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TEJIDO LAS CÉLULAS MADRE ESPECÍFICAS de
Análisis Comparativo de Células Madre Mesenquimales de Médula Ósea, Sangre del Cordón Umbilical, o tejido adiposo
SUSANNE a KERN, HERMANN un EICHLER, JOHANNES b STOEVE, HARALD KL de UTER - CAUSE ¨ , KAREN un BIEBACK
aInstitute de medicina de transfusión y de la inmunología, Sangre de la Cruz Roja Alemana Servicio de Baden-Wu ¨baden-württemberg de Hessen, Mannheim, Alemania; bDepartment de cirugía ortopédica del Hospital Universitario de Mannheim, Universidad de Heidelberg, Facultad de Medicina Clínica, Mannheim, Alemania
Palabras Clave. Las células madre mesenquimales • La mã©dula ósea • sangre de cordón umbilical • tejido adiposo • análisis comparativo diferenciación multilinaje
RESUMEN
las células madre mesenquimales (MSCs) representan una herramienta prometedora de los CSM tipo derivados de esas fuentes son evidentes.
de nuevo conceptos clínicos de apoyo terapia celular. Se observaron diferencias en cuanto a la tasa de éxito de la médula ósea (BM) fue la primera fuente informó a contener aislando CSM, que fue de un 100% de BM y EN, pero sólo Microsoft Cluster Server (MSCS). Sin embargo, para el uso clínico, BM puede ser perjudicial 63% para UCB. La colonia fue el más bajo en frecuencia UCB, debido a lo altamente invasiva y el procedimiento de donación de- mientras que la más. Sin embargo, UCB-MSCs podría cline en MSC número y potencial de diferenciación se cultivaron con más tiempo y mostraron la mayor proliferación aumento de la edad. Más recientemente, sangre de cordón umbilical (UCB), la capacidad, mientras que BM-MSCs poseen el menor cultura nivel de un método menos invasivo, se presentó como un período y la menor proliferación capacidad. La mayoría strik- fuente alternativa para Microsoft Cluster Server (MSCS). Otra fuente potencial es enorme, UCB MSCs de diferenciación adipogénica no mostraron ca- tejido adiposo). Hemos comparado MSCs derivadas de estas indemniza, en contraste con BM- y en Microsoft Cluster Server (MSCS). Ambos UCB y en las fuentes sobre morfología, la tasa de éxito de aislamiento son alternativas atractivas de BM en aislar MSC: al CSM, colonia frecuencia, potencial de expansión, múltiples- contiene MSCs en la más alta frecuencia y UCB como parece ferentiation capacidad y fenotipo inmune. No hay que ser ampliable a números más altos. LAS CÉLULAS MADRE 2006 ;24:
las diferencias en cuanto a la morfología y vehí inmune- 1294-1301
INTRODUCCIÓN aislar Msc [6, 7], y a las de otros grupos lograron iso- células madre mesenquimales (MSC) que se encuentra en muchos tejidos adultos son cubier MSCs de término completo UCB [8 - 12].
una atractiva fuente de células madre para la regeneración de tejido adiposo (TA) es otra fuente alternativa que pueden ser tejidos en aplicaciones clínicas porque se caracterizan como obtenido por un método menos invasivo y en mayores cantidades de células indiferenciadas, capaces de renovarse con una alta proliferativa BM. Se ha demostrado que las células madre
en capacidad y mesodérmicas poseen un potencial de diferenciación [ 1], que al igual que BM-MSCs, que se denominan procesados lipoaspirate Aunque médula ósea (BM) ha sido la principal fuente de (PLA) células [ 13]. Estas células pueden ser aisladas de la aislamiento de cosméticos multipotentes MSCs, la cosecha de BM es muy grasa en grandes cantidades y fácil de cultivar en procedimiento invasivo y el número potencial de diferenciación, el cultivo de tejidos [ 13]. La diferenciación multilinaje y máxima vida útil de MSCs de BM disminución- tróficas capacidad de PLA células se ha confirmado [ 13].
edad [ 2- 4]. Por lo tanto, fuentes alternativas de como BM-MSCs se caracterizan mejor, le preguntamos si aislar MSCs MSCs son objeto de una intensa investigación. procedentes de otras fuentes comparten las características de BM-MSCS
Una fuente alternativa es sangre de cordón umbilical (UCB), el objetivo de nuestro estudio fue comparar MSCs aislado de los tres que se pueden obtener a través de un método menos invasivo, sin perjudicar las fuentes bajo idénticas condiciones in vitro con respecto a la de la madre o el bebé [ 5]. Sin embargo, existe controversia morfología, frecuencia de las colonias características de expansión, mul- si de UCB puede servir como una fuente de diferenciación tilineage capacidad aislante, inmunofenotipo y multipotentes éxito MSCs: a pesar de que algunos grupos no tuvo éxito en la tasa de aislamiento de las células.
