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INFORME TÉCNICO FINAL DE PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN
(Enero 2008-Diciembre 2008)
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
PROYECTO
Efecto del estrés físico en la expresión de moléculas de adhesión en el NALT de ratones
PROGRAMA Estudio morfológico y funcional del tejido linfoide asociado a la
nariz
CLAVE PROYECTO 20080671
NOMBRE DEL DIRECTOR(A) DEL PROYECTO
Dra. María Elena Hernández Campos
RESUMEN
El sistema inmunitario de las mucosas comprende tejidos asociados con las
superficies de las mucosas respiratoria, digestiva y genitourinaria, los cuales
protegen al organismo de antígenos externos. El tejido linfoide asociado a la
nariz (NALT) representa un compartimiento inductor de la respuesta inmunitaria
y se localiza en piso de la nariz de algunos roedores; mientras que la lámina
propia de la mucosa nasal representa al compartimiento efector. El estrés,
provoca un incremento de la secreción de hormonas glucocorticoides y
catecolaminas por activación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal. Estas
hormonas interactúan con receptores de las células inmunitarias ocasionando
cambios en su respuesta. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos
del estrés físico en ratones adenalectomizados la expresión de integrinas: α4β1,
α4β7, y L-selectina en linfocitos del NALT mediante citometría de flujo y de las
moléculas de adhesión, MAdCAM-1, PNAd, ICAM-1 y VCAM-1 en este tejido
mediante inmunohistoquímica. Se utilizaron ratones Balb/c machos de 9
semanas de edad, divididos en un grupo control y un grupo problema, a los que
se aplicó 3 horas de ejercicio intenso durante 4 días.
En el análisis morfológico, no se observaron cambios en la arquitectura del
NALT, sin embargo durante el estrés de 4 días el volumen del órgano disminuyó
ligeramente, mientras que a los 8 días éste se incrementó. La expresión de
MAdCAM-1, PNAd, ICAM-1 y VCAM-1 fueron semejantes en los tres grupos de
estudio. La citometría de flujo mostró que en los linfocitos T se incremento la
expresión de las integrinas L-selectina, α4β7 y α4β1 del NALT posiblemente por la
influencia de las hormonas secretadas durante el estrés.
INTRODUCCION
Funcionalmente el aparato respiratorio se divide en tres segmentos: las
porciones conductora, respiratoria y de ventilación. La primera a su vez se divide
anatómicamente en vías aéreas superiores constituidas por: fosas nasales,
cavidad oral y faringe, mientras que las vías aéreas inferiores están
comprendidas por: laringe, tráquea, bronquios y bronquiolos preterminales y
terminales.
Las fosas nasales de acuerdo al tipo de epitelio de la mucosa que las
tapiza, se divide en tres zonas; 1) El vestíbulo, se encuentra situado en el
extremo anterior de las fosas nasales, presentando un epitelio plano estratificado
no queratinizado, con numerosos folículos pilosos, glándulas sebáceas y
sudoríparas 2) El área respiratoria, comprende la porción más extensa de las
fosas nasales; se localiza predominantemente en la parte anterior y piso de la
cavidad, con un epitelio que cambia a cilíndrico ciliado pseudoestratificado con
células caliciformes (epitelio respiratorio), que a su vez, también recubre la
trompa de Eustaquio, amígdalas y nasofaringe. Este tejido descansa sobre una
lámina propia que se continúa con el periostio o el pericondrio del esqueleto de
la nariz y está constituida por tejido conectivo laxo en el que se encuentran
células fijas y libres: fibroblastos, mastocitos, macrófagos, granulocitos, células
plasmáticas y linfocitos, además de glándulas mucoserosas. En la mucosa
respiratoria, también se encuentra una gran cantidad de células inmunitarias, las
cuales se distribuyen en la lámina propia en forma difusa, así como en
estructuras foliculares no encapsuladas, o constituyendo el tejido linfoide
asociado a la nariz (NALT), el cual forma parte de los tejidos linfoides asociados
a las mucosas (MALT). Entre las células del epitelio respiratorio que recubre el
NALT, también se encuentra gran cantidad de células M (membranosas o con
micropliegues), cuya principal función es la captura y la transitosis de los
antígenos desde la porción apical de la célula, hasta la porción basal, en donde
muestran el antígeno a las células presentadoras de antígenos. (Giannasca PJ y
cols 1997) 3) La porción olfatoria situada en la región posterior y techo de las
fosas nasales, presenta un epitelio cilíndrico pseudoestratificado alto.
