UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ - UESC

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL - PPGPV

MATHEUS DE CARVALHO SILVA

RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE LARANJEIRA ‘VALENCIA’ SOB DIFERENTES

PORTA-ENXERTOS CÍTRICOS EM FUNÇÃO DA VARIAÇÃO DA UMIDADE DO

SOLO

ILHÉUS - BAHIA

2018

MATHEUS DE CARVALHO SILVA

RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE LARANJEIRA ‘VALENCIA’ SOB DIFERENTES

PORTA-ENXERTOS CÍTRICOS EM FUNÇÃO DA VARIAÇÃO DA UMIDADE DO

SOLO

Tese apresentada à Universidade

Estadual de Santa Cruz, como parte

das exigências para a obtenção do

título de Doutor em Produção Vegetal.

Linha de pesquisa: Melhoramento de

Plantas e Biotecnologia

Orientador: Prof. Dr. Marcio Gilberto

Cardoso Costa

Co-orientador: Prof. Dr. Alex-Alan

Furtado de Almeida

ILHÉUS - BAHIA

2018

MATHEUS DE CARVALHO SILVA

RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE LARANJEIRA ‘VALENCIA’ SOB DIFERENTES

PORTA-ENXERTOS CÍTRICOS EM FUNÇÃO DA VARIAÇÃO DA UMIDADE DO

SOLO

Tese apresentada à Universidade

Estadual de Santa Cruz, como parte

das exigências para a obtenção do

título de Doutor em Produção Vegetal.

Ilhéus-BA, 23 de fevereiro de 2018.

__________________________________________________ Prof. Dr. Marcio Gilberto C. Costa

UESC/DCB (Orientador)

___________________________________________________ Prof. Dr. Arlicélio Q. Paiva

UESC/DCAA

____________________________________________________ Prof. Dr. Marcelo S. Mielke

UESC/DCB

____________________________________________________ Profª. Drª. Ivanildes C. dos Santos

UESC/DCB

__________________________________________________ Prof. Dr. Rogério Ferreira Ribas

(UFRB)

DEDICATÓRIA

Dedico a Andressa Rodrigues de Oliveira Sousa pela sua amizade e apoio dado nos

trabalhos desenvolvidos durante o doutorado. Você tornou minha temporada em

Cruz das Almas muito mais agradável e produtiva.

AGRADECIMENTOS

Ao meu Senhor e Salvador Jesus Cristo, a quem dou toda honra e toda a glória.

Grato sou a Ti por todas as conquistas alcançadas.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcio Gilberto Cardoso Costa, pela orientação dada,

confiança e paciência nessa longa jornada durante o doutorado.

Ao pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura, Dr. Maurício Antonio Coelho

Filho, pela sua orientação e dedicação nos trabalhos desenvolvidos por mim nessa

instituição de pesquisa.

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida, pelo apoio nos

momentos solicitados.

A Andressa Rodrigues de Oliveira Sousa e Elaine da Silva Cruz, pela amizade e

apoio dado nos trabalhos desenvolvidos. Essa vitória é nossa. Muito Obrigado!

A Universidade Estadual de Santa Cruz e ao Programa de Pós-Graduação em

Produção Vegetal pela infraestrutura e oportunidade oferecida.

A Embrapa Mandioca e Fruticultura por ceder sua estrutura e equipe, tornando-se

possível a realização dos experimentos de pesquisa.

A Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado da Bahia, pela concessão da bolsa de

estudo, permitindo me dedicar de forma exclusiva nos trabalhos de pesquisa

científica.

Ao pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura, Dr. Abelmon da Silva Gesteira,

pela orientação e amizade.

Ao grupo do Laboratório de Ecofisiologia Vegetal da Embrapa Mandioca e

Fruticultura, pelos momentos alegres vividos juntos. Sentirei falta de vocês!

A Jair, Reinaldo, Jorge e Tibério, pelo amizade e suporte dado nos experimentos.

Ao Sr. Santana, pelo seu conhecimento, paciência e disponibilidade em atender os

pedidos solicitados.

Ao aluno de iniciação ciêntífica, Wilson Amorin, pelo auxílio dado nos experimentos

realizados. Sua ajuda foi fundamental!

As alunas de iniciação científica, Liziane Marques e Alana Batista, por sempre dizer

sim quando solicitava ajuda.

A minha mãe Neuza de Carvalho Silva e meus irmãos Arquiminio Bomfim da Silva

Neto e Fabiana de Carvalho Silva, por apoiar e acreditar nas minhas escolhas.

A Geraldo Ferreira da Silva e Maria das Graças da Silva, ao ensinarem o valor do

conhecimento e a importância de estudar.

Aos meus amigos que me apoiaram de forma direta e indireta na conquista desse

título. São eles: Roseli Nogueira Cellos, Marcio de Paiva Carneiro, Patrícia Santos,

Marina Santos, Nelson Santos, Alessana Schlichting, Sidnéia Leite, Marcos

Fernandes, Odarcina Chaves, Ilná Carvalho

SUMÁRIO

RESUMO..................................................................................................................... 9

ABSTRACT ............................................................................................................... 11

1 Introdução ............................................................................................................. 13

2 Objetivos ................................................................................................................ 16

2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 16

2.1 Objetivos Específicos ....................................................................................... 16

3 Revisão Bibliográfica ........................................................................................... 17

3.1 Aspectos Gerais da Citricultura ........................................................................ 17

3.2 Deficiência Hídrica em Citros ........................................................................... 19

3.3 Respostas ao Déficit Hídrico ............................................................................ 21

3.3.1 Fisiológicas ................................................................................................ 21

3.3.2 Bioquímicas e Moleculares ........................................................................ 23

3.4 Melhoramento Genético ................................................................................... 25

4 Material e Métodos ............................................................................................... 27

4.1 Experimento I ................................................................................................... 27

4.2 Experimento II .................................................................................................. 28

4.2.1 Material vegetal e condições experimentais .............................................. 28

4.2.2 Relação entre Transpiração Relativa e Fração de Água Transpirável ....... 32

4.2.3 Potencial Hídrico Foliar (L) ...................................................................... 33

4.2.4 Potencial de Turgor (p) ............................................................................ 33

4.2.5 Teor Relativo de Água (RWC) na Folha .................................................... 34

4.2.6 Fluorescência da Clorofila a ...................................................................... 34

4.2.7 Trocas Gasosas Foliares ........................................................................... 35

4.2.8 Eficiência de Uso da Água ......................................................................... 35

4.2.9 Parâmetros da Curva Pressão-Volume (PV) em Folhas ............................ 35

4.2.10 Potencial Osmótico () .......................................................................... 36

4.2.11 Atividade da Dismutase do Superóxido (SOD) ........................................ 36

4.2.12 Atividade da Peroxidase do Guaiacol (GPX) .......................................... 37

4.2.13 Extração de RNA e Síntese de cDNA ..................................................... 37

4.2.14 Análise de PCR em Tempo Real (qRT-PCR) ......................................... 38

4.2.15 Análise Estatística .................................................................................... 39

5 Resultados ............................................................................................................ 40

Experimento I ......................................................................................................... 40

Experimento II ........................................................................................................ 47

6 Discussão ............................................................................................................. 62

Experimento I ......................................................................................................... 62

Experimento II ........................................................................................................ 66

7 Conclusão ............................................................................................................. 74

8 Referência Bibliográfica ...................................................................................... 75

RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE LARANJEIRA ‘VALENCIA’ SOB DIFERENTES

PORTA-ENXERTOS CÍTRICOS EM FUNÇÃO DA VARIAÇÃO DA UMIDADE DO

SOLO

RESUMO

A seca é um dos fatores abióticos mais ameaçadores para o cultivo dos citros no

mundo. O uso de porta-enxertos pode contribuir para a tolerância da variedade copa

ao déficit hídrico, além de favorecer outros traços horticulturais, como maior

eficiência de produção e qualidade de frutos. O presente estudo objetivou avaliar,

em condições controladas, as respostas fisiológicas de quatro novos porta-enxertos

híbridos com reconhecido potencial de tolerância à seca e eficiência produtiva sob

condições de campo, visando identificar as respostas comuns e divergentes

associadas com a indução da tolerância à seca em citros. Os híbridos investigados

foram: ‘LCR x TR - 001’, ‘TSKC x CTSW - 041’, ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ e ‘HTR -

069’. O primeiro experimento foi conduzido em fitotron, em que plantas pé-franco de

origem nucelar, com 140 dias de idade, foram submetidas aos tratamentos controle

(irrigado) e estresse hídrico (suspensão da irrigação), e diversas variáveis

fisiológicas foram analisadas ao longo de 48 dias após imposição dos tratamentos.

O segundo experimento foi conduzido em casa de vegetação, em que plantas dos

híbridos citados, com aproximadamente 1 ano de idade, enxertadas com a copa de

laranjeira ‘Valencia’ (Citrus sinensis L. Osb.), foram submetidas a cinco diferentes

regimes hídricos (controle, estresse leve, estresse moderado, estresse severo e

reidratação), definidos com base no potencial hídrico foliar antemanhã, e diversas

variáveis fisiológicos foram avaliados. Os resultados do primeiro experimento

mostraram que o déficit hídrico alterou a resposta dos híbridos avaliados para a

maioria das variáveis analisadas. A deficiência hídrica reduziu significativamente a

condutância estomática (gs) e aumentou significativamente a temperatura foliar, sem

diferenças significativas observadas entre os híbridos. A deficiência hídrica também

limitou significativamente o aumento da área foliar, número de folhas e altura da

planta, com exceção de ‘HTR - 069’, e massa seca foliar, com exceção de ‘TSKC x

CTSW - 041’ e ‘HTR - 069’, ao passo que favoreceu o aumento da massa seca de

raiz em ‘TSKC x CTSW - 041’. ‘TSKC x CTSW - 041’ e ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’

apresentaram maior comprimento total de raiz e comprimento de raízes finas (classe

de diâmetro entre 0-0,5 mm) em comparação com os demais híbridos, independente

do tratamento, sendo que a deficiência hídrica induziu uma redução significativa no

diâmetro médio de raiz no primeiro híbrido, mas um aumento significativo dessa

variável no segundo híbrido. Os resultados do segundo experimento indicaram que a

taxa líquida da fotossíntese, condutância estomática, transpiração e concentração

de carbono intercelular não diferenciaram entre as plantas mantidas em condições

de estresses leve e moderado, evidenciando uma boa eficiência no uso da água. Os

ajustamentos osmótico e elástico das paredes celulares induzidos pelos diferentes

híbridos permitiram que a pressão de turgor das células permanecesse inalterado,

garantindo a atividade fotossintética nos diferentes regimes de restrição hídrica.

Análises de expressão gênica e atividade das enzimas antioxidantes dismutase do

superóxido (SOD) e peroxidase do guaiacol (GPX) em folhas de laranjeira ‘Valencia’

enxertada nos híbridos ‘LCR x TR - 001’ e ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ revelaram uma

indução significativa de expressão e atividade de GPX em plantas de ambos os

híbridos submetidos a condições de estresse moderado. Em conclusão, os quatros

porta-enxertos híbridos avaliados apresentaram respostas fisiológicas e de

crescimento tanto comuns como divergentes quando submetidos à condições

limitantes de água, sugerindo que diferentes atributos podem contribuir com o

mecanismo de tolerância à seca em citros.

Palavras-chave: estresse abiótico, seca, trocas gasosas, condutância estomática,

potencial de turgor, potencial osmótico, ajuste osmótico, ajuste elástico

PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF 'VALENCIA' LARANJEIRA UNDER

DIFFERENT CITRUS FRUITS IN THE FUNCTION OF VARIATION OF SOIL

MOISTURE

ABSTRACT

Drought is one of the most threatening abiotic factors for citrus cultivation in

the world. The use of rootstocks can contribute to the tolerance of canopy variety to

water deficit, besides favoring other horticulture traits, such as greater production

efficiency and fruit quality. The present study aimed to evaluate under physiological

conditions the physiological responses of four new hybrid rootstocks with recognized

potential for drought tolerance and productive efficiency under field conditions,

aiming to identify the common and divergent responses associated with the induction

of drought tolerance in citrus. The investigated hybrids were: 'LCR x TR - 001', 'TSKC

x CTSW - 041', 'TSKC x (LCR x TR) - 059' and 'HTR - 069' The first experiment was

conducted in phytotron, in which 140-day-old plant-free plants of nucellar origin were

submitted to control (irrigated) and water stress (irrigation suspension) treatments,

and several physiological variables were analyzed throughout 48 days after

imposition of treatments. The second experiment was conducted in a greenhouse,

where plants of the mentioned hybrids, aged approximately 1 year, grafted with the

crown of Valencia orange (Citrus sinensis L. Osb.), Were submitted to five different

water regimes ( control, light stress, moderate stress, severe stress and rehydrated),

defined on the basis of the foliar water potential beforehand, and several

physiological variables were evaluated. The results of the first experiment showed

that the water deficit altered the response of the hybrids evaluated for most of the

analyzed variables. Water deficiency significantly reduced stomatal conductance (gs)

and significantly increased leaf temperature, with no significant differences observed

among hybrids. The water deficit also significantly limited leaf area increase, leaf

number and plant height, with the exception of 'HTR - 069', and leaf dry mass, with

the exception of 'TSKC x CTSW - 041' and 'HTR - 069' , while favoring the increase

of dry root mass in 'TSKC x CTSW - 041'. 'TSKC x CTSW - 041' and 'TSKC x (LCR x

TR) - 059' showed higher total root length and root length (diameter class 0-0.5 mm)

compared to the other hybrids, independently of the treatment, with water deficiency

inducing a significant reduction in root mean diameter in the first hybrid, but a

significant increase of that variable in the second hybrid. The results of the second

experiment indicated that the net rate of photosynthesis, stomatal conductance,

transpiration and intercellular carbon concentration did not differentiate between

plants maintained under mild and moderate stress conditions, evidencing a good

water use efficiency. The osmotic and elastic adjustments of the cell walls induced by

the different hybrids allowed the turgor pressure of the cells to remain unchanged,

guaranteeing the photosynthetic activity in the different water restriction regimes.

Analysis of gene expression and activity of the antioxidant enzymes antioxidant

superoxide (SOD) and guaiacol peroxidase (GPX) on 'Valencia' orange leaves

grafted on the 'LCR x TR - 001' and 'TSKC x (LCR x TR) - 059 'revealed a significant

induction of GPX expression and activity in plants of both hybrids subjected to

moderate stress conditions. In conclusion, the four evaluated hybrid rootstocks

presented both common and divergent physiological and growth responses when

submitted to water limiting conditions, suggesting that different attributes may

contribute to the mechanism of drought tolerance in citrus.

Keywords: abiotic stress, drought, gas exchange, stomatal conductance, turgor

potential, osmotic potential, osmotic adjustment, elastic adjustment

13

1 Introdução

A produção mundial estimada de laranja doce na safra 2013/14 foi 68.925

milhões toneladas (FAO, 2015), sendo uma cultura de grande expressão

socioeconômica dentro do cenário agrícola nos países produtores. Mas a citricultura

anda ameaçada pela falta de diversificação genética dos porta-enxertos nos

pomares citrícolas e pelos diversos fatores bióticos e abióticos que desestabilizam a

produtividade. Esses incluem a deficiência hídrica, o mais importante estresse

ambiental experienciado pela cultura dos citros, dado que o seu cultivo encontra-se

distribuído principalmente nas regiões semiáridas do mundo. A crescente escassez

de água para irrigação das culturas, assim como os efeitos causados pelas

mudanças climáticas globais, tais como elevadas temperaturas e mudança nos

padrões de precipitação, tornam imperativo o melhoramento genético para tolerância

à seca (WHITE et al. 2004).

