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Bedeutung von Peroxisomen im Metabolismus von degenerativen sowie malignen Lebererkrankungen beim Hund Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen
Nationalbibliografie;
1. Auflage 2012
Gießen
degenerativen und neoplastischen Lebererkrankungen beim Hund
INAUGURAL – DISSERTATION
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
Deutsches Primatenzentrum, Göttingen
Tierärztliche Hochschule Hannover
Deutsches Primatenzentrum, Göttingen
Tierärztliche Hochschule Hannover
Institut für Pathologie
Meinem Vater, meiner Mutter
2.2.2 Abnahme der Peroxisomenzahl durch Autophagie ...................................... 37
2.3 Hepatopathien des Hundes .......................................................................... 39
2.3.1 Hepatozelluläre Degeneration ...................................................................... 42
Hepatozyten .................................................................................................. 48
3.1.1 Einleitung ...................................................................................................... 57
3.1.2 Patienten ....................................................................................................... 57
3.1.5 Auswertung und Dokumentation ................................................................... 65
3.1.6 Statistik ......................................................................................................... 68
3.2 Ergebnisse .................................................................................................... 68
3.2.2 Veränderungen der labordiagnostischen Leberwerte ................................... 72
3.2.3 Lichtmikroskopische Untersuchungsergebnisse ........................................... 76
4.2.3 Quantitative Erfassung der Peroxisomen/Hepatozyt- Fläche/Rasse........... 133
4.2.4 Morphologische Untersuchungen ............................................................... 134
5 Zusammenfassung ..................................................................................... 142
6 Summary .................................................................................................... 145
7 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 148
8 Abbildungsverzeichnis ................................................................................ 166
9 Tabellenverzeichnis .................................................................................... 172
10 Anhang ....................................................................................................... 174
10.1.1 Fixierlösungen............................................................................................. 174
10.2 Anhangstabellen ......................................................................................... 182
Px Peroxisom
RHT Rauhaardackel
s Sekunde
SOD Superoxiddismutase
Abkürzungsverzeichnis
vak. vakuolär
WHWT Westhighland White Terrier
zahlreicher wissenschaftlicher Untersuchungen in der Humanmedizin sind. Die
Untersuchungsergebnisse zeigen, dass die Peroxisomen an zahlreichen humanen
kongenitalen Erkrankungen beteiligt sind. „Lorenzo´s oil“ ist der Titel eines Filmes,
der sehr eindrücklich das Leben eines Jungen erzählt, der an einer unerklärlichen
Erkrankung leidet. Gleichgewichtsstörungen und letztlich schwere Hirnschädigungen
sind Folgen dieser Erkrankung, bei der es sich um die „Adrenoleukodystrophie“
handelt. Intensive wissenschaftliche Untersuchungen der letzten Jahrzehnte führten
zu der Erkenntnis, dass kleine Zellorganellen, Peroxisomen, die Ursache dieser
Erkrankung sind. Das Zellweger Syndrom und die „Refsum disease“ sind weitere
kongenitale peroxisomale Erkrankungen. Durch die Entdeckung der Peroxisomen
1954 durch RHODIN und die weiteren wissenschaftlichen Untersuchungen des
belgischen Wissenschaftlers DE DUVE (1966) erlangte diese kleine Organelle eine
immer größere Bedeutung. Ihre Beteiligung innerhalb komplexer physiologischer
Vorgänge, wie Einbindung in den Wasserstoffperoxidstoffwechsel, die ß-Oxidation
langer bis sehr langer Fettsäuren, die Synthese komplexer Substrate wie
Cholesterine, Plasmalogene und Gallensäuren, sowie die Fähigkeit sich in
Anwesenheit sogenannter Peroxisomenproliferatoren zu vermehren, machten sie zu
einem spannenden Forschungsgebiet, vor allem in der Humanmedizin. Während sich
die ersten Arbeiten mit den kongenitalen Erkrankungen der Peroxisomen befassten,
folgten durch DE CRAEMER (1995) wissenschaftliche Untersuchungen zum
Verhalten der Peroxisomen bei erworbenen Erkrankungen, wie Steatose, Hepatitis
und Zirrhose, hervorgerufen durch verschiedene Noxen wie Alkohol, Viren und
diverse Medikamente. Weitere Untersuchungen folgten zum Verhalten der
Peroxisomen bei cholestatischen Prozessen der Leber, Hepatomen und
extrahepatischen Tumoren mit oder ohne Lebermetastasen.
Die wissenschaftlichen Erkenntnisse über Peroxisomen in der Veterinärmedizin sind
bis dato sehr gering. LAGING et al. (1988) untersuchten vergleichend das Verhalten
12 1 Einleitung
der Peroxisomen in Leber und Niere von Hunden der Rasse Beagle und Dalmatiner
bei purinreicher und purinarmer Ernährung. Sie kamen zu der Erkenntnis, dass
Dalmatiner unabhängig von der Ernährung größere und zahlreichere Peroxisomen
haben als Beagle. Eine weitere Untersuchung von CENTER und Mitarbeitern (1993)
befasste sich mit dem Verhalten der hepatischen Peroxisomen in an Lipidose
erkrankten Katzen. CENTER et al. (1993) vermuteten dabei, dass eine Abnahme der
Peroxisomen mit dem Krankheitsbild der hepatischen Lipidose einhergeht. Die ersten
elektronenmikroskopischen Daten zur Morphometrie der hepatozellulären
Peroxisomen des Hundes wurden 1973 erhoben. Dies erschien notwendig, da der
Hund immer häufiger für pharmakologische und toxikologische Studien als Modell für
humane Lebererkrankungen herangezogen wurde (HESS et al. 1973).
Elektronenmikroskopische und biochemische Untersuchungen aus der
Humanmedizin zum Verhalten von Peroxisomen bei tumorösen und degenerativen
Erkrankungen der Leber (HRUBAN 1979; DE CRAEMER et al. 1993) ergaben, dass
bei degenerativen Erkrankungen, z.B. aufgrund von hepatischer Lipidose/Steatose
und entzündlichen Prozessen, im Rahmen eines erhöhten oxidativen Stresses für die
Hepatozyten, die Zahl der Peroxisomen ansteigt. Tumoröse Veränderungen der
Leber, seien sie nun primären oder sekundären Ursprunges, führten dagegen in der
Mehrzahl der Fälle zu einer Verminderung der Peroxisomen. Weiterhin haben
Untersuchungen gezeigt, dass unter dem Einfluss des Tumornekrosefaktors die
Bildung von Radikalen erheblich ansteigt. In einem solchen Fall ist die
Kapazitätsgrenze der Peroxisomen erreicht, und es kommt zu einem Abbau dieser
Organelle infolge zunehmender Zellzerstörung (YASMINEH et al. 1991). Es kann
deshalb vermutet werden, dass die Anzahl der Peroxisomen in einem Verhältnis zum
Grad der Malignität zu sehen ist. Weiterhin kann vermutet werden, dass
therapeutische Maßnahmen, welche zu einer Peroxisomenvervielfältigung führen
über eine Beeinflussung des oxidativen Stresses und Veränderungen bei der
Energiegewinnung einen Einfluss auf die Leberzelle haben könnten. Angesichts
dieser Informationen aus der Humanmedizin ist es Ziel dieser Arbeit, das Verhalten
der hepatozellulären Peroxisomen im Metabolismus von Lebererkrankungen des
Hundes elektronenmikroskopisch zu untersuchen. Dabei wurde insbesondere auf
1 Einleitung 13
Veränderungen einerseits und malignen Tumoren der Leber andererseits
eingegangen, um zu überprüfen, ob die von CRAEMER et al. (1993) bzw. HRUBAN
(1979) gewonnenen Erkenntnisse auch auf den Hund übertragbar sind.
14 2 Literaturübersicht
2.1 Das Peroxisom
Peroxisomen kommen sowohl im Pflanzen- als auch im Tierreich vor. Es wurde von
ihrem Vorkommen in Amphibien, Insekten, Schnecken, Würmern und Protozoen
berichtet (MASTERS u. CRANE 1995).
Die Peroxisomen wurden erstmals 1954 durch RHODIN in Nierentubuluszellen von
Ratten entdeckt, er gab diesen Zellorganellen zunächst den Namen „Microbodies“
(RHODIN 1954). Im Jahre 1956 wurden Zellorganellen, die den bereits
beschriebenen „Microbodies“ der Niere sehr ähnlich waren, in Hepatozyten von
Rattenlebern gefunden (Abbildung 2-1) (LAZAROW u. FUJIKI 1985).
Weitere Aufklärung haben in den 60iger Jahren die biomedizinischen Experimente
von DE DUVE und BAUDHUIN (1966) erbracht, in denen Peroxisomen von
Rattenlebern isoliert und deren enzymatische Ausstattung näher differenziert wurde.
Diese biochemischen Erkenntnisse führten dazu, dass der morphologisch geprägte
Name „Microbody“ der funktionellen Bezeichnung „Peroxisom“ wich.
Die Isolierung der Peroxisomen und die anschließende zentrifugale Fraktionierung
ihrer einzelnen Komponenten, wie das peroxisomale Core oder Nukleoid, die
peroxisomale Matrix und die peroxisomale Membran, ermöglichten eine detaillierte
Aufschlüsselung der enzymatischen Ausstattung der Peroxisomen. Darüber hinaus
diente die Elektronenmikroskopie, insbesondere die zytochemische Färbung und die
immunhistochemische Elektronenmikroskopie, der Aufklärung der Funktion, der Art
und der Lokalisation der einzelnen peroxisomalen Enzyme und der Aufklärung der
verschiedenartigen morphologischen Erscheinungsbilder (MASTERS u. CRANE
1995).
Im Folgenden wird vor allem auf den Aufbau der Peroxisomen und deren
enzymatische Ausstattung im Hinblick auf die verschiedenen Funktionen
eingegangen. Außerdem wird kurz das Peroxisom im Zusammenspiel mit anderen
2 Literaturübersicht 15
Zellorganellen betrachtet. Im Anschluss werden die Mechanismen zur Regulation der
Peroxisomenzahl in der Zelle besprochen, bevor ein allgemeiner Überblick zu den
Hepatopathien des Hundes folgt.
Abbildung 2-1 Aufbau einer idealisierten tierischen Zelle (LÖFFLER et al. 2007)
2.1.1 Morphologie
Peroxisomen sind dynamische Organellen, die in Größe und Aussehen variieren
können. Darüber hinaus sind sie in der Lage, ihre räumliche Position in der Zelle
entlang des Zytoskelettes zu verändern (SCHRADER et al. 2003). Im Gegensatz zu
den Lysosomen, die sich eher perikanalikulär aufhalten, folgt die Lage der
Peroxisomen im Leberläppchen keinem festgelegten Muster (NOVIKOFF u.
16 2 Literaturübersicht
GOLDFISCHER 1969). In gesunden Hepatozyten liegen die Peroxisomen homogen
im Hepatozyten verteilt vor und das Auftreten von Peroxisomen in Gruppen ist üblich
(ROELS et al. 1983).
Peroxisomen können eine sphärische bis längliche Gestalt haben (Abbildung 2-2),
sich aber auch in Form eines tubulär-retikulären Netzwerkes darstellen, welches
häufig mit Fetttropfen assoziiert ist (SCHRADER 2001).
Abbildung 2-2 Elektronenmikroskopische Darstellung eines Peroxisoms (Pfeil) mit Marginalplatte und Nukleoid. (P596-07/K1979), Ultradünnschnitt, Transmissionselektronenmikroskopie, Gerätevergr. 16.000x).
Peroxisomen besitzen im Zentrum einen dunklen homogenen Kern, der kristalline
Strukturen enthält (BERNHARD u. ROUILLER 1956) und nach BAUDHUIN et al.