En esta porción se distinguen 3 tipos celulares: de sostén, receptoras olfatorias y
básales. Las células de sostén son cilíndricas altas, su borde superior está
cubierto por microvellosidades, y tienen prolongaciones que rodean y separan a
las células olfatorias. Estas células de sostén se localizan en la porción luminal
del epitelio, en las caras laterales y están unidas por complejos de unión (zonula
ocluyente, zonula adherente y desmonsomas). Las células receptoras olfatorias,
son neuronas bipolares modificadas y su porción apical son dendritas
modificadas que se ubican en sentido perpendicular a la superficie de la
membrana nasal. La célula se estrecha a nivel de las uniones con las células de
sostén vecinas. Por encima de la zona estrecha, la dendrita se ensancha y tiene
la forma de un bulbo (vesícula olfatoria), la cual presenta varios cilios olfatorios
largos, no móviles. La porción basal de la célula se va adelgazando,
prolongándose en un axon (amielinico), siendo una fibra del nervio olfatorio. Las
células basales, son de aspecto cónico y se encuentran dispersas sobre la
lámina basal, se estima que son células madre pluripotenciales que se pueden
diferenciar en células de sostén o en células receptoras olfatorias. Por debajo
del epitelio en la lámina propia, se encuentran células pigmentarias, células
linfoides, además de una gran vascularización sanguínea y linfática que permite
la circulación y migración de células en el seno de la lámina propia, desde los
tejidos linfoides, así como del epitelio de revestimiento. La región olfatoria
presenta glándulas tubuloalveolares (Glándulas de Bowman), las cuales vierten
una secreción serosa. La mucosa además de continuarse con el periostio,
también presenta una gran cantidad de fibras colinérgicas y fibras adrenérgicas
(Geneser F 2002).
ARQUITECTURA HISTOLÓGICA DEL NALT
El tejido linfoide asociado a nariz (NALT) forma parte del sistema
inmunitario de las mucosas (MALT). Es un órgano linfoide par que se desarrolla
en algunos roedores después de la primera semana de nacimiento (Mebius R
2003, Ying X et al 2005, Harmsen A et al 2002); tiene la forma de un cilindro de
aproximadamente 3 mm de longitud y descansa a ambos lados del tabique
sobre el piso de la cavidad nasal. (Asanuma et al 1997, Heritage et al 1998,
Sminia T y Kraal G 1999)
Debido a su localización anatómica, se considera un análogo del anillo de
Waldeyer humano (Boyaka NP et al 2000) y funcionalmente se compara con la
placa de Peyer por presentar características inductoras similares. (Kiyono H y
Fukuyama S 2004)
La función atribuida al NALT, es proporcionar un sistema de defensa en
las vías aéreas superiores (Csencsits et al 1999, Boyaka PN et al 2000). El
NALT es un compartimiento inductor y corresponde a la porción de células
linfoides organizadas. En este sitio se inicia la respuesta inmunitaria, además de
ser el sitio de cambio de isotípo de inmunoglobulina IgM+ por IgA+ (Shikina T et
al 2004); una vez terminado este proceso, las células plasmáticas productoras
de IgA, migran hacia la lámina propia sobre la que descansa el tejido
organizado, en este sitio que es la porción efectora, se lleva acabo la producción
de IgA secretora la cual se encuentra presente en el moco nasal.
En cuanto a su estructura, el NALT está compuesto principalmente por
linfocitos T (predominando los CD4+) y linfocitos B en cantidades similares. El
órgano se encuentra regionalizado de acuerdo al patrón de distribución de cada
tipo celular; los linfocitos B se localizan preferentemente en la porción central
del órgano, conformando la zona B o folicular, mientras que los linfocitos CD3+
se distribuyen en la periferia de la zona B, conformando la zona T o parafolicular.
Otras poblaciones presentes son células dendríticas y macrófagos (Asanuma H
et al, 1997). Además en el epitelio respiratorio que recubre el NALT, otra forma
de entrada de antígenos, está dada por endocitosis de las células epiteliales.
(Cleary PP et al 2004). Aunque algunos antígenos solubles como la toxina del
cólera, pueden atravesar las uniones estrechas entre las células epiteliales, lo
que provoca la respuesta inmunitaria tanto en el compartimiento inductor como
en el efector de forma directa. Otro tipo de células encontradas son los linfocitos
intraepiteliales CD3+CD4+ y CD3+CD8+, los cuales se encuentran incluidos en
todo el epitelio, no solo el que recubre al NALT.
El NALT presenta una red reticular que se distribuye en la totalidad del
órgano; no presenta irrigación linfática aferente ya que la entrega de antígenos
ocurre principalmente por los procesos de transitosis en las células M, sin
embargo el tejido presenta irrigación linfática eferente, la cual drena
predominantemente hacia los nódulos linfoides cervicales posteriores, mientras
que el drenaje linfático de la mucosa nasal ocurre principalmente hacia los
nódulos linfoides cervicales superficiales. Además, debido a la expresión de
moléculas de adhesión en las vénulas de endotelio alto, a este componente se le
atribuye la función de permitir el ingreso, alojamiento y organización de las
células en el tejido (Drayton LD et al 2004).