As plantas podem adotar duas diferentes estratégias de tolerância para

contornar os efeitos potencialmente nocivos causados pela seca: evitar o estresse

ou tolerar o estresse (LAWLOR, 2013; VERSLUES et al., 2006). Os mecanismos de

prevenção para evitar o estresse incluem o fechamento estomático, aumento da

eficiência do uso da água (WUE), aprofundamento do sistema radicular e redução

do crescimento da parte aérea. Os mecanismos de tolerância à seca incluem a

desintoxicação pelas espécies reativas de oxigênio (ROS), acumulação de proteínas

protetoras, ajuste osmótico e ajuste elástico das paredes celulares (CLAEYS; INZE,

2013).

Estudos em diferentes genótipos de citros relataram que o déficit hídrico induz

uma queda nas taxas de condutância estomática, fotossíntese e transpiração

(SANTANA-VIEIRA et al., 2016; PEDROSO et al., 2014; SUASSUNA et al., 2014;

ROMERO et al., 2006). Quando a condutância é limitada para reduzir a perda de

água, o influxo de CO2 para o interior da folha também diminui, o que compromete a

14

taxa de fotossíntese líquida (SHIMAZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007). Esses

são considerados mecanismos de escape à seca (MEDINA et al., 2005). Os

atributos adaptativos das plantas cítricas descritos anteriormente são influenciados

pelo porta-enxerto, que afeta a distribuição do sistema radicular (CASTLE;

KREZDORN, 1975), eficiência de absorção de água e nutrientes (CASTLE;

KREZDORN 1977), anatomia dos elementos de vaso do xilema (VASCONCELLOS;

CASTLE, 1994; RODRÍGUEZ-GAMIR et al. 2010b), condutividade hidráulica da raiz

(SYVERTSEN; GRAHAM, 1985; MEDINA et al. 1998; RODRÍGUEZ-GAMIR et al.

2010b) e a capacidade de ajustes osmótico e elástico das paredes celulares

(RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010a; GONÇALVES et al., 2016). Estas propriedades

determinam a capacidade do porta-enxerto em suprir as necessidades de água e

nutrientes para a planta e a produção de hormônios indutores de adaptações

metabólicas que garantam a sua sobrevivência em solos mais secos.

Os níveis econômicos alcançados com o cultivo de citros foram obtidos

principalmente pela utilização de porta-enxertos tolerantes às condições bióticas e

abióticas. Entretanto, atualmente a citricultura apresenta elevada concentração no

uso de um número restrito de variedades porta-enxerto comerciais, limitando a

variabilidade genética e tornando a citricultura vulnerável ao surgimento de fatores

adversos, como ocorreu no passado.

A avaliação do potencial de uso de novos porta-enxertos desenvolvidos pelos

programas de melhoramento genético de citros visando a diversificação dos

pomares deverá incluir a análise da tolerância à seca, a fim de adaptar a cultura dos

citros ao clima atual e futuro. Ramos et al. (2015) avaliaram 21 porta-enxertos

combinados com a copa laranjeira ‘Valencia’ cultivados no campo sob condições de

sequeiro, no período de 2009-2011, sendo que os híbridos ‘LCR x TR - 001’, ‘TSKC

x CTSW - 041’, ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ e ‘HTR - 069’ conferiram a maior

eficiência de produção de frutos em comparação com as demais variedades porta-

enxerto, incluindo as convencionais como limoeiro ‘Cravo’. O híbrido ‘059’ foi o

destaque, através de uma análise visual para tolerância à seca, entre esses quatro

híbridos. Quando Carvalho et al. (2016) avaliaram porta-enxertos alternativos ao

limoeiro ‘Cravo’ enxertado em laranjeira ‘Pera’, cultivados no campo sob condições

de sequeiro, teve o híbrido ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ entre os destaques que

induziram eficiência produtiva numericamente superior à do limoeiro 'Cravo'.

15

Pesquisas que identifiquem mecanismos comuns e divergentes de tolerância

à seca, adotados por diferentes porta-enxertos pela indução de respostas

fisiológicas na variedade copa, quando em condições limitantes de água no solo, se

tornam necessários para melhor elucidar os diferentes fenótipos adotados e o uso

dessas informações nos programas de melhoramento genético como estratégias de

pré-seleção de materiais promissores.

16

2 Objetivos

2.1 Objetivo Geral

Caracterizar novos porta-enxertos híbridos com potencial de tolerância à

seca, mediante avaliações fisiológicas, bioquímicas e moleculares, quando

em condições de déficit hídrico.

2.1 Objetivos Específicos

i. Avaliar variáveis fisiológicas e de crescimento dos híbridos como pé-

franco em condições de déficit hídrico;

ii. Avaliar as respostas fisiológicas, bioquímicas e moleculares de

laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos diferentes porta-enxertos híbridos

em condições de déficit hídrico.

17

3 Revisão Bibliográfica

3.1 Aspectos Gerais da Citricultura

Os citros compreendem um grande grupo de plantas do gênero Citrus e

outros gêneros afins (Fortunella e Poncirus) ou híbridos da família Rutaceae, ao qual

são originários da Ásia meridional, com registros mais antigos na China há milhares

de anos (NICOLOSI, 2007). Com liderança mundial de frutíferas, os citros são

cultivados em mais de 100 países que apresentam climas tropical, subtropical e

mediterrâneo (KHAN; KENDER, 2007) sendo consumidos por famílias de todas as

classes sociais (GOMES, 2007; OLIVEIRA et al., 2008), além de terem também

significado industrial como matéria-prima para produtos cosméticos e farmacêuticos.

O comércio entre as nações e as guerras favoreceram a difusão do cultivo sendo

estes levados para a Europa na época das Cruzadas e chegando ao Brasil trazidos

pelos portugueses, no século XVI (GOMES, 2007; NEVES et al., 2010; PASSOS et

al., 2013).

A citricultura no Brasil ganhou destaque, visto que mesmo fora do habitat

original, as plantas cítricas encontraram condições melhores para vegetar e produzir,

expandindo-se por todo o território, em maior ou menor escala (MOREIRA, 1980;

NEVES et al., 2010; PASSOS et al., 2013). O produtor nacional especializou-se na

produção de cultivares destinadas ao suco, diante da produção de suco concentrado

de laranja destinado ao mercado externo (SANTOS FILHO et al., 2005; NEVES et

al., 2010). O país detém 50% da produção mundial de suco de laranja e exporta

98% do que produz, sendo a Europa o principal destino dessas exportações

(NEVES et al., 2010).

O estado de São Paulo é o maior produtor nacional, liderando a produção das

três principais frutas cítricas produzidas no país (laranja, limão e tangerina)

(SANTOS FILHO et al., 2005). A Bahia é o segundo maior produtor de laranja do

18

país com produção anual em 2016 de 1,1 milhão de toneladas de acordo com dados

do PAM (2016) gerados principalmente pela região do litoral norte do estado.

Segundo levantamento do IBGE (2017) a produção de laranja no país em

outubro/2017 chegou a 17.266.133 toneladas com área cultivada de 638.523 ha.

Na produção mundial de citros, quase todas as frutas comerciais são

cultivados como árvores enxertadas por apresentar diversas vantagens como a

uniformidade das mudas, precocidade na produção, aumento na produtividade,

dentre outros por constituir um único indivíduo vegetal produtivo e longevo

(AMARAL, 1994; ANDRADE; MARTINS, 2003; POMPEU JUNIOR, 2005; KHAN;

KENDER, 2007; OLIVEIRA et al., 2008). O uso de um porta-enxerto adequado pode

propiciar frutos de melhor qualidade além de induzir diversas alterações na

variedade copa destacando dentre eles: absorção, síntese e utilização de nutrientes;

transpiração e composição química das folhas; resposta a produtos de abscisão de

folhas e de frutos; porte, precocidade de produção e longevidade das plantas;

maturação, peso e permanência de frutos na planta; coloração da casca e do suco;

teores de açúcares, ácidos e de outros componentes do suco; tolerância a pragas,

doenças e fatores abióticos, como frio, salinidade e seca; conservação pós-colheita;

produtividade; e qualidade das frutas (POMPEU JUNIOR, 1980; SCHAFER et al.,

2001).

Entretanto, a maior parte da produção brasileira de citros é sustentada por um

número reduzido de porta enxertos, sendo que o limoeiro ‘Cravo’ ainda é o genótipo

de uso em maior abrangência nacional, representando cerca de 50% da produção

dos viveiros no país (OLIVEIRA et al., 2008; FUNDECITRUS, 2013). Este apresenta

um amplo número de características fisiológicas e agronômicas importantes, como

tolerância à seca, facilidade na obtenção de sementes, tolerância à tristeza dos

citros (CTV), compatibilidade com todas as variedades copa, indução de produção

precoce e alta produtividade o que justifica a sua principal utilização (SOARES

FILHO et al., 2008). Todavia, a citricultura mostra-se vulnerável devido,

principalmente, à utilização de poucas combinações copa/porta-enxerto tornando

necessária a realização de um programa de diversificação em nível nacional

(CUNHA SOBRINHO et al., 1980; SCHINOR et al., 2006).

19

3.2 Deficiência Hídrica em Citros

Devido ao ciclo de vida sésseis, as plantas desenvolveram mecanismos para

responder e se aclimatar a estresses ambientais adversos durante o seu

crescimento e desenvolvimento (OSAKABE et al., 2014). Os estresses abióticos ou

bióticos, causam grandes impactos na agricultura a cada ano, restringindo o

rendimento e a produção das culturas (SINGH et al., 2017; ZANDALINAS et al.,

2017). Entre os vários fatores limitantes da produção vegetal, o déficit hídrico ocupa

posição de destaque, visto que além de afetar as relações hídricas nas plantas,

alterando-lhes o metabolismo, é o fenômeno que ocorre em grandes extensões de

áreas cultiváveis causando inúmeras perdas econômicas (NOGUEIRA et al., 2001;

OSAKABE et al., 2014; SMEKALOVA et al., 2014).

O déficit de água permanente ou temporário prejudica severamente o

crescimento e desenvolvimento da planta mais do que outro fator ambiental (ANJUM

et al., 2011). E desde os primórdios, o homem tem procurado uma alternativa mais

efetiva do aproveitamento da água para superar os efeitos do déficit hídrico às

plantas (SANTOS; CARLESSO, 1998). A irregularidade de chuvas no país agravada

pela ocorrência em condições de distribuição, tempo e intensidade limita a demanda

e uso da água existente (SCHAFER et al., 2001; ZARCH et al., 2015) e assim, a

produtividade da planta é amplamente afetada por episódios de seca em condições

de campo (TODAKA et al., 2015).

A seca é uma condição natural e inevitável sendo a consequência de uma

redução natural na quantidade de precipitação recebida durante um período

prolongado de tempo, variando em gravidade e duração e sendo associada a outros

fatores climáticos, tais como temperaturas elevadas, ventos fortes e de baixa

umidade relativa (WILHITE, 2000; TODAKA et al., 2015). Contudo, as áreas

afetadas aumentaram substancialmente desde meados do século 20 e como

resultado, plantas apresentam um crescente estresse hídrico, por déficit, em muitas

regiões do mundo que impõe sérios riscos as culturas (DAI, 2011; GRAY; BRADY,

2016). A escassez de água pode acontecer lentamente durante o desenvolvimento

da planta (dias a semanas ou meses) ou ser de curto prazo (horas a dias) e por ser

independente da planta, os efeitos da deficiência hídrica pode mudar drasticamente

20

de acordo com o genótipo e ambiente (CHAVES et al., 2003; GILBERT; MEDINA,

2016)

O cultivo dos citros no Brasil se dá predominantemente sem irrigação, e no

nordeste brasileiro a citricultura encontra-se assentada, principalmente, no

ecossistema de Tabuleiros Costeiros com produtividade baixa, devido ao déficit

hídrico que ocorre de modo mais acentuado, nos meses mais quentes do ano, de

novembro a fevereiro (CRUZ et al., 2003; CERQUEIRA et al., 2004; PEIXOTO et al.,

2006) e pela presença de horizontes coesos (PAIVA et al., 1998). Salienta-se que o

requerimento hídrico para uma boa produção de frutos em citros é cerca de 900 a

1.200 mm por ano e varia com a demanda evapotranspirométrica, solo, copa e com

o porta-enxerto utilizado (DONATO et al., 2007). Na Bahia, mesmo a faixa citrícola

apresentando volume de chuvas considerado quase ideal (em torno de 1.100 mm), a

produção é afetada pela má distribuição e intensidade irregular destas chuvas,

principalmente nos períodos críticos de floração e frutificação (CUNHA SOBRINHO;

PASSOS, 2004).

As plantas são impostas ao estresse por seca quer quando o abastecimento

de água às raízes se torna difícil ou quando a taxa de transpiração se torna muito

alta (ANJUM et al., 2011). Mudanças climáticas levam a uma maior demanda de

água atmosférica e, conseqüentemente, a uma taxa aumentada de

evapotranspiração das culturas e depleção de água do solo (LAVOIE-LAMOUREUX

et al., 2017). A limitação excessiva de água prejudica o crescimento vegetativo,

provocando abortamento de frutos jovens, redução no desenvolvimento e qualidade

interna e externa dos frutos, causando importantes perdas econômicas em pomares

(PÉREZ-PÉREZ et al., 2008; RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010; LAVOIE-

LAMOUREUX et al., 2017).

A produção de alimentos em todo o mundo é afetada por secas periódicas e a

agricultura mundial está enfrentando o desafio de aumentar a produtividade, a fim de

acompanhar a crescente demanda de alimentos da população em crescimento

(SHABALA, 2017; SINGH et al., 2017). Neste contexto, têm-se enfrentado muitos

desafios, como produzir mais alimentos para a população crescente, e a

produtividade das culturas não está aumentando em paralelo com a demanda de

alimentos (PARIHAR et al., 2014). Então, para garantir que o abastecimento

acompanhe o crescimento populacional, é necessária uma compreensão completa

21

dos processos envolvidos no crescimento e no desenvolvimento das culturas para o

manejo das práticas agronômicas (ANJUM et al., 2011).

3.3 Respostas ao Déficit Hídrico

Os estresses ambientais desencadeiam uma grande variedade de respostas

nas plantas, e estas evoluíram seus mecanismos para monitorar com precisão o

ambiente e reprogramar seu metabolismo por uma rede de sinalização robusta para

ajustar o seu crescimento e desenvolvimento de acordo com uma ampla gama de

sinalizações fisiológicas, bioquímicas e moleculares para percepção, reação e

adaptação, permitindo sobrevivência e reprodução (ANJUM et al., 2011; CLAEYS;

INZÉ, 2013; OSAKABE et al., 2014; SMEKALOVA et al., 2014). A deficiência hídrica

provoca alterações comportamentais que podem ser reversíveis ou irreversíveis, e

condicionam a planta estratégias para aclimatação ou adaptação, influenciadas por

fatores como severidade e duração do estresse, estádio e idade da planta bem

como pela competição com plantas vizinhas (SANTOS; CARLESSO, 1998; ZHAO et

al., 2014; GILBERT; MEDINA, 2016).

3.3.1 Fisiológicas

Para produzir de forma economicamente viável, torna-se necessário

satisfazer a fisiologia do vegetal, fornecendo à planta, no momento preciso, a

quantidade de água suficiente para que ela se desenvolva normalmente e alcance o

máximo de seu rendimento (OLIVEIRA; COELHO, 1980). Então, a produtividade da

planta depende da quantidade de água disponível e da eficiência do seu uso pelo

organismo (TAIZ; ZEIGER, 2004).

