE ETIOLOGICAL AGENT OF
CERATOCYSTIS WILT IN COCOA
SUMMARY
The fungus Ceratocystis cacaofunesta is the causal agent of ceratocystis wilt in cocoa, a vascular disease difficult to control. As the fungus penetration into cacao trees is only by injuries, there is the possibility of treating injuries with yeast as biocontrol agents (BCAs) prior to arrival of the pathogen. Yeasts are excellent wound colonizers. This study aimed to test the potential antagonist of 11 cacao phylloplane yeast isolates against C. cacaofunesta. For such antagonism is evaluated by: i) the antagonism by BCAs confronting the pathogen in vitro ii) inhibiting the spores of C. cacaofunesta germination; iii) the antagonist effect of the BCAs secretomes on perithecia formation over leaf discs inoculated with the pathogen; iv) seeds treatment and irrigation of the soil surface with BCAs spore suspensions; v) application of BCAs on stem injury before the pathogen inoculation in cacao seedlings; and vi) the yeast performance in mini cuttings inoculated with the pathogen. The yeasts 161, 166, 169, 174, 165, 23 and 92 paralyzed the pathogen growth on the 11th day of evaluation. All 11 BCAs reduced the pathogen spores germination and inhibited to some extent the perithecia formation over leaf discs inoculated with the pathogen. There was no statistic difference between the inoculated control and any of the treatments with BCAs after seedlings from seeds treated and irrigated with BCAs suspensions. However, when the mini cuttings roots were deep In BCAs suspensions and inoculated with the pathogen, the isolates LEV034 and LEV101 had only 15 and 15.9% of dead plants, respectively being better than all other treatments. It was demonstrate that there is possibility of the yeasts LEV034 and LEV101 (Rhodosporidium paludigenum) to control C. cacaofunesta. Better ways of these BCAs application should be searched. Keywords: Ceratocystis cacaofunesta, biological control, Sporobolomyces roseus, Rhodosporidium paludigenum, Rhodototula spp.
55
4.1 INTRODUÇÃO
Planta perene, arbórea, de clima tropical e nativa das margens dos rios da
bacia Amazônica (MONTEIRO; AHNERT, 2012), o cacaueiro (Theobroma cacao
L.) é cultivado desde os anos 600 a.C., pelos maias em Yucatan e na Guatemala
(FARROW, 2005).
No Brasil, a cacauicultura teve início no Estado do Pará, na segunda metade
do século XVII, quando a Carta Régia autorizava os colonizadores a cultivar
cacaueiro em suas terras (LEÃO, 2010). Na Bahia, o cultivo foi introduzido em 1746
e, em virtude das condições edafoclimáticas favoráveis, tornou-se a principal região
produtora do país e o cacau tornou-se a principal fonte de renda da região
(GRAMACHO et al., 1992).
Um dos principais fatores limitantes ao cultivo do cacaueiro é a ocorrência
de doenças. Dentre as quais se destaca a murcha de ceratocystis ou mal do facão,
causada pelo ascomiceto Ceratocystis cacaofunesta Engelbr. & T.C. Harr., citado
até 2005 como C. fimbriata. Esta enfermidade é uma doença letal, que provoca
inicialmente clorose, seguida de murcha e seca dos galhos ou de toda a planta,
dependendo do local de infecção. As folhas perdem a turgidez, pendendo
verticalmente, amarelecendo, enrolando, secando e, mesmo após a morte da
planta as folhas permanecem aderidas aos ramos por duas a quatro semanas
(OLIVEIRA; LUZ, 2005).
Este fungo possui penetração indireta, necessitando de aberturas para poder
invadir a planta. Desta forma, ferimentos ocasionados pelos tratos culturais e pela
abertura de galerias por coleobrocas são citados como vias de penetração. As
ferramentas especialmente por ocasião da poda e da desbrota podem introduzir o
patógeno nas plantas e contribuem passando propágulos do fungo de uma planta
infectada para outra sadia (SANCHES, 2007; OLIVEIRA; LUZ, 2005).
