ESPECTROMETRA DE MASAS La Espectrometra de Masas es una tcnica microanaltica usada para identificar

compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la

estructura y propiedades qumicas de molculas. La deteccin de compuestos puede

ser llevada a cabo con cantidades realmente pequeas (algunos moles) de muestra y

obtener informacin caracterstica como el peso y algunas veces la estructura del

analito.

En principio, el espectro de masas de cada compuesto es nico y puede ser usado

como se "huella qumica" para caracterizar el analito.

La espectrometra de masas atmicas es una herramienta muy verstil y til para

identificar los elementos presentes en una muestra y determinar las concentraciones

de cada una de las materias que la componen. Esta tcnica nos permite determinar

prcticamente todos los elementos del sistema peridico.

Esta tcnica ofrece numerosas ventajas frente a las tcnicas espectofotomtricas ya

que:

Los lmites de deteccin que son, para muchos elementos, tres rdenes de magnitud ms sensibles frente a los mtodos pticos.

Espectros notablemente ms sencillos, generalmente nicos y con frecuencia fcilmente interpretables.

Capacidad para medir relaciones isotpicas atmicas.

En cambio, tambin tienen una serie de desventajas que no podemos obviar como:

El coste del instrumento es de dos a tres veces el de los instrumentos pticos atmicos.

La deriva del instrumento puede ser del orden del 5 o 10%/hora. Contiene unas determinadas interferencias.

Con la espectrometra de masas somos capaces de proporcionar informacin acerca de:

La composicin elemental de las muestras: de esta se encarga la espectrometra de masas atmico.

De la composicin de las molculas inorgnicas, orgnicas y biolgicas. De la composicin cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas. De la estructura y composicin de superficies slidas. De las relaciones isotpicas de tomos en las muestras.

Hoy en da se contina avanzando y cabe citar al cientfico japons K. Tanaka, que bombardeando muestras de macromolculas biolgicas en estado slido o viscoso con rayos lser, consigui su dispersin en porciones ionizadas de pequesimo tamao, aptas para su anlisis por espectrometra de masas. Un mtodo para determinar la masa de macromolculas en espectrometra es acelerarlas en una cmara de vaco y medir su "tiempo de vuelo". Los blancos del espectrmetro son alcanzados por las molculas en un orden determinado por sus unidades Thomson. Las ms rpidas son las ms ligeras y de mayor carga. Estos mtodos poseen muchas aplicaciones como son el desarrollo de productos farmacuticos, control de sustancias nutritivas y diagnsticos precoces de enfermedades como la malaria, cncer de mama, cncer de prstata, etc.

FUNDAMENTOS TERICO- TCNICOS DE E.M.

Hoy en da, esta tcnica contina teniendo los mismos fundamentos que en su origen. La espectrometra de masas se fundamenta en la separacin de partculas moleculares o atmicas por su diferente masa. El proceso de la espectrometra de masas comprende bsicamente cuatro etapas:

Ionizacin de la muestra. Aceleracin de los iones por un campo elctrico. Dispersin de los iones segn su masa/carga. Deteccin de los iones y produccin de la correspondiente seal elctrica.

Fig.1: Esquematizacin del paso de una muestra por los principales componentes de un instrumento de espectroscopia de masas.

A. Ionizacin de la muestra

La ionizacin de la muestra se consigue por bombardeo mediante electrones (e-) segn el proceso.

B. Aceleracin de los iones por un campo elctrico

Convertimos una fraccin significativa de los tomos formados en la etapa 1 en un flujo de iones, generalmente positivos y de carga nica. La velocidad que adquieren viene regida por la formula:

v = [2eV/m]

Donde V es el potencial aplicado, e la carga del electrn y m la masa. Cuando las partculas aceleradas se someten a la accin de un campo magntico (H) describen una trayectoria circular de radio r alrededor de este campo, desarrollando una fuerza centrfuga mv2/r, la cual es igual a la fuerza de atraccin del campo Hev. De esto deducimos que el radio es igual a:

r = (2Vm/H2e)

C. Dispersin de los iones segn su relacin masa/carga

Basndonos en la ecuacin anterior podemos calcular la relacin m/e que es: m/e = H2.r2/2V

Dado que la mayora de los iones formados en la segunda etapa tienen una sola carga y que el resto de parmetros se mantienen constantes, la relacin m/e suele ser la masa del in. La utilidad analtica de un espectrmetro de masas depende de la resolucin del instrumento, o capacidad del mismo para separar dos partculas de diferente masa.