El NALT juega un papel muy importante en el sistema de defensa del
tracto respiratorio alto en los roedores, ya que se ha demostrado que puede
provocar respuestas inmunitarias, tanto locales como sistémicas, por lo que se
ha considerado un modelo muy efectivo para inducir inmunidad. (Rojas-
Hernández S et al 2004).
EJE HIPOTALAMO-HIPOFISIS-ADRENAL
El hipotálamo es un centro de integración que recibe y monitorea
información acerca del ambiente, y además coordina las respuestas a través del
sistema nervioso central, autónomo y endocrino. Las principal información que
recibe es la visual, olfativa, auditiva y sensitiva.
Dentro de las funciones del hipotálamo está la de controlar la secreción
de hormonas hipofisiarias, controlar las acciones involuntarias por medio del
SNA (sistema nervioso autónomo) y regular la motivación y los instintos por
medio del sistema límbico. El núcleo paraventricular del hipotálamo secreta la
hormona corticotropina (CRH) dentro del sistema portahipofisiario, la cual regula
subsecuentemente la producción de hormona adrenocorticotrofica (ACTH) en la
glándula hipófisis anterior. La hormona ACTH a su vez actúa en la corteza de la
glándula suprarrenal provocando la secreción de cortisol. Durante los periodos
de estrés se produce una sobreestimulacion hipotalámica, lo cual provoca una
hipersecreción hormonal.
El sistema de estrés está constituido por el eje hipotálamo-hipófisis-
adrenal (HPA) y el sistema simpático sistémico, los cuales se encuentran
controlados por señales limbicas, circadianas, neurosensoriales y hormonales.
Las situaciones de estrés, tales como la hipoglicemia, procesos inflamatorios,
fiebre, trauma, ejercicio intenso, cirugía y problemas emocionales pueden activar
este sistema (Paca´k K y Palkovits M 2001).
ESTRÉS
Actualmente el estrés se define como un estado de amenaza para la
homeostasis, durante el cual se activa una respuesta adaptativa compensatoria.
(McEwen BS 1998). Cannon en 1929 fue el primer investigador en introducir el
término de homeostasis, el cual definió como un conjunto de mecanismos
fisiológicos coordinados que mantienen la mayoría de los procesos del
organismo en estados constantes. Cannon señala que el sistema nervioso
simpático es esencial para restaurar la homeostasis alterada por el estrés y para
promover la sobrevivencia del organismo, además mencionó la existencia de
respuestas al estrés, especificas para cada tipo de agente estresor.
Posteriormente, se introdujo el termino “Estrés” y se popularizó como una idea
científica. Dentro de sus principales efectos, describió una tríada patológica que
consiste en: hipertrofia suprarrenal, ulceración gastrointestinal e involución
timolinfática, la cual fue provocada por diferentes estresores. Debido a que las
diferentes respuestas específicas convergen en el estado de estrés, lo refirió
como un componente no especifico compartido. Posteriormente introdujo el
término de “síndrome de adaptación general” con sus tres fases sucesivas:
alarma, resistencia y agotamiento. Además propuso que la mayoría de los
estímulos agotadores, inducen dos tipos de respuestas: 1) respuesta general al
estrés, en la cual todos los agentes estresantes, implican el eje HPA. 2).- la
respuesta individual al estrés, mediada por factores condicionantes como la
predisposición determinada genéticamente.
Recientemente, McEwen BS (McEwen BS 1998) introdujo el término de
alostasis y la definió como la capacidad de adaptarse exitosamente a los
cambios. Durante este proceso activo de adaptación, se producen respuestas
que involucran el SNA y eje HPA, los cuales al ser activados, intervienen directa
o indirectamente en la producción de varios mediadores como el cortisol,
catecolaminas, citocinas, mediadores tisulares y genes de expresión temprana.
De acuerdo a la duración, el estrés se clasifica en:
Estrés agudo: En el sentido de la lucha, se considera simple, intermitente y de
exposición por tiempo limitado.
Durante el estrés agudo se produce una respuesta adaptativa, la cual
provoca que los procesos fisiológicos inhiban o estimulen varios sistemas y/o
sus componentes, para movilizar las reservas energéticas hacia órganos
prioritarios como los sistemas muscular y nervioso.
Estrés crónico: (carga de tensiones acumulativas); es la exposición a agentes
estresantes en forma prolongada y continua.
Los agentes estresantes se incluyen dentro de los principales
acontecimientos de la vida diaria y se pueden dividir en:
Físicos: frío, calor, ruido, vibración, ejercicio intenso, trauma, cirugía, radiación
etc.