(1965) als Kern mit „amorpher und fein granulärer Struktur“ beschrieben wird. Der
Kern, auch Nukleoid genannt, ist in Abhängigkeit zur Schnittebene des
elektronenmikroskopischen Präparates nicht in allen Peroxisomen der Leber
sichtbar. Ebenso abhängig von der Schnittebene ist das Erscheinungsbild des
Nukleoids: feingranulär oder polytubulär (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966). Im
2 Literaturübersicht 17
Längsschnitt haben die Nukleoide eine längliche rechteckige Gestalt, während sie im
Querschnitt rund erscheinen. Sie liegen frei in der Matrix der Peroxisomen. Der
Umfang der Nukleoide beträgt 0,69-0,74 µm (LAGING et al. 1988). Allgemein ist das
Auftreten der Nukleoide in Leber und Nieren verbunden mit der Anwesenheit von
Uratoxidase, so dass Organismen ohne Nukleoide auch nicht über das Enzym
Uratoxidase verfügen. Es gibt aber Abweichungen davon, so dass Nieren von Ratten
und Hepatozyten des Menschen keine Uratoxidaseaktivität zeigen, jedoch über
Nukleoide verfügen und einige Nichtvertebraten, große Mengen an Uratoxidase
beherbergen, aber keine entsprechend hohe Anzahl an Nukleoiden aufweisen
(MASTERS u. CRANE 1995).
Die Membran der Peroxisomen besteht aus einer trilamellären Struktur, die eine
Dicke von 4,5 bis 8 nm aufweist (HRUBAN et al. 1966). Damit ist sie deutlich dünner
als die Membran von Lysosomen (MASTERS u. CRANE 1995).
Die Peroxisomen des Hundes sind 0,3-0,9 µm im Diameter und somit etwas kleiner
als die Peroxisomen der Ratte. Die Peroxisomen in der Leber von Dalmatinern sind
im Vergleich mit denen von Beagle deutlich größer und weisen eine höhere Dichte
auf (LAGING et al. 1988). Peroxisomen des Hundes enthalten kristalloide Nukleoide,
die aus 3-8 parallel verlaufenden Linien bestehen (SHNITKA 1966). Das Nukleoid
des Peroxisoms beim Hund ist Sitz der Urikase (BAUDHUIN et al. 1965; HAYASHI et
al. 1976; CHEVILLE 1994a). Peroxisomen in Zellen der kaninen Perianaldrüse
(KUHN 1968) sowie der Leber und der Niere (HRUBAN u. RECHCIGL 1969)
besitzen eine Marginalplatte, in Form einer elektronendichten Verdickung unter der
Membran, die durchschnittlich 0,25-0,39 µm lang ist (LAGING et al. 1988). In diesem
Teil des Peroxisoms ist die L-alpha-Hydroxysäureoxidase B lokalisiert (ZAAR 1992).
Die Peroxisomen des Hundes nehmen nur ca. 3,9 % des Zytoplasmas ein, obwohl
ca. doppelt so viele in einer Zelle vorhanden sind wie Mitochondrien, die 24 % des
zytoplasmatischen Volumens ausmachen (HESS et al. 1973).
Aufgrund ihrer charakteristischen morphologischen Eigenschaften sollen
Peroxisomen auch ohne spezielle Färbung eindeutig von den häufig räumlich
benachbarten Mitochondrien zu unterscheiden sein (BERNHARD u. ROUILLER
18 2 Literaturübersicht
1956). Eine Abgrenzung von Lysosomen ist ebenfalls möglich, da Peroxisomen
kleiner sind, ein homogeneres Erscheinungsbild besitzen, häufig zentral ein Nukleoid
aufweisen und eng mit dem Endoplasmatischen Retikulum assoziiert sind (SHNITKA
1966). Darüberhinaus sind Lysosomen in der Lage Substrate zu inkorporieren, eine
Eigenschaft, die den Peroxisomen fehlt (SHNITKA 1966).
Im Rahmen eines schnellen Zellwachstums können die Peroxisomen sehr
verschiedenartige und komplexe Formen annehmen. Dieses Phänomen kann
beispielsweise durch eine partielle Hepatektomie, Stimulation mit
Wachstumsfaktoren, Zugabe freier Fettsäuren oder freier Radikale provoziert werden
(SCHRADER et al. 1998a; SCHRADER et al. 1999).
2.1.2 Funktion
Die Peroxisomen sind in ein großes Spektrum an Aufgaben und Funktionen in der
eukaryontischen Zelle involviert (PLATTA u. ERDMANN 2007). Sie sind besonders
an Oxidations- und Detoxifikationsvorgängen beteiligt (CHEVILLE 1994e). Die
Aufgaben der Peroxisomen variieren je nach Organismus, Gewebe und der
Umgebung, in der sie sich befinden. Daher verfügen sie in den einzelnen Geweben
über unterschiedliche Enzymausstattungen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN
1992) mit über 50 verschiedenen Enzymen (DE DUVE u. BAUDHUIN 1966). Davon
sind die meisten ausschließlich in Peroxisomen lokalisiert, während einige außerdem
in Mitochondrien vorkommen (WANDERS u. WATERHAM 2006). Trotz der großen
enzymatischen Variation gilt jedoch das Auftreten von Oxidase und Katalase in den
Peroxisomen als konstant und dient somit ihrer Charakterisierung und Identifizierung
(MASTERS u. CRANE 1995).
Mehr als siebzig Prozent der peroxisomalen Enzyme befinden sich in der Matrix.
Einige wenige Enzyme sind im Nukleoid lokalisiert und der verbleibende Anteil ist in
der einfachen Membran der Peroxisomen angesiedelt (MANNAERTS u. VAN
VELDHOVEN 1992).
Das Aufgabenspektrum ist sehr komplex und umfasst den Peroxidmetabolismus, die
ß-Oxidation sowie die Biosynthese von Etherphospholipiden (Plasmalogene), welche
2 Literaturübersicht 19
besonders im Nervensystem zu finden sind. Die Synthese von Cholesterol,
Gallensäuren, Leukotrienen, Prostaglandinen und der Metabolismus von Xenobiotika
obliegt ebenfalls den Peroxisomen. Cholesterol ist ein wichtiger Bestandteil von
Membranen und dient als Komponente von Lipoproteinen. Darüber hinaus ist es an
der Synthese von Gallensäuren und Steroiden beteiligt (MASTERS u. CRANE 1995).
Da Peroxisomen auch am Abbau insbesondere von sehr langkettigen Fettsäuren
beteiligt sind, haben ihre Abwesenheit oder das Fehlen eines ihrer Enzyme, wie
Katalase oder Oxidase, metabolische Konsequenzen. Zahlreiche angeborene
Erkrankungen, darunter das Zellweger Syndrom, lassen Peroxisomen in den
Körperzellen missen und führen dadurch zu schweren körperlichen Anomalien, die
mit einem Überleben über das Säuglingsalter hinaus nicht vereinbar sind. Ein
anderes Beispiel ist der Urikasedefekt des Dalmatiners, bei dem das dunkle Zentrum
des Peroxisomes, als Sitz der Urikase definiert, beim Dalmatiner deutlich kleiner
ausgeprägt ist als bei anderen Hunderassen. Das klinische Bild ist durch deutlich
erhöhte Harnsäureaussscheidung charakterisiert mit der Gefahr der Uratsteinbildung
in den harnbildenden und –ableitenden Wegen (CHEVILLE 1994a).
Im Folgenden werden die wichtigsten Funktionen und Aufgaben der Peroxisomen
näher erläutert.
2.1.2.1 Peroxidmetabolismus
Eine der wichtigsten Funktionen der Peroxisomen ist die Neutralisierung von freien
Radikalen mit Hilfe enzymatischer Mechanismen, die im Folgenden besprochen
werden.
Oxidativer Stress ist ein Zustand der Imbalanz zwischen prooxidativ wirkenden
Komponenten (Oxidantien) und antioxidativ wirkenden Abwehrmechanismen
(Antioxidantien), der durch einen Überschuss an freien Radikalen gekennzeichnet ist
(DJORDJEVIC 2004). Der Redox Status ist dabei ein übergeordneter Begriff, der
beide Mechanismen zusammenfasst (WEBB u. TWEDT 2008).
20 2 Literaturübersicht
Freie Radikale wirken prooxidativ, da sie ein oder mehrere ungepaarte Elektronen
aufweisen (WEBB u. TWEDT 2008). Zu dieser Gruppe gehören das Superoxid-
Radikal O2 -, das Hydrogen Radikal H•, das Hydroxyl Radikal OH• und das Hydrogen
Peroxid Radikal H2O2 (DJORDJEVIC 2004). Diese sind in der Lage, unterschiedliche
Biomoleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren (DJORDJEVIC 2004)
anzugreifen und in ihrer Funktion schwer zu beeinträchtigen (LÖFFLER et al. 2007).
Die meisten freien Radikale stammen vom Sauerstoff ab, dann bezeichnet man sie
auch als reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS=reactive oxygen species). Die
Radikalbildung ist unweigerlich an die mitochondriale Energieproduktion gekoppelt
(GEROK 1995; MANDELKER 2008; WEBB u. TWEDT 2008). Die Reduktion des
Sauerstoffes während der mitochondrialen Atmungskette erzeugt freie Radikale wie
das Superoxidradikal (MANDELKER 2008). Die zweite Gruppe der Radikale stammt
von Stickstoff ab und wird als Gruppe reaktiver Nitrogenverbindungen (RNS)
bezeichnet (MANDELKER 2008). Der gesunde Organismus wandelt ein Viertel des
eingeatmeten Sauerstoffes zu Radikalen um. Bei Krankheit werden sogar drei Viertel
des inspiratorischen Sauerstoffes in Radikale umgesetzt (DJORDJEVIC 2004).
Freie Radikale sind an der Pathogenese von zahlreichen Krankheitsprozessen
beteiligt, beeinflussen das Immunsystem negativ und beschleunigen den
Alterungsprozess der Zelle (DJORDJEVIC 2004; MANDELKER 2008; CAMOES et
al. 2009). So können zahlreiche unterschiedliche Ursachen wie Toxämien,
Infektionen, hypoxisch-ischämische Zustände, Hyperglykämien, die Verstoff-
wechslung von Xenobiotika, Hyperlipidämien, Hyperproteinämien, Neoplasien,
Entzündungen sowie Immunreaktionen und erhöhte metabolische Raten oxidativen
Stress auslösen. Vor allem bei alternden Geweben kann ein zu niedriger ATP
Gehalt, bedingt durch eine ungenügende mitochondriale Produktion, zu erhöhtem
oxidativen Stress führen (MANDELKER 2008). Außerdem entstehen freie Radikale
bei Absorption von Strahlung, dem Metabolismus von Ethanol in Hepatozyten und
Lipidperoxidation von ungesättigten Fettsäuren (DJORDJEVIC 2004). Der Vorgang
der Lipidperoxidation wird dabei selbst auch durch freie Radikale in Gang gesetzt
und dann durch sekundär gebildete Radikale aufrecht erhalten, welche das
umliegende Gewebe schädigen und so eine Kettenreaktion auslösen. Von der
2 Literaturübersicht 21
betroffen (DJORDJEVIC 2004).
Die Folge der Lipidperoxidation ist eine Zunahme der Membranpermeabiltät, so dass
die Integrität von Zellorganellen wie Peroxisomen, Mitochondrien und Lysosomen
herabgesetzt wird. Darüber hinaus werden Enzyme und Rezeptoren inaktiviert.
Letztlich kann die Peroxidation zur Zerstörung aller Lipidmembranen führen
(HARMAN 1956). Mit der Zerstörung von Zellorganellen, wie z.B. den Mitochondrien,
beginnt der Alterungsprozess der Zelle, da die Energieproduktion abnimmt, vermehrt
freie Radikale anfallen und der oxidative Stress zunimmt, was wiederum zu einer
weiteren Zellschädigung führt (WALLACE 2001). Zusammenfassend kann also der
oxidative Schaden, verursacht durch freie Radikale, entweder die Ursache aber auch
die Folge mitochondrialer Dysfunktion sein (MANDELKER 2008).