D. Deteccin de los iones y produccin de la correspondiente seal elctrica.

El ordenador al que est conectado el aparato recoge las distintas seales y las reproduce en forma de espectrograma, formato de fcil interpretacin.

INSTRUMENTACIN EN E.M. Bsicamente un espectrmetro de masas costa esencialmente de las siguientes partes:

Sistema de entrada de muestras. Cmara de ionizacin. Acelerador. Analizadores. Detector.

o Sistema de entrada de muestras.

En el sistema de entrada de muestras, un micromol o menos de muestra se convierte al estado gaseoso por calentamiento a unos 400C y se introduce lentamente en la cmara de ionizacin. La finalidad del sistema de entrada es permitir la introduccin de una muestra representativa en la fuente de iones con la mnima perdida de vaco. En los espectrmetros de masas ms modernos encontramos diferentes tipos de sistemas de entrada:

Sistemas indirectos de entrada: es el sistema ms clsico y el ms simple, en el cual la muestra se volatiliza externamente y se introduce en la regin de ionizacin que esta a

baja presin. El sistema de entrada es normalmente de vidrio para evitar posibles

prdidas por adsorcin.

Entrada por sonda indirecta: los lquidos y los slidos no voltiles se pueden introducir en la regin de ionizacin mediante un soporte para muestra o sonda, el cual

se inserta a travs de un cierre de vaco. El sistema de cierre se utiliza para controlar la

cantidad de aire que entra despus de la insercin de la sonda en la regin de ionizacin.

Las sondas tambin se usan cuando la cantidad de muestra es limitada ya que se pierde

mucha menos cantidad.

Sistemas de entrada cromatrogrficos y de electroforesis capilar: es un tipo de sistema de entrada especial, esta indicado su uso cuando al espectrmetro de masa va

acoplado un sistema de cromatrografa de gases o de lquidos de alta eficacia o a

columnas de electroforesis capilar que permiten la separacin y determinacin de los

componentes de mezclas complejas

o Cmara de ionizacin

Las fuentes de iones de los espectrmetros de masas, tienen todas unas caractersticas comunes, pese a la variabilidad de tipos existente y es que todas transforman los componentes de una muestra en iones. En muchos casos el sistema de entrada y la fuente de iones estn combinados en un nico componente. En todos los casos, se obtiene un haz de iones positivos o negativos (normalmente positivos) que posteriormente se acelera hacia el interior del analizador de masas o sistema separador a travs del acelerador.(Skoog, Hiller, Hieman, 2000, 212). La formacin de iones del analito es el punto de arranque de arranque de un anlisis por espectrometra de masas. El aspecto de los espectros de masas para distintas especies moleculares, depende en gran medida del mtodo utilizado para la formacin de los iones. Estos mtodos los podemos dividir en dos categoras:

Fuentes de fase gaseosa: en estas primero se volatiliza la muestra y luego se ioniza.

Estn generalmente restringidas a compuestos trmicamente estables que tengan puntos de ebullicin menores de unos 500C. En la mayora de los casos, estos requerimientos limitan la utilizacin de las fuentes de fase gaseosa a compuestos con pesos moleculares menores de unos 103 Daltons. Son aplicables a muestras no voltiles y trmicamente inestables. Normalmente los espectrmetros de masas estn equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes. Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 1000 Daltons.

Fuentes de desorcin: es estas la muestra en estado slido o lquido, se transforman directamente en iones gaseosos. Son aplicables a muestras no voltiles y trmicamente inestables. Normalmente los espectrmetros de masas estn equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes. Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 100000 Daltons. Las fuentes de iones se pueden clasificar tambin en fuentes duras y fuentes blandas.

Fuentes duras: comunican suficiente energa a las molculas para que estn en un estado de energa altamente excitado. La relajacin posterior, implica la rotura de las

uniones produciendo iones fragmentados. Su espectro da lugar a muchos picos y nos da

informacin acerca de la naturaleza de los grupos funcionales e informacin estructural

de los analitos.