Químicos: venenos, fármacos etc.
Psicológicos: procesos emocionales y cambios de comportamiento.
Sociales: desempleo, falla de relaciones interpersonales, nivel socioeconómico
etc.
Biológicos: enfermedades infecciosas.
El estrés por dolor y el estrés metabólico puede ser provocado por de
algunos de los agentes previos, como son el frío, el calor, el trauma, la cirugía,
químicos, venenos, fármacos, etc. (Paca´k K y Palkovits M. 2001)
En relación con la función inmunitaria se sabe que el estrés provoca un
incremento en la secreción de hormonas glucocorticoides y catecolaminas, las
cuales son reguladas por el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal; estas hormonas
interactúan con receptores de las células inmunitarias, provocando cambios en
su respuesta que incluyen, modificaciones en el tráfico y proliferación celular,
cambios en la secreción de citocinas y anticuerpos y en la actividad citolítica.
(Padgett DA y Glaser R 2003).
EFECTOS DEL ESTRÉS SOBRE EL SISTEMA INMUNITARIO
Frente al estrés, el organismo se protege a través del SNA-eje HPA, el
sistema inmunitario, cardiovascular y metabólico, por medio de respuestas
contra el estrés interno y externo. (Guyton AC 2003). El cortisol es el principal
glucocorticoide involucrado en la inmunomodulacion, el cual ejerce efecto sobre
prácticamente todas las células del sistema inmunitario. La hormona se une a
receptores citoplasmáticos, formando complejos hormona-receptor que entran al
núcleo y regulan la trascripción de diversos genes, lo que ocasiona efectos
inmunosupresores y anti-inflamatorios Además el SNA y el eje HPA provocan
supresión de las respuestas de fase aguda y de la inmunidad mediada por
células. (Padgett DA y Glaser R 2003).
El estrés agudo, provoca por un periodo de 3 a 5 días, efectos
inmunitarios que dependen de la secreción adrenal, lo que origina migración y
redistribución de macrófagos y linfocitos a través del cuerpo, con marginación
de las células en la pared de los vasos sanguíneos y otros compartimientos
como la piel, nódulos linfoides y médula ósea. Con esta respuesta, el organismo
establece un periodo de alarma, durante el cual posiblemente se incrementa la
vigilancia inmunológica y permite una mayor y más rápida migración celular a un
sitio de demanda. Si las señales hormonales disminuyen y no hay desafío, las
células regresan a la circulación. (Padgett y Glaser 2003)
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Identificar los efectos del estrés físico sobre las células del tejido linfoide
asociado a nariz en el ratón.
JUSTIFICACIÓN
La mucosa nasal es una vía de entrada y primer sitio de contacto para
múltiples antígenos. El NALT es una estructura linfoide organizada que se
encuentra situada estratégicamente en la porción del tracto respiratorio alto, que
tiene la capacidad de iniciar respuestas inmunitarias tanto locales como
sistémicas las cuales han sido poco estudiadas.
Por tal motivo la posible alteración en la morfología y función del NALT,
podría explicar el incremento en la susceptibilidad del tracto respiratorio a
enfermedades infecciosas provocadas por el estrés.
HIPÓTESIS
Si el estrés provoca un incremento en la secreción de hormonas
glucocorticoides y catecolaminas y si estas tienen influencia sobre las células
del sistema inmunitario asociado a la mucosa nasal, entonces los ratones
sometidos a estrés, presentarán modificaciones en las poblaciones de linfocitos
y moléculas de adhesión celular del NALT.
OBJETIVO GENERAL
En ratones adrenalectomizados con y sin estrés, determinar la expresión
de integrinas: α4β1, α4β7, y de la L-selectina en linfocitos del tejido linfoide
asociado a la nariz mediante citometría de flujo y de las moléculas de adhesión,
MAdCAM-1, PNAd, ICAM-1 y VCAM-1 en este tejido mediante
inmunohistoquimica.
MATERIAL Y METODOS
Animales. Se utilizaron ratones Balb/c machos con un peso entre 21-24 g
proporcionados por Harlan México, el manejo de los animales se realizo de
acuerdo a las normas de la Comisión de Bioética de la ESM. Posteriormente se
les removieron las adrenales y se cuidaron durante días días. Los ratones se
dividieron en dos grupos de 7 animales cada uno; divididos en un grupo control y
un grupo problema, a los que se aplicó 3 horas de ejercicio intenso durante 4
días.