Métodos de controle desta enfermidade tem-se baseado principalmente na
utilização de plantas resistentes e manejo cultural a fim de eliminar fontes de
56
inóculo e evitar a disseminação da doença (OLIVEIRA; LUZ, 2012). Visto que o
controle químico com aplicação de fungicida protetores ou sistêmicos é oneroso e,
até o momento, não propiciou resultados plenamente satisfatórios
(ALBUQUERQUE et al., 2005). O controle biológico para esta doença ainda não foi
testado, todavia, pode representar uma alternativa viável e promissora a ser
inserida em programas de manejo da murcha de ceratocystis em cacaueiro. O
controle integrado é uma estratégia que tem sido recomendada, visto que combina
dois ou mais métodos de tratamentos, objetivando superar o desempenho e
aumentar a eficácia das técnicas alternativas existentes (FERREIRA et al., 2015).
As leveduras são fungos adequados à utilização como agentes de controle
biológico devido à sua alta capacidade de colonizar superfícies vegetais e
manterem-se viáveis durante longos períodos de tempo sob diferentes condições
ambientais (PIMENTA et al., 2009). Compondo a microbiota epifítica e endofítica de
plantas (VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000), podem ser extraídas para utilização
no controle biológico, com a vantagem de que são fenotipicamente mais adaptadas
ao meio (FIALHO, 2004). Presentes no filoplano de plantas, leveduras colonizam
as folhas desde o início de seu desenvolvimento, formando uma barreira na
superfície foliar e são responsáveis pelo controle biológico natural de diversas
doenças (FOKKEMA et al., 1979; BUCK; ANDREWS, 1999).
Sporobolomyces roseus Kluyver & C.B. Niel e algumas leveduras dos
gêneros Rhodosporidium e Rhodototula tem demonstrado um elevado potencial
como agentes de biocontrole (ALVES, 2007). Rhodosporidium paludigenum Fell &
Tallman está entre as leveduras citadas pelo potencial de biocontrole, possuindo
ampla faixa de ações contra fungos (LU et al., 2014). Também entre as leveduras
mais testadas, encontram-se as do gênero Rhodotorula, devido aos bons
resultados apresentados em experimentações (MELO, 2012). A utilização de
Rhodotorula sp. proporcionou uma redução considerável de doenças (MELO, 2012;
COELHO et al., 2011; MELLO, 2011; VALDEBENITO-SANHUEZA, 2000). Vários
estudos tem sugerido que a levedura S. roseus é uma boa antagonista à
fitopatógenos (ALVES, 2007; SPADARO; GULLINO, 2002; JANISIEWICZ;
KORSTEN, 2002; FILONOW, 1998; JANISIEWICZ, 1996).
As leveduras são testadas amplamente no controle de doenças pós-colheita
de frutos, mas não devem ficar restritas ao controle desse tipo de doença, pois,
57
devido a sua capacidade de colonizar superfícies vegetais podem atuar também
como agentes de controle biológico para patógenos de plantas.
Desta forma, objetivou-se prospectar leveduras extraídas do filoplano de
cacaueiro quanto ao antagonismo a C. cacaofunesta, a fim de oferecer novos
subsídios para o controle da murcha de ceratocystis do cacaueiro.
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Fitopatologia e na
casa de vegetação da Seção de Fitopatologia (Sefit) do Cepec (14º75’54,23 S,
39º23’11,35 W), na Ceplac, município de Ilhéus – Bahia. Todos os experimentos
foram repetidos uma vez, para assegurar confiança nos dados obtidos.
4.2.1 Obtenção do Fitopatógeno e dos Agentes de Controle Biológico
O isolado do fitopatógeno testado foi o Cc20, proveniente da coleção de
Ceratocystis do CEPEC. Este isolado foi escolhido por ser altamente virulento e
apresentar bom crescimento em meio de cultura e em partes da planta inoculadas;
e por esporular farta e rapidamente.
Os candidatos à antagonistas utilizados nos testes foram onze isolados de
leveduras extraídas de cacaueiro pelo doutorando Antônio Pimenta Neto e equipe,
em pesquisa que está em andamento no Cepec/Sefit para o controle da VB
(Quadro 1).
Quadro 1 – Leveduras utilizadas como agentes de biocontrole.