Fuentes blandas: dan lugar a poca fragmentacin y el resultado es un espectro con muy pocos picos dndonos informacin til ya que nos permite la determinacin exacta del

peso molecular de la molcula o molculas

TIPO NOMBRE Y ACRNIMO AGENTE IONIZANTE Impacto de electrones (EI) electrones energticos Fase Gaseosa Ionizacin qumica (CI) iones gaseosos reactivos Ionizacin por campo (FI) electrodo de elevado potencial Desorcin por campo (FD) electrodo de elevado potencial Ionizacin por electronebulizacin (ESI) campo elctrico elevado Desorcin/ionizacin asistida por una matriz (MALDI) haz de lser Desorcin Desorcin por plasma (PD) fragmentos de fisin del 252Cf Bombardeo con tomos rpidos (FAB) haz de tomos energticos Espectrometra de masas de iones secundarios

(SIMS) haz de iones energticos

Ionizacin por termonebulizacin (TS) elevada temperatura

Fig. 1: Clasificacin de los distintos tipos de cmaras de ionizacin, indicando sus nombres y acrnimos y especificando cada sus agentes ionizantes.

Con la Espectrometra de Masas se proporciona informacin acerca de:

La composicin elemental de las muestras La composicin de las molculas inorgnicas, orgnicas y biolgicas. La composicin cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas. La estructura y composicin de superficies slidas. Las relaciones isotpicas de tomos en las muestras.

APLICACIONES DE E.M.

Las aplicaciones son tan numerosas y abarcan tantos campos que resulta complicado citarlas todas, a continuacin veremos las ms caractersticas:

Elucidacin de la estructura de molculas orgnicas y biolgicas. Determinacin del peso molecular de pptidos, protenas y oligonucleicos. Identificacin de los compuestos de cromatogramas en capa fina y papel. Determinacin de secuencias de aminocidos en muestras de polipptidos y protenas. Deteccin e identificacin de especies separadas por cromatrografa y electroforesis

capilar.

Identificacin de drogas de abuso y sus metabolitos en sangre, orina y saliva. Control de gases en enfermos respiratorios durante los procesos quirrgicos. Pruebas para confirmar la presencia de drogas en sangre de caballos de carreras y en

atletas olmpicos.

Datacin de ejemplares en arqueologa. Anlisis de partculas en aerosoles. Determinacin de residuos de pesticidas en alimentos. Control de compuestos orgnicos voltiles en el agua de suministro

Vamos a ver ahora de un modo ms extenso las principales aplicaciones de esta tcnica.

Aplicaciones cualitativas (Skoog D., Holler J., Nieman)

Determinacin del peso molecular de todas las sustancias que pueden volatilizarse por la posicin del pico correspondiente a la masa patrn.

Determinacin de la formula molecular. Si el instrumento es de gran resolucin bastar la determinacin precisa de su masa molecular para poder atribuirle una frmula

emprica. Otras veces puede determinarse por la relacin entre las alturas del pico

correspondiente a la masa patrn y la de los picos de los istopos. Existe una tercera

forma que sera con la regla del nitrgeno, segn la cual todas las sustancias orgnicas

con peso molecular par deben de contener un nmero par o ningn tomo de N y los de

nmero impar deben de contener un nmero impar. Por el contrario los fragmentos

moleculares por rotura de enlace, tienen una masa impar si contienen cero o nmero par

de tomos de N y masa par si el nmero de tomos de N es impar.

Identificacin de compuestos por su fragmentacin patrn: la fragmentacin de la mayor parte de las molculas produce un gran nmero de picos que permiten la

identificacin de numerosos compuestos y el reconocimiento de ciertos grupos

funcionales de ellos. Se han descrito una serie de reglas generales que rigen los procesos

de fragmentacin, los cuales son de gran utilidad para la determinacin de los espectros.

Identificacin de productos de reaccin o de productos metablicos: se usa en cintica qumica y en farmacologa pudindose llegar a identificar impurezas y

metabolitos a concentraciones de pocas partes por milln.

Caracterizacin y anlisis de polmeros: el polmero se piroliza en condiciones controladas y los productos voltiles se hacen pasar a un espectrmetro para su anlisis.

Anlisis de sangre: gracias ala rapidez del mtodo, se puede emplear incluso como control durante un proceso quirrgico. As se puede determinar a gran velocidad las

concentraciones hemticas de monxido y dixido de carbono, oxgeno, nitrgeno,

gases anestsicos (como el NO).