Tratamiento de estrés. Los animales fueron sometidos a un esquema de estrés
por ejercicio intenso en contenedores cilíndricos apropiados al tamaño del
animal (5 cm. de largo, 3 cm de alto y 3.5 cm de diámetro) con ventilación
adecuada. Antes y después del periodo de estrés, los animales se mantuvieron
en jaulas durante los días de tratamiento, ingiriendo agua y comida a libre
demanda. Los animales control se mantuvieron en las mismas condiciones.
Obtención y procesamiento del material biológico. Posterior al tratamiento,
los animales se anestesiaron profundamente con vapores de éter, se sangraron
por punción cardiaca directa y se sacrificaron por decapitación. Se procedió a
realizar lavado nasal con 2 ml de solución salina estéril, colocando un catéter en
la tráquea, para realizar infusión retrógrada y colectar el liquido de lavado nasal
en tubos Eppendorff, después se almacenó en congelación para cuantificar
posteriormente la sIgA (IgA secretora) mediante ELISA. Por último se realizaron
curvas de concentración y cuantificación de proteínas por el método de Bradford.
Para la obtención del NALT, después del lavado nasal se removió la piel
de la cabeza, se retiró el maxilar inferior y los tejidos blandos, como lo describen.
Las cabezas se inmovilizaron en una placa de cera, colocando el paladar
superior en posición ventral para su disección con la ayuda de microscopio
estereoscópico, para la cual se realizó se dos incisiones verticales con hoja de
bisturí desde el vértice del paladar por la parte interna de los dientes incisivos,
siguiendo las porciones laterales hasta la base del paladar por la parte interna
de los dientes molares. Enseguida el colgajo fue sujetado por el vértice, con
pinzas de punta fina y se realizó tracción hacia la base del paladar, retirándolo
por completo. El paladar extraído se colocó en contenedores de aluminio de 1
cm³, sobre una base de medio de inclusión hidrosoluble (Tissue-tek), con el
NALT en posición ventral, éste fue cubierto con una segunda capa de tissue-tek
y se congeló en isopentano. Las muestras fueron almacenadas a –70° C, hasta
su corte en criostato.
Después de extraído el NALT los cráneos fueron fijados por inmersión en
paraformaldehido al 4% por 24 horas. Después de lavado, se descalcificaron con
EDTA al 8% p.H 7.6, realizando un cambio diario durante 8 días. Al término se
procesaron para su inclusión en parafina.
Inmunohistoquimica. De las muestras del NALT congeladas se obtuvieron
cortes de 7 µm de espesor, se colocaron en series de portaobjetos previamente
tratados con gelatina la 1%. Algunos se fijaron en acetona durante 20 minutos y
otros en formaldehído al 4% durante el mismo tiempo.
Los cortes del NALT fijados en formaldehído y cortes de 7 µm de espesor,
obtenidos de las muestras incluidas en parafina se tiñeron con hematoxilina y
eosina para un análisis morfológico general.
Tinciones. En los cortes fijados en acetona se realizaron las tinciones
inmunohistoquímicas para identificar las siguientes poblaciones celulares: por
inmunohistoquímica indirecta se detectaron la expresión de MAdCAM-1, PNAd,
ICAM-1 y VCAM-1 en el endotelio y las vénulas del endotelio alto, utilizando los
respectivos anticuerpos monoclonales de ratón, conjugados con biotina
(Pharmingen). Posteriormente se aplicó estreptavidina conjugada con
peroxidasa (Jackson Immuno Reserch).
Previa a las tinciones la actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó
incubando los cortes en una solución de H2O2 al 0.3% y NaN3 al 0.1% en PBS,
durante 10 minutos. Los tiempos de incubación con los anticuerpos primarios fue
de 1-2 horas y para la estreptavidina de 1 hora, ambos a temperatura ambiente y
en cámara húmeda. Después de cada incubación se realizaron lavados suaves
con PBS. La reacción de peroxidasa se revelo según el método de Karnovsky
con DAB (Pierce). Las muestras se contracolorearon con hematoxilina de Harris
(dilución 3:1 agua destilada/hematoxilina), se deshidrataron y cubrieron con
resina sintética. Para cada uno de los anticuerpos se realizaron tinciones control
siguiendo el mismo protocolo, excepto que el primer anticuerpo se sustituyó en
PBS.
Obtención de linfocitos para citometría de flujo. Después de remover el
NALT, la obtención de linfocitos se realizó de la siguiente forma: el paladar del
ratón, conteniendo el NALT se colocó en una caja de Petri con 10 ml de medio
RPMI-1640, se realizó un raspado suave con una espátula para separar el NALT
del paladar, después se disgregó el NALT con el émbolo de plástico de una
jeringa y se recuperó la suspensión celular, la cual se filtró en tela de organza de
10 × 10 cm. con una abertura de 1mm y se colocó en tubos cónicos de 15 ml. La
suspensión celular se centrifugó a 1500 rpm/10 min. a 4° C, se desechó el
sobrenadante y se resuspendió la pastilla en 1 ml de RPMI-1640. Finalmente se
ajustó a 1x106 células, para realizar las diferentes inmunotinciones para
citometría de flujo.