ESPÉCIE ISOLADO SUBSTRATO
Spodobolomyces roseus LEV001 Folha
Rhodosporidium paludigenum LEV023, LEV034, LEV092, LEV165, LEV166, LEV169,
LEV170, LEV174
Folha
R. paludigenum LEV101 Flor
Rhodotorula sp. LEV161 Folha
58
4.2.2 Confronto dos agentes de controle biológico com o patógeno
Para o confronto com as leveduras utilizou-se um funil de vidro para dispô-
las circundando o disco de micélio do fitopatógeno pela borda da placa de Petri
(Figura 1). Ambos, antagonista e patógeno, foram colocados no mesmo dia. O
controle continha apenas o disco de micélio do Cc20 no centro da placa. Neste
experimento testaram-se as leveduras LEV023, LEV092, LEV161, LEV165,
LEV166, LEV169, LEV170 e LEV174 (Quadro 3). As placas foram vedadas e
incubadas em BOD, com temperatura de 28ºC, no escuro, em delineamento
inteiramente casualizado (DIC), com seis replicatas por tratamento.
Figura 1 – Confronto do patógeno com uma
das leveduras antagonistas.
O crescimento médio radial das colônias do patógeno a cada 24 h foi
utilizado para medir a inibição provocada pelo antagonista em função do
crescimento nas placas sem o antagonista. O percentual de inibição foi
determinado aplicando-se a fórmula:
em que:
59
Pinib = percentual de inibição (%);
Test = média da testemunha;
Trat = média do tratamento.
4.2.3 Avaliação do potencial dos agentes de biocontrole como inibidores da
germinação dos esporos de C. cacaofunesta
Para avaliar a inibição da germinação de esporos do patógeno, a suspensão
de esporos de C. cacaofunesta foi misturada ao secretoma dos antagonistas, a fim
de que os esporos do patógeno e do antagonista não se confundissem dificultando
a avaliação.
4.2.3.1 Obtenção dos secretomas dos antagonistas
Neste experimento testaram-se oito leveduras, as mesmas do experimento
anterior. Foram preparadas suspensões de leveduras na concentração de 1x108
UFC/ml, e colocadas em meio de cultura líquido batata-dextrose. As suspensões
foram armazenadas em tubos de penicilina vedados e incubadas em BOD, com
temperatura de 28ºC, no escuro. Após o período de 48 h, as suspensões foram
filtradas em gaze e papel filtro, centrifugadas a 7000 rpm por 15 minutos e retirado
o sobrenadante para ser utilizado no experimento.
4.2.3.2 Obtenção da suspensão de esporos de C. cacaofunesta e testes de
germinação de esporos
A suspensão do patógeno foi preparada a partir da raspagem superficial de
colônias de C. cacaofunesta em meio BDAb, com placas de 10 dias de isolamento
axênico e a concentração foi calibrada em hemocitômetro para 3x104 UFC/ml.
Para o teste de germinação, placas de Petri contendo ágar-água foram
divididas em seis quadrantes. Quantidades da suspensão do patógeno e do
secretoma do antagonista, conforme as concentrações utilizadas, foram colocadas
em tubos Eppendorf de 2 ml e agitadas por 30 s manualmente e, posteriormente,
colocou-se uma alíquota de 10 µl da mistura em cada quadrante. As concentrações
testadas foram 90, 75, 50, 25, 10 e 0% do antagonista (testemunha). As placas
60
foram incubadas em BOD, a 28ºC, no escuro por 6 h, quando então se colocou
uma gota de lactofenol + azul de algodão para paralisar as atividades dos fungos.
Posteriormente procedeu-se a contagem em microscópio ótico, utilizando a objetiva
de 10x, os esporos de C. cacaofunesta germinados e não germinados, perfazendo
um total de 100 esporos por campo. Posteriormente calculou-se o percentual de
inibição pela mesma fórmula do experimento 2.2. A análise estatística foi realizada
no software Sisvar® versão 5.6, realizando testes de Scoot-knott a 5% de
probabilidade para agrupamento das médias dos tratamentos.