Der Entstehung von Tumoren liegen Mutationen und unkontrollierte
Zellproliferationen zu Grunde. Die chronische Exposition durch oxidativen Stress
kann Mutationen der DNA zur Folge haben, die zur Expression modifizierter Gene
führen und somit das Wachstum von Tumoren unterstützen. Daher wird dem
oxidativen Stress auch eine Beteiligung an der Karzinogenese zugesprochen
(DJORDJEVIC 2004; KLAUNIG u. KAMENDULIS 2004).
Antioxidantien
Antioxidative Mechanismen wirken den freien Radikalen entgegen und können in
enzymatische und nicht enzymatische Prozesse eingeteilt werden. Im Folgenden
werden nur die enzymatischen Antioxidantien besprochen, da diese in Peroxisomen
vorkommen. Zu dieser Gruppe gehören die Katalase, als ein Bestandteil der
Peroxisomen, die Glutathionperoxidase und die Superoxiddismutase (SOD) (GEROK
1995; SCHRADER u. FAHIMI 2004). Glutathionperoxidasen sind wichtige
Bestandteile des antioxidativen Schutzsystems aller Zellen, kommen aber auch im
Extrazellularraum vor (LÖFFLER et al. 2007). Das Enzym ist in der Matrix und in den
Mitochondrien lokalisiert und kann als ein alternatives Enzym zur Katalase betrachtet
werden. Es ist in der Lage, organische Peroxide, wie Lipidperoxide (CHEVILLE
22 2 Literaturübersicht
1994b; DJORDJEVIC 2004; LÖFFLER et al. 2007) oder Wasserstoffperoxide
abzubauen, wenn die Katalaseaktivität ausgeschaltet ist, wie z.B. im Falle einer
Endotoxämie oder des Ischämie-Reperfusionssyndroms (SINGH et al. 1994).
Die Superoxiddismutase (SOD) existiert in verschiedenen Varianten mit
unterschiedlichen Metallionen im aktiven Bereich des Enzyms. CuZn SOD findet sich
im Zytoplasma, im Kern und in Peroxisomen von Säugetieren (DJORDJEVIC 2004).
Weiterhin existiert eine SOD im Serum und anderen extrazellulären Flüssigkeiten
(MARKLUND 1980). Eine erhöhte Aktivität der SOD wird über Zytokine wie IFN γ
induziert, während eine verminderte Aktivität über TNFα und TGF β eingeleitet wird
(MARKLUND 1992). Die SOD unterstützt die Beseitigung von Superoxidanion- und
Hydroxyperoxidradikalen, indem das weniger reaktionsfähige Wasserstoffperoxid
und molekularer Sauerstoff entsteht (GEROK 1995). Das Wasserstoffperoxid dient
dann wiederum der Katalase als Substrat (MASTERS u. CRANE 1995;
ANGERMULLER et al. 2009).
reduzieren können, als auch über Katalasen, die Wasserstoffperoxid zu Wasser
reduzieren (BAUDHUIN et al. 1965; DE DUVE u. BAUDHUIN 1966; SHNITKA 1966).
Die Enzyme Katalase und einige Oxidasen sind in der Matrix lokalisiert (BAUDHUIN
et al. 1965). Es existieren verschiedene Oxidasen, die ein spezielles Endprodukt und
zusätzlich Wasserstoffperoxid produzieren. Zu den peroxisomalen Oxidasen gehören
die L-α-Hydroxyacid-Oxidasen A und B. Hydroxyacid-Oxidase A ist in der Matrix und
Hydroxyacid-Oxidase B ist in der Marginalplatte lokalisiert. Beide Enzyme finden sich
insbesondere in Leber und Niere. Eine weitere Oxidase, die D-Aminoacid-Oxidase,
ist außer in den Peroxisomen auch frei im Zytosol der Zelle vorhanden (MASTERS u.
CRANE 1995).
Die Produktion und Reduktion der Wasserstoffperoxide mittels Katalase sowie die
Entgiftung anderer reaktiver Sauerstoffradikale schützt Zellen vor oxidativen
Schädigungen (TERLECKY et al. 2006). Die Katalase ist ein ubiquitäres Enzym
(SHARMA et al. 1989), das 40 % des peroxisomalen Proteins ausmacht (DE DUVE
u. BAUDHUIN 1966) und eine besonders hohe Aktivität in der Leber aufweist. Außer
2 Literaturübersicht 23
in Peroxisomen ist das Enzym auch in Mitochondrien lokalisiert, eine für die Zelle
günstige Lage, da hier viele Wasserstoffperoxid produzierende Enzyme ansässig
sind (SHARMA et al. 1989).
Die Katalase unterstützt sowohl katalytische als auch peroxidative Reaktionen.
Beide Reaktionen benötigen Wasserstoffperoxid. Im katalytischen Fall kommt ein
zweites Wasserstoffperoxid zur Reaktion dazu und es entsteht Wasser und
Sauerstoff. In der peroxidativen Reaktion reagiert Wasserstoff mit weiteren
Wasserstoffdonatoren, wie Alkoholen, Phenolen, Nitriten, Formaldehyd und primären
Aminen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; GEROK 1995; MASTERS u.
CRANE 1995).
Peroxiosmen verfügen über zahlreiche weitere Enzyme. Eine umfassende Übersicht
bieten Kapitel 2 („Enzymology“) und Kapitel 3 („Intraparticulate organization of
peroxisomal proteins-methodology and topology“) des Buches „The peroxisome: a
vital organelle“ von Colin Masters und Denis Crane (MASTERS u. CRANE 1995).
Rolle der Mitochondrien bei oxidativem Stress
Mitochondrien werden ursächlich durch Hypoxie, freie Radikale und Toxinbelastung
geschädigt (VIEIRA u. KROEMER 1999).
Neben den vielseitigen, für die Zelle nützlichen Aufgaben, tragen die Mitochondrien
aber auch selbst zur Radikalbildung bei (ROTH 1997). O2- und H2O2 reagieren häufig
mit Eisen, das sich in den Mitochondrien befindet. Dadurch kann die mitochondriale
DNA geschädigt werden. Die Folge dieser Schädigung ist eine Verstärkung des
oxidativen Stresses aufgrund Expression veränderter Proteine, die verantwortlich für
die Elektronentransportkette sind. Es entsteht ein Circulus vitiosus mit verstärkter
24 2 Literaturübersicht
Radikalbildung (LEE u. WEI 1997) Unter physiologischen Bedingungen werden die
Radikale durch Antioxidantien neutralisiert (ROTH 1997). Das wichtigste Antioxidans
zum Schutz der Mitochondrien ist Glutathion (MANDELKER 2008). Bei
Krankheitszuständen, z.B. Sepsis, reichen diese Mechanismen jedoch nicht aus und
erschöpfen (ROTH 1997). Oxidativer Stress der Mitochondrien kann zu einer
Aktivierung der Mitochondrienexpression führen und damit zu Erhöhung der
Organellenanzahl (MANDELKER 2008). Neben dem Enzym Glutathion schützen
erhöhte peroxisomale Katalasekonzentrationen die Mitochondrien vor Fehl-
funktionen, während niedrige Konzentrationen zu einer mitochondrialen Dysfunktion
führen können (KOEPKE et al. 2008).
2.1.2.2 ß-Oxidation
In der Pilz- und Pflanzenzelle ist dieser biochemische Vorgang ausschließlich in den
Peroxisomen lokalisiert. In eukaryontischen Zellen findet die ß-Oxidation sowohl in
Mitochondrien als auch in Peroxisomen statt, mit dem Ziel, die Lipidhomöostase
aufrechtzuerhalten (WANDERS 2004b; POIRIER et al. 2006).
Das peroxisomale ß-Oxidationssystem dient über etwa fünf hintereinander
ablaufende ß-Oxidationszyklen der Verkürzung von sehr langen und toxischen
Fettsäuren (REDDY u. MANNAERTS 1994; MASTERS u. CRANE 1995;
HASHIMOTO 1999). Kurze Fettsäuren (<C8) sind kein geeignetes Substrat für
Peroxisomen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992). Die peroxisomale
Oxidationsrate der Fettsäuren durch die Peroxisomen nimmt bei gleichzeitig sich
verkürzender Kettenlänge ab. Ungesättigte Fettsäuren werden dahingegen
bevorzugt von den Peroxisomen oxidiert (MASTERS u. CRANE 1995).
Die daraus hervorgehenden kurz- und mittellangen Fettsäuren erreichen dann das ß-
Oxidationssystem der Mitochondrien. Diese Verstrickung der Stoffwechselwege zeigt
das enge Verhältnis von Mitochondrien und Peroxisomen (LAZAROW 1978;
HASHIMOTO 1987; MASTERS u. CRANE 1995). Der weitaus größte Anteil der
langen Fettsäuren wird in Mitochondrien der ß-Oxidation unterzogen. Die
Begründung liegt darin, dass die mitochondriale ß-Oxidation im Hinblick auf die
2 Literaturübersicht 25
der Peroxisomen (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992).
Die Enzyme zur peroxisomalen ß-Oxidation befinden sich in der Matrix. Dabei
unterliegt die peroxisomale Enzymausstattung einer Dynamik, die von dem Gewebe,
der Spezies und den Rahmenbedingungen sowie dem Einfluss von Umweltfaktoren
oder Xenobiotika abhängt (MASTERS u. CRANE 1995).
Die eigentliche ß-Oxidation gesättigter Fettsäuren verläuft in vier Schritten
(Abbildung 2-3):
oxidiert, dabei entsteht Wasserstoffperoxid.
Hydroxyl-CoA.
Zwischenprodukt 3-Ketoacyl-CoA
mittels der thiolytischen Spaltung des Ketoacyl-CoAs, ein Acetyl-CoA und eine
um zwei C-Atome verkürzte aktivierte Fettsäure, die wieder in den ß-
Oxidationszyklus einfließen kann (LAZAROW 1978; HASHIMOTO 1987)
26 2 Literaturübersicht
Abbildung 2-3 Abbau geradzahliger Fettsäuren durch β-Oxidation (LÖFFLER et al. 2007)
Der Vorgang der ß-Oxidation beginnt mit der Aktivierung der Fettsäure. Die
peroxisomale Membran besitzt zwei Acyl-CoA-Synthetasen, die an der Aktivierung
von langen (C14-C20) und sehr langen Fettsäuren (>C20) beteiligt sind (MANNAERTS
et al. 1982; SINGH u. POULOS 1988; LAZO et al. 1990; LAGEWEG et al. 1991). Zur
Aktivierung werden ATP und Coenzyme A benötigt (MASTERS u. CRANE 1995). Da
in Peroxisomen vor allem die Oxidation sehr langer Fettsäuren stattfindet, zeigen
Patienten mit Peroxisomenmangel eine erhöhte intrazelluläre Anhäufung von sehr
langen Fettsäuren (MASTERS u. CRANE 1995).
Im Folgenden werden die wichtigsten Unterschiede zwischen peroxisomaler und
mitochondrialer ß-Oxidation in tabellarischer Form aufgezeigt:
2 Literaturübersicht 27
Funktion
ß-Oxidation
(Peroxisom)
ß-Oxidation
(Mitochondrien)
CRANE 1995)
membranständiges Transportsystem,
Carnithin unabhängig
Carnithin abhängig
1979)
lediglich Verkürzung von Fettsäuren
OSMUNDSEN et al. 1991)
Abläufe
4 Enzyme
ATP abhängig
Synthese der Plasmalogene
Die Peroxisomen verfügen über eine enzymatische Ausstattung zur Synthese von
Plasmalogenen. Diese werden außer in den Peroxisomen auch im
Endoplasmatischen Retikulum hergestellt (MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN
1992). Im menschlichen Organismus bilden die Plasmalogene 18 % der gesamten
Phospholipide (WANDERS u. WATERHAM 2006) und machen mehr als 80 % des
Phospholipidgehaltes der weißen Substanz im Gehirn aus (WANDERS 2004a).