Inmunotinción de linfocitos para citometría de flujo. La tinción de los
linfocitos se realizó con anticuerpos anti-ratón (Becton Dickinson Technologies,
Gaithersburg, MD) obtenidos de PharMingen (San Diego, CA) con fluorocromos
conjugados biotinilados. Para controles de isotipo, anticuerpos anti-IgG2a
marcados con Phicoerithrin (PE) y Ab anti-IgG2b con (FITC), PE-conjugado a
estreptoavidina; anti-LPAM-1 (complejo integrina α4β7) PE (DATK32); anti-
CD62L FITC (L-selectina, LECAM-1, Ly-22) (MEL-14); anti-CD29 FITC (integrina
β1 cadena) (Ha/2). Los anticuerpos se diluyeron 1:100 con amortiguador de
fosfatos con albúmina sérica bovina p.H 7.4 (PBA) (10 mg/ml) y se colocaron 10
µl de cada anticuerpo, por cada millón de células, incubando en oscuridad a 4°C
por 30 min. Al término de ese tiempo se lavaron con PBA y se desechó el
sobrenadante, al paquete celular se le agrego 400 µl de para-formaldehído al 1%
y se guardo en oscuridad a 4 º C hasta su lectura en el Citómetro de flujo
FACSCAN (Becton Dickinson, San Jose, CA), cada conteo se realizo en un
mínimo de 10,000 eventos. El análisis de resultados, se llevó a cabo mediante el
software (winMDI 2.8)
Análisis estadístico. Utilizando la prueba de ANOVA de una vía, se
compararon los grupos experimentales de cada protocolo con su respectivo
testigo. Los datos se analizaron mediante el software Sigma Stat y se graficaron
mediante el software Sigma Plot.
RESULTADOS Efecto del estrés en la morfología del tejido linfoide asociado a nariz.
En los cortes teñidos con H-E el NALT se observó como dos masas
ovoides situadas a los lados de la línea media en la cara nasal del paladar. Por
su forma, se pueden describir tres caras, la basal apoyada sobre el paladar, la
medial revestida por epitelio respiratorio, el cual en todos los grupos presentó
características normales y una cara lateral en relación con la pared lateral de la
nariz. En la estructura del NALT, no se identificaron nódulos linfoides típicos. En
relación a la irrigación se identificaron vénulas convencionales y de endotelio
alto (HEV) así como arteriolas. (Figura 1). Los animales de los grupos
estresados 3 horas durante 4 dias, no presentaron cambios en la morfología del
NALT comparados con el grupo control.
ER
CL
CB
LP
Figura 1. Morfología del NALT. ER epitelio respiratorio,
CL cara lateral, CB cara basal, LP lámina propia. H-e. 4x.
NALT
Molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1+).
Las inmunotinciones para esta molécula, mostraron en todos los animales
estudiados reacción positiva en la trama reticular del órgano y en el endotelio de
las vénulas de endotelio alto, las cuales se localizaron en las zonas de linfocitos
T y estuvieron ausentes en las zonas de linfocitos B. También se observó que
algunos linfocitos expresan en su membrana ICAM-1 (Figura 2)
Figura 2. Expresión de ICAM-1 en el NALT. Se observa la reacción positiva en la
trama reticular del NALT. (Flecha gruesa), las vénulas de endotelio alto (asterisco) muestran
reacción positiva, así como algunos linfocitos (flecha delgada). 40x
Para analizar posibles diferencias de intensidad en las vénulas del
endotelio alto y la trama reticular del NALT durante el estrés, se cuantificó con el
software Imagen Pro Plus, valorando la luminosidad de la muestra, así las zonas
con mayor reacción se observan mas obscuras y son las que muestran los
valores mas bajos. Los resultados de este análisis fueron: el grupo control
mostró una intensidad de 200±5.9 en un área de 12538 µm2, los grupos de
animales estresados 3 horas durante 4 días presentaron intensidades de
210±9.8 y 209±8.4 respectivamente. (Figura 3). El análisis estadístico no mostró
diferencias significativas entre los dos grupos de estudio (F2,15=1.676; P 0.220).
Sin embargo se puede decir que hay tendencia hacia una menor expresión de
la molécula en los animales sometidos a estrés.
3 hrs
Inte
nsid
ad %
de reaccio
n
0
50
100
150
200
250
CONTROL 4 DIAS
Figura 3. Reacción a la molécula ICAM-1 en el NALT. La gráfica compara los grupos
problema con el testigo, cuantificando cantidad de reacción positiva a la molécula ICAM-1. En el
análisis estadístico, la reacción fue similar en los tres grupos de estudio (DF2,15=1.676; P 0.220).