As plantas cítricas apresentam uma dinâmica de crescimento que está

diretamente relacionada às alterações ambientais (CASTRO NETO, 2013), sendo

que diversas respostas são observadas em restrição hídrica, como: a redução na

taxa de divisão e expansão celular, reduzindo o tamanho da folha e área de

transpiração; fechamento estomático; ajustamento osmótico e manutenção do

turgor; o alongamento do caule e crescimento de raiz; a redução das relações de

nutrientes e eficiência do uso da água, inibição de crescimento bem como da

produtividade das culturas (CHAVES et al., 2003; FAROOQ et al., 2012).

22

As plantas podem adotar duas diferentes estratégias para contornar os efeitos

potencialmente nocivos causados pela seca: prevenção ou tolerância ao estresse

(VERSUES et al., 2006; LAWLOR, 2013). A prevenção do estresse tem como

objetivo o equilíbrio da absorção e perda de água (CLAEYS; INZÉ, 2013) e ocorre

pela eficiência para absorver a água pelo sistema radicular, seja pelo

aprofundamento da raiz ou pela maior densidade (BLUM, 2005). Por conseguinte, os

mecanismos de tolerância visam proteger a célula de lesões graves quando os

mecanismos de prevenção ainda não são suficientes, dentre os quais inclui:

fechamento de estômatos para evitar perdas de água por transpiração,

desintoxicação de espécies reativas de oxigênio (ROS), acúmulo de proteínas

protetoras e solutos, redução de crescimento, dentre outros.

Uma das principais sinalizações é o fechamento estomático que pode

ocasionar alterações na transpiração e fotossíntese, gerando custos para a

temperatura da folha, que é um fator importante no controle do estado da água das

folhas sob o estresse por seca e no crescimento da planta (ANJUM et al., 2011;

MARTIN-STPAUL et al., 2017). O fechamento estomático reduz a evaporação foliar

e é uma das primeiras linhas de defesa contra a dessecação, uma vez que é um

processo mais rápido e flexível, principalmente a curto prazo (CHAVES, 1991). A

condutância estomática é um mecanismo bastante eficiente no controle da perda de

água na planta em condições de déficit hídrico tornando-se um potencial indicador

da tolerância à seca (PEDROSO et al., 2014; ULLAH et al., 2017).

A inibição de crescimento da parte aérea, tanto diretamente através de uma

resposta ativa e indiretamente pelo fechamento dos estômatos, também é um dos

efeitos do estresse por seca, havendo limitação da expansão foliar e com o aumento

da intensidade do estresse podendo acarretar em abscisão foliar, a fim de contribuir

para economia de água, permitindo a realocação de nutrientes armazenados em

folhas mais velhas para o caule e as folhas mais jovens (KHANNA-CHOPRA et al.,

1999; CHAVES et al., 2003; CLAEYS; INZÉ, 2013). A área foliar e a condutância

estomática são os principais fatores que afetam as taxas transpiratórias e, com isso,

a sua diminuição permite que o potencial hídrico aumente ou se mantenha dentro

dos limites que possibilitem o desenvolvimento vegetal (VERSLUES et al., 2006).

Quando o potencial hídrico foliar cai abaixo de um determinado limiar há o

fechamento estomático em resposta a limitação hídrica (FANG; XIONG, 2015).

23

O potencial de água da folha é considerado um parâmetro confiável para

quantificar a resposta ao estresse hídrico da planta (SIDDIQUE et al., 2000) por

determinar a quantidade de água celular disponível no tecido para a realização de

trabalho químico. No período antemanhã, diante da redução das perdas de água por

evapotranspiração, este pode ser usado como uma medida indireta favorável para

indicar o comportamento do potencial hídrico do solo (KRAMER; BOYER, 1995;

TAIZ; ZEIGER, 2004). Por este parâmetro é possível monitorar a intensidade do

estresse e correlacionar com o teor relativo de água foliar indica o estado hídrico da

planta, no qual com a menor demanda de água, há uma redução destes parâmetros

e consequentemente da taxa fotossintética (MEDINA et al., 1999; SIDDIQUE et al.,

2000).

As variações no potencial da água da planta também podem ser atribuídas a

uma mudança na potencial osmótico (SIDDIQUE et al., 2000). Em resposta ao

estresse por déficit hídrico, os sistemas iônicos e o transporte de água através das

membranas funcionam para controlar as mudanças de pressão de turgescência em

células guarda e estimular fechamento estomático (OSAKABE et al., 2014). Esta

acumulação de uma mistura complexa de ácidos orgânicos, açúcares e aminoácidos

é denominada de ajustamento osmótico (NOGUEIRA et al., 2001) e é um dos mais

frequentes mecanismos de tolerância à seca em plantas (MEDINA et al., 2005). O

ajuste osmótico permite que as plantas mantenham o turgor da folha necessário

para a abertura estomática, sustentando a fotossíntese e o crescimento

(RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010).

3.3.2 Bioquímicas e Moleculares

Durante a deficiência hídrica, podem ocorrer também alterações bioquímicas

e moleculares por uma complexa rede de interação de sinais, hormônios e proteínas

que permitem à sinalização de estresse e a ativação de mecanismos que

possibilitem adaptação e sobrevivência sob condições ambientais adversas (PELEG;

BLUMWALD, 2011; RODZIEWICZ et al., 2014; SMEKALOVA et al., 2014; ARBONA

et al., 2017).

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são produzidas naturalmente através

do metabolismo celular de organelas como as mitocôndrias, cloroplastos e

peroxissomos pelo vazamento inevitável de elétrons em O2 ou como subproduto de

24

várias vias metabólicas localizadas em diferentes compartimentos celulares, sendo

produzidos o oxigênio singleto (1O2), o radical superóxido (•O2 −) e hidroxil (•OH) e o

peróxido de hidrogênio (H2O2) (KARUPPANAPANDIAN et al., 2011; SHARMA et al.,

2012). Entretanto, com a limitação hídrica podem ocorrer danos no aparato

fotossintético aumentando o estresse oxidativo, provocado pela intensificação da

formação de ROS, que atingem moléculas vitais como lipídios, proteínas e ácidos

nucléicos, gerando distúrbios estruturais, metabólicos e fisiológicos nas células

vegetais, podendo levá-las à morte (BRAY et al., 2000; HALLWELL; GUTTERIDGE,

2006; SHARMA et al., 2012).

Ainda não está totalmente elucidado o papel da produção e controle das

concentrações de ROS durante o estresse hídrico em plantas, todavia observam-se

alterações na produção de ROS em condições de estresse (NUNES JUNIOR et al.,

2017). Neste sentido, as ROS parecem ter um duplo efeito sob condições de

estresse abiótico que dependem de sua quantidade celular global, logo se

mantiveram níveis relativamente baixos, provavelmente funcionarão como

componentes de uma via de sinalização de estresse, provocando respostas de

defesa/aclimatação do estresse, enquanto em concentrações elevadas, as ROS

causam dano às biomoléculas (SHARMA et al., 2012; REN et al., 2016).

O que determinará se a presença de ROS indica sinalização ou molécula

prejudicial é o equilíbrio entre a produção e eliminação destas moléculas evitando o

estresse oxidativo (SHARMA et al., 2012). A eliminação das ROS é realizada por

compostos antioxidantes como a glutationa reduzida (GSH), ascorbato (AsA),

tocoferol, vitaminas e pigmentos carotenóides, os quais agem em conjunto com as

enzimas antioxidantes superoxidase dismutase (SOD), glutationa redutase (GR),

catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX) (GRATÃO et al., 2005). Em plantas

sob estresse hídrico, observa-se um aumento na atividade dessas enzimas

relacionado ao aumento na tolerância à seca (XIONG et al., 2002).

Uma das principais enzimas do sistema de defesa antioxidante é a SOD, que

constitui o primeiro nível de defesa contra os radicais superóxido (ZANDALINAS et

al., 2017). A enzima SOD atua na conversão do radical superóxido (•O2 −) a

peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio (O2). O H2O2 por sua vez, devido à sua

toxicidade, é dismutado em H2O e O2 pelas enzimas CAT, APX e GPX, a fim de

diminuir os efeitos citotóxicos no vegetal (SHEHAB et al., 2010). A GPX está

associada com muitos processos biossintéticos, incluindo lignificação da parede de

25

celular, degradação do ácido indolacético (AIA), biossíntese do etileno, e defesa

contra estresses bióticos e abióticos nas plantas (GILL; TUTEJA, 2010; SHARMA et

al., 2012). Esses estresses abióticos, como a seca, induzem a expressão de um

grande número de genes (TODAKA et al., 2015) e a existência de respostas

específicas de variedade sugere uma considerável plasticidade genética no controle

da resposta ao crescimento na limitação de água (CLAEYS; INZÉ, 2013).

3.4 Melhoramento Genético

A seleção de porta-enxertos tolerantes é uma estratégia eficiente para mitigar

os efeitos do déficit hídrico em muitas culturas (ALBACETE et al., 2015; BERDEJA

et al., 2015; TWORKOSKI et al., 2016; LÓPEZ-MARÍN et al., 2017), sendo a melhor

opção para a produção de culturas, a melhoria do rendimento e a estabilidade da

planta diante das condições de estresse (SIDDIQUE et al., 2000). O

desenvolvimento de plantas com maior capacidade de sobrevivência e crescimento

pelo emprego adequado de caracteres fisiológicos e/ou bioquímicos durante o

estresse é fundamental na seleção de materiais para tolerância as condições de

seca em programas de melhoramento (NOGUEIRA et al., 2011; OSAKABE et al.,

2014).

Na citricultura, a busca é pela seleção de porta-enxertos mais ao convívio das

mudanças climáticas, principalmente com potencial para tolerância à seca (NEVES

et al., 2013; PEDROSO et al., 2014; GONÇALVES et al., 2016; SANTANA-VIEIRA et

al., 2016; DUTRA-SOUZA et al., 2017; SANTOS et al., 2017). Os efeitos do estresse

da seca podem ser gerenciados pela seleção dos genótipos vegetais mais

adequados, sendo estes fundamentais para manutenção e melhoria da cadeia

produtiva citrícola juntamente com o ajuste das práticas agronômicas (densidade da

planta; manejo do solo) a fim de permitir uma produtividade aceitável sob menor

disponibilidade de água (FAROOQ et al., 2009; TARDIEU, 2012).

A seleção de genótipos que apresentem mutações ou recombinações nos

genes envolvidos na tolerância a estresses abióticos é de grande valor, pois se

estas diferenças forem expressas em melhoria, possivelmente esses genes podem

ser transferidos para cultivares comerciais, possibilitando a obtenção de genótipos

mais produtivos (MAGALHÃES JUNIOR, 2010). Sendo assim, germoplasma

contendo genótipos que possuam diversidade de respostas à deficiência hídrica, é

26

de interesse em programas de melhoramento genético, sendo importante o

conhecimento dos mecanismos relacionados a tais respostas diferenciais (PEIXOTO

et al., 2006). Todavia, todos porta-enxertos usados atualmente, no mundo, possuem

limitações o que permitiu ao longo de muitos anos seleções por porta-enxertos

adaptados as suas condições. Por esse motivo, os principais países produtores de

citros conduzem programas de melhoramento contínuos para obtenção de porta-

enxertos (CRISTOFANI et al., 2005)

O melhoramento genético dos citros por métodos tradicionais como via

hibridação apresentam vários obstáculos, dentre os quais se sobressaem: (1)

poliembrionia, que dificulta a identificação de híbridos; (2) elevada heterozigosidade,

que leva à formação de híbridos com características diversas; e (3) longo período

pré-reprodutivo, dado que a frutificação dos híbridos obtidos não raramente tem

início somente aos sete ou mais anos de idade (SOARES FILHO et al., 2013). Entre

esses fatores, a apomixia e/ ou poliembrionia talvez seja o que mais dificulta a

obtenção de grande número de indivíduos zigóticos na progênie, uma vez que o

desenvolvimento de populações segregantes é condição para o estabelecimento de

um programa de melhoramento bem sucedido havendo, portanto, necessidade de

recuperar e selecionar o embrião zigótico (CRISTOFANI et al., 2005)

Dentre os híbridos desenvolvidos pela Embrapa Mandioca e Fruticultura, o

‘LCR x TR - 001’, ‘TSKC x CTSW – 041’, ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ e ‘HTR-069’

foram avaliados como porta-enxertos para laranjeira ‘Valência’ e induziram redução

no tamanho da copa e maior eficiência na produção de frutos com boa qualidade em

comparação a porta-enxertos tradicionais, como o limoeiro ‘Cravo’ e a tangerineira

‘Sunki’. Além disso, apresentaram alta tolerância à seca, com resultados superiores

ao limoeiro ‘Cravo’ e precocidade na produção, com pouca suscetibilidade à gomose

e tolerância ao CTV (RODRIGUES et al., 2014; RAMOS et al., 2015; RODRIGUES

et al., 2015). Destacam-se os híbridos 'TSKC × (LCR × TR) - 059' e 'LCR × TR - 001'

com maior eficiência de produção e maior tolerância à seca quando comparados aos

outros híbridos, com melhor uso de água disponível (RAMOS et al., 2015). Neste

contexto, a seleção de novas variedades cítricas no cenário atual, torna-se

preponderante para a ampliação da base genética atual focada na maior

produtividade e sobrevivência em condições de estresse.

27

4 Material e Métodos

4.1 Experimento I

O Experimento foi realizado em ambiente protegido e controlado (FITOTEC –

modelo: LT 13,76 UTFP), com temperatura e umidade de 26°C e 70% Umidade

Relativa do Ar (UR), respectivamente, para o período diurno, e 21°C e 80% UR para

o período noturno, com fotoperíodo de 12h. O FITOTEC está localizado no

Laboratório de Ecofisiologia da Embrapa Mandioca e Fruticultura, município de Cruz

das Almas, BA (Latitude: 12º 40’ 39’’ S; Longitude; 39º 06’ 23’’ W; Altitude: 225m).

Sementes dos híbridos ‘LCR x TR - 001’, resultante do cruzamento entre

Limoeiro ‘Cravo’ (Citrus limonia L. Osbeck) x Trifoliata (Poncirus trifoliata L. Raf.) ;

‘TSKC x CTSW - 041’, resultante do cruzamento entre Tangerineira ‘Sunki’ {[C. sunki

(Hayata) hort. ex Tanaka] seleção comum} x citrumelo ‘Swingle’ (C. paradisi Macfad.

x P. trifoliata); ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’, resultante do cruzamento entre

Tangerineira ‘Sunki’ {[C. sunki (Hayata) hort. ex Tanaka] seleção comum} x citrumelo

‘Swingle’ (C. paradisi Macfad. x P. trifoliata); e ‘HTR - 069’, resultante do cruzamento

entre Híbrido trifoliado obtido por cruzamentos não identificados utilizando "lima

Rangpur", mandarina "Cleopatra" (C. reshni Hort. Ex Tan.) e laranja doce, foram

semeadas em tubetes de 290 cm3 contendo substrato Plantmax e cultivados por 120

dias em telado antiafídeo. As plântulas de origem nucelar foram transplantas para

tubos de PVC com 0,3 m de comprimento e 0,075 m de diâmetro contendo areia

lavada e acomodadas no FITOTEC. A umidade do substrato foi mantida na máxima

retenção de água (0,15 cm3 cm-3) para todas as parcelas experimentais, durante o

período de aclimatação de 20 dias. Solução nutritiva (Forth Nutri) foi utilizada para a

irrigação, e o volume de água utilizado para reestabelecer a umidade do substrato

na capacidade de campo era com base no volume de água transpirada do substrato,

determinado pela diferença entre a massa do vaso no dia e a massa do vaso com

28

umidade de 0,15 cm3 cm-3. Decorrido o período de incubação, houve a suspensão

da irrigação das parcelas experimentais destinadas ao tratamento déficit hídrico e o

momento de avaliação e coleta de material vegetal foi definido quando uns dos

híbridos apresentasse folhas enroladas, como um processo de ajustamento

fisiológico ao déficit hídrico.