4.2.4 Efeito dos biocontroladores sobre a infecção e formação de peritécios
em discos de folhas de cacaueiro
A metodologia utilizada para inoculação em discos de folha com C.
cacaofunesta foi descrita por MAGALHÃES et al. (2013) e utilizada também com
sucesso para testar resistência de cacaueiro ao patógeno (SANTOS, 2015). Folhas
de cacaueiro foram coletadas de plantas saudáveis e conduzidas ao laboratório,
onde foram sanitizadas com álcool 70%, hipoclorito de sódio 2,5% e água estéril,
respectivamente. Com o auxílio de uma lâmina de aço cortante, fez-se um
ferimento no sentido longitudinal da nervura central, retirando a parte mais
superficial. Em um cortador semiautomático, foram cortados discos de 1,5 cm de
diâmetro da folha ao longo da nervura. Os discos foram imersos por cinco minutos
nas suspensões das leveduras com concentrações ajustadas para 1x108
esporos/ml, obtidas de culturas com 48 h de incubação e posteriormente
arrumados com a nervura central para cima em caixas contendo espuma
umedecida com água estéril, para formar uma câmara úmida e proporcionar
condições favoráveis ao desenvolvimento dos fungos. As caixas foram fechadas e
incubadas a 28ºC em BOD, no escuro por 24 h; passado este período, ocorreu a
inoculação do Cc20 com uma suspensão de inóculo com concentração ajustada
para 3x104 UFC/ml, arrastando-se uma a gota de 20 µl pela nervura central do
disco. Novamente, sob as mesmas condições, incubaram-se as caixas. Os discos
controle foram imersos em água estéril 24 h antes da inoculação com o Cc20.
O experimento foi montado em DIC, com 21 tratamentos, 10 repetições de 6
unidades experimentais (cada disco de folha representa uma UE). Quatro dias
depois da inoculação com o patógeno, procedeu-se, sob microscópio
61
estereoscópio binocular com aumento de 400 x, a contagem do número de
peritécios formados na superfície dos discos. A análise estatística foi realizada no
software Sisvar® versão 5.6, realizando testes de Scoot-knott a 5% de
probabilidade, para agrupamento das médias.
4.2.5 Teste de antagonismo provocado por leveduras em mudas
estaqueadas enraizadas em espuma fenólica
Estacas coletadas de cacaueiros dos clones CEPEC 2002, CCN51 e
PS1319 foram colocadas para enraizar em espuma fenólica, sendo primeiro
tratadas na base com ácido indol-butírico (AIB) e colocadas em câmara de
nebulização para manter a atmosfera saturada a 100% de umidade relativa na
superfície da folhas, por 15 segundos a cada cinco minutos entre as 6 e 18 h e 15
segundos a cada hora das 18 às 6 h do dia seguinte (SODRÉ, 2007).
Figura 2 – Mudas estaqueadas na câmara de nebulização para enraizamento.
Após 60 dias, quando notava-se a presença de raízes, as mesmas foram
cortadas rente à base da espuma fenólica com o auxílio de uma tesoura. O sistema
radicular de 18 mudas de cada clone foi imerso por 24 h na suspensão de cada
62
uma das leveduras. As suspensões de três diferentes isolados de leveduras
(LEV001, LEV034 e LEV101) foram calibradas em hemacitômetro à concentração
de 1x108 UFC/ml. O sistema radicular das testemunhas foi imerso em água
destilada esterilizada por igual período. No dia seguinte foram escorridas as
suspensões das leveduras das bandejas e os sistemas radiculares foram imersos
por 24 h em 1l da suspensão de 3x104 UFC/mL do isolado Cc20 de C.
cacaofunesta, incluindo as testemunhas (MAGALHÃES et al., 2016).
Durante todo o processo de inoculação as plantas permaneceram em
câmara úmida. O delineamento experimental consistiu de blocos casualizados
(cinco) com 30 plantas de cada um dos quatro clones, JACA, CCN 51, PS1319 e
CEPEC 2002. Cada clone foi inoculado com três as leveduras, sendo que para o
isolado 101 houve dois tratamentos: em um deles a inoculação foi realizada apenas
no sistema radicular, e no outro, além desta inoculação, foi borrifado o ABC sobre a
parte aérea de igual número de mudas. O número de plantas mortas foi avaliado e
as médias comparadas pelo teste Tukey (p<0,05) no software SAS® 1987.