Correspondencia: Karen Bieback, Ph.D. , Instituto de Medicina de transfusión y de la inmunología, Sangre de la Cruz Roja Alemana Servicio de Baden-Wu ¨baden-württemberg - Hesse, Universidad de Heidelberg, Facultad de Medicina Clínica Mannheim, Friedrich-Ebert -Stra e 107, D-68167 Mannheim, Alemania. Teléfono: 49-621 -3706-8216; fax: 49-621 -3706-851; correo electrónico: [email protected] recibido 28 de julio de 2005; aceptado para su publicación 21 de diciembre de 2005; publicado por primera vez en células madre EXPRESS 12 de enero de 2006. ©AlphaMed Press 1066-5099/ 2006/ $20.00 /0 doi: 10,1634 /stemcells.2005-0342
CÉLULAS MADRE 2006 ;24:1294 -1301 www.StemCells.com
Kern, Eichler, Stoeve et al.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección de BM
BM el material aspirado de 18 pacientes con edades que oscilan entre 68 - 84 años se obtuvieron a partir del eje femoral en reemplazo total de cadera en el servicio de ortopedia del Hospital de la Universidad Mannheim. El material aspirado BM adicionales fueron obtenidos de tres pacientes con edades que oscilan entre 44 y 71 años por puntualmente turing la cresta ilíaca. El BM se ha recibido el material aspirado de conformidad con las normas éticas del comité ético local.
Aislamiento y cultivo de Células Mononucleares de BM
El aspirado se diluye 1:5 con 2 mM ethylenediaminetet- raacetic (EDTA) -de tampón fosfato salino (PBS) (Merck & Co. , Whitehouse Station, NY, http://www.merck.com; Nex- ell, Baxter, Unterschleissheim, Alemania, http://www.baxter.
de). El MNC fracción fue aislado por gradiente de densidad de centrif ugation a 435g durante 30 minutos a temperatura ambiente con Ficoll-Hypaque -Plus (GE Healthcare BioSciences Corp. , Piscataway, NJ, http://www.gehealthcare.com) y sembrados a una densidad de 1 6 10 2 células por cm en T75 o T175 frascos de cultivo celular (Nunc, Rochester, NY, http://www.
CO2. La expansión medio se aplicó a células madre mesenquimales o medio de crecimiento de balas Kit(MSCGM;Cambrex,Walkersville, MD,http://www.cambrex. %5 Nuncbrand.com; Greiner Bio-One , Frickenhausen, Alemania, http://www.gbo.com). El primer cambio del medio fue cum- plido dentro de los 3 días de aislamiento. Las células adherentes fibroblastoides resultante se denomina BM derivados de células adherentes fibroblastoides (BM-Codes) y fueron cultivadas a 37 °C en una atmósfera humidificada con
com) o de Dulbecco Eagle modificado medio-bajo de glucosa (DMEM-lg) que contiene un 10% crecimiento células madre mesenquimales suplementos (MSCGS) (Cambrex). Los códigos se mantuvieron en MSCGM o DMEM-lg 10% MSCGS hasta llegar a un 70% y un 90% aproximadamente. Las células fueron cosechadas en subconfluence con tripsina (PromoCell, Heidelberg, Alemania, http://www.
PromoCell.com). Las células en el segundo pasaje y después fueron replated en una densidad media de 1,3 0,7 3 10 2 /cm .
Generación de individuales separadas, las colonias denominadas fibroblastoides fibroblastoides de las unidades formadoras de colonias (CFU-F) fue alcanzada por la siembra de la Emn inicialmente en una baja densidad (1
3 10 4 10 1 a 2 células por cm ). CFU-F se seleccionaron y aislarse con tripsina (PromoCell) o por medio de un raspado de la superficie de la placa de cultivo con la punta de una pipeta. El cultivo se realizó como se describe en la BM de FACs.
Colección de UCB
UCB unidades (n 59) fueron recogidos del feto placenta de término completo varias entregas en un sistema de bolsa que contiene 17 ml de tampón citrato fosfato dextrosa (sangre de cordón colección Sys- tem; eltest, Bonn, Alemania) [14, 15] y transformarse en un plazo de 24 horas desde su recogida. La colección se realizó de acuerdo con las normas éticas del comité ético local.
Aislamiento y cultivo de MNC de UCB
el aislamiento de los CSM se realiza según lo descrito por BM con unas pocas excepciones. Antes de que el aislamiento de MNC, la anticoag epidemioló- sangre del cordón umbilical se haya diluido 1:1 con 2 mM EDTA-SAF. El MNC fracción fue inicialmente sembrada en una densidad de 1 6 10
2 1295 www.StemCells.com MNC/cm en suero de feto de ternera (FCS), placas de cultivo previamente untada (FCS lotes S0113/1038E y S0113/892E; Biochrom, Berlín, Alemania, http://www.biochrom.de) (Falcon, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, http://www.bd.com) [ 8].
Las células se quintuplicaba retirado 12-18 horas después de la plat. Las mismas condiciones de cultivo y los medios de información se aplica como se ha descrito en BM-FACs. Sólo las células fibroblastoides adherentes- como CFU-F y se recolectan en subconfluence con tripsina (PromoCell). Las células en el segundo pasaje y después fueron replated en una densidad media de 3,5 4,8 3 2 10 /cm .