As variáveis analisadas foram: Umidade do Substrato pelo método

gravimétrico; Condutância Estomática (gs) com uso do porômetro (Decagon Device,

Inc., Washington, USA); Temperatura Foliar (°C) com o uso de termômetro

infravermelho; Área Foliar (cm2) segundo metodologia proposta por Dultra et al.

(2017) ; Número de Folhas; Altura de Planta (cm); Diâmetro de Caule (mm); Massa

Seca de Folha - MSF (g); Massa Seca da Parte Aérea – MSPA (g); Massa Seca de

Raiz – MSR (g). O Crescimento Foliar (cm2) foi determinado pela diferença entre a

área foliar final e a área foliar no início da imposição do déficit hídico. O

Comprimento Total de Raiz (cm), Diâmetro Médio de Raiz (mm) e Comprimento de

Raiz em Diferentes Classes de Diâmetro (cm) foram obtidos por processo de

digitalização das imagens, realizado por meio de escâner com o uso do software

WinRizho, versão 2013d.

O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial foi

4x2, sendo quatro híbridos e dois manejos hídricos (controle e déficit hídrico), com

três repetições.

Os resultados dos parâmetros avaliados foram submetidos à análise de

variância e teste de Tukey com significância do teste F de até 5% de probabilidade

(p ≤ 0,05). Todas as análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do

aplicativo SISVAR (FERREIRA, 2011).

4.2 Experimento II

4.2.1 Material vegetal e condições experimentais

O experimento foi conduzido em telado antiafídeo, no período de dezembro

de 2015 a outubro de 2016, na Embrapa Mandioca e Fruticultura, situada no

município de Cruz das Almas, Bahia, Brasil (Latitude: 12º40’39’’S, Longitude; 39º06’

23’’W, Altitude; 225m). Dados de temperatura e umidade relativa do ar (UR) foram

29

obtidos do Instituto Nacional de Meteorologia (INMET), localizado na Embrapa

Mandioca e Fruticultura, com temperatura média de 24,9 C e UR média de 79,8 %,

durante o período experimental.

Foram avaliados quatro porta-enxertos híbridos de citros selecionados pelo

Programa de Melhoramento Genético da Embrapa Mandioca e Fruticultura com

potencial para tolerância a seca (RODRIGUES et al., 2015; RAMOS et al., 2015),

enxertados com a copa Laranjeira ‘Valencia’ (Citrus sinensis L. Osb.). As mudas de

aproximadamente um ano de idade foram transplantadas para vasos plásticos de

100 dm3, perfurados e previamente divididos em quatro compartimentos por tela

antiafídeo e preenchidos com 89,94 dm3 de solo a uma densidade de 1,5 kg dm-3.

Cada compartimento representou uma parcela experimental com 22,50 dm3 de solo

e, portanto, cada vaso foi composto por quatro parcelas experimentais com quatro

plantas de citros, sendo uma de cada híbrido avaliado (Figura 1). Os vasos foram

cobertos com papel filme de PVC e papel alumínio para que a perda de água do solo

se desse somente por transpiração da planta.

30

Figura 1. Vasos plásticos de 100 dm3 divididos em quatro compartimentos por tela

antiafídeo.

O solo utilizado foi coletado a uma profundidade de 0-50 cm em uma área

experimental da Embrapa Mandioca e Fruticultura e classificado como Lalossolo

Amarelo distrocoeso (SANTOS et al., 2013). Com base na análise química do solo

(Tabela 1), realizou-se a calagem visando elevar a saturação por bases para 70%

com o uso de calcário dolomítico, e foi aplicado 100 mg dm-3 de P2O5 e 50 mg dm-3

de K2O, ambos em dose única. A adubação nitrogenada foi parcelada em três

aplicações de 50 mg dm-3 aos 20, 40 e 60 dias após o transplantio, e a torta de

mamona (80g vaso-1) foi utilizada como fonte de micronutrientes.

Tabela 1. Análise química e granulométrica de amostra de um Latossolo Amarelo ditrocoeso coletado na área experimental II da Embrapa Mandioca e Fruticultura na camada de 0-50 cm

pH Na Ca Mg Al H+Al SB CTC V P K M.O Areia Silte Argila

H2O ------------------------ cmolc dm-3

------------------------ % -- mg dm-3

-- -------------- g Kg-1

---------------

5,2 0,03 0,76 0,53 0,3 3,19 1,45 4,64 31 2,0 0,13 8,0 647 79 274

Decorrido trinta dias de incubação do calcário, as mudas de citros foram

transplantadas dos sacos plásticos com 3 litros do substrato casca de pinus para os

vasos com solo. Realizou-se a poda e a desfolha quinze dias após o transplantio,

padronizando as mudas com trinta centímetros de altura.

Os tratamentos constituíram da combinação de quatro porta-enxertos e quatro

ou cinco regimes hídricos em esquema fatorial 4x4 ou 4x5, a depender da variável

analisada. Os porta-enxertos (001, 041, 059 e 069) e os regimes hídricos (Controle -

CO, Estresse Leve - MI, Estresse Moderado - MO e Reidratado - RE; ou Controle -

CO, Estresse Leve - MI, Estresse Moderado - MO, Estresse Severo - SE e

Reidratado - RE) foram combinados em delineamento inteiramente casualizado com

5 repetições, totalizando 80 parcelas que foram representadas por 20 vasos. Cada

parcela experimental equivaleu a ¼ de um vaso.

O tratamento SE é resultado das variáveis analisadas das plantas

pertencentes ao tratamento reidratado quando elas estavam em condições de déficit

hídrico com L -3,5 MPa, antes da reidratação.

31

Os regimes hídricos foram definidos com base no potencial hídrico foliar. Para

o tratamento CO, a umidade do solo ficou sempre situada próximo a capacidade de

campo e o L foi mantido entre -0,1 e -0,5 MPa; para o tratamento MI, houve a

suspensão da irrigação e o estresse foi caracterizado quando as folhas atingiram

valores de L entre -1,0 e -1,5 MPa; para o tratamento MO, houve a suspensão da

irrigação e o estresse foi caracterizado quando as folhas atingiram valores de L

entre -2,5 e -3,5 MPa; para o SE, foi definido valores de L menores que -3,5 MPa; e

para o tratamento RE, depois que as plantas atingiram L abaixo de -3,5 MPa a

umidade do solo foi elevada para a capacidade de campo e 24 h depois as análises

foram realizadas.

As avaliações fisiológicas in situ e coleta de material vegetal foram realizadas

quando as quatro plantas de cada vaso estavam dentro da faixa de potencial hídrico

foliar que caracterizou cada tratamento. Dois dias antes de suspender a irrigação

para dar início aos estresses, a área foliar foi uniformizada em cada vaso. Dessa

forma, as quatro plantas dos diferentes porta-enxertos foram submetidas ao déficit

hídrico com a mesma área foliar.

O volume de água utilizado para a irrigação foi determinado pela equação de

van Genuchten, conforme a curva de retenção de água do solo, que descreve a

variação da umidade do solo em função da tensão (Figura 2). A capacidade de

campo de -10 kPa foi utilizada conforme indicação de Bernardo (2006). A umidade

do solo foi determinada a partir de medições de umidade volumétrica, em cada

parcela experimental, obtidas com uso de TDR (Reflectometry Domain Time), com

valores corrigidos com base na curva de calibração das sondas em amostras

indeformadas das unidades experimentais (Figura 3). O valor médio da umidade dos

quatro compartimentos do vaso foi utilizado para calcular o volume de água a ser

utilizado na irrigação, com leituras realizadas em dias intercalados para auxiliar no

manejo da irrigação e caracterização do secamento do solo.

32

Figura 2. Curva de retenção de água no solo prevista pelo modelo de van Genuchten para os pontos de 0, 10, 33, 100, 300 e 1500 KPa.

Figura 3. Relação entre constante dietétrica do solo (Ka) e umidade volumétrica (cm3 cm-3).

4.2.2 Relação entre Transpiração Relativa e Fração de Água Transpirável

A transpiração relativa foi calculada pela equação 1 (SINCLAIR; LUDLOW,

1986) com base nos dados de transpiração das plantas.

(1)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

θ (

cm3

cm-3

)

Potencial Matricial (KPa)

Equação de van Genuchten (1980)

θ = 0,00005ka3 - 0,0022ka2 + 0,0474ka - 0,1693 R² = 0,9983

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

5 7 9 11 13 15 17 19 21

Ѳ (

cm³

cm- ³

)

Constante Dielétrica (ka)

33

Em que:

TR = Transpiração relativa

TTd = Transpiração dos tratamentos que sofrem déficit hídrico, em cm3 cm-3

TTo = Transpiração do tratamento sem déficit hídrico, em cm3 cm-3

A fração de água transpirável do solo, em condições de deficiência hídrica, foi

calculada de acordo com a metodologia adota por Sinclair e Ludlow (1986), segundo

a equação 2:

(2)

Em que:

FAT = Fração de Água Transpirável

θ inicial = umidade volumétrica no momento que a irrigação foi interrompida

θ do dia = umidade volumétrica no dia que as leituras eram realizadas

θ final = umidade volumétrica no final do período que caracterizou cada tratamento.

4.2.3 Potencial Hídrico Foliar (L)

A segunda ou terceira folha totalmente expandida e madura a partir do ápice

da planta foi utilizada para determinar o potencial hídrico foliar (L) no período entre

2 - 4 horas da manhã (potencial hídrico antemanhã) utilizando uma câmara de

pressão Scholander (M670, PMS Instrument Co., Albany, OR, EUA), segundo a

metodologia descrita por Scholander et al. (1965). Houve o monitoramento durante o

período experimental do L para que as avaliações fisiológicas e coletas de material

vegetal situasse dentro da faixa de potencial determinado para cada tratamento.

4.2.4 Potencial de Turgor (p)

O potencial de turgor (p) das folhas foi determinado com o uso do

equipamento Wiltmeter® desenvolvido pela Embrapa Instrumentação e estimado a

partir da equação 3, proposta por Calbo e Nery (1995) e Calbo et al. (2010).

34

p = Py – fw (3)

Em que:

p = Potencial de turgor (MPa)

Py = Pressão no momento da leitura registrada pelo manômetro do aparelho

fw = Fator de wiltmeter

4.2.5 Teor Relativo de Água (RWC) na Folha

Ao atingir a faixa de potencial hídrico foliar caracterizada para cada

tratamento, as folhas foram coletadas para determinar o teor relativo de água de

acordo com Barrs e Weatherley (1962). Com um cilindro de metal de 2 cm de

diâmetro, retirou-se dez discos foliares em cada pool amostral e, imediatamente, os

discos foliares foram pesados para determinar o massa fresco (MF). Em seguida, os

discos foram imersos em água destilada e armazenados em ambiente escuro a 4 ºC

por 24h e pesados após esse período para determinar o massa túrgido (MT).

Posteriormente os discos foliares foram secos em estufa de circulação forçada de ar

a 70 ºC até peso constante e obteve-se o massa seca (MS).

RWC foi calculado como (Equação 4):

(4)

4.2.6 Fluorescência da Clorofila a

As medições da emissão de fluorescência da clorofila a foram efetuadas em

folhas maduras entre 8 e 10 h. As folhas selecionadas foram submetidas a um

período de adaptação ao escuro por 20 minutos, suficiente para a oxidação

completa dos centros de reação. Foi usado o medidor portátil de luz modulada (opti-

Sciences, modelo OS5p, Hudson, USA). Os sinais de fluorescência foram

registrados no sistema de aquisição de dados do aparelho, que calcula

automaticamente as fluorescências mínima (Fo), máxima (Fm) e o rendimento

quântico potencial máximo do fotossistema II (Fv/Fm).

35

4.2.7 Trocas Gasosas Foliares

As taxas de fotossíntese líquida por unidade de área foliar (A), a condutância

estomática ao vapor de água (gs), a taxa transpiratória foliar (E) e a concentração de

carbono intercelular (Ci) foram estimadas a partir dos valores da variação de CO2 e

da umidade do ar no interior da câmara, determinados pelo analisador portátil

LCpro-SD IRGA (ADC biotech-scientific Limited, UK). As medições foram realizadas

entre 8 - 10 h, sempre na mesma folha, localizada no terço médio de cada planta.

4.2.8 Eficiência de Uso da Água

Três formas de expressar a eficiência de uso da água foram utilizadas nas

análises e interpretação dos dados experimentais. Eficiência instantânea de uso da

água (A/E), calculada pela razão entre a taxa fotossintética líquida (A) e a taxa de

transpiração (E); eficiência intrínseca de uso da água (A/gs), calculada pela razão

entre a taxa fotossintética líquida (A) e a condutância estomática (gs); e a razão

entre as concentrações intercelular e atmosférica de CO2 (Ci/Ca).

4.2.9 Parâmetros da Curva Pressão-Volume (PV) em Folhas

Três folhas de cada planta (réplica técnica), de quatro parcelas experimental

(réplica biológica) para cada tratamento (controle, estresse moderado e reidratado),

foram coletadas e vedadas em sacos plásticos e armazenadas em caixa de isopor

em condição refrigerada e levadas imediatamente para o laboratório de Ecofisiologia

Vegetal da Embrapa Mandioca e Fruticultura. O pecíolo foi cortado a 0,5 cm da

inserção com o ramo e imediatamente imerso em água destilada por um período de

24 horas em ambiente escuro a 4 ºC para total reidratação das folhas. Após

reidratação, procedeu-se a pesagem da folha, com precisão de 0,0001 g para

obtenção de peso túrgido e em seguida determinou-se o L, utilizando uma câmara

de pressão tipo Scholander (M670, PMS Instrument Co., Albany, OR, EUA),

segundo a metodologia descrita por Scholander et al. (1965). A massa fresca das

folhas e as medidas do L foram obtidas em intervalos de 1 hora e o procedimento

36

foi finalizado quando as folhas atingiram o L ≤ -3,50 MPa. Nos intervalos entre as

pesagens e medidas de L, as folhas foram deixadas sobre a bancada para

desidratação pelo processo de transpiração livre sob temperatura ambiente.

Subsequentemente, a massa seca foi determinada após a folhas serem secas em

estufa de circulação forçada de ar a 75°C até peso constante. Com os dados

obtidos, as relações pressão-volume foram obtidas conforme detalhado por DaMatta

et al. (1993). Os cálculos dos parâmetros teor relativo de água no ponto de perda de

turgor (RWCTLP), potencial osmótico em plena turgescência (0), potencial osmótico

no ponto de perda da turgescência (TLP) e módulo de elasticidade (ε) foram

calculados utilizando planilhas de análises conforme descritos por Koide et al. (2000)

e Sack et al. (2003).

4.2.10 Potencial Osmótico ()

Folhas de citros dos respectivos tratamentos foram prensadas e recolhidos 10

µL da solução para análise de potencial osmótico por meio de osmômetro de

pressão de vapor modelo VAPRO 5520 (Wescor, Ins., Logan, UT, EUA). Os valores

de potencial osmótico foram obtidos a partir da osmolalidade (mmol L-1) da seiva do

tecido foliar, mediante o uso da equação de Van’t Hoff (REICHARDT; TIMM, 2004)

(Equação 5), cujos resultados foram expressos em MPa.