Con respecto al grupo control, la expresión de ICAM-1 no disminuye significativamente con el
estrés de 3 hrs y 4 días, en donde las barras fueron mayores ya que mostraron mayor
luminosidad.
En relación a las tras moléculas de adhesión analizadas no se observaron
diferencias en la entre los grupos controles y estresados físicamente 3 horas
durante 4 días. (datos no mostrados).
Expresión de moléculas de adhesión en animales control y estresados. Por
otra parte al analizar la expresión de los receptores de homing encontramos que
el estrés modificó de manera significativa su expresión. En la Fig. 4 observamos
que en los linfocitos T de ratones estresados aumento la expresión de L-
selectina de un 2% a un 35% en animales sometidos a estrés físico por tres
horas y en un 22% en los ratones estresados durante 4 días. En lo que respecta
a la expresión de α4β1 observamos el mismo comportamiento se incremento su
expresión de un 26% del grupo control a un 35% en los ratones sometidos a un
estrés físico por tres horas y un 50% en los animales estresados por cuatro días.
Interesantemente en la expresión de la integrina α4β7 se modifico su expresión
únicamente en los animales sometidos a estrés físico por 4 días de un 1% a un
5% (Figura 4).
Fig. 4. Efecto del estrés fisico en la expresión de L-selectina, αααα4ββββ7, y αααα4ββββ1 en
linfocitos del NALT. A partir de ratones control y estresados se obtuvo el NALT. Los
linfocitos purificados de estos compartimentos se tiñeron con anticuerpos monoclonales
anti-CD3+, L-selectina, α4β7 y α4β1, y su expresión fue analizada en linfocitos T por
citometria de flujo. Los números indican el porcentaje de las células positivas, se
realizaron tres experimentos con resultados similares.
Control Estrés 3 hrs
αα αα4ββ ββ7+
L-selectina
αααα 4 ββββ 1 +
Estrés 4 días
Control Estrés 3 hrs
αα αα4ββ ββ7+
L-selectina
αααα 4 ββββ 1 +
Estrés 4 días
DISCUSION
El estrés causo una disminución no significativa en el volumen del NALT
De acuerdo a los objetivos planteados en el presente trabajo, en primer
lugar se determinó la morfología y volumen del tejido linfoide asociado a nariz.
En la literatura solo se encuentra reportado que el NALT del ratón, presenta una
longitud de 3 mm, por 0.5 de ancho. (Heritage PL y cols 1997, 1998) y no se
menciona su volumen.
En el presente trabajo se encontró un volumen de 3 mm³ para el NALT de
los animales testigo; en relación a esta cifra el estrés fisico aplicado durante 4
días causó una disminución del volumen del órgano. Esta tendencia al cambio
del volumen del NALT puede explicarse por la influencia de las hormonas
relacionadas con el estrés, las cuales probablemente alteran el tráfico de
linfocitos, disminuyendo la retención o su entrada en el tejido. En la literatura se
encontraron reportes que apoyan lo anterior, en uno de ellos la aplicación de
hidrocortisona durante 14 días, provocó disminución en el tamaño de los nódulos
linfoides mesentéricos de la rata entre al día 5 y 7 de tratamiento. (Grigorenko
DE y Budushkina EE 1985).
En un modelo de estrés por inmovilización en ratones C57BL/6, se
observó involución del timo, bazo y nódulos linfoides, cuyo grado de disminución
dependió del tiempo de estimulación. En ese caso el timo mostró mayor
susceptibilidad, disminuyendo su tamaño más rápidamente durante el tercer día
de estrés y además presentó una recuperación mas rápida que el bazo y
nódulos linfoides después de retirado el estímulo, con un incremento 12% mayor
que en el grupo testigo. (Domínguez-GL y Rey MM 1997).