4.2.6 Ação dos antagonistas no controle da murcha de ceratocystis através
da inoculação em plantas de cacaueiro
As sementes de cacaueiro foram provenientes da área de produção de
sementes e da Estação Experimental Arnaldo Medeiros (Esarm) do Cepec/Ceplac,
bem como da Biofábrica de cacau de Ilhéus. As sementes tiveram a mucilagem
removida em peneiras com o auxílio de serragem, foram despeletizadas e
colocadas para pré-germinar em água corrente por 24 h. Após este período, as
sementes foram mergulhadas por 12 horas nas suspensões das leveduras
ajustadas para a concentração de 1x108 esporos/ml. Com a radícula emitida, as
sementes foram plantadas em sacos de 1,5 kg contendo a mistura solo e substrato
na proporção de 2:1, previamente esterilizada em autoclave durante uma hora, por
duas vezes consecutivas com intervalo de 24 h. Este experimento foi conduzido em
casa de vegetação, com delineamento em blocos casualizados (DBC), com 10
tratamentos, sendo: 8 antagonistas, uma testemunha inoculada e uma testemunha
absoluta, nove blocos e cada bloco com cinco plantas por tratamento.
Duas doses de 10 ml da suspensão de cada antagonista na mesma
concentração anteriormente citada foram aplicadas no solo da rizosfera das
63
plantas, respectivamente, aos 15 e aos 30 dias antes da inoculação do patógeno.
Estando as mudas com 150 dias de idade, procedeu-se a inoculação de 30 µl de
C. cacaofunesta [3x104 UFC/ml] no caule das plantas, conforme metodologia de
inoculação em mudas de cacaueiro (LUZ et al., 2000), em que foi feita uma incisão
com bisturi, no sentido diagonal cerca de 10 cm acima do coleto. No ferimento
depositou-se uma alíquota de 30 µL do inóculo com uma pipeta automática. Abaixo
da incisão colocou-se um pedaço de algodão umedecido em água estéril e
envolveu-se com fita de vedação o local de inoculação, a fim de uma compor uma
câmara úmida, criando condições favoráveis à penetração e colonização do
hospedeiro. Para melhorar a aeração do local inoculado, quarenta e oito horas
após a inoculação do patógeno, o algodão e a fita de vedação foram removidos
(SILVA et. al., 2012).
Vinte e dois dias depois da inoculação do fitopatógeno avaliou-se o número
de plantas mortas (NPM), e nas plantas sobreviventes a área da lesão (AL), o peso
da parte aérea (PPA) e do sistema radicular (PSR), bem como a altura (AC) e o
diâmetro das plantas (DC) 0,5 cm acima do local de inoculação. Os dados foram
analisados através dos softwares SISVAR® versão 5.6, realizando testes de Scoot-
knott a 5% de probabilidade e SAS® 1987, para os testes de Dunnett (p<0,05).
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3.1 Confronto das leveduras testadas como ABCs com o patógeno
No confronto com as leveduras, dos oito isolados testados, sete LEV161,
LEV166, LEV169, LEV174, LEV165, LEV23 e LEV92 paralisaram completamente o
crescimento do patógeno no 11º dia de avaliação – ao 13º dia a testemunha (Cc20
sem confronto) tomou completamente a superfície da placa de Petri, com colônias
de aproximadamente 80 mm de diâmetro – e destas, somente LEV165 e LEV174
controlaram o desenvolvimento das colônias de C. cacaofunesta a partir do décimo
dia de avaliação (Figura 3). Todos os tratamentos foram estatisticamente iguais,
mas diferiram significativamente da testemunha.
Analisando o aspecto das colônias, observou-se menor formação de
peritécios e micélio nas colônias confrontadas quando comparadas à testemunha.
64
Algum composto, volátil ou não, inibiu o desenvolvimento tanto vegetativo quanto
reprodutivo do C. cacaofunesta (Figura 4). Sob esta perspectiva, pode-se dizer que
houve inibição satisfatória por parte das leveduras testadas como antagonistas.
Todavia, é um parâmetro subjetivo, variando com a percepção do observador.