Cholesterinsynthese
Außerdem enthalten Peroxisomen Anteile der enzymatischen Ausstattung zur
Bildung des Cholesterols (WANDERS u. WATERHAM 2006). Die Menge des in den
Peroxisomen produzierten Cholesterols ist jedoch im Vergleich zur Cholesterol-
synthese des Endoplasmatischen Retikulums sehr klein. Die physiologische Rolle
28 2 Literaturübersicht
der peroxisomalen Cholesterolsynthese ist bis jetzt unklar (MANNAERTS u. VAN
VELDHOVEN 1992).
Harnsäurestoffwechsel
Das Enzym Uratoxidase oder auch Urikase ist am Purinkatabolismus beteiligt und
findet sich in den meisten Säugetierperoxisomen (USUDA et al. 1988). Dort ist es,
wie auch die Xanthinoxidase bevorzugt, im Nukleoid lokalisiert. Es gibt jedoch auch
Vertebraten, die eine nennenswerte peroxisomale Aktivität dieses Enzyms
aufweisen, ohne Nukleoide zu besitzen (MASTERS u. CRANE 1995). Die
Xanthinoxidase verstoffwechselt Xanthin zu Harnsäure, während die Uratoxidase die
Oxidation von Urat mit Hilfe von molekularem Sauerstoff zu Allantoin katalysiert
(MASTERS u. CRANE 1995). Bei einigen Neuweltaffen und dem Menschen fehlt die
Uratoxidase in hepatozellulären Peroxisomen, sodass bei diesen Spezies Harnsäure
als Endprodukt des Purinkatabolismus ausgeschieden wird (USUDA et al. 1988;
MASTERS u. CRANE 1995). Primaten verfügen dagegen über eine gewisse
Leberuratoxidaseaktivität und zeigen daher nur niedrige Harnsäurespiegel
(MASTERS u. CRANE 1995).
Die Gicht des Menschen ist eine Erkrankung in Folge des Mangels an Uratoxidase
(MANNAERTS u. VAN VELDHOVEN 1992; HAYASHI et al. 2000). Es ist das einzige
peroxisomale Enzym, das in der veterinärmedizinischen Literatur für den Hund
beschrieben ist und befindet sich in den hepatozellulären Peroxisomen im Nukleoid
(LAGING et al. 1988). Der Dalmatiner besitzt im Vergleich zum Beagle eine höhere
Anzahl und auch größere Peroxisomen. Es handelt sich hier um einen
kompensatorischen Mechanismus, um einer erhöhten Harnsäurekonzentration im
Blut vorzubeugen. Die Unfähigkeit der Hepatozyten des Dalmatiners, aus Harnsäure
mittels der in den Peroxisomen lokalisierten Urikase Allantoin zu synthetisieren, liegt
jedoch nicht an dem bei dieser Rasse vorherrschenden Urikasemangel, sondern
aufgrund eines Transportdefektes, an einer verminderten Fähigkeit der Hepatozyten,
die Harnsäure in die Hepatozyten hineinzutransportieren (GIESECKE et al. 1985;
LAGING et al. 1988).
Peroxisomen sind Organellen, die nicht isoliert im Zytoplasma liegen, sondern
aufgrund metabolischer Zusammenhänge mit anderen subzellulären Strukturen, wie
den Mitochondrien, dem Endoplasmatischen Retikulum, Fetttropfen und dem Zytosol
assoziiert sind (WANDERS 2004b; POIRIER et al. 2006).
Wie bereits beschrieben, ist die ß-Oxidation ein grundlegender Mechanismus, der
ebenso wie die Thermogenese sowohl in Peroxisomen als auch in Mitochondrien
stattfindet (REDDY u. MANNAERTS 1994; WANDERS 2000, 2004b). Darüber
hinaus teilen sie sich Komponenten in der Zelle, die zur Organellenteilung notwendig
sind (SCHRADER 2006; SCHRADER u. YOON 2007). Vor kurzem wurde ein
Transportmechanismus zwischen Mitochondrium und Peroxisom entdeckt
(NEUSPIEL et al. 2008), der dazu dienen könnte, Metabolite, Lipide oder Proteine
zwischen den beiden Organellen auszutauschen (KOCH et al. 2005). Dazu befindet
sich an der äußeren mitochondrialen Membran eine Ligase MAPL (mitochondria-
anchored protein ligase), welche ein „RING-Finger Motiv“ umfasst und die
Morphologie der Mitochondrien reguliert. Diese MAPL Struktur kann dann in Form
von Vesikeln (MDV=mitochondria derived vesicles) von Mitochondrien abschnüren
und später mit Peroxisomen verschmelzen. Somit teilen sich Mitochondrium und
Peroxisom nicht nur wichtige Regularien zur Teilung, sondern sind auch über
metabolische Funktionen eng miteinander verknüpft (NEUSPIEL et al. 2008). Eine
andere Funktion der MDV´s könnte der Rücktransport von zu den Mitochondrien
fehlgeleiteten peroxisomalen Membranproteinen sein, was häufig unter
experimentellen Bedingungen beobachtet wird (SACKSTEDER et al. 2000).
30 2 Literaturübersicht
2.2 Kontrolle der Peroxisomenzahl
Die Zelle hat die Fähigkeit auf metabolischen oder umgebungsbedingten Stress zu
reagieren, indem sie die Zahl der Peroxisomen erhöht, bei Bedarf jedoch auch
überschüssige oder geschädigte Organellen entfernt (YAN et al. 2005).
Peroxisomen sind Zellorganellen, die sich sowohl über Wachstum und Teilung
vermehren, als auch aufgrund ihrer engen Assoziation mit dem Endoplasmatischen
Retikulum neu gebildet werden können (GRABENBAUER et al. 2000; SCHRADER
u. FAHIMI 2006).
Die Peroxisomen sind sehr stark in Hepatozyten vertreten. In einem Hepatozyten
finden sich bis zu 1000 Peroxisomen in enger Verbindung zum Endoplasmatischen
Retikulum (CHEVILLE 1994e). Weiterhin findet man sie in großer Zahl in renalen
Tubuluszellen und in steroidsynthetisierenden Zellen (CHEVILLE 1994e).
Die Verteilung von Peroxisomen innerhalb einer Zelle bzw. im Zellverband bedarf der
Bewegung einzelner Organellen. Für diesen Zweck benötigen die Peroxisomen der
Säugetiere auf Mikrotubuli basierende Filamente (SCHRADER et al. 2003). Die
Motilität der Organelle dient dazu, eine gleichmäßige Verteilung innerhalb der Zelle
aufrechtzuerhalten, mit anderen Peroxisomen oder anderen Zellorganellen in Kontakt
zu treten oder auch Zellkompartimente zu erreichen, die aufgrund der metabolischen
Situation Peroxisomen benötigen (SCHRADER et al. 2003). Es können zwei
Bewegungsarten unterschieden werden. Die erste Variante beinhaltet eine
langsame, nicht gerichtete Bewegung, der sich ca. 95 % der Peroxisomen bedienen.
Sie benötigt keine Mikrotubuli und ist energieunabhängig. Die zweite Möglichkeit der
Bewegung ist eine energieverbrauchende, schnelle, gerichtete Motilität, die an
Mikrotubuli gekoppelt ist (WIEMER et al. 1997). Weitere Untersuchungen der
Peroxisomenmotilität an kultivierten Zellen ergaben, dass sich elongierte oder
retikulär ausgerichtete Peroxisomen langsamer und ohne Mikrotubuli bewegen,
während sphärische Peroxisomen deutlich schneller entlang des Mikrotubulisystems
ihre Lokalisation verändern können (SCHRADER 2001).
2 Literaturübersicht 31
In eukaryontischen Zellen gibt es drei verschiedene Wege, die die Anzahl der
Peroxisomen in der Zelle beeinflussen können (YAN et al. 2005).
Einer der drei Mechanismen umfasst die Peroxisomenteilung im Rahmen der
Zellteilung mit Aufteilung der Organellen auf die Tochterzellen (VEENHUIS et al.
2003). Der zweite Mechanismus beinhaltet die Autophagie von überflüssigen oder
geschädigten Peroxisomen (FARRE u. SUBRAMANI 2004; YAN et al. 2005). Der
letzte Vorgang umfasst die übermäßige starke numerische Zunahme von
Peroxisomen in kurzer Zeit unabhängig vom Zellzyklus; dieser Vorgang wird
allgemein als Peroxisomenproliferation bezeichnet (YAN et al. 2005).
2.2.1 Biogenese und Proliferation
Die Neuentstehung der Peroxisomen war und ist ein ständiger Diskussionspunkt
(PLATTA u. ERDMANN 2007) und seit ihrer Entdeckung 1954 gibt es dazu viele
Theorien (BERNHARD u. ROUILLER 1956).
Die ersten Untersuchungen, die zur Aufklärung der Biogenese von Peroxisomen in
eukaryontischen Zellen beitrugen, wurden an Hefen und Pflanzen durchgeführt und
die daraus gewonnenen Erkenntnisse auf die Säugetierzelle übertragen (GOULD u.
VALLE 2000). Dabei zeigte sich, dass die Regulation und Transkription bestimmter
Gene, sogenannter PEX-Gene, und die daraus hervorgehenden Proteine, die
sogenannten Peroxine, maßgeblich an der Entstehung von Peroxisomen beteiligt
sind.
Bis heute sind 32 PEX Gene bekannt, die an drei verschiedenen Schlüsselpositionen
der Peroxisomentwicklung involviert sind (VAN DER ZAND et al. 2006): an der
Bildung der peroxisomalen Membran, der Peroxisomenproliferation und der
Bereitstellung und Positionierung von peroxisomalen Matrixproteinen (PLATTA u.
ERDMANN 2007).
einen findet während der Zellteilung eine Teilung der vorhandenen Peroxisomen
32 2 Literaturübersicht
statt, um eine gleichbleibende Anzahl an Peroxisomen in den Tochterzellen zu
gewährleisten. Es handelt sich dann um eine konstitutive Teilung.
Zum anderen kann durch extrazelluläre Stimuli eine intrazelluläre Teilung der
Peroxisomen provoziert werden, die eine starke Vermehrung (Proliferation) zur Folge
hat. Diese Peroxisomenproliferation ist charakterisiert durch eine numerische
Zunahme, erhöhte Volumendichte, zunehmende Größe und gegebenenfalls eine
vermehrte Bereitstellung von peroxisomalen Enzymen. Dadurch wird erhöhten
metabolischen Anforderungen Rechnung getragen (SCHRADER u. FAHIMI 2006).
Peroxisomen enthalten keine DNA. Die Informationen zur Herstellung von
peroxisomalen Proteinen ist in nukleären Genen verschlüsselt (LAZAROW u. FUJIKI
1985). Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Proteine der
Membran und der Peroxisomenmatrix an freien, im Zytosol befindlichen
Polyribosomen produziert und posttranslational in bereits bestehende Peroxisomen
transportiert werden. Hierauf begründet sich die Theorie, dass die Peroxisomen
Organellen sind, die sich wie Mitochondrien und Chloroplasten über Wachstum und
Teilung vermehren (LAZAROW u. FUJIKI 1985). Das Wachstum von Peroxisomen
wird dabei durch den Import von Membran- und Matrixproteinen gewährleistet. Bei
entsprechender Größe kommt es zur Aufteilung der Matrix und der peroxisomalen
Membran in mindestens zwei neue Peroxisomen (SCHRADER u. FAHIMI 2006).
Neuere Untersuchungen am Beispiel von Saccharomyces cerevisiae zeigen, dass
peroxisomale Bausteine aus dem Endoplasmatischen Retikulum hervorgehen,
insbesondere die peroxisomalen Membranteile, die bei der de-novo Synthese von
Peroxisomen benötigt werden (HOEPFNER et al. 2005; VAN DER ZAND et al.
2006).