= - R . T . C (5)

Em que:

= Potencial osmótico da solução (MPa)

R = Constante universal dos gases (0,00831 kg MPa mol-1 K-1)

T = Temperatura absoluta da solução (ºK)

C = Concentração de solutos na solução (mmol L-1)

4.2.11 Atividade da Dismutase do Superóxido (SOD)

Uma unidade de atividade enzimática (UA) de SOD foi determinada medindo-

se a capacidade da enzima em obter 50% de inibição da redução fotoquímica de

nitroazul de tetrazólio (NBT), que leva à formação de um precipitado de cor azul

37

denominado formazana. O método utilizado para avaliação da atividade enzimática

foi descrito por Gianopolitis e Ries (1977), com modificações. Ao extrato bruto, foi

adicionado o tampão de extração contendo: tampão fosfato de potássio (50 mM / pH

6,0), EDTA (1mM) e metionina (13 mM). A atividade enzimática foi iniciada com a

adição de riboflavina (1mM). A leitura inicial ocorreu após a placa ter ficado no

escuro por 5 min, sendo a segunda leitura realizada após a placa ter sido submetida

a luz fluorescente de 15W, expostas por mais 5 min. Após iluminação, a reação foi

finalizada e as amostras lidas em espectrofotômetro de microplacas Espectramax

Paradigm (Molecular Devices) a 560 ƞm. Foram considerados como brancos os

poços que não continham extrato vegetal bruto.

4.2.12 Atividade da Peroxidase do Guaiacol (GPX)

Preparou-se para o ensaio enzimático microplacas de 96 poços contendo 140

µL de tampão de reação GPX 2x [40 mmol L-1 de guaiacol, H2O2 a 0,06% e fosfato

de sódio (20 mmol L-1, pH 6.0)],135 µL de tampão fosfato (50 mmol L-1, pH 6,0) e 5

µL de extrato enzimático, que foi previamente diluído. A leitura das amostras foi

realizada em espectrofotômetro de microplacas Espectramax Paradigm (Molecular

Devices), em comprimento de onda de 470 ƞm. A atividade de peroxidases foi

expressa com o aumento do consumo de guaiacol em µmol s-1 g-1 de biomassa

seca. A conversão dos dados obtidos em valores de absorbância a 470 nm min-1 g-1

de matéria seca para consumo de guaiacol em mmol h-1 g-1 de matéria seca foi feita

com o uso da equação y = 0.1284x + 0.0189 (R2=0.99) originada a partir de uma

curva padrão para GPX (Rehem et al., 2011).

4.2.13 Extração de RNA e Síntese de cDNA

O pool de RNA total de folhas das plantas submetidas ao tratamento controle

e estresse leve foi isolado utilizando o RNeasy Micro Kit (Qiagen). A qualidade e a

integridade do RNA extraído foram avaliadas por análise em gel de agarose 1% e

quantificado utilizando NANOdrop. As amostras foram tratadas com DNAse I, RNAse

free (Fermentas Life Science), após o processo de extração, seguindo as instruções

do fabricante (1µl de DNAse). A reação de transcrição reversa foi realizada usando o

38

kit RevertAid H Minus (Fermentas – First Strand cDNA Synthesis Kit), seguindo as

instruções do fabricante.

4.2.14 Análise de PCR em Tempo Real (qRT-PCR)

Para as análises de expressão gênica via qRT-PCR foram utilizados

oligonucleotídeos especificamente desenhados para a amplificação dos genes que

codificam enzimas envolvidas na resposta ao estresse oxidativo, baseado em suas

sequências disponíveis no banco de informação genômica de Citrus sinensis, no

Phytozome (http://www.phytozome.org/), conforme descritos na Tabela 2.

As reações foram realizadas em termociclador da Stratagene Mx 3005P

(Agilent Technologies), contendo o software MxPro-Mx 3005P, usando o kit

Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Scientific). O gene utilizado

como controle endógeno (gene de referência) foi o da gliceraldeído 3-fosfato

desidrogenase C2 (GAPC2) (Mafra et al., 2012). As reações foram feitas em três

réplicas, o volume utilizado na reação foi de 22 µL, contendo 100 ng de cDNA, 1 µL

de cada primer especifico (R+F) 10 µmol.L-1 e 11 µL de Maxima® SYBR

Green/ROX qRT-PCR Master Mix (2X) (Fermentas). Para testar a especificidade dos

oligonucleotídeos, os produtos foram analisados por curva de dissociação. A

ciclagem de amplificação foi realizada nas seguintes etapas: 50°C por 2 minutos,

95°C por 10 minutos, 95°C por 15 segundos e 60 °C por 1 minuto. Essas etapas

foram repetidas por 40 ciclos. Após a ciclagem de amplificação dos genes, foi

realizada a dissociação dos produtos para confirmar a formação de produtos únicos

e específicos, neste caso as etapas realizadas apresentaram as seguintes

características: 95 °C por 15 segun dos, 60 °C por 1 minuto e 95 °C por 1 segundo.

Para quantificação da expressão utilizou-se o método 2-∆∆Ct (Livak; Schmittgen,

2001), considerando a média dos valores de Ct das três réplicas realizadas.

Tabela 2. Oligonucleotídeos empregados nas análises de qRT-PCR

Gene Loco Oligonucleotídeo

SOD orange1.1g032551m Forward: 5’-TAGGCTTGGGTAAATCCGTAGGA-3’

Reverse: 5’-CTAATCGCCGGCTCCAAAG-3’

GPX orange1.1g027311m Forward: 5’- GCTTGGAGATTCTGGCCTTTC-3’

Reverse: 5’- TCAGCCTTAAAGCGAGTGCAT-3’

39

4.2.15 Análise Estatística

Os resultados dos parâmetros avaliados foram submetidos à análise de

variância e teste de Tukey com significância do teste F de até 5% de probabilidade

(p ≤ 0,05). Todas as análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do

aplicativo SISVAR (FERREIRA, 2011).

40

5 Resultados

Experimento I

O estresse causado pelo déficit hídrico alterou o padrão de comportamento

dos híbridos avaliados ao comparar os resultados encontrados para os dois regimes

hídricos impostos, para a maioria das variáveis analisadas (Tabela 3).

Tabela 3. Síntese da análise de variância para as variáveis avaliadas em função dos regimes hídricos e dos híbridos estudados.

Variáveis

Fator de Variação / Quadrado Médio

Regime Hídrico (RH)

Genótipo (G)

RH*G Erro Média Geral

CV (%)

Umidade do Substrato

743.15 *** 2.11 ** 2.25 ** 0,23 7,54 6,33

Cond. Estomática 6448.48 *** 511.07 ** 500.57 ** 43,26 33,08 19,89

Temperatura Foliar 121.50 *** 3.44 *** 5.61 *** 0,08 40,50 0,71

Área Foliar 1442.59 *** 5270.71 *** 222.86 ** 22,90 66,21 7,23

Número de Folhas 84.38 *** 60.15 *** 6.26 * 1,46 13,29 9,09

Altura de Planta 38.51 *** 84.99 *** 6.82 ** 0,46 11,68 5,82

Diâmetro de Caule 0.27 ** 0.51 *** 0.05 ns 0,02 2,63 5,14

Massa Seca de Folha

0.03 ** 0.08 *** 0.003 * 0,001 0,32 9,52

Massa Seca P. Aérea

0.05 ** 0.21 *** 0.006 ns 0,004 0,54 10,94

Massa Seca de Raiz

0.02 * 0.02 * 0.01 * 0,002 0,30 15,42

MSPA/MSR 1.98 ** 1.55 *** 0.17 ns 0,09 1,84 15,99

Comp. Total de Raiz

63.46 ns 31501.9 *** 2205.85 ns 860,54 267,98 10,95

Diâm. Médio de Raiz

0.0005 ns 0.03 *** 0.003 ** 0,0003 0,67 2,70

41

D. Médio de Raiz 9.59 ns 39457.3 *** 1581.29 ** 140,01 132,99 8,90

(0,0 < d < 0,5 mm)

D. Médio de Raiz 1.85 ns 9209.25 ** 247.76 ns 623,8 112,98 22,11

(0,5 < d < 1,0 mm)

D. Médio de Raiz 6.88 ns 28.63 ns 22.47 ns 9,61 8,82 35,14

(1,0 < d < 1,5 mm)

D. Médio de Raiz 1.43 ns 78.76 ** 2.09 ns 5,89 13,19 18,39

(d > 1,5 mm)

*, ** e *** significativo a 5, 1 e 0,1% de probabilidade pelo teste F, respectivamente, e ns não significativo

O híbrido pé-franco 041 foi o que primeiro apresentou sintomas visuais

(murcha das folhas) que estava sob condições de estresse por déficit hídrico,

ocorrendo 48 dias após a suspensão da irrigação. A umidade do substrato registrado

para esse híbrido foi de 0,84%, enquanto para os demais híbridos, situou-se entre

1,36 a 3,41%. Mesmo não havendo murcha das folhas nos demais híbridos, a

umidade do substrato ficou abaixo de 4%, que é caracterizada como uma umidade

crítica quando o substrato é areia. A restrição de água no solo também influenciou,

de forma significativa, a gs e a temperatura foliar, mas sem distinção entre os

híbridos quando em condições de déficit hídrico para essas duas variáveis (Figura

04). Em condições de controle, o híbrido 041 é o que apresenta a maior gs e o

oposto é registrado para o híbrido 069, que não apresenta diferença significativa

entre o tratamento controle e déficit hídrico. Essa diferença na gs explica a menor e

maior umidade do substrato nas parcelas experimentais do tratamento déficit hídrico

para os respectivos híbridos citados.

42

Figura 4. Umidade do substrato, condutância estomática (gs) e temperatura foliar dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e em diferentes regimes hídricos. Letras maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. NS e ns – não significativo pelo teste de Tukey (p≤0,05). As barras indicam o erro padrão.

43

A restrição de água no solo limitou o crescimento das plantas,

comprometendo o aumento da área foliar, do número de folhas, da altura da planta,

do diâmetro do caule e da massa seca de folha (MSF) e parte aérea (MSPA). Para

todas essas variáveis de crescimento, o híbrido 059 foi o que apresentou os maiores

valores tanto em condições de controle como de déficit hídrico, com exceção para

massa seca de raiz (MSR), tendo o híbrido 041 um aumento significativo de raízes

quando submetido a condições deficitária de água no solo quando comparado ao

tratamento controle, e para os demais híbridos a MSR permaneceu inalterada,

estatisticamente, entre os dois tratamentos (Figura 5).

44

Figura 5. Área foliar, número de folhas, altura de plantas, diâmetro do caule, massa seca de folha (MSF), massa seca da parte aérea (MSPA), massa seca de raiz (MSR) e a razão entre MSPA/MSR dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e diferentes regimes hídricos. Letras maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. NS e ns – não significativo pelo teste de Tukey (p≤0,05). As barras indicam o erro padrão.

45

De maneira geral, o estresse por deficiência hídrica promoveu reduções no

crescimento foliar de todos os genótipos em condição pé-franco, destacando-se os

híbridos 041 com maior e 069 com menor diferença entre os regimes hídricos:

controle e estresse (Figura 6).

Figura 6. Aumento da área foliar dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e diferentes regimes hídricos, ao longo de 48 dias.

O crescimento e a distribuição do sistema radicular é uma possível

estratégia da planta diante da limitação hídrica e afeta suas respostas frente ao

estresse. Neste estudo, não houve diferença significativa entre o comprimento total

das raízes em condições de controle ou seca, entretanto os híbridos 041 e 059

apresentaram em ambas as condições maior comprimento total do sistema radicular

dentre os genótipos analisados e também apresentaram alterações no diâmetro

médio de raízes diante da restrição hídrica, todavia com comportamentos opostos

(Figura 7).

46

Figura 7. Comprimento total de raiz e diâmetro médio de raiz dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e diferentes regimes hídricos. Letras maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. NS – não significativo pelo teste de Tukey (p≤0,05). As barras indicam o erro padrão

Pela dinâmica de crescimento do sistema radicular, observa-se influência da

limitação hídrica no comprimento da classe 0,0 < d < 0,5 mm para os híbridos 041 e

059 apresentando correlação positiva com diâmetro médio de raízes (Figura 7 e 8A).

Figura 8. Comprimento de raiz em diferentes classes de diâmetros: 0.0 < d < 0.5 mm (A); 0.5 < d < 1.0 mm (B); 1.0 < d < 1.5 mm (C) e d > 1.5 (D) dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e diferentes regimes hídricos. Letras maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro cada

47

regime hídrigo. NS e ns – não significativo pelo teste de Tukey (p≤0,05). As barras indicam o erro padrão

Experimento II

O estresse causado pelo déficit hídrico alterou o padrão de comportamento da

laranjeira ‘Valencia’ enxertada no diferentes híbridos avaliados, ao comparar os

resultados encontrados para as variáveis fisiológicas, bioquímicas e moleculares,

entre os diferentes regimes hídricos impostos (Tabela 4).

Tabela 4. Síntese da análise de variância para as variáveis avaliadas em função dos regimes hídricos e dos híbridos avaliados.

Variáveis

Fator de Variação / Quadrado Médio

Regime Hídrico Genótipo RH*G Erro Média Geral

CV (%)

L 46,32 *** 0,12 * 0,03 ns 0,03 -1,64 9,71

RWC (%) 3908,43 *** 5,65 ns 52,29 ns 18,72 75,36 5,74

p 50,11 *** 0,28 ns 0,80 *** 0,16 3,58 11,02

3,27 *** 0,04 ** 0,07 *** 0,01 -2,08 4,71

Cu

rva

de

Pre

ssão

-V

olu

me

(PV

) 1,08 * 0,10 ns 0,33 ns 0,17 -2,34 17,72

TLP0,71 *** 0,04 ns 0,10 * 0,04 -2,82 7,44

RWCTLP 1452,82 *** 139,26 *** 68,95 ** 11,54 79,93 4,25

293,57 *** 4,09 ns 4,72 ns 3,09 14,00 12,56

Flu

ore

scên

cia

da

Clo

rofi

la a

Fo 354,44 * 21,19 ns 164,81 ns 83,87 140,49 6,52

Fm 88758,00 *** 834,64 ns 6012,5 ** 1422,16 673,71 5,60

Fv/Fm 0,01 *** 0,0001 ns 0,0002 ns 0,0001 0,79 1,48

193,46 *** 0,23 ns 0,47 ns 0,79 3,31 26,84

gs 0,05 *** 0,0002 ns 0,0002 ns 0,0004 0,05 44,32

9,43 *** 0,11 ns 0,11 ns 0,09 0,91 32,84

Ci 32954,70 *** 1520,28 ns 791,13 ns 1824,49 247,55 17,25

A/gs 23494,33 *** 1824,57 ns 1617,13

ns 1877,75 86,56 50,06

A/E 21,97 *** 0,16 ns 0,55 ns 0,92 3,38 28,34

48

Ci/Ca 0,23 *** 0,01 ns 0,005 ns 0,01 0,65 17,21 A

tiv.