Entre las posibles causas de la disminución del volumen en el NALT, esta
el incremento en la secreción de glucocorticoides durante el periodo de estrés,
pues se ha reportado que el estrés por inmovilización en ratas, durante un
periodo de 5 horas, provoco hipertrofia de la glándula adrenal, además de
cambios destructivos en el timo y el bazo (Durnova GN y cols 1983). La
hipertrofia adrenal reportada, puede corresponder al incremento en la secreción
de glucocorticoides que algunos estudios refieren como una de las principales
causas de involución de los tejidos linfoides, apoyados por lo observado
después de adrenalectomía quirúrgica o química o con el uso de antagonistas
de los receptores de glucocorticoides, tratamientos que mostraron contrarrestar
los efectos provocados por el estrés, como la involución del timo, disminución de
las células CD4+, CD8+, B220+ y fragmentación del ADN tímico durante la
apoptosis dependiente de los glucocorticoides endógenos. (Tarcic N y cols
1998). El mecanismo de la disminución de volumen en el NALT, puede
encontrarse en el incremento de la apoptosis celular dependiente o
independiente del incremento de glucocorticoides, ya que algunos trabajos sobre
otros tejidos linfoides muestran esta relación; además de que el bloqueo de
receptores de glucocorticoides en la placa de peyer, inhibió la apoptosis. (Sudo
N y cols 2001). Aun los glucocorticoides provocaron cambios en la expresión de
moléculas de adhesión (Sapolsky RM y cols 2000), lo cual afecta la
redistribución celular. Por otro lado, es posible que la disminución del volumen,
también se haya debido al incremento de catecolaminas, ya que esta reportado
que las catecolaminas secretadas durante los periodos de estrés agudo,
ocasionan movilización de linfocitos hacia la circulación periférica, provocando
leucocitosis (Benschop RJ y cols 1996). Aunque en el presente estudio no se
realizo cuantificación de células periféricas. En el NALT, estudiado en este
trabajo, la respuesta fue semejante si se considera que a los 8 días (datos no
mostrados), los animales se recuperaron del estrés; el hecho de que los
resultados no tuvieran diferencias significativas, pueden deberse a que los
ratones Balb/c y los C57BL/6, tengan diferente susceptibilidad al estrés. Por otro
lado es posible que durante los periodos de estrés, haya ocurrido un periodo de
adaptación o habitación primaria, la cual se produce con la finalidad de ajustar el
desequilibrio provocado (Pacak K y Palkovits 2001). Sin embargo, ya que estos
cambios no son significativos, se sugiere que el NALT presenta mayor
resistencia que otros órganos linfoides, los cuales si se modifican
significativamente, con esquemas de estrés similares al utilizado en el presente
trabajo (Domínguez-Gerpe L y Rey-Méndez M 1997), por lo que se puede
concluir que la tendencia a los cambios en el volumen del NALT, tienen relación
con la modificación en la circulación de los linfocitos, debido a diferencias en la
expresión de moléculas de adhesión y/o sus ligandos, o bien a un incremento en
la muerte celular por apoptosis; todo esto debido a los efectos de las hormonas
del estrés.
El estrés no modificó la expresión de la molécula ICAM-1 en el NALT
Se sabe que la molécula ICAM-1, se expresa continuamente a nivel del
endotelio vascular alto de los tejidos linfoides secundarios y en células
endoteliales cercanas a los procesos inflamatorios, en donde su principal
finalidad es la de dirigir la diapédesis de los leucocitos (Shaw SK y cols 2004).
La expresión de ICAM-1 (CD54), se analizó para determinar su posible
relación con el tráfico de linfocitos desde otros compartimientos hacia el NALT.
A pesar de no encontrar reportes de la expresión de la molécula sobre este
órgano, esta molécula se identifico en las vénulas de endotelio alto y a nivel de
la trama reticular del NALT; el grado de expresión de ICAM-1 sobre estas
estructuras, fue prácticamente igual en los tres grupos de estudio.
Su expresión en el NALT, puede indicar su participación en la
redistribución de las células linfoides, al igual que MAdCAM-1 y PNAd se sugiere
permiten el tráfico, la organización y el alojamiento de los linfocitos en varios
tejidos linfoides secundarios (Csencsits KL 1999). Los resultados indican que
esta molécula no se afecta por el modelo de estrés utilizado y por tanto las
variaciones en la cantidad de linfocitos, puedan deberse a cambios en la
expresión de integrinas leucocitarias (ligandos de ICAM-1), como ha sido
reportado en humanos, en donde el estrés psicológico provocó disminución en
la expresión de antìgeno 1 asociado a función de linfocitos (LFA-1), el principal
ligando de ICAM-1, mientras que esta ultima no presentó cambios significativos
(Mills PJ y Dimsdale JE 1996).
CONCLUSIONES
1. Se comprueba la hipótesis de influencia del estrés sobre el tejido linfoide
del NALT.
2. El esquema de estrés utilizado, no provocó cambios significativos en el
tamaño y forma del NALT.
3. El esquema de estrés físico no modifico la expresión de moléculas de
adhesión endotelial, sin embargo si modifico la expresión de las integrinas
L-selectina, α4β7 y α4β1 de los linfocitos del NALT.
4. Se sugiere que los efectos del estrés sobre las poblaciones celulares del
NALT, se ejercen a través de la influencia de las hormonas,
catecolaminas y glucocorticoides, por mecanismos como apoptosis o a su
redistribución de las células inmunitarias debido a modificaciones en la
expresión de moléculas de adhesión y/o apoptosis.
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