Ausgehend vom Stadium des reifen Peroxisoms werden für eine Verdopplung
folgende Stadien durchlaufen (Abbildung 2-4) :
1) Verlängerung und Abschnürung
2) Teilung und Gruppenbildung
3) Trennung der Peroxisomen
Wachstum und Reifung durch Matrixproteinimport
Verlängerung/ Abschnürung
Teilung/ Gruppenbildung
Abbildung 2-4 Modell für die Teilung und Proliferation von Peroxisomen (modifiziert nach PLATTA u. ERDMANN 2007)
Wachstum und Reifung der Peroxisomen
Das Verfahren zur Proteinherstellung gilt sowohl für Matrixproteine als auch für
peroxisomale Membranproteine. Die im Endoplasmatischen Retikulum produzierten
peroxisomalen Membranproteine werden in das neu entstehende Peroxisom
eingebaut. Dadurch findet ein Wachstums- und Reifungsprozess statt, bis es
aufgrund der maximalen Größe erneut zu einer Teilung kommt. Damit die neu
synthetisierten Proteine die Peroxisomen erreichen, verfügen diese über
„peroxisomale targeting Signale“ (PTS). Zwei dieser Zielsignale sind bekannt unter
den Abkürzungen PTS1 und PTS2 (GOULD u. VALLE 2000; PLATTA u. ERDMANN
2007).
Der erste Schritt umfasst die Bindung eines neu synthetisierten, gefalteten Proteins
an den PTS1/Pex5-Rezeptor oder den löslichen Pex7-Rezeptor (1). Der
überwiegende Anteil der gefalteten Proteine wird über PTS1/Pex5-Rezeptor in das
peroxisomale Lumen transportiert, indem der Rezeptor zunächst das Protein zur
peroxisomalen Membran leitet (2). Anschließend erfolgt der Übertritt des Rezeptor-
Proteinkomplexes auf die luminale Seite der Peroxisomenmembran (3). Daraufhin
trennen sich Rezeptor und Protein (4). Das Protein verbleibt im Peroxisom, während
der Rezeptor in das Zytosol zurückkehrt, um für weitere peroxisomale
Matrixproteinimporte zur Verfügung zu stehen (GOULD u. VALLE 2000; PLATTA u.
ERDMANN 2007). Der Export des Rezeptors aus dem peroxisomalen Lumen zurück
ins Zytosol ist ein energieverbrauchender Prozess (OLIVEIRA et al. 2003) und auch
das Einschleusen der Proteine ist ATP abhängig. Zuerst werden die
Membranproteine synthetisiert, anschließend erfolgt die Synthese der Matrixproteine
(MASTERS u. CRANE 1995).
3
Auslösende Faktoren der Peroxisomenproliferation
induzieren können (YAMAMOTO u. FAHIMI 1987). Eine Regeneration der Leber
nach einer partiellen Hepatektomie führt zu einer Peroxisomenproliferation in den
Hepatozyten (YAMAMOTO u. FAHIMI 1987). Auch zahlreiche Chemikalien,
Medikamente und Weichmacher, allgemein als Peroxisomenproliferatoren (PPO)
bezeichnet, können eine Vermehrung der Zellorganelle bewirken (LAZAROW u. DE
DUVE 1976; FAHIMI et al. 1982). Weichmacher, die sich z.B. in Plastikverpackungen
von Lebensmitteln befinden, haben in tierexperimentellen Studien gezeigt, dass sie
eine Peroxisomenproliferation auslösen können (MASTERS u. CRANE 1995).
Langzeitfütterungsversuche mit Ratten führten darüberhinaus zu der Entwicklung von
hepatozellulären Karzinomen (MASTERS u. CRANE 1995). Auch Medikamente, wie
Azetylsalizylsäure, anabole Steroide, Clofibrate, Trimethoprim Sulfonamide,
Spironolacton und orale Kontrazeptiva führen zu einer Erhöhung der
36 2 Literaturübersicht
Schilddrüsenhormonen geht beispielsweise mit einer verminderten Katalaseaktivität
bei gleichzeitiger Erhöhung der Peroxisomenzahl von verminderter Größe einher
(JUST u. HARTL 1983; KERCKAERT et al. 1989). Die Stimulation von kultivierten
humanen Hepatozyten mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren oder
Sauerstoffradikalen kann ebenfalls eine Peroxisomenproliferation auslösen
(SCHRADER et al. 1998a; SCHRADER et al. 1999). Zahlreiche Untersuchungen
haben gezeigt, dass es etwa 60 Xenobiotika gibt, die zu einer
Peroxisomenproliferation führen (MOODY et al. 1991). Darüber hinaus können
fettreiche Diäten, Hungerperioden, Vitamin E Mangel, Hyperthyreoidismus und
Anpassung an Kälte zu einer Proliferation der Peroxisomen führen (MASTERS u.
CRANE 1995). Die Peroxisomenproliferation, herbeigeführt durch PPO, fällt je nach
Lokalisation im Leberläppchen sehr variabel aus. In periportalen Hepatozyten finden
sich sehr viele elongierte Peroxisomen, während im perizentralen Bereich eher
rundliche Peroxisomen vorkommen (FAHIMI et al. 1996). Elongierte Peroxisomen
sind ein Zeichen für eine peroxisomale Proliferation und geben somit einen wichtigen
Hinweis auf eine stattgefundene Teilungsaktivität der Peroxisomen (SCHRADER et
al. 1996; SCHRADER et al. 1998b; KOCH et al. 2004). Vergleicht man diese
Beobachtung mit der Proliferation von hepatischen Stammzellen von periportal nach
perizentral (ARBER et al. 1988), kann daraus gefolgert werden, dass die
Peroxisomen dieser Proliferationsrichtung folgen (SCHRADER u. FAHIMI 2006). Bei
Proliferationsvorgängen wird auch eine perinukleäre Verteilung der Peroxisomen
beobachtet (ROELS et al. 1983; DE CRAEMER et al. 1993).
Regulation der Peroxisomenproliferation
nukleäre Transkriptionsfaktoren. Diese Transkriptionsfaktoren gehören zur großen
Familie der Steroid-, Thyroid- und Retinoidrezeptoren und werden als „Peroxisome
proliferator activated receptors“ (PPARs) bezeichnet (ISSEMANN u. GREEN 1990).
Es werden drei Typen unterschieden: PPAR α, PPAR β und PPAR γ
(SCHOONJANS et al. 1996).
2 Literaturübersicht 37
PPAR α ist in den Lipidstoffwechsel, die Lipoproteinsynthese und den Ablauf von
Entzündungsreaktionen involviert (FEIGE et al. 2006). PPAR α wird stark in der
Leber exprimiert (KLAUNIG et al. 2003) und wird besonders bei Nagern durch
Lipidsenker sowie mehrfach ungesättigte Fettsäuren aktiviert (BEIER et al. 1992,
1997). PPAR α fungiert als Sensor für den Lipidgehalt der Hepatozyten und reguliert
die Genexpression für die mitochondriale und peroxisomale ß-Oxidation
(HASHIMOTO et al. 2000). Ein entscheidender Punkt in der Karzinogenese ist die
Aktivierung von PPAR α (GONZALEZ et al. 1998). PPAR β bestimmt das Maß des
Fettmetabolismus in Skelettmuskeln und Fettgewebe (LUQUET et al. 2005). Die
Bedeutung von PPAR γ liegt in der Regulation der Proliferation und
Ausdifferenzierung von Fettzellen (LUQUET et al. 2005).
2.2.2 Abnahme der Peroxisomenzahl durch Autophagie
Im Folgenden wird auf die Abnahme der Peroxisomenzahl in der Zelle eingegangen,
was insbesondere über Autophagie reguliert wird.
Autophagische Prozesse sind katabole intrazelluläre Abläufe, die letztendlich in
einen lysosomalen Abbau von Zellorganellen münden. Die Autophagie nimmt eine
wichtige Stellung ein, zum Beispiel in Hepatozyten, indem die nicht mehr benötigten
Zellorganellen abgebaut werden und die Abbauprodukte der Zelle als Nährstoffe
wieder zur Verfügung stehen (CUERVO 2004a; MIZUSHIMA 2005).
Es gibt drei verschiedene Formen der Autophagie, die alle ähnliche Funktionen
erfüllen: die Makroautophagie, die Mikroautophagie und die „Chaperon-mediierte
Autophagie“ (CUERVO 2004a). Diese drei Mechanismen kommen alle in
Säugetierzellen vor (CUERVO 2004a).
Bei der Makroautophagie werden die zu entsorgenden Komponenten in eine
Doppellamelle, dem Autophagosom, verpackt, welches dann mit dem Lysosom
verschmilzt und durch Hydrolasen abgebaut wird (SAKAI et al. 2006). Die
Membranen des lysosomalen Systems sowie die lysosomalen Proteine werden im
glatten Endoplasmatischen Retikulum (sER) synthetisiert (LÖFFLER et al. 2007).
38 2 Literaturübersicht
Im Rahmen der Mikroautophagie wird das zu entsorgende Material von der
lysosomalen Membran direkt umschlossen, als sogenanntes „Microautophagic body“,
und mittels Hydrolasen abgebaut (SAKAI et al. 1998; LÖFFLER et al. 2007).
Der Prozess der „Chaperon mediierten Autophagie“ beinhaltet die Bindung eines
Rezeptors an das zu eliminierende Substrat im Zytosol. Dieser Komplex bindet nun
an einen an der lysosomalen Membran befindlichen Rezeptor. Daraufhin erfolgt der
Übertritt des Substrates in das lysosomale Lumen, in dem die Degradierung durch
Hydrolasen stattfindet (CUERVO 2004b).
Der Vorgang der Makroautophagie ist sowohl bei pathologischen, als auch
physiologischen Abläufen, wie der Beseitigung von apoptotischen Zellen, während
der Embryogenese, der Wiederverwertung von Nährstoffen und der Beseitigung von
fehlgefalteten Proteinen, intrazellulären Bakterien und geschädigten Zellorganellen
beteiligt (CUERVO 2004a; LEVINE u. KLIONSKY 2004). Es wird angenommen, dass
es sich in erster Linie um einen protektiven Mechanismus handelt (LEMASTERS et
al. 2002; CUERVO 2004a).
Auch zur Vermeidung von Neoplasien besitzt die Autophagie eine wichtige
Schutzfunktion. Durch die Beseitigung von geschädigten Mitochondrien und der
Reduktion des oxidativen und metabolischen Stresses wird auch die DNA vor
Angriffen durch Radikale geschützt, was Mutationen verhindert und die Stabilität des
Genoms wahrt (NELSON et al. 2004; KARANTZA-WADSWORTH et al. 2007;
MATHEW et al. 2007). Eine gestört ablaufende Autophagie führt jedoch zu einer
Genamplifikation, die letztlich ein Hauptmechanismus in der Onkogenaktivierung
darstellt (LITTLE u. CHARTRAND 2004).
Regulation
Der bedeutendste Faktor, der den Prozess der Autophagie in der Leber einleitet ist
Hungern. Hierbei wird in den ersten 48h bei Ratten und Mäusen 25-45 % des
zelleigenen Proteins abgebaut (ADDIS et al. 1936). Autophagie scheint dabei einen
wichtigen Mechanismus zur alternativen Energieversorgung darzustellen, um
2 Literaturübersicht 39
während Hungerperioden durch Recyling von Zellbestandteilen einen normalen
Metabolismus zu gewährleisten (JIN u. WHITE 2007). Autophagie trägt dadurch zur
Energieversorgung von Zellen in Hungerperioden bei und ist somit an der
Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase beteiligt (NELSON et al. 2004).
Autophagie ist ein energieverbrauchender Prozess, der bei ATP Mangel zum
Erliegen kommt (MEIJER u. CODOGNO 2004). Auch Insulin übt einen
inhibitorischen Effekt aus (PFEIFER 1977), während Glukagon Autophagieprozesse
fördert (DETER et al. 1967). Die alimentäre Aufnahme von langen und sehr langen
Fettsäuren, die den Peroxisomen als Substrat dienen, führt ebenfalls zu einem
Abbruch der Pexophagie (LUIKEN et al. 1992).