En

zi-

mát

ica SOD 0,29 ns 0,001 ns 0,02 ns 0,11 11,47 2,84

GPX 706,23 * 2003,46

*** 10,43 ns 43,26 35,17 18,70

Exp

ress

ão

Gên

ica SOD 2,14 * 0,15 1,75 22,45

GPX 2,07 * 0,17 2,38 17,49

*, ** e *** significativo a 5, 1 e 0,1% de probabilidade pelo teste F, respectivamente, e ns não significativo

A diminuição dos valores de umidade do solo durante a imposição do

estresse, nos diferentes regimes hídricos, não seguiu a mesma cinética para os

diferentes híbridos, embora um padrão de extração de água tenha sido observado

independentemente do genótipo, com quedas mais bruscas da umidade na fase

inicial e perdas mais lentas a partir do 17º dia sem irrigação (Figura 9). Entre os

compartimentos do vaso, a umidade pouco se diferenciou em cada leitura, e quando

cada planta do mesmo vaso atingiu a faixa de potencial hídrico foliar que

caracterizou o tratamento aplicado, a umidade do solo situou-se bem próxima para

os quatro diferentes híbridos. A exceção foi o híbrido 059 no tratamento MI, que

registrou valor médio de umidade do solo no final da duração do estresse de 0,126

cm3 cm-3, enquanto que para os demais híbridos registrou-se uma média de

0,141cm3 cm-3 (Figura 9). O valor médio de umidade do solo para o MO foi de 0,125

cm3 cm-3 e para o SE foi de 0,122 cm3 cm-3.

Observa-se que os valores de umidade do solo, no momento das avaliações

fisiológicas, pouco diferiu entre o tratamento MO e SE; porém, as respostas

fisiológicas diferiram significativamente entre esses dois tratamentos para a maioria

das avaliações. A redução da umidade do solo para próximo a 0,12 cm3 cm-3 indica

a umidade limite para a extração de água pelos genótipos avaliados nas condições

impostas nesse estudo, uma vez que a severidade do estresse aumentou, indicado

pelo potencial hídrico foliar, ao passo que a umidade do solo pouco alterou. Isso

pode ser explicado pela continuidade da transpiração da planta em condições de SE

sem extração de água do solo.

A severidade do estresse para o tratamento SE também foi detectada

visualmente, com folhas mais murchas e enroladas quando comparadas às plantas

do MO (Figura 10).

49

Figura 9. Umidade do solo (θ) no período do estresse hídrico para os tratamentos hídricos: estresse leve (A), estresse moderado (B), estresse severo (C) e reidratado (D).

Figura 10. Alterações morfológicas nas folhas em resposta ao déficit hídrico na laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos híbridos 001, 041, 059 e 069, para os regimes hídricos: estresse moderado (A) e estresse severo (B).

O valor da fração de água transpirável do solo, em que se inicia a redução da

transpiração relativa ocorre quando a curva estimada pela equação logística afasta-

se de 1 e inicia-se o decréscimo linear (ponto crítico) (SINCLAIR; LUDLOW, 1986).

Assim, pode-se observar na Figura 11 que os híbridos ‘059’ e ‘069’ apresentaram

50

um declínio nas taxas de transpiração em frações de água transpirável do solo

menores do que os híbridos ‘001’ e ‘041’, indicando que esses últimos apresentam

uma estratégia mais ‘conservativa’, enquanto os primeiros apresentam uma

estratégia mais ‘produtiva’.

.

Figura 11. Transpiração relativa (TR) em função da fração de água transpirável do solo (FTSW).

Diferenças significativas no L foram observadas apenas para os regimes

hídricos. Os tratamentos controle e reidratado não diferiram pelo teste de média

aplicado e apresentaram valores situados entre -0,25 e -0,35 MPa, mostrando a

capacidade dos híbridos em reestabelecer o L em poucas horas após a

reidratação. Os valores médios para o estresse leve foi de -1,13 MPa, diferindo do

estresse moderado com média de -3,01 MPa e estresse severo com valores

menores que -3,5 MPa, caracterizando a intensidade de cada estresse nos

diferentes tratamentos hídricos impostos (Figura 12).

y = -2,6448x3 + 4,2121x2 - 0,7913x + 0,2449 R² = 0,917

y = -3,5291x3 + 5,1286x2 - 0,846x + 0,2149 R² = 0,8875

y = -0,7933x3 + 0,6355x2 + 0,9148x + 0,2482 R² = 0,9763

y = -0,6121x3 - 0,047x2 + 1,487x + 0,1649 R² = 0,9907

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

TR

FTSW

001

041

059

069

51

Figura 12. Potencial hídrico foliar (L) sob influência dos regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado) para os híbridos 001, 041, 059 e 069 dos cinco regimes hídricos aplicados. As letras distintas indicam diferença estatística pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). As barras indicam o erro padrão.

Os regimes hídricos influenciaram de forma significativa o teor relativo de

água (RWC) das folhas de laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos quatro híbridos

avaliados, decrescendo a medida que o déficit hídrico se tornou mais acentuado.

Observou-se que para os híbridos avaliados, quando submetidos a déficit hídrico

com L menor que -3,5 MPa e avaliados 24 horas após a reidratação, houve uma

recuperação parcial do RWC (81,97%) quando comparado ao tratamento controle

(87,67%). O MO foi o que ocasionou o menor RWC (55,61%), com redução de

36,57% em relação ao tratamento controle (Figura 13).

52

Figura 13. Teor relativo de água (RWC) das plantas em diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; RE – Reidratado). As letras distintas indicam diferença estatística pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). As barras indicam erro padrão.

Houve interação entre os fatores para p com valores decrescentes quando a

disponibilidade hídrica do solo foi limitante. Mesmo apresentando resposta

significativa pelo teste de Tukey para o fator de variação porta-enxerto e regime

hídrico, os valores de p não diferiram entre os híbridos quando eles estavam em

condições de CO, MI, MO e SE, todavia, quando em RE, os híbridos diferiram entre

si (Figura 14). A turgescência foliar é influenciada de forma negativa quando a

umidade do solo decresce, corroborando com as diferenças encontradas neste

trabalho entre as condições de disponibilidade (CO e RE) e restrição (MI, MO e SE)

hídrica. O híbrido 059 não alterou seu p nas três diferentes condições de déficit

hídrico, sendo o destaque entre os híbridos para essa variável analisada, visto que

mesmo em SE manteve o mesmo p comparado ao estresse leve (MI). Os híbridos

001 e 041, em condições de déficit hídrico, só apresentaram diferenças entre o MI e

o SE (Figura 14).

Houve o reestabelecimento do p quando a avaliação ocorreu 24 horas após

a irrigação das plantas submetidas ao SE, se igualando ao p das plantas em

condição de potencial matricial do solo próximas a capacidade de campo (Figura

15), com exceção do híbrido 041 que parece responder de forma mais lenta no

processo de recuperação da turgescência foliar (Figura 14).

53

Figura 14. Potencial de turgor (p) sob influência dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado). Letras maiúsculas distintas indicam diferenças entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo e letras minúsculas distintas indicam diferença entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. ns indica não significativo pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). As barras indicam o erro padrão.

Figura 15. Laranjeira ‘Valencia’ enxertada em porta-enxertos híbridos (001, 041, 059

e 069) apresentando p ≤ 2,25 MPa para o tratamento Estresse Severo (A) e p ≥ 5,00 MPa para o tratamento Reidratado (B).

O resultado da análise do mostrou que houve interação entre os porta-

enxertos e os regimes hídricos aplicados, com um padrão similar de comportamento

na acumulação de solutos no interior das células a medida que o estresse por déficit

hídrico foi intensificado. O processo contrário ocorreu quando a planta saiu da

54

condição limitante de água no solo para a capacidade máxima de retenção em um

período de 24 horas, com valores intermediários de situados entre os valores de

MI e MO, demostrando que é necessário um período maior que 24 horas para o

reestabelecimento dos valores da condição CO (Figura 16). Ao analisar o

comportamento dos híbridos dentro de cada regime hídrico, observa-se que o

híbrido 059 apresentou a menor concentração de solutos no interior das células

quando em condição de CO e MI, e o inverso ocorreu quando em condição de MO e

RE.

Figura 16. Potencial osmótico () dos híbridos 001, 041, 059 e 069 sob diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; RE – Reidratado). Letras maiúsculas distintas indicam diferenças entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo e letras minúsculas distintas indicam diferença entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. ns indica não significativo (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey. As barras indicam o erro padrão.

Os parâmetros obtidos pela análise da curva PV mostraram que o teor relativo

de água no ponto de perda de turgor (RWCTLP) e módulo elasticidade (ε)

aumentaram significativamente quando os híbridos 001, 041, 059 e 069 foram

submetidos à déficit hídrico e reidratação. A intensidade do estresse hídrico para as

plantas pertencentes ao tratamento RE foi superior ao das plantas que foram

submetidas ao MO, isso, provavelmente, explica o resultado obtido para essas

variáveis da curva PV. O híbrido 001 difere dos demais híbridos para o RWCTLP na

55

condição de disponibilidade constante de água no solo, com o menor valor (Tabela

5).

Tabela 5. Parâmetros da Curva de Pressão-Volume (PV). Média do teor relativo de água no ponto de perda de turgor (RWCTLP), potencial osmótico em plena

turgescência (0), potencial osmótico no ponto de perda de turgor (TLP), módulo de elasticidade (ε) e ajuste osmótico (AO) em folhas de laranjeira ‘Valencia’ enxertadas nos híbridos 001, 041, 059 e 069

Letras maiúsculas distintas, na coluna, indicam diferença significativa entre os regimes hídricos para cada híbrido. Letras minúsculas distintas, na coluna, indicam diferença significativa entre os híbridos para cada regime hídrico. ns não significativo (p ≥ 0,05) pelo teste de Tukey. ± indica o erro padrão.

Dos três parâmetros avaliados pelo medidor portátil de luz modulada com

base na fluorescência da clorofila a, houve efeito isolado do fator regime hídrico para

a variável rendimento quântico máximo do fotossistema II (Fv/Fm) e efeito da

interação entre os fatores para fluorescência máxima (Fm), não havendo diferença

significativa entre os tratamentos para a fluorescência mínima (F0) (Tabela 5).

Ao analisar a resposta da Fm sobre os regimes hídricos para cada híbrido

avaliado, verifica-se que os menores valores dessa variável foram encontrados no

SE e RE, e os maiores valores nos tratamentos CO e MI, padrão bem definido pelos

híbridos 041 e 069. A Fv/Fm foi alterada pela intensidade do estresse, dado ao

agrupamento do SE e RE pela análise estatística. O MI não causou perturbações no

sistema fotossintético, visto que não houve inibição da atividade fotoquímica quando

comparado ao tratamento CO (Tabela 6).

56

Tabela 6. Fluorescência da clorofila a de folhas de laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos híbridos 001, 041, 059 e 069 sob diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado) para os parâmetros: F0 = fluorescência mínima; Fm = fluorescência máxima; Fv/m = eficiência máxima do fotossistema II.

Letras maiúsculas distintas, na coluna, indicam diferença significativa entre os regimes hídricos para cada híbrido. Letras minúsculas distintas, na coluna, indicam diferença significativa entre os híbridos para cada regime hídrico. ns indica não significativo (p ≥ 0,05) pelo teste de Tukey. ± indica o erro padrão.

Não houve diferença entre os porta-enxertos quanto a taxa líquida da

fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E), concentração de

carbono intercelular (Ci), eficiência intrínseca do uso da água (A/gs), eficiência

instantânea de uso da água (A/E) e razão das concentrações interna e atmosférica

de CO2 (Ci/Ca). Essas variáveis fisiológicas tiveram alteração somente quando as

plantas foram submetidas aos diferentes regimes hídricos (Figuras 17).

Diferenças nas trocas gasosas entre os porta-enxertos provavelmente não

foram detectadas porque no primeiro nível de déficit hídrico (MI), em que as plantas

estavam em uma umidade média do solo, entre os compartimentos, de 0,138 cm3

cm-3, esses parâmetros não diferiram entre os híbridos. No entanto, observa-se que

quando a umidade do solo situa-se entre 0,204 a 0,15607 cm3 cm-3 (entre o 5º e 14º

dia após a suspensão da irrigação), a A, gs e E diferiu entre os híbridos, com base

57

nos valores encontrados, tendo o híbrido 069 os maiores valores no 14º dia (Figura

18).

O déficit hídrico, para os híbridos avaliados, causou decréscimo nos valores

dos parâmetros de trocas gasosas e o SE foi o mais prejudicial às plantas, com uma

redução de 93,77% na A, 43,64% na gs e 84,43% na E, em relação as plantas

mantidas em umidade do solo próximo a capacidade campo (Figura 17). Entre o MI,

MO e RE não houve diferenças nas respostas das plantas, permanecendo com os

parâmetros de trocas gasosas inalterados, com a umidade do solo e L, em MI e

MO, alterando de 0,141 cm3 cm-3 e -1,33 MPa para 0,125 cm3 cm-3 e -3,01 MPa,

respectivamente. A exceção foi para a gs, que mesmo registrando o menor valor sob

SE, não diferiu estatisticamente entre os regimes com déficit hídrico e reidratado.

Figura 17. Taxa líquida da fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E) e concentração de carbono intercelular (Ci), em laranjeira ‘Valencia’ enxertada em quatro diferentes porta-enxertos (001, 041, 059 e 069) submetidos a cinco diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado). Letras distintas indicam diferença significativa (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey. Barras indicam erro padrão.

58

Figura 18. Variação da fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E) e umidade do solo (θ) ao longo de 26 dias sem irrigação para os hídridos 001, 041, 059 e 069.

Os valores de A/gs foram maiores quando as plantas estavam ou passaram

por déficit hídrico, com exceção para o SE que ocasionou uma redução significativa

dos valores dessa relação equiparando-se ao tratamento CO. Conforme o déficit

hídrico se intensificou, os valores da relação A/gs diminuiram, registrando valores de

109,76, 98,66 e 36,48 µmol CO2 mol-1 H2O para os MI, MO e SE, respectivamente

(Figura 19).

A A/E das plantas em condições de MO e RO foi a mesma para as plantas em

condições de CO e MI, com impacto negativo da A/E somente para as plantas em

SE (Figura 19). A razão Ci/Ca permaneceu constante entre os regimes hídricos, com

elevação da concentração de CO2 no mesófilo foliar apenas quando as plantas

estavam em SE (Figura 19).

59

Figura 19. Eficiência intrínseca do uso água (A gs-1), eficiência instantânea de uso da

água (A E-1) e razão das concentrações interna e atmosférica de CO2 (Ci Ca-1) em laranjeira ‘Valencia’ enxertada em quatro diferentes porta-enxertos submetidos a

BC

A AB

C

A

00,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

Control Leve Moderate Drought Rehydrated

A/g

s (µ

mo

l CO

2 m

ol-1

H2O

)

Condictions

A

B

AB

C

AB

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

Control Leve Moderate Drought Rehydrated

A/

E (µ

mo

l CO

2 m

mo

l-1 H

2O

)

Condictions

B B B

A

B

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

CO MI MO SE RE

Ci/

Ca

(µ

mo

l CO

2 m

ol-1

H2O

)

Water Regime

60

cinco diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado). Letras distintas indicam diferença significativa (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey. Barras indicam erro padrão.

A atividade da enzima SOD não diferenciou entre os dois regimes hídricos

(CO e MI) e nem entre os dois híbridos avaliados (‘001’ e ‘059’) (Figura 20A),

indicando que a atividade da SOD não altera seu padrão de acumulação da enzima

frente a fase inicial do estresse hídrico (MI). Para a atividade enzimática da GPX,

houve efeito isolado dos fatores, com maior atividade da enzima para o híbrido ‘001’,

independente do regime hídrico, e em condições de MI a atividade da GPX

sobressai quando em condições de CO, independente do híbrido avaliado (Figura

20B).

Figura 20. Atividade enzimática da SOD (A) e GPX (B) em folhas de laranjeira

‘Valencia’ enxertada nos genótipos 001 e 059 em diferentes regimes hídricos. Letras

maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada

genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro

de cada regime hídrico. NS e ns – não significativo.