Estudiar la abundancia de istopos: Esta fue la finalidad con la que fue creada la tcnica y en la actualidad se usa para anlisis por dilucin de istopos, estudios con

trazadores isotrpicos, estudiar la edad de las muestra por su proporcin de istopos con

la ventaja frente a los radiactivos que se pueden medir los istopos no radiactivos.

Aplicaciones cuantitativas.(Skoog D., Holler J., Nieman T.)

Para la determinacin cuantitativa de los componentes de una mezcla es conveniente que cada uno de ellos presente por lo menos un pico que difiera claramente de los dems. La calibracin se realiza por comparacin de los picos con patrones adecuados. Las alturas de los picos son directamente proporcionales a las presiones parciales de los componentes volatilizados en la muestra. Las aplicaciones cuantitativas de la espectrometra de masas para analisis cuantitativo son de dos tipos:

Determinacin cuantitativa de especies moleculares o tipos de especies moleculares en muestras orgnicas, biolgicas y ocasionalmente inorgnicas: normalmente tales

analisis se llevan a cabo haciendo pasar la muestra a travs de una columna

cromatrogrfica o de electroforesis capilar y posteriormente por el espectrmetro.

Determinacin de la concentracin de elementos en muestras inorgnicas y, en menor medida, de muestras orgnicas y biolgicas: las concentraciones de analito en

este caso se obtienen directamente a partir de las alturas de los picos de los espectros de

masas. Se crean curvas de calibrado que nos permiten el analisis cuantitativo gracias a

la existencia de picos nicos para cada componente y cada valor de m/z.

GLOSARIO

Relacin masa/carga: Esta expresin, abreviada m/z, es la relacin del nmero de masa (m) de una partcula dada entre el nmero (z) de unidades cargadas electrostticamente (e) que

posee la partcula. As, m/z es una relacin adimensional que es el parmetro medido por el

analizador de masas. La masa de una partcula dada es igual a la suma de sus masas

atmicas (en Daltons) de todos los elementos que componen la partcula. El smbolo para

las unidad de masa es u, y corresponde a 1/12 de la masa del 12C, al que se la ha asignado

un valor de 12.000000 por convencin.

Iones doblemente cargados:Es posible para una molcula perder dos electrones durante el proceso de ionizacin. Estos iones que estn doblemente cargados producirn un pico en el

espectro de masas en un valor m/z numricamente igual a la mitad de la masa molecular del

ion. Los iones doblemente cargados son insignificantes en el espectro de masa para la

mayora de los compuestos. Sin embargo, para aquellas molculas que los produzcan en

forma estable, los picos correspondientes en el espectro de masas pueden ser usados en la

interpretacin de datos.

Ion molecular: El ion molecular resulta de la ionizacin de la molcula a analizar. Este ion representa la molcula intacta y es el ltimo precursor de todos los iones fragmentados que

componen el espectro de masas. El pico del ion molecular aparece a un valor m/z

numricamente igual al peso molecular del compuesto.

Pico base: Es el pico ms intenso en el espectro de masas. Es usado como base para normalizar las intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una intensidad

relativa de 100%.

Intensidad relativa: La intensidad relativa de un pico representa su intensidad en comparacin con el pico base. Se representa como % respecto al pico base que es 100%. Por

convencin, este dato se indica en la izquierda del espectro de masas.

Porcentaje total de ionizacin: Este trmino expresa la abundancia de un ion individual comparado con la suma de las abundancias de todos los iones en un rango de masa

especifico. puede ser utilizado para comparar diferentes espectros de masas de diferentes

compuestos. Espectro de masas: Un espectro de masas es una grfica de intensidad relativa del ion

como funcin de la relacin masa/carga (m/z). El espectro de masas es frecuentemente

representado como un histograma simple. Esta forma de registro de iones y sus intensidades

sirven para establecer el peso molecular y estructura del compuesto a ser analizado. Debido

a que ocurre la fragmentacin del analito, las fracciones del ion aparecen en el espectro a

valores m/z menores que la molcula completa ionizada (ion molecular) a partir de es tos

datos se deduce la estructura y peso molecular de la molcula completa.

ESPECTROMETRA DE MASAS