2.3 Hepatopathien des Hundes
vor allem auf einer Biogenese- oder Funktionsstörung der Peroxisomen beruhen
(WANDERS 2004a). Für den Hund sind weder angeborene noch erworbene
peroxisomale Erkrankungen beschrieben. Um jedoch herauszufinden, ob
Peroxisomen bei bestimmten degenerativen bzw. neoplastischen Lebererkrankungen
eine Rolle spielen, wurden in der vorliegenden Arbeit Hunde mit Hepatopathien
untersucht, die im Folgenden hinsichtlich ihres makroskopischen und
mikroskopischen Erscheinungsbildes näher erläutert werden sollen.
Die Leber befindet sich zentral im kranialen Abdomen, dem Zwerchfell direkt
anliegend. Die Oberfläche ist glatt, da sie von einer serösen Kapsel überzogen ist.
Das Leberparenchym erscheint rotbraun, ist von fragiler Konsistenz und beim Hund
in zahlreiche Leberlappen unterteilt, deren Enden im gesunden Zustand scharf
konturiert sind (CULLEN 2007a).
unterschieden werden: Die klassische Einteilung der Leber mit dem Leberläppchen
als kleinste anatomische Einheit. Das Leberläppchen bildet eine mehr oder weniger
sechseckige Struktur mit der in der Mitte befindlichen Zentralvene, die das Blut der
40 2 Literaturübersicht
Lebervene zuführt. An den Ecken des Sechseckes befinden sich die Portalfelder , die
auch als Glisson Trias bezeichnet bezeichnet werden. Sie schließen Gallengänge,
Zweige der Portalvene, der Leberarterie, Nervenfasern und Lymphgefäße ein,
gestützt von einem feinen retikulären Bindegewebe (Abbildung 2-6 A). Das Blut wird
aus der Leberarterie und Portalvene in die Sinusoide geleitet, wo es sich vermischt
und eng an den Hepatozyten vorbeifließt, bevor es über die Zentralvene in die V.
hepatica abgeführt wird (CULLEN 2007a).
Bei der funktionalen Einteilung der Leber nach RAPPAPORT (1980) stellt das
Portalgebiet den zentralen Punkt des sogenannten Leberazinus dar, da dort das
sauerstoffreiche Blut über die Arterie ankommt und zu den in der Peripherie
gelegenen Lebervenen abgeführt wird. Dabei nimmt der Sauerstoffgehalt von Zone 1
(periportal oder zentroazinär) über Zone 2 (mittzonal) nach Zone 3 (periazinär)
kontinuierlich ab (Abbildung 2-6 B) (CULLEN 2007a).
2 Literaturübersicht 41
Die Hepatozyten sind in einschichtigen Zellreihen angeordnet und radiär zur
Zentralvene ausgerichtet. Die Zellreihen werden durch besondere Kapillaren, die
sogenannten Sinusoide, getrennt. Sie besitzen keine typische Basalmembran und
sind durch ein diskontinuierliches Endothel ausgekleidet. Hier befinden sich auch die
Lebermakrophagen (Kupffer-Sternzellen), die der Kontrolle des sinusoidalen Blutes
dienen (CULLEN 2007a).
42 2 Literaturübersicht
Die Hepatozyten besitzen zu der das Lumen der Sinusoide begrenzenden Seite
zahlreiche Mikrovilli, die der Oberflächenvergrößerung, der Aufnahme von
Substanzen aus dem Plasma und der Sekretion von Produkten dienen. An den
basolateralen Seiten der Hepatozyten befinden sich Gallekanälchen, die sich aus
den modifizierten Zellmembranen zweier benachbarter Hepatozyten ergeben. Der
Disse´ Raum ist eine besondere anatomische Struktur zwischen den Hepatozyten
und den Endothelzellen der Lebersinusoide. Hier findet ein Austausch von Stoffen
zwischen Plasma und den mit Mikrovilli besetzten Hepatozyten statt. Eine
Schädigung dieser Zone beeinträchtigt die Leberfunktion erheblich. In diesem Raum
befinden sich auch fettspeichernde Zellen, sogenannte Ito-Zellen, die unter anderem
der Vitamin A-Speicherung dienen. Bei Leberschädigungen sinkt ihr Vitamin A-
Gehalt und sie bilden Kollagen, das die Entstehung einer Leberfibrose fördert
(CULLEN 2007a).
primär entzündlich bedingte Veränderungen der Hepatozyten, beispielsweise durch
Sauerstoffmangel oder Stoffwechselstörungen. Die Veränderungen können folgenlos
bleiben, in ein von Entzündungsprozessen begleitetes chronisches Stadium
übergehen oder in einer chronischen Zerstörung von Lebergewebe mit vergeblichen
bindegewebigen Umbau- und Regenerationsprozessen (Zirrhose) enden (KÄUFER-
WEISS 2007).
Das Verteilungsmuster der auftretenden degenerativen Veränderungen gibt
Aufschluss über die möglichen Ursachen. So wird unterschieden, ob Leberzellen im
gesamten Parenchym (diffus), zufällig verteilt (multifokal) oder in bestimmten Zonen
(1-3) des Leberazinus geschädigt sind (ROTH u. MEYER 1995).
Hydropische Degeneration
Hepatozyten reagieren bei Störung ihrer Homöostase immer in ähnlicher Weise.
Dabei werden im allgemeinen die Elektrolytkonzentration und der Flüssigkeits-
haushalt derart gestört, dass es zu einem Wassereinstrom kommt und die Zelle
2 Literaturübersicht 43
anschwillt (CULLEN et al. 2006). Diesen Vorgang nennt man daher auch
hydropische Degeneration (CULLEN 2007b).
Mikroskopisch kann sich das zunächst in Form einer trüben Schwellung des
Hepatozyten darstellen. Dabei kommt es zu einer Schädigung der Mitochondrien
z. B. durch exogene Gifte, Hypoxie und/oder Stoffwechselentgleisungen, was zu
einer unspezifischen Leistungsschwäche der Hepatozyten führt (KÄUFER-WEISS
2007). Die ebenfalls durch Wassereinstrom vergrößerten Mitochondrien können
lichtmikroskopisch als gleichmäßig in der Leberzelle verteilte Körnchen
wahrgenommen werden (KÄUFER-WEISS 2007).
ballonierende Degeneration. Dabei nimmt der Einstrom von Wasser und Natrium
stetig zu. Die Konsequenz ist eine massive Schwellung der gesamten Zelle und
deren Organellen, insbesondere der Mitochondrien, der Lysosomen und des
Endoplasmatischen Retikulums (KÄUFER-WEISS 2007; STALKER u. HAYES 2007).
44 2 Literaturübersicht
Eine Zellschwellung kann reversibel sein, wenn das Ausmaß und die Dauer der
schädigenden Noxe begrenzt sind (Abbildung 2-8). Wird dabei jedoch ein kritischer
Punkt überschritten, so kommt es in der Folge zum irreversiblen Zelluntergang
(CULLEN 2007b)
Auslöser einer hydropischen Degeneration ist im Prinzip immer eine gestörte
Zellatmung aufgrund hypoxischer Zustände, die entweder den gesamten
Organismus betreffen können oder nur lokal wirken. Eine Vergiftung oder
Blockierung mitochondrialer Enzyme führt ebenfalls zu einer gestörten Zellatmung
(KÄUFER-WEISS 2007). Daher ist die hydropische Degeneration eine relativ
unspezifische Zellveränderung, der viele Ursachen zugrunde liegen können
(CULLEN 2009). So können bei Jungtieren, die vom Wachstumsverhalten der
Wurfgeschwister abweichen, angeborene Erkrankungen, wie z. B. primäre
2 Literaturübersicht 45
während bei älteren Tieren zahlreiche erworbene Erkrankungen (z. B. chronische
Vergiftungen, hohe Blutkortisolspiegel, Herzinsuffizienz, Adipositas) eine
hepatozelluläre Degeneration auslösen können. Im Rahmen einer hepatozellulären
Degeneration kommt es häufig zu Einlagerungen bestimmter Substanzen, da der
Hepatozyt nicht mehr in der Lage ist, diese angemessen zu verstoffwechseln. Dabei
handelt es sich am häufigsten um Fett oder Glykogen (STALKER u. HAYES 2007;
CULLEN 2009).
Rahmen einer steroidinduzierten Hepatopathie auf und ist induziert durch endogene
oder exogene Glukokortikoide bzw. in seltenen Fällen durch Steroidhormone
(Progesteron, Aldosteron) (CULLEN et al. 2006; SEPESY et al. 2006). SEPESY et
al. (2006) gehen davon aus, dass auch eine stressinduzierte Hyperkortisolämie bei
akuten oder chronischen Erkrankungen an der Entstehung einer Glykogenose
beteiligt ist. Weiterhin beobachten sie außerdem Glykogeneinlagerungen im
Zusammenhang mit hepatischen und nicht hepatischen Neoplasien, auch wenn die
Hunde keine exogen zugeführten Glukokortikoide erhielten. Glukokortikoide führen
zu einer Anordnung der Peroxisomen um Glykogentropfen, wobei insgesamt die
Anzahl der Peroxisomen vermindert ist (PHILLIPS et al. 1987).
Im Falle einer steroidinduzierten Hepatopathie ist die Leber vergrößert und weist eine
blassbraune Farbe auf (CULLEN 2007a). Das Bild einer hepatozellulären
Glykogeneinlagerung zeigt sich als intrazytoplasmatische Vakuolisierung von
Hepatozyten mit überwiegend kleinen verwaschenen Vakuolen. Der Nukleus befindet
sich dabei zunächst noch in zentraler Position (CULLEN et al. 2006). Bei
zunehmender Glykogeneinlagerung kann es zu einer zwei bis zehnfachen
Vergrößerung der Hepatozyten mit Verdrängung des Kernes in die Peripherie
kommen. Die Veränderungen beginnen am häufigsten in der Zone 2 (intermediäre
Zone) des Azinus, können sich jedoch im weiteren Krankheitsverlauf zunehmend
ausbreiten. Im fortgeschrittenen Stadium gehören Zelluntergänge (Nekrosen), sowie
46 2 Literaturübersicht
histologischen Bild. Die PAS-Färbung (periodic acid Schiff reaction) gibt Aufschluss
über den intrahepatozellulären Gehalt an Glykogen. Klinisch sind deutlich erhöhte
enzymatische Aktivitäten der ALT und der ALKP zu erwarten (STALKER u. HAYES
2007). Das Erkrankungsbild findet sich häufig bei Hunden. Auch angeborene
Glykogenspeicherkrankheiten führen zu ähnlichen Veränderungen der Hepatozyten
(STALKER u. HAYES 2007).
Lipidose
Der Lipidmetabolismus in der Leber wird sehr eng reguliert. Fettsäuren werden
oxidiert, um dem Energiebedarf zu decken; sie werden zu Triglyzeriden verestert, die
an VLDL (very long density lipoprotein) gebunden in die Fettdepots transportiert oder
in den Hepatozyten gespeichert werden (RAO u. REDDY 2004).
Bei der Anreicherung von Fetttropfen in Hepatozyten spricht man von einer
hepatischen Lipidose oder hepatozellulären Steatose, die im Extremfall zu einer
Leberverfettung führen kann (DE CRAEMER 1995; KÄUFER-WEISS 2007;
STALKER u. HAYES 2007). Dies beinhaltet eine absolute Erhöhung des
Fettgehaltes der Leberzellen (CULLEN et al. 2006; SCHRADER u. FAHIMI 2008).
Akute Lipidosen zeigen sich makroskopisch als vergrößerte blasse Lebern mit
brüchiger bis fettiger Konsistenz ohne Veränderung der Leberarchitektur.
Makroskopisch erscheinen die Ränder abgerundet (STALKER u. HAYES 2007).