Houve aumento de mRNA dos genes que codificam para as enzimas SOD e

GPX quando as plantas estavam em condição de MI, com base nos resultados

encontrados por qRT-PCR, com diferenças significativas entre os genótipos (Figura

21). A expressão do gene SOD para o híbrido 001 foi 2,34x quando comparado ao

nível de expressão em condição de CO, e para o híbrido 059 a quantificação

observada foi de 1,15x. Ao analisar a expressão do gene GPX, o híbrido 001 produz

1,79x mais transcritos quando em MI e o híbrido 059 alcança níveis de 2,96x.

61

Figura 21. Análise da expressão do gene SOD e GPX em folhas de laranjeira

‘Valencia’ enxertada nos genótipos 001 e 059 em condições de Estresse Leve. Os

níveis de expressão foram equiparados com os níveis de expressão gênica de

plantas em condições controle. Letras indicam diferença estatística entre os

genótipos para SOD e GPX. SOD: CV = 22,45%; Significativo a 0,5. GPX: CV =

17,49%; Significativo a 0,5.

A

B

B

A

0

1

2

3

4

001 059

Qu

anti

fica

ção

Re

lati

va

Genotypes

SOD GPX

62

6 Discussão

Experimento I

A compreensão dos mecanismos de respostas e comportamentos dos

híbridos em condição pé-franco permite inferir sobre as possíveis interações e

influências do genótipo como porta-enxerto para tolerância ao déficit hídrico. Na

citricultura é interessante a utilização de porta-enxertos com boas características de

aclimatação às condições climáticas, principalmente as de tolerantes à seca, que

possuam diversidade de respostas à deficiência hídrica, fato que possibilitará a

diversificação de materiais (SUASSUNA et al., 2012). Neste estudo, foram

observados comportamentos diferenciais entre os híbridos nos diferentes regimes

hídricos, com relação às variáveis analisadas.

A umidade do solo e o L foram os parâmetros com maiores discrepâncias

entre os híbridos, sendo preponderantes para compreensão das variações de

respostas dos híbridos e nos regimes hídricos para outras análises realizadas. O

suprimento de água às plantas é determinado pela habilidade da cultura em utilizar a

água disponível no solo, entretanto essa capacidade vai além das culturas,

diferentes genótipos expressam respostas adversas à disponibilidade de água no

solo (CARLESSO,1995). Neste contexto, observou-se que o hibrido ‘041’

apresentou a menor umidade do substrato em restrição hídrica, sugerindo que

dentre os genótipos, este híbrido possui uma alta capacidade de extração de água,

diferentemente do híbrido ‘069’, que apresentou um comportamento mais

conservador mantendo uma umidade do substrato 4x maior quando comparado ao

‘041’ (Figura 4).

63

A inibição de crescimento da parte aérea também é um dos efeitos mais

significativos do estresse por seca, havendo limitação da expansão foliar e com o

aumento da intensidade do estresse, pode acarretar em abscisão foliar, a fim de

contribuir para economia de água (KHANNA-CHOPRA et al., 1999; CHAVES et al.,

2003; CLAEYS; INZÉ, 2013). Todos os genótipos avaliados, com exceção do híbrido

‘069’, apresentaram redução da área foliar pela suspensão da irrigação, diferindo ao

encontrado por Peixoto et al. (2006), que em genótipos citrinos com potenciais para

tolerância ao deficit hídrico, verificaram que o LCR não diferiu significativamente em

área foliar quando em déficit hídrico, bem como a maioria dos híbridos avaliados.

Isso pode ser explicado pelo curto período de estresse progressivo (12 dias). O

híbrido ‘059’ apresentou maior área foliar, dentre os genótipos, independente do

regime hídrico, contudo apresentou um menor número de folhas sob seca.

Contrariamente, o híbrido ‘041’ tem uma menor área foliar com um número de folhas

similar ao híbrido ‘059’ (Figura 5). A diferença de crescimento foliar entre os regimes

hídricos para os dois genótipos foi mais acentuado para o híbrido ‘041’, com

destaque para o 14º dia, ao qual parece ocorrer diferenciação e caracterização do

regime hídrico imposto para cada genótipo, e ao 36º dia (Figura 06) por um provável

processo de aclimatação que requer gasto energético, resultando, em redução do

crescimento (LACHER, 2000).

A gs é um mecanismo bastante eficiente no controle da perda de água na

planta em condições de déficit hídrico tornando-se um potencial indicador da

tolerância à seca (PEDROSO et al., 2014; ULLAH et al., 2017) por estratégia de

conservação da água no ponto crítico. Com exceção do ‘069’, todos os genótipos

tiveram redução significativa da gs em função da diminuição da umidade do

substrato, confirmando que o fechamento estomático é uma das primeiras linhas de

defesa contra a dessecação em plantas cítricas, uma vez que é um processo mais

rápido e flexível, principalmente a curto prazo (CHAVES, 1991). A maior gs em

condição controle foi verificada para o híbrido ‘041’, havendo um decréscimo de 78%

na imposição ao estresse. Já o híbrido ‘059’ teve decréscimo de 68,5% entre o

período sem e com estresse, valor superior ao encontrado por Suassuna et al.

(2014). Estes autores avaliaram também os parâmetros E e A do híbrido ‘059’ sob

restrição hídrica e observaram uma correlação positiva de gs, E e A, havendo uma

redução de 64,52% e 78,82% para E e A, respectivamente, com relação as plantas

em condições de umidade do solo na capacidade de campo. O fechamento

64

estomático também gera custos para a temperatura da folha, este parâmetro é

importante no controle do estado da água das folhas sob o estresse por seca

(ANJUM et al., 2011; MARTIN-STPAUL et al., 2017). Neste estudo, mesmo o híbrido

‘069’, que tinha maior umidade de substrato entre os híbridos para o tratamento

déficit hídrico, apresentou aumento significativo da temperatura foliar sendo similar

ao híbrido ‘041’, indicando uma via de resposta rápida a dessecação.

Durante o início da seca, a redução na gs leva a menor influxo de CO2 para

os cloroplastos, reduzindo as taxas fotossintéticas. Essa restrição da difusão de CO2

contribui para o menor acúmulo de biomassa para a manutenção do

desenvolvimento vegetal (VERSLUES et al, 2006; CHAVES, 1991). Neste estudo,

observa-se que não há diferença significativa para a variável MSF entre os regimes

hídricos para o híbrido ‘041’, todavia há um decréscimo de 23% da MSF de controle

para estresse hídrico no híbrido ‘059’ (Figura 5). Esses dados corroboram com o

encontrado por Suassuna et al. (2012) que observaram uma redução significativa de

MSF para o híbrido ‘059’ quando exposto a estresse hídrico por déficit, sendo este

comportamento semelhante ao LCR no mesmo estudo. Em relação a MSPA,

espera-se que com a progressão do estresse ocorra uma maior redução da

fitomassa da planta como observado na maioria das variedades do estudo de

Cerqueira et al. (2004). Por outro lado, dentre os genótipos avaliados por estes

autores, os híbridos apresentaram menor sensibilidade ao déficit hídrico progressivo.

Contrariamente, Suassuna et al. (2012) constataram que o híbrido ‘059’ teve MSPA

maior quando comparado ao LCR. No presente estudo, o híbrido ‘059’ apresentou

fitomassa superior aos outros genótipos avaliados independente do regime hídrico

(Figura 05), logo, mesmo com a imposição ao estresse, este híbrido mantém uma

maior MSPA. Este fato, possivelmente pode ter ocorrido, visto que o híbrido ‘059’ foi

o que apresentou maior altura, não havendo distinção entre os híbridos 041 e 059

quanto ao diâmetro do caule na restrição hídrica (Figura 5). Vale ressaltar que todos

os genótipos tiveram reduções proporcionais relacionadas ao regime hídrico para

variável diâmetro do caule, diferentemente do observado por Nascimento et al.

(2010), ao qual observaram diferenças entre os regimes hídrico, sendo que o LCR

apresentou maior sensibilidade a restrição hídrica do que os genótipos utilizados no

estudo.

O aumento de raízes é uma das respostas das plantas frequentemente

observadas em restrição hídrica (CHAVES et al., 2003; FAROOQ et al., 2012), seja

65

pelo alto aprofundamento da raiz nas camadas mais profundas ou pela maior

densidade (BLUM, 2005). A expansão do sistema radicular para zona mais

profundas e úmidas do solo permiti o aumento da área de absorção efetiva de água,

assim, normalmente, com uma limitação na disponibilidade hídrica intensa ou

contínua, há um aumento da densidade e comprimento de raízes. Os híbridos ‘041’

e ‘059’ apresentaram resultados contrastantes quanto ao comprimento total e

diâmetro de raízes (Figura 07), no qual o híbrido ‘041’ apresentou aumento do

sistema radicular em diâmetro na classe 0.0 < d < 0.5 mm em condições de limitação

hídrica (Figura 08), corroborando com Moumeni et al. (2011), que observaram que

em situação de déficit hídrico, houve a ativação de genes responsáveis pelo

crescimento e alongamento na ponta das raízes de espécies de arroz tolerante a

seca. O aumento de diâmetro no híbrido ‘041’ condicionou a um incremento

significativo também na MSR, diferentemente dos outros híbridos analisados (Figura

5). Entretanto, a variação da resposta radicular entre os híbridos pode ser justificada

pela diferença de umidade de solo entre eles, dado que em condições de estresse, o

crescimento de raízes pode ser estimulado em resposta à deficiência hídrica como

mecanismo de obtenção de água no solo, mas o crescimento também pode ser

muitas vezes mantido (GRAY; BRADY, 2016; XU et al, 2010), representando

portanto um mecanismo distinto entre os híbridos em resposta ao déficit.

Circunstancialmente, o híbrido ‘041’ apresentou um maior diâmetro de raízes na

suspensão hídrica como uma possível estratégia de manter o equilíbrio da absorção

e perda de água.

Dentre os genótipos avaliados neste estudo, o híbrido ‘041’ foi o que

apresentou características mais semelhantes ao LCR, caracterizado pela alta

capacidade de extração de água no solo e aumento do sistema radicular.

Contrariamente, o híbrido ‘069’ em condição de pé-franco parece usar estratégias de

conservação da água no solo para retardar os efeitos do estresse. Os híbridos

analisados apresentam distintas estratégias e mecanismos de tolerância ao estresse

por déficit hídrico.

66

Experimento II

Ao submeter à laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos híbridos ‘001’, ‘041’, ‘059’ e

‘069’ a condições deficitárias de água no solo, observou-se que as respostas

fisiológicas alteraram, com diferenças significativas entre as plantas que estavam ou

foram submetidas a um nível de déficit hídrico e aquelas que sempre permaneceram

em plena irrigação, com a umidade do solo próximo a capacidade de campo durante

todo o período amostral. Entretanto, a umidade do solo nos diferentes

compartimentos do vaso pouco diferiu e não caracterizou diferenças significativas no

L entre os híbridos independente do regime hídrico imposto. Contrariamente, no

experimento I, os híbridos em condição pé-franco, registraram diferentes umidade de

solo. Sendo assim, a combinação entre os diferentes híbridos no mesmo vaso

possibilitou o compartilhamento da água no solo tornando semelhante entre estes a

extração e armazenamento de água.

O L e o RWC são parâmetros utilizados para medir a intensidade do

estresse hídrico em plantas (FLEXAS et al., 2004), e no presente estudo, para cada

regime hídrico, as plantas apresentaram diferentes valores desses dois parâmetros,

sendo possível verificar que diferenças no potencial matricial do solo modificou o

estado hídrico da laranjeira ‘Valencia’ sem influência dos híbridos avaliados. O

mesmo comportamento, para essa laranjeira enxertada em outros porta-enxertos, foi

observado por Santana-Vieira et al. (2016), Gonçalves et al. (2016), Neves et al.

(2013), Machado et al. (1999), entre outros, quando submetida a déficit hídrico. Os

resultados obtidos confirmam que o estresse por déficit hídrico altera o L e o RWC

e a intensidade do estresse faz com que os valores para cada parâmetro diminua

com diferenças significativas, e com recuperação rápida quando as plantas são

reidratadas.

O fechamento estomático num maior valor de fração de água transpirável no

solo, durante um déficit de curta duração, segundo Ray e Sinclair (1997), será

traduzido em perda de produtividade. Porém, em condições de monocultura, a

espécie que fecha os estômatos em maior fração de água transpirável no solo

apresenta uma estratégia ‘conservativa’, já que irá poupar água e aumentar suas

chances de sobrevivência durante as secas de longo prazo, ainda que haja perda na

67

produtividade (RODRIGUES et al., 2015). Os padrões distintos de resposta de

transpiração para a fração de água transpirável do solo (FTSW) entre os porta-

enxertos, ilustram suas diferentes estratégias adaptativas frente à condições de

deficiência hídrica (Figura 11). As plantas em '001' e '041' mostraram uma estratégia

mais ‘conservativa’ do que as de '069' e '059', reduzindo suas taxas de transpiração

em valores de FTSW relativamente maiores. Plantas pé-franco de 'Sunki Maravilha'

também mostraram uma estratégia ‘conservativa’ em condições de deficiência

hídrica, visto que o início de declínio de transpiração nessas plantas ocorreu em

FTSW de ~0,70, enquanto as plantas pé-franco de limoeiro 'Cravo' mostraram uma

estratégia 'produtiva', mantendo sua transpiração em FTSW de até ~0,60 (NEVES et

al., 2013).

Em reposta a desidratação das folhas (Figuras 12 e 13), as plantas

acumularam solutos no vacúolo e/ou citosol nas células das folhas da laranjeira

‘Valencia’ à medida que o estresse hídrico foi intensificado, com diferenças entre os

híbridos para as mesmas condições impostas. O híbrido 059 foi o que teve a menor

concentração de solutos em MI e a maior em MO. Mesmo não avaliando essa

variável em condições de SE, estima-se que esse híbrido também tenha mantido

uma concentração de solutos mais elevada, em relação aos demais híbridos, para

essa condição hídrica, com base no dados de p, sendo o híbrido com a maior

turgescência foliar. Variação no padrão de reposta para é influenciado tanto pelo

o porta-enxerto, como verificado neste estudo, quanto pela copa, comportamento

esse evidenciado por Santana-Vieira et al. (2016).

Acúmulo de solutos em folhas de citros, sob condições de estresse, é um

mecanismo que também mantém o turgor das células (MARIJUAN; BOSCH, 2013),

como observado no presente estudo, havendo pouca alteração do p pouco alterado

nas três diferentes condições de déficit hídrico (Figura 14). Sugere-se que este

mecanismo seja uma resposta viável da planta ao déficit, mesmo em condições

iniciais de estresse (Figura 16), visto que os hidratos de carbono, além de serem

uma ótima fonte de energia, podem atuar como osmoprotetores e também manter o

turgor das membranas celulares e evitar a degradação protéica (MARIJUAN;

BOSCH, 2013; SCHER et al., 2012; ASHRAF et al., 2011). Esses mesmos

carboidratos previnem as células de danos oxidativos através da interação com

68

espécies reativas de oxigênio (ROS), exercendo uma atividade antioxidante

(KEUNEN et al., 2013).