Estes resultados corroboram os de Mello et al. (2011) afirmando que as
leveduras apresentaram baixa eficiência para controle da podridão mole
(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum). Em testes in vitro, Mello (2012)
concluiu que dos 60 isolados testados nenhum inibiu satisfatoriamente o
crescimento de Acidovorax citrulli, causador da mancha aquosa em meloeiro.
4.3.2 Avaliação do potencial de isolados de leveduras como inibidores da
germinação dos esporos de C. cacaofunesta
Todos os isolados de leveduras usadas como antagonistas inibiram, em
maior ou menor porcentagem, a germinação de esporos do patógeno. Na
avaliação, contou-se conídios e ascósporos germinados e não germinados de C.
cacaofunesta. Pode-se observar que a variação foi significativa para todos os
isolados pela comparação de médias entre linhas (Tabela 1). No entanto, não foi
possível determinar qual concentração do secretoma seria ideal, uma vez que os
resultados obtidos sugerem que cada isolado tem o seu melhor desempenho em
concentrações específicas. À concentração de 90% dos secretomas das leveduras
não foi a melhor para nenhum dos isolados e não deve ser usada em pesquisas
posteriores, pois teve ação contrária ao esperado, diminuindo e não aumentando a
inibição da germinação dos esporos do patógeno.
A porcentagem máxima de inibição em todo o experimento, 81,7% foi obtida
pelo isolado LEV169 à concentração de 75% do secretoma, enquanto a menor foi à
32% (LEV92 – concentração de 90% do secretoma). Cada isolado teve melhor
atuação em determinada concentração do secretoma com destaque para o isolado
de Rhodosporidium paludigenum (LEV169) que em todas as concentrações esteve
entre os isolados que causaram as mais altas porcentagens de inibição, variando
de 81,7 (75% do secretoma) à 70% (90% do secretoma).
65
Figura 3 – Diâmetro médio das colônias de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20) confrontadas em placas de Petri com
isolados de leveduras e da testemunha (sem confronto) durante treze dias de avaliação.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Diâ
metr
o d
a c
olô
nia
do p
ató
geno (
cm
)
Dias
LEV170
LEV169
LEV23
LEV185
LEV166
LEV161
LEV174
LEV92
TEST
165
66
Figura 4 – Colônias de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20) em confronto
com isolados de leveduras no 13º dia de avaliação. Isolado LEV92
(A); isolado LEV170 (B); testemunha (C).
Outra levedura que pode ser ressaltada é o isolado LEV170, que não foi
distinto de LEV169 para as concentrações de secretoma entre 10 a 50%, causando
inibições entre 73,3 e 76,8% da germinação de esporos de C. cacaofunesta.
Portanto, estes dois isolados de R. paludigenum, entre os testados, são os que
apresentam melhores chances de atuar como agente biocontrolador de C.
cacaofunesta, pelo menos, atuando na redução da produção e germinação dos
esporos deste importante patógeno.
As demais leveduras testadas tiveram o seu melhor desempenho a
diferentes concentrações do secretoma. O isolado LEV92 foi o que menos inibiu a
germinação do patógeno em todas as concentrações testadas, e seu melhor
percentual de inibição foi de 60% à 50% de diluição do secretoma. Este isolado
pertence à mesma espécie do LEV169 e ambos foram extraídos de folhas de
cacaueiro, demonstrando haver variação na atuação de isolados da mesma
espécie como agentes biocontroladores.
Souza et al. (2014) verificaram que as leveduras interferiram na produção de
esporos de Aspergillus ochraceus e A. carbonarius isoladas do café em duas
concentrações de suspensão de esporos dos antagonistas a 40 e 80%. Quando
Pichia burtonii foi utilizada na maior concentração, houve um melhor efeito inibitório
sobre o crescimento e a esporulação do patógeno, confrontando os resultados aqui
apresentados, visto que a maior concentração não correspondeu aos melhores
percentuais de inibição.
A B C
67
Tabela 1 – Percentual de inibição da germinação de esporos de
Ceratocystis cacaofunesta quando tratados com seis
concentrações de secretoma das leveduras.