Vorangeschrittene toxische Schädigungen von Hepatozyten führen zur
Verschmelzung von kleinen Lipidtropfen zu einem großen Tropfen, der den Kern aus
seiner zentralen Stellung verdrängt und zur Konturveränderung der Zelle führt. Die
Sinusoide werden komprimiert und vermindert durchblutet (STALKER u. HAYES
2007).
Eine Ansammlung von Triglyzeriden in Form von Fetttropfen kann sich histologisch
mikrovesikulär oder makrovesikulär darstellen (RAO u. REDDY 2004; STALKER u.
HAYES 2007). Die mikrovesikuläre Steatose beschreibt intrazelluläre, überwiegend
perinukleär angeordnete Lipidtropfen, die kleiner sind als der Kern, während bei einer
2 Literaturübersicht 47
makrovesikulären Steatose, die Lipidtropfen mindestens so groß wie der Kern oder
größer sind und den Nukleus nach peripher verdrängen (CULLEN et al. 2006).
Eine mikrovesikuläre Lipidose beginnt meistens zentrolobulär (Zone 3) im
Leberläppchen und kommt vor allem bei erhöhter Mobilisation von Fetten z. B. bei
Diabetes mellitus und juveniler Hypoglykämie von Toy Rassen (CULLEN et al. 2006)
und nicht selten bei toxisch bedingten Hepatopathien vor (STALKER u. HAYES
2007). Die mikrovesikuläre Lipidose tritt häufig im Zusammenhang mit Schädigungen
der Mitochondrien auf und ist hinsichtlich des Zellschadens als schwerwiegender
einzuordnen als die makrovesikuläre Lipidose (CULLEN 2009).
Bereits degenerierte Hepatozyten zeigen in besonderem Maße eine hepatische
Lipidose, da der Durchsatz von Fettsäuren und Triglyzeriden durch die Blockade an
entscheidenden Punkten im Lipidstoffwechsel und der Sekretion von VLDL
beträchtlich eingeschränkt ist. Das Fett, das als Substrat der ß-Oxidation dient,
sammelt sich somit im Hepatozyten (DE CRAEMER et al. 1995). Eine krankhafte
Verfettung der Leber kann demnach durch vielfältige alimentäre, metabolische,
toxische und hypoxische Ursachen eintreten (STALKER u. HAYES 2007). Die
hepatische Steatose kann, wie die hydropische Degeneration reversibel verlaufen.
Bei persistierender oder sehr heftiger Noxe im Zusammenhang mit ROS,
Endotoxinen, Tumornekrosefaktor alpha und unter dem Einfluss von bestimmten
Zytokinen kann sie sich zu einer Steatohepatitis ausweiten (DAY u. JAMES 1998).
Zu den verschiedenen Ursachen und Mechanismen, die eine Lipidansammlung in
Hepatozyten auslösen können, gehören:
Fettsäuren (z. B. Mobilisation bei Laktation, Hunger, endokrine Störungen,
Trächtigkeit) (CULLEN 2007a; STALKER u. HAYES 2007)
intrahepatische Ursachen: abnorme Hepatozytenfunktion und Energie-
mangelzustände mit herabgesetztem Lipidstoffwechsel (CULLEN 2007a),
toxische und hypoxische Ursachen (CULLEN 2007a), Reduktion der Enzyme
zur ß-Oxidation in den Peroxisomen (FAN et al. 1998).
48 2 Literaturübersicht
Bildung und Export von Lipoproteinen aus den Hepatozyten (CULLEN 2007a)
Längerfristig bestehende Lipidosen ziehen meist weitere Schädigungen nach sich.
So kommt es bei chronischen Zuständen zu Fibrose, Pigmentablagerungen und
nodulären Hyperplasien. Diese Veränderungen werden durch fortschreitende
peroxidative Schädigung und Aktivierung von Ito-Zellen hervorgerufen. Das erhöhte
Auftreten von Lipidtropfen erhöht auch den oxidativen Stress der Zelle, der zur
Verstärkung der Lipidperoxidation von Membranen beiträgt (STALKER u. HAYES
2007). In der Humanmedizin wird histologisch die Steatose auch mit Auftreten von
inflammatorischen Veränderungen, ballonierender Degeneration, Apoptose und
Entzündung beobachtet (RAO u. REDDY 2004).
2.3.2 Verhalten der Peroxisomen bei degenerativen
Veränderungen der Hepatozyten
Bildung von Myelinfiguren und der Verlust von Zellkontakten. Veränderungen der
Mitochondrien in Form von Schwellung und das Auftreten von amorphen
Einlagerungen sind häufig sowie die Dilatation des Endoplasmatischen Retikulums
und die Ablösung der Ribosomen (CULLEN et al. 2006).
Beim Menschen zeigen Peroxisomen der Hepatozyten im Rahmen einer Steatose
eine variable Katalaseaktivität, werden kleiner und proliferieren, wobei sie
unterschiedliche Erscheinungsformen wie anguläre, gebogene oder irreguläre
Konturen mit Protrusionen und Membranschleifen (Gastruloid cisternae) annehmen
können. Das peroxisomale Nukleoid verschwindet dabei (DE CRAEMER et al. 1995).
Die Mitochondrien der steatotisch veränderten humanen Leber nehmen beachtlich
an Größe zu und werden als Megamitochondrien bezeichnet. Dabei zeigen sie
parakristalline Einschlüsse und parallel arrangierte Cristae (DE CRAEMER et al.
2 Literaturübersicht 49
1995). Das Endoplasmatische Retikulum einer Fettleber ist dilatiert und zeigt
Vesikelbildung (DE CRAEMER et al. 1995).
In nahezu allen geschädigten Zellen, besonders in Hepatozyten, die zu den
metabolisch aktiven Zellen zählen, kommt es im Rahmen von degenerativen
Veränderungen zu einem Anstieg der Peroxisomenzahl. Die sehr pleomorphen
Peroxisomen lagern sich dabei im Bereich der Schädigung, z.B. in der Nähe von
Mitochondrien, gruppenweise an. Insgesamt erscheint die Peroxisomenproliferation
zentrolobulär ausgeprägter als perilobulär (CHEVILLE 1994c).
2.3.3 Hepatitiden
spezifische infektiös bedingte und unspezifische reaktive Formen eingeteilt werden.
Das Verteilungsmuster ist dabei abhängig von der Entzündungsursache, der
Eintrittspforte, dem Infektionserreger bzw. dessen Zelltropismus innerhalb der Leber
(CULLEN 2007a; STALKER u. HAYES 2007).
Hämatogene Infektionen verursachen z. B. ein eher zufällig verteiltes, multifokales
Verteilungsmuster, während über die Gallenwege aszendierende Infektionen vor
allem in Portalbereichen ihre Manifestation finden, wobei schwerwiegende
Infektionen das gesamte Portalfeld und über dessen Grenzen hinaus
Entzündungsprozesse mit einbeziehen können (CULLEN 2007a).
Akute Hepatitis
Die akute Hepatitis ist durch das Auftreten von Entzündungserscheinungen mit
Infiltration von neutrophilen Granulozyten, Aktivierung von Kupffer-Zellen, Nekrosen
und Apoptosevorgängen von Hepatozyten charakterisiert. Die Zellpopulationen, die
an der Entzündungsreaktion beteiligt sind, variieren stark in Abhängigkeit von der
Ursache, der Wirtsantwort und dem Stadium der Läsion. Meist dominieren
neutrophile Granulozyten bei bakteriell bedingten Infektionen und
Protozoeninfektionen. Virale Infektionen führen in erster Linie zum Auftreten von
Nekrosen, Apoptosen einzelner Zellen und häufig nur minimalen
50 2 Literaturübersicht
Kupffer-Zellen spielen außerdem eine wichtige Rolle bei akuten
Entzündungsprozessen, da sie durch ihre Phagozytosefähigkeit zur Beseitigung von
pathogenen Noxen, wie z. B. Bakterien, beitragen. Im Zuge einer Aktivierung zu
sekretorisch aktiven Histiozyten schütten sie neben Zytokinen weitere Mediatoren
aus, die an hypertrophen und proliferativen Prozessen der Hepatozyten, der Ito-
Zellen und Endothelien beteiligt sind (STALKER u. HAYES 2007). Bakterielle
Leberentzündungen können beim Hund durch Leptospiren verschiedener Serovare
(L. grippothyphosa, L. pomona, L. bratislava, L. canicola, L. icterohaemorrhagiae),
bei Jungtieren durch Clostridium piliforme oder auch nach disseminierter Ausbreitung
im Organismus durch Nocardia asteroides verursacht werden. Ursache viraler
Hepatitiden sind das canine Adenovirus 1 und das canine Herpesvirus 1 (KÄUFER-
WEISS 2007).
Chronische Hepatitis
Bei immer wiederkehrenden Noxen oder unvollständiger Ausheilung akuter
Hepatitiden kommt es zur Entwicklung einer chronischen Hepatitis. Sie ist in erster
Linie gekennzeichnet durch eine Fibrose neben Infiltrationen von mononukleären
Entzündungszellen, wie Lymphozyten, Makrophagen und Plasmazellen.
Regenerationsprozesse in Form von proliferierenden Knötchen sind ebenfalls häufig
zu finden (CULLEN 2007a). Die Diagnose sollte die Dauer und den Grad der
Erkrankung einbeziehen. Die Aktivität einer Hepatitis wird durch den Grad der
Entzündungsreaktion und das Ausmaß von Apoptose und Nekrose bestimmt
(CULLEN et al. 2006). Beim Hund finden sich variable Mengen neutrophiler
Granulozyten. Dies weist daraufhin, dass ein akuter Entzündungsreiz bestehen bleibt
bzw. wiederholt auftritt (CULLEN 2007a).
Es können verschiedene Formen von chronischen Hepatitiden unterschieden werden
(CULLEN 2007a):
disseminiert, Entzündungsgeschehen wird dominiert durch Makrophagen und
2 Literaturübersicht 51
Plasmazellen)
bindegewebig abgegrenzt/eingekapselte Prozesse)
Hepatitis)
Entzündungszellinfiltraten
o Cholestase
Weiterhin sind zwei Subtypen der chronischen Hepatitis für Hunde beschrieben:
progressive chronische Hepatitis (rassebedingte Kupfervergiftung bei
Dalmatiner, Bedlington und West Highland White Terrier, Pudel)
familiäre chronische Hepatitis (weibliche Hunde der Rasse Dobermann,
Skye Terrier, Cocker Spaniel und Labrador Retriever)
2.3.4 Lebertumoren
Lebertumoren können primär oder sekundär auftreten. Primäre Tumore des Leber-
und des Gallengangsystems haben ihren Ursprung in epithelialen Zellen, wie den
Hepatozyten, dem Gallengangsepithel sowie dem Epithel der Gallenblase oder
entstehen aus mesenchymalem Gewebe, wie Bindegewebe oder Zellen der
Blutgefäße. Sekundäre Tumore der Leber sind sehr häufig und stellen den größten
Anteil der Lebertumore aufgrund ausgeprägter Metastasierung in dieses Organ dar.
Am häufigsten metastasieren in die Leber maligne Lymphome, darüber hinaus
Melanome und Hämangiosarkome (CULLEN 2007a).
52 2 Literaturübersicht
Humanmedizin eine eher untergeordnete Rolle. Tumoren der Leber und der
Gallengänge stehen, soweit bekannt, in der Veterinärmedizin nicht in direktem
Zusammenhang mit vorangegangenen Lebererkrankungen (STALKER u. HAYES
2007).
Die epithelialen Tumoren der Leber gehen entweder von Hepatozyten, von
Gallengangsepithelien oder deren gemeinsamen undifferenzierten Vorläuferzellen
(oval cells) hervor. Hepatozelluläre Adenome kommen vor allem bei älteren Hunden
sowohl in gesundem Gewebe als auch in zirrhotisch umgebautem Parenchym vor
(KÄUFER-WEISS 2007). Sie unterscheiden sich makroskopisch kaum von nodulären
Hyperplasien oder von Leberzellkarzinomen und treten normalerweise als einzelne
Tumoren auf (STALKER u. HAYES 2007).