A crescente acumulação de soluto em condições de limitação hídrica,

corrobora com os dados da curva PV, ao indicar que houve ajuste osmótico (AO)

entre os híbridos avaliados (Tabela 5), sugerindo que o aumento nas concentrações

de soluto responsáveis pelo AO foi proporcionado pelo processo de perda de água

que as células tiveram, conforme redução nos valores de RWC (Figura 13). O

acúmulo de solutos compatíveis não é nocivo ao metabolismo celular e, por

aumentar a pressão osmótica no interior das células, mantêm a absorção de água e

a pressão de turgor das células, o que contribui para a continuidade dos processos

fisiológicos, ainda que em níveis menores (MARIJUAN; BOSCH, 2013;

RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010). Esse mecanismo de aclimatação ajuda a folha a

conservar a água dentro de uma certa variação do potencial de água no solo. O

enrijecimento da parede celular reduz o potencial hídrico foliar quando há diminuição

do teor relativo de água na folha (LENZ et al. 2006), e o aumento da rigidez e

acumulo de solutos na célula para a manutenção da turgescência celular se dá pelo

processo de aclimatação pela condição imposta, sendo um mecanismo de tolerância

da planta (VERSLUES et al., 2006; MEDINA et al., 2005). Assim, o ajustamento

osmótico permite que o crescimento celular ocorra sob um potencial hídrico que

geralmente seria inibidor de tal condição. Ele também auxilia a manutenção da

abertura estomática e o funcionamento do maquinário fotossintético (Figura 17),

permitindo que este opere mesmo em condições de baixo potencial hídrico

(TURNER 1997).

O teor relativo de água no ponto de perda de turgor (RWCTLP) aumentou

significativamente quando os híbridos 001, 041, 059 e 069 foram submetidos ao

déficit hídrico. Estes dados são diretamente proporcionais ao aumento significativo

no módulo de elasticidade (ε), os quais indicam que as suas paredes celulares se

tornaram mais rígidas com o déficit hídrico. O inverso ocorreu com o potencial

osmótico em plena turgescência (0), diminuindo em déficit hídrico, o que demonstra

a ocorrência de ajuste osmótico para esses híbridos (Tabela 5). Esse mesmo

mecanismo de ajuste foi encontrado em ‘Sunki Tropical’ (Citrus sunki Hort. ex. Tan.)

e trifoliata ‘Flying Dragon’ (Poncirus trifoliata L.) quando enxertados em laranjeira

‘Westin’ em condição de seca (GONÇAVES et al., 2016) e em Poncirus trifoliata e

tangerineira ‘Cleópatra’ enxertado em laranjeira ‘Valencia’ (RODRÍGUEZ-GAMIR et

69

al., 2010). Quando o 0 e o TLP diminuem em condições de déficit hídrico é um

indicativo de maior tolerância à deficiência hídrica, pois os tecidos suportam a

condição adversa por mais tempo antes das células atingirem o estado de

plasmólise (MARUR, 1999). O TLP define o potencial de água no solo abaixo do

qual a planta não pode absorver água suficiente para recuperar seu máximo teor de

água.

Quando a fluorescência da clorofila a apresenta alterações em plantas sob

diferentes regimes hídricos, isso pode ser um indicativo de comprometimento no

processo fotossintético. Dessa forma, avaliação dessa variável fisiológica torna-se

útil para mensurar as alterações na capacidade fotossintética das plantas em

decorrência de estresse causado por deficiência hídrica. A relação Fv/Fm é uma

estimativa da eficiência quântica máxima da atividade fotoquímica do fotossistema II,

quando todos os centros de reação estão abertos (BAKER; ROSENQVST, 2004).

Essa relação tem sido utilizada frequentemente para detectar perturbações no

sistema fotossintético causada por estresses ambientais, visto que a diminuição

indica inibição da atividade fotoquímica. Mesmo a planta em plena turgescência

foliar, potencial hídrico foliar condizente a condições ótimas de umidade no solo e

teor relativo de água acima de 80%, a maquinaria fotossintética do fotossistema II

das plantas pertencentes ao tratamento RE tem uma eficiência fotoquímica reduzida

quando comparado ao tratamento CO e MI, indicando que reduções bruscas do

RWC podem afetar o fotossistema II, mesmo a planta sendo avaliada 24 horas após

a rega. Apesar dessas reduções terem sido significativas pelo teste de Tukey, o

valores obtidos de Fv/Fm para SE e RE estão dentro da faixa indicativa de aparelho

fotossintético intacto (BOLHÀR-NORDENKAMPF et al., 1989; MAXWELL;

JOHNSON, 2000). Com base nesses autores, mesmo com diferença estatística

entre os regimes hídricos, não houve dano fotoinibitório nos centros de reação do

fotossistema II pelos tratamentos em que as plantas estavam ou passaram por

déficit hídrico.

A água é um dos fatores que regula a abertura e o fechamento dos

estômatos, sendo essa estrutura responsável pela regulação do fluxo de CO2 em

direção ao sítio de carboxilação, de modo que a redução desse fluxo é uma das

principais causas da redução da fotossíntese (BOSCO et al., 2009; SHIMAZAKI;

YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007). A restrição de água no solo fez a A, gs e E

diminuírem, com valores de cada parâmetro situados abaixo da faixa considerada

70

limite para citros (MATTOS JUNIOR et al., 2005), demostrando que as plantas

alteraram as respostas para esses parâmetros em função das condições de estresse

hídrico em que foram submetidas, sem diferenças significativas entre os porta-

enxertos. Alguns pesquisadores têm verificado resposta similares ao submeterem

laranjeiras enxertadas tanto em híbridos quanto em cultivares de citros e em outras

espécies cultivadas (SANTANA-VIEIRA et al., 2016; PEDROSO et al., 2014

CLAEYS; INZE, 2013; ROMERO et al., 2006; MACHADO et al., 1999). Em estudo de

campo feito por Carvalho et al. (2016) com diferentes portas-enxertos na estação de

seca, verificaram que a gs e E em folhas de laranjeira ‘Pera‘ de aproximadamente

2,5 anos não diferiram entre limoeiro 'Cravo' comum, limoeiro 'Cravo Santa Cruz',

‘TSKC X CTSW - 041’ e ‘TSKC x (LCR x TR) - 059,’ enquanto que a A, A E-1 e A gs-1

foram parâmetros em que o ‘059’ sobressaiu. O comportamento semelhante entre os

híbridos, no presente estudo, para as variáveis mencionadas, podem estar sob a

influência da variedade copa e/ou intensidade do estresse.

Ao avaliar o efeito da restrição hídrica a partir de 45% abaixo da capacidade

de campo, a condutância estomática diminuiu em 79,5%, 80,2%, 88,4% e 81,0%

para os tratamentos MI, MO, SE e RE, respectivamente. No experimento I, a gs não

diferiu significativamente entre os híbridos, em condição de restrição hídrica, mesmo

havendo uma menor umidade para o híbrido ‘041’, logo sob restrição hídrica há uma

resposta imediata dos estômatos mantendo-se constante independente do aumento

na severidade ao estresse e após reidratação. Uma redução tão significativa da gs

desde o primeiro nível de estresse (MI) pode ser um indicativo da ocorrência de

ajustamento fisiológico mais eficiente sob a influência dos híbridos avaliados, por

aumentar a resistência estomática ao fluxo de vapor d’água das folhas através dos

estômatos para a atmosfera externa a fim de manter o potencial hídrico nas folhas

(TAIZ; ZEIGER, 2009). Cerqueira et al. (2004) ressaltam que a abertura dos

estômatos, que é diretamente relacionada à condutância estomática, depende do

grau de saturação hídrica das células estomáticas, e pode influenciar a taxa de

transpiração. Plantas que reduzem rapidamente a condutância estomática são

consideradas preventivas (LEVITT, 1980), e o fechamento parcial dos estômatos é

devido à desidratação das células-guardas e, provavelmente, por resposta

hormonal.

Santana-Vieira et al. (2016) obtiveram resultados semelhantes para os

parâmetros de troca gasosa quando submeteram a laranjeira ‘Valencia’ enxertada

71

em limoeiro ‘Cravo’ e tangerineira ‘Sunki Maravilha’ a condição de déficit hídrico

com L ≤ -2,0 MPa. Os resultados obtidos no estudo citado mostraram que esses

parâmetros melhoram suas respostas de forma significativa 24 horas após a

reidratação, com valores intermediários entre controle e déficit hídrico, o que não foi

observado no presente estudo. Esses mesmo autores relatam que a concentração

de ácido abscísico (ABA) nas folhas e raízes aumentou sob condições de seca, e

observaram que esse resultado está associado a diminuição da condutância

estomática. Possivelmente, os híbridos utilizados neste estudo realizam estratégia

de prevenção com alteração rápida na condutância estomática mesmo em

condições leve de estresse. Todavia, não houve recuperação imediata da

condutância estomática após 24 horas de reidratação. Mesmo não havendo como

inferir se houve influência de respostas hormonais para tais respostas. Gomes et al.,

1999 relatam que mesmo em condições pós-estresse (reidratado), níveis de ABA

podem permanecer elevados mantendo o fechamento parcial dos estômatos. Neves

et al. (2013) verificaram que a concentração de ABA em folhas de ‘Sunki Maravilha’

aumentou em 80% quando a umidade do solo foi reduzida de 0,17-0,16 cm3 cm-3

para 0,15-0,14 cm3 cm-3, indicando uma possível regulação do fechamento

estomático mediado por ABA no presente estudo, conforme dados de umidade do

solo ao longo do tempo (Figura 18).

A fotossíntese teve uma correlação positiva, tanto com a condutância

estomática quanto com a transpiração, mostrando que as respostas dessas

variáveis estão interligadas quando plantas cítricas estão submetidas a condição de

seca, corroborando com os resultados de Santana-Vieira et al. (2016) e Pedroso et

al. (2014). Quando as plantas estavam com o L -3,5 MPa, a A diminuiu

significativamente dentre os regimes com restrição hídrica, comportamento não

registrado para a gs, não diferenciando entre SE e MI, mantendo a condutância em

SE sem diferenciar de MI. Tal fenômeno pode também ter sido atribuída por fatores

não estomáticos, determinadas, possivelmente, pela inativação parcial da enzima

rubisco, bem como a sua concentração (RIBEIRO; MACHADO, 2007; VU;

YELENOSKY, 1988). Isso pode justificar o aumento de Ci, podendo estar

relacionado a queda na atividade de enzimas envolvidas no processo de fixação de

CO2 (MACHADO et al., 1999) e possível diminuição na carboxilação (MATTOS

JUNIOR et al., 2005) ou pelo aumento d fotorespiração. Outra hipótese seria pela

redução da eficiência fotoquímica do fotossistema II (MAGNANI, 2005), contudo esta

72

é menos provável, visto que os dados desse trabalho evidenciam a integridade

desse fotossistema.

Para os parâmetros de trocas gasosas houve recuperação, de forma parcial,

das taxas 24 horas após a reidratação, indicando que é necessário um período

maior que esse para o completo retorno da atividade fisiológica, como mostrado em

diversos trabalhos (SANTANA-VIEIRA et al., 2016; NEVES et al., 2013;

CERQUEIRA et al., 2004; MACHADO et al., 1999).

Consequentemente, essas mudanças de respostas para os parâmetros de

trocas gasosas frente aos estresses em que as plantas foram submetidas, reflete

nos resultados das análises das relações desses parâmetros, com diferenças

significativas para os regimes hídricos em que as plantas estavam condicionadas. O

melhor resultado da AE é quando a planta absorve o máximo de CO2 com o mínimo

de perda de água, que está relacionada à quantidade de carbono que a planta fixa

por cada unidade de água que perde (SHIMAZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI,

2007; TAIZ; ZEIGER, 2009). Segundo Larcher (2000), a melhor relação entre

absorção de CO2 e perda de H2O é alcançada quando os estômatos estão

parcialmente fechados. O mecanismo de regulação estomática tende acompanhar a

quantidade de água no solo, confirmados nesse estudo, fechando os estômatos

antes que ocorra grandes alterações na fotossíntese líquida da planta. Isso

evidencia que os híbridos avaliados foram eficientes quanto ao uso da água, pois

A/E e A/gs não diferiram entre CO, MI, MO e RE (Figura 19), com valores elevados

para os regimes de restrição hídrica, com exceção para o SE. Coêlho e Oliva (1981)

asseguram que alto valor de AE associado a uma menor taxa transpiratória, e em

condições de turgidez, sugere um comportamento conservador, enquanto que em

uma situação contrária sugere um comportamento consumidor. A utilização da água

disponível de forma mais eficiente é um mecanismo da planta para sobreviver por

período prolongado em condições de seca, característica indicada para plantas

cultivadas em sistema de sequeiro. Deve-se considerar que a perda de água foi

somente por transpiração, o que não ocorre nos pomares citrícolas, que pode ser

atenuado pelo adensamento das plantas, já que os híbridos são indutores de

redução da copa. Assim, as respostas morfológicas e fisiológicas das folhas ao

déficit hídrico são cruciais para reduzir a perda de água e promover a eficiência do

seu uso (FANG; XIONG, 2015).

73

As enzimas SOD e GPX são importantes componentes do sistema de

eliminação de ROS em plantas expostas a fatores de estresses. O incremento na

atividade dessas enzimas tem sido correlacionado com a maior capacidade dos

genótipos em evitar danos oxidativos e dessa forma melhorar a aptidão para tolerar

o déficit hídrico (BOARETTO et al., 2014; FU, 2014; BELA et al., 2015; Zhang et al.,

2015; GONÇAVES et al., 2016; Anjum et al., 2017). No presente estudo, a

expressão gênica e a atividade enzimática relacionada a SOD não se

correlacionaram, indicando que um ou mais níveis de regulação pós-transcricional

podem estar envolvidos na regulação da atividade dessa enzima. Não foram

observados incrementos da atividade dessa enzima em decorrência do estresse de

deficiência hídrica, em nenhum dos híbridos avaliados. Esse resultado sugere que o

estresse vivenciado pela planta (MI) provavelmente não promoveu aumento do

ânion superóxido (O2-) para que os níveis da enzima SOD alterasse entre os

tratamentos CO e MI. Por outro lado, uma correlação positiva entre a atividade

enzimática e a expressão gênica foi verificada para GPX, em que houve incremento

nos valores dessas variáveis em condições de MI para ambos os híbridos avaliados.

Comportamento semelhante foi encontrado por Gonçalves et al. (2016), ao relatarem

que limoeiro ‘Cravo’ enxertado com a copa de laranjeira ‘Westin’ não diferiu no

valores da atividade da SOD entre o tratamento controle e déficit hídrico; porém,

houve um aumento do nível de expressão gênica para essa enzima em condições

de seca. Esses mesmos autores observaram que a atividade da GPX para ‘Cravo’ e

‘Sunki Tropical’ não teve diferença significativa entre as plantas em condições

controle e de seca, mas houve o aumento na expressão do gene, contrariamente ao

obtido para os híbridos avaliados nesse experimento. No entanto, esses autores

relataram um aumento significativo nos níveis de expressão gênica e atividade

enzimática de GPX em plantas de laranjeira ‘Westin’ enxertadas em trifoliata ‘Flying

Dragon’ submetidas à deficiência hídrica. Portanto, coletivamente esses resultados

indicam que GPX é a mais importante enzima antioxidante a atuar em condições de

estresse por deficiência hídrica em citros.

74

7 Conclusão

Em condição de deficiência hídrica, os híbridos pé-franco avaliados apresentam

respostas similares de fechamento estomático, mas respostas distintas quanto a

extração de água do solo, crescimento e distribuição radicular quanto a classe de

diâmetro.

Os quatros híbridos avaliados na condição de enxertia possuem os mesmos padrões

de respostas fisiológicas quando em condições limitantes de água no solo em

diferentes intensidades de estresse, mantendo as eficiências instantânea e intríseca

do uso da água mesmo com redução significativa no teor relativo de água foliar,

indicando possível mecanismo de prevenção da desidratação.

Os ajustamentos osmótico e elástico das paredes celulares e a indução da

expressão gênica e atividade de GPX garantiram a turgescência mínima e

homeostase celular para a realização da fotossíntese e manutenção do crescimento,

mesmo que em menores níveis.

75

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