Isolado Concentrações do antagonista (%)
10 25 50 75 90
LEV161 43,8 b C 59,7 a B 35,2 c D 56,3 a C 44,7 b E
LEV165 46,8 b C 49,3 b C 49,3 b C 68,8 a B 45 b E
LEV166 67 b B 62,5 b B 74,3 a A 68,3 b B 63 b B
LEV169 79,4 a A 70,2 c A 74,8 b A 81,7 a A 70 c A
LEV170 73,3 a A 76,8 a A 74,8 a A 57,3 b C 55 b C
LEV174 45,3 a C 53,5 a B 63,5 a B 64,5 a C 59,7 a B
LEV23 44,7 b C 58,8 a B 44,3 b C 55 a C 50 b D
LEV92 37,2 c C 43 b C 63,3 a B 60 a C 32 c F
*Médias seguidas pela mesma letra, minúscula na linha e maiúscula na coluna, não diferem entre si pelo teste de Scoot-Knott (p<0,05).
4.3.3 Efeito dos biocontroladores sobre a infecção e formação de peritécios
em discos de folhas de cacaueiro
No experimento em discos de folhas o melhor biocontrolador entre as
leveduras foi o isolado LEV170, que causou 89,7% de inibição na formação de
peritécios pelo patógeno, seguido de LEV174, LEV092, LEV165, LEV23, LEV166,
LEV161 e LEV169 que foram estatisticamente iguais, e apresentaram percentuais
de inibição entre 68,3 e 84,7% (Figura 5). Todos os tratamentos diferiram da
testemunha e causaram inibições ao patógeno.
Fokkema e Meulen (1976) utilizando folhas de trigo, obtiveram reduções de
50% na infecção causada por Septoria nodorum com a aplicação de
Sporobolomyces roseus, Aureobasidium pullulans e Cryptococcus laurentii var.
florescens, residentes na filosfera de trigo. Enquanto em cacaueiro, no presente
trabalho, o percentual de inibição do patógeno foi superior aos destes autores,
variando entre 68,3 e 89,7%, provocado pelos isolados LEV169 e LEV170,
respectivamente, da levedura R. paludigenum.
68
Figura 5 – Número de peritécios de Ceratocystis cacaofunesta e percentual de
inibição provocado pelos antagonistas.
4.3.4 Teste de antagonismo provocado por leveduras em mudas
estaqueadas enraizadas em espuma fenólica
Três isolados de leveduras (LEV034, LEV101 e LEV001) foram aplicados
nas raízes (todos) e também pulverizados na planta (LEV101) de mudas
enraizadas em espuma fenólica e inoculadas posteriormente imergindo as raízes
na suspensão de esporos e fragmentos de micélio do patógeno. Nestas condições,
LEV034 e LEV101_A (pulverizado e aplicado na raiz) foram estatisticamente
superiores aos demais tratamentos (Figura 6), com percentuais de mortalidade de
15 e 15,9%, respectivamente. Os isolados LEV001 e LEV101_B (somente aplicado
na raiz) foram semelhantes entre si, com 19,5 e 20,4% de mortes, respectivamente.
Das 113 plantas mortas, 29,2% foram da testemunha, que foi diferente dos
tratamentos pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Estes valores indicam que
houve redução da mortalidade das mudas em função do uso de leveduras.
O clone “Jaca” é resistente à murcha de ceratocystis (SILVA; PAIM;
CASTRO, 2004), por este motivo, nenhuma das plantas morreram quando
inoculadas com o patógeno, quer tenham sido tratadas com leveduras ou não.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
5
10
15
20
25
30
35
TEST LEV169 LEV161 LEV166 LEV23 LEV165 LEV174 LEV92 LEV170
Isolados
NPER
%INIB
a b b
b b b b b
c
69
Figura 6 – Porcentagem de mudas enraizadas de cacaueiro mortas por
Ceratocystis cacaofunesta mediante a presença dos isolados de
leveduras.
Em plântulas de meloeiro pulverizadas com isolados de Rhodotorula
aurantiaca e R. glutinis, não foram observados sintomas da mancha aquosa
provocada por A. citrulli, indicando 100% de controle da doença (MELO, 2012).