Hepatozelluläre Karzinome kommen selten aber mit einer gewissen Regelmäßigkeit
bei Hunden vor (CULLEN 2007a). Sie treten als einzelne oder multinoduläre
Umfangsvermehrungen auf (STALKER u. HAYES 2007), zeigen ein infiltratives
Wachstum und neigen nach Einbruch in das Pfortadersystem zur weiteren
Ausbreitung in der Leber (KÄUFER-WEISS 2007). Hämatogene Metastasen über die
Lebertumoren epithelial mesenchymal
2 Literaturübersicht 53
Vena hepatica finden sich meist zuerst in der Lunge (HEAD et al. 2003; STALKER u.
HAYES 2007). Histologisch werden trabekuläre, adenoide und solide Formen der
Karzinome unterschieden (STALKER u. HAYES 2007), wobei mehr als eine
histologische Variante in einem Tumor auftreten kann (HEAD et al. 2003). Mitosen
kommen häufig vor (STALKER u. HAYES 2007). Die zellulären Eigenschaften der
Hepatozyten in hepatozellulären Karzinomen variieren je nach Differenzierungsgrad.
Gut differenzierte hepatozelluläre Karzinome zeigen Leberzellen, die normalen
Hepatozyten gleichen, mit rundem zentralen Kern und eosinophilem Zytoplasma.
Das Zytoplasma kann auch blass sein, vakuolisiert und gefüllt mit Glykogen oder
Lipiden. Schlecht differenzierte Karzinome weisen dagegen Hepatozyten auf, die
sehr pleomorph sind. Diese Tumorzellen zeigen eine Anisokaryose und nur wenig
basophiles Zytoplasma. Die Nukleoli sind deutlich vergrößert. Eine Sonderform des
hepatozellulären Karzinoms stellt das Klarzellkarzinom dar, das vollständig aus
ballonierten Zellen zusammengesetzt ist (HEAD et al. 2003).
Bei den Tumoren, die vom Gallengangsepithel ausgehen, werden das Cholangiom
und das Cholangiokarzinom unterschieden. Das Cholangiom findet sich vor allem in
Lebern älterer Hunde. Cholangiome treten intrahepatisch auf, selten extrahepatisch
und erscheinen als solide oder zystische Tumore (STALKER u. HAYES 2007). Das
Wachstumsverhalten der Gallengangskarzinome ist solide oder multinodulär
(STALKER u. HAYES 2007) und besitzt häufig ein ausgeprägtes fibröses Stroma
(CULLEN 2007a). Hämatogene Metastasen sind selten, Metastasen in regionale
Lymphknoten dagegen häufig. Das Wachstumsverhalten ist sehr invasiv. Die
Abgrenzung zu anderen metastatischen Adenokarzinomen ist mitunter sehr
schwierig. (STALKER u. HAYES 2007).
Das Hepatoblastom ist ein Tumor ausgehend von pluripotenten Vorläuferzellen,
welcher sowohl bei alten als auch bei jungen Hunden vorkommt (STALKER u.
HAYES 2007).
Tumoren, die aus neuroendokrinen Zellen der Leber oder der Gallengänge
hervorgehen, nennt man hepatische Karzinoide. Diese sind gekennzeichnet durch
ein besonders aggressives Wachstumsverhalten in Form von stark infiltrativem
54 2 Literaturübersicht
Typischerweise sind die Tumorzellen nesterartig arrangiert, durchzogen von
Bindegewebssepten (HEAD et al. 2003; STALKER u. HAYES 2007). Hepatische
Karzinoide müssen von metastatischen Tumoren des Nebennierenmarkes
abgegrenzt werden (HEAD et al. 2003).
Primäre mesenchymale Tumoren der Leber können von Bindegewebe der glatten
Muskulatur oder den Endothelzellen ausgehen. Sowohl gutartige Leiomyome als
auch maligne Leimyosarkome und Fibrosarkome treten auf. Hämangiome und
Hämangiosarkome finden sich ebenfalls häufig in der Leber, wobei
Hämangiosarkome dort häufiger als Metastasen vorkommen (STALKER u. HAYES
2007).
Sonstige Neoplasien
Die Leber ist aufgrund ihrer starken Vaskularisation ein bevorzugtes Organ für die
Ansiedlung metastatischer Tumoren (CHEVILLE 1994d; STALKER u. HAYES 2007).
Metastatische Neoplasien sind bei Hunden die am häufigsten vorkommenden
Lebertumoren und entstammen zumeist dem Pankreas, dem Gastrointestinaltrakt,
der Milz, der Milchleiste, den Nebennieren, Knochen und der Schilddrüse (HOSKINS
2005). Karzinome des Pankreas und Gastrointestinaltraktes metastasieren über die
Portalvene in die Leber. Einige Tumore, wie Mammakarzinome, Schildrüsen-
karzinome, Melanome und Sarkome, metastasieren über die Lunge und die
Leberarterie (STALKER u. HAYES 2007). Die periportalen und perisinusoidalen
Bereiche sind sehr empfänglich für hämatopoetische neoplastische Zellen. Aufgrund
dieser Tatsache sind Lymphome, maligne Histiozytose, myeloide und erythroide
Leukämien sowie Mastzelltumoren in der Leber nicht selten (STALKER u. HAYES
2007). Das multizentrische maligne Lymphom ist ein häufiger Tumor der Leber, auch
unter Einbeziehung von Milz (HEAD et al. 2003; STALKER u. HAYES 2007),
Lymphknoten, Thymus, Knochenmark und anderen Organen (KÄUFER-WEISS
2007; STALKER u. HAYES 2007).
2 Literaturübersicht 55
Wie bereits erwähnt sind Hämangiosarkome der Leber häufig als Metastasen
anzutreffen. Der Tumor besteht aus Endothelzellen, die unterschiedlich große
vaskuläre Spalten und Kavernen ausformen. Auch solide Formen treten auf
(STALKER u. HAYES 2007), wobei die neoplastischen Endothelzellen anhand ihrer
„schuhzweckenförmigen“ Gestalt erkannt werden können (KÄUFER-WEISS 2007).
Die bevorzugten Lokalisationen der Primärtumoren sind Milz, Knochenmark und
Leber. Die Metastasierung erfolgt in besonderem Maße in die Lunge und das rechte
Herzohr. Neben der Bösartigkeit dieser Tumore ist, im Gegensatz zu den
Hämangiomen, ihre Tendenz zur spontanen Ruptur auffällig. Häufiger als andere
Rassen erkranken der Deutsche Schäferhund und der Boxer am Hämangiosarkom
(KÄUFER-WEISS 2007).
Tumoren
eine große Variabilität der Tumorzellen in der Frühphase der Karzinogenese.
Während der Entstehung eines hepatozellulären Karzinoms zeigen Tumorzellen eine
strukturelle Vereinfachung des Zytoplasmas, der Organellen (simplification).
Vereinfachungen der Organellen treten besonders beim rER und den Mitochondrien
auf. Ein Verlust von Organellen betrifft vor allem das sER, die Peroxisomen und das
Substrat Glykogen.
Peroxisomenzahl und deren Enzymausstattung beobachtet werden (MOCHIZUKI et
al. 1971). Darüber hinaus findet während des Tumorwachstums ein Wechsel von
peroxidativem zu mitochondrialem Metabolismus statt, um Energie für Zellwachstum
und Mitose bereitzustellen (TOLBERT u. ESSNER 1981). Bei hepatozellulären
Karzinomen sowie bei Lebermetastasen anderer Tumore konnten Veränderungen
des peroxisomalen Erscheinungsbildes in Form von Invaginationen, Protrusionen
und Membranschleifen (Gastruloid cisternae) beobachtet werden (DE CRAEMER et
al. 1993). Diese Veränderungen sind jedoch nicht spezifisch für Tumorerkrankungen,
56 2 Literaturübersicht
da sie ebenfalls bei Hepatitis und Steatose vorkommen können (DE CRAEMER et al.
1991; DE CRAEMER et al. 1995).
Im Gegensatz zu den zahlreichen Informationen in der Humanmedizin liegen in der
Veterinärmedizin keine Erkenntnisse in Bezug auf das Verhalten der Peroxisomen
und der Mitochondrien bei tumorösen Prozessen, insbesondere des Hundes vor. Ziel
dieser Arbeit ist es, Informationen hinsichtlich des Verhaltens der caninen
Peroxisomen und auch in untergeordneter Stellung, der Mitochondrien, in tumorösen
und degenerativen Erkrankungen der Leber zu erarbeiten.
3 Eigene Untersuchungen 57
quantitative elektronenmikroskopische Untersuchung der hepatozellulären
Peroxisomen von Hunden, die an degenerativen Erkrankungen oder tumorösen
Erkrankungen der Leber litten. Als Kontrollgruppe dienten Hunde ohne
Leberveränderungen.
Alle Gruppen wurden hinsichtlich der Anzahl an Peroxisomen pro Fläche/Hepatozyt
(µm²) miteinander verglichen. Neben der Untersuchung der Peroxisomen hinsichtlich
Morphologie und Anzahl wurden außerdem die übrigen Zellorganellen der
Hepatozyten (rER, sER, Mitochondrien, Lysosomen, Glykogen) auf morphologische
Veränderungen untersucht und mit denen von lebergesunden Hunden verglichen.
Die Patienten wurden einer Anamnese, einer Allgemeinuntersuchung und einer
Ultraschalluntersuchung unterzogen. Ergänzende Untersuchungen, wie die
Bestimmung klinisch-chemischer und hämatologischer Parameter, wurden
standardmäßig eingeleitet. Vor jeder Biopsieentnahme wurden
Gerinnungsparameter, wie aktivierte partielle Thromboplastinzeit und
Prothrombinzeit bestimmt. Zur weiteren Abklärung der Hepatopathie wurde
transabdominal oder laparaskopisch eine Biopsie des pathologisch veränderten
Lebergewebes entnommen und einer histologischen Untersuchung unterzogen.
3.1.2 Patienten
Im Zeitraum Oktober 2006 - Juni 2009 wurden insgesamt 45 Patienten mit
Hepatopathien in die Studie aufgenommen. Davon konnten jedoch insgesamt 26
Patienten aufgrund unterschiedlicher Ausschlusskriterien (Tabelle 3-1) nicht
58 3 Eigene Untersuchungen
verwendet werden. Überwiegend handelte es sich dabei um die Tatsache, dass der
pathohistologische Befund am Paraffin eingebetteten Gewebe nicht in
Übereinstimmung mit der für ultrastrukturelle Untersuchungen in Epon eingebetteten
sehr kleinen Gewebeproben stand, so dass schließlich die Proben von 19 Patienten
für die vorliegende Studie zur Verfügung standen und untersucht wurden.
Auswahlkriterien/Verteilung
klinisch-chemischer Blutparameter und der histologischen Diagnose der
Leberbiopsie in die Studie aufgenommen. Auch die Patienten mit tumorösen
Lebererkrankungen wurden anhand histologischer Befunde der Leberbiopsie und
gegebenfalls veränderter Blutwerte in die Studie integriert.
Tabelle 3-1 Anzahl der Patienten mit Hepatopathien, die nicht mit in die vorliegende Studie einbezogen werden konnten
Letztlich wurden 19 Patienten in die vorliegende Studie aufgenommen, von denen 11
in die Gruppe der degenerativen Lebererkrankungen und 8 Patienten in die Gruppe
der neoplastischen Lebererkrankungen fielen.
3 Eigene Untersuchungen 59
Diese Patientengruppe umfasst 11 Hunde, die an einer degenerativen
Lebererkrankung litten. In Tabelle 3-2 findet sich eine Übersicht der Patienten.
Tabelle 3-2 Übersicht Patienten der Gruppe 1 mit degenerativen Lebererkrankungen (w=weiblich, wk=weiblich kastriert, m=männlich, M.=Morbus, WHWT=Westhighland White Terrier, JRT=Jack Russ