Elencando que a pulverização de leveduras é uma metodologia que apresenta
bons resultados de controle de patógenos, pois as mesmas colonizam a superfície
da planta e impede ou reduz o estabelecimento de patógenos, assim como ocorreu
pulverizando a planta com o isolado LEV101_A, que foi melhor do que quando
somente quando aplicado na raiz.
4.3.5 Ação ou efeito dos antagonistas no controle da murcha de ceratocystis
através da inoculação em plantas de cacaueiro
Quando aplicadas as leveduras em plantas de CCN 51 aos 150 dias de
idade em condições de casa de vegetação, houve uma grande mortalidade das
plantas em todos os tratamentos, a exceção da testemunha absoluta; na qual todas
as plantas permaneceram sadias, até o 22º dia após a inoculação, quando foi feita
a avaliação do experimento. O mesmo ocorreu nas duas replicatas do experimento,
realizadas no intervalo de sete dias. Uma da outra. Nenhum dos tratamentos diferiu
da testemunha inoculada em relação ao número e porcentagem de plantas mortas
0
2
4
6
8
10
12
14
16
LEV034 LEV101_A LEV001 LEV101_B TEST
PS1319
CEPEC2002
CCN51
JACA
a
a
ab
ab
b
70
pelo teste de Dunnett (p<0,05) e todos diferiram da testemunha absoluta. A
porcentagem de plantas vivas variaram para os tratamentos entre 6 (LEV161) e
14% (LEV92), enquanto para a testemunha inoculada e para o tratamento LEV166,
nenhuma planta sobreviveu.
É provável que as plantas ainda não estivessem no estágio de
desenvolvimento adequado para inocular, pois a luminosidade da casa de
vegetação onde foram cultivadas está aquém do que seria desejável, o que não
permite aos caules adquirirem o diâmetro necessário para suportar a inoculação
com o patógeno. Müller e Valle (2012) discutem que plântulas de cacau em
condições de câmara úmida, folhas que se desenvolvem em alta intensidade
luminosa apresentam maior capacidade fotossintética do que aquelas
desenvolvidas em baixa irradiação, refletindo no desenvolvimento de outros tecidos
da planta, a citar o espessamento do caule. Também deve-se considerar que o
clone CCN 51 é altamente suscetível ao isolado Cc20 de C. cacaofunesta e que o
método de aplicação das leveduras não permitiu que elas colonizassem os tecidos
da planta onde o patógeno foi aplicado, tecido interno.
Melo (2012) tratou sementes de meloeiro com isolados de Rhodotorula
aurantiaca e R. glutinis, o que resultou em plântulas com menor severidade dos
sintomas da macha aquosa. Contudo, entre o tratamento de sementes e a
aplicação de patógeno houve apenas seis dias de diferença, enquanto no presente
experimento a diferença foi de 150 dias, podendo este longo período entre
tratamento de sementes e inoculação do patógeno ter influenciado nos resultados.
71
5 CONCLUSÕES GERAIS
1. O melhor meio de cultura para isolamento de C. cacaofunesta é o batata-
dextrose-ágar preparado a partir de caldo de batata em laboratório.
2. Não foi possível estabelecer uma concentração padrão do secretoma que
abrangesse todos os isolados, sendo específica para cada um deles,
alcançando os melhores percentuais de inibição com concentrações entre 10 e
75%.
3. Todos os isolados de Trichoderma controlaram o desenvolvimento do patógeno
satisfatoriamente em confronto direto. As leveduras não inibiram o crescimento
radial das colônias, mas, não houve formação abundante de micélio e
peritécios do patógeno nos tratamentos quando comparados com a
testemunha.
4. É possível encontrar um agente biocontrolador efetivo para C. cacaofunesta
dentre as espécies de Trichoderma testadas, especialmente os isolados 7CC
(T. atroviride), T68 (T. virens), Tc26 (T. koningiopsis) e 2729 (T. harzianum).
5. As leveduras Rhodosporidium paludigenum isolados LEV034 e LEV101 são
promissoras como agentes de controle biológico da murcha de ceratocystis.
6. As metodologias utilizadas para teste em mudas não apresentaram bons
resultados, devendo-se testar outras metodologias para inoculação em mudas
e plantas de cacaueiro, a fim de definir o modo de ação dos antagonistas nas
plantas.
72
REFERÊNCIAS
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