Colección de DE
AT se obtuvo de 18 donantes de edades que oscilaban entre 26 y 57 años que fueron sometidos procedimientos para la liposucción. Lipoaspirates fueron obtenidos de acuerdo con las normas éticas del comité ético local.
Aislamiento y cultivo de células de PLA en
la materia prima lipoaspirate (50 - 100 ml) fue procesado como se describe anteriormente [ 13]. Para aislar el vasculares estromales (SVF), lipoaspirates se lavaron intensamente con SAF. A partir de ese momento el lipoaspirates fueron digeridos con un volumen igual de 0,075 % colagenasa tipo I ( Sigma-Aldrich , St. Louis, http://www.
sigmaaldrich.com) durante 30 - 60 minutos a 37 °C con un suave agi- taciones. La actividad de la colagenasa fue neutralizado con DMEM-lg que contiene 10% FCS Para obtener el de alta densidad SVF pellet, digerida la lipoaspirate se centrifugaron a 1.200 g durante 10 minutos. El precipitado fue resuspendido en MSCGM o DMEM-lg que contiene el 10% MSCGS y filtrada a través de una 100 m de nylon filtro celular (Falcon). La dirección se filtran las células- fuged a 1.200 g durante 10 minutos. Las células fueron resuspendidas chapado en CONTRIBUCIONES VOLUNTARIAS a una densidad de 1 106 2 /cm en T75 o T175 frascos de cultivo. Quintuplicaba las Células se quitaron 12-18 horas después de la primera siembra de lavado intensamente las placas. Los fibroblas- toid células adherentes fueron llamados A adher fibroblastoides derivado de células- (FACs). En los códigos fueron cultivadas en las mismas condiciones que las descritas para BM-FACs. EN terreno se har- investidos de subconfluence con tripsina (PromoCell). Las células en el segundo pasaje y después fueron replated en una densidad media de 1,8 3,1 3 2 10 /cm .
La generación de un solo separados CFU-F fue alcanzado por
2, la siembra de la SVF células en una baja densidad (1 10 a 1
3 10 2 células por cm ). CFU-F se seleccionaron y aislados de mencionar para BM-UFC-F. Subcultivo de las Células se formó como se describe en el caso de la FACs.
Los fibroblastos dérmicos como Principal
Principal controles normales los fibroblastos dérmicos (PromoCell) sirve como controles negativos en la diferenciación. Las células fueron cultivadas en un 10% completado media crecimiento de fibroblastos (PromoCell).
Características de Expansión
las células fibroblastoides de BM, UCB, y se recolectan en subconfluence como se describió en los párrafos anteriores. Las culturas se han abandonado tan pronto como se mostraron un fenotipo senescente definidos en función de dos criterios: 1) cuando al menos el 90% de las Células aprobado morfología semejante a una alteración de las células senescentes 3- 4 semanas después se realizarán subcultivos (Fig. 1E- 1G); y 2) al haber dejado proliferación. El proceso de senescencia proporción se determinó hasta paso 2 calcular la proporción de muestras
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Figura 1. Morfología de células adherentes después de la siembra y en la senectud. (A-C): fibroblastoides células adherentes después de la primera siembra de células adherentes el fibroblastoides (FAC) monocapa de BM en el día 14 (A), de la UCB-fibroblastoides de las unidades formadoras de colonias (CFU-F) en el día 16 (B), y de la monocapa de FAC en día 8 (C). (E-G):
las células senescentes de la FAC monocapa de BM en paso 2 (E), de la UCB-CFU-F en el pasaje 4 (F), y de la monocapa de FAC en paso 6 (G) se identifican mediante un morfología alterada. Todo representante se muestran ejemplos con una ampliación de 100. (D): valores promedio de la población acumulativa doblajes. Duplicaciones de población se determina en cada subcultivo; valores promedio de BM-mesenchy- mal las Células madre (CSM) se muestran en negro; valores promedio de UCB-CSM son mostrados en gris; valores promedio de MSCs se muestran por barras abiertas.
p7, n 1. , P .05. Abreviaturas: ;2 p5 y p6, n ;5 p4, n ;6 p9, n 1. EN: p3, n ;4 p6 - 8, n ;7 p5, n ;9 p6, n 1. UCB: p4, n ;7 p4 y p5, n ;9 La muestra de partida número 2 en el pasaje en el diagrama. Las muestras fueron sometidas a senescencia, el número de muestras en los conductos procedimiento; el número de muestras en diferentes pasajes dio lugar a los siguientes valores promedio. BM: p3, n
, tejido adiposo; BM, en la médula ósea; P, de paso, UCB, sangre de cordón umbilical
adoptar un fenotipo senescente y el número total de muestras cultivadas. Doblajes población acumulada se calcula usando la fórmula x [log10 (NH) log10 (N1) ] /log10 (2) [ 16], donde N1 es el inóculo número de móvil y NH la celda número cosecha. El rendimiento acumulado de duplicación, la duplicación de la población para cada paso se calculó y, a continuación, se añaden a la duplicación de la población los niveles de la anterior los conductos. Como el número de células de células fibroblastoides de los tres tejidos podrían ser deter- minada por primera vez en el pasaje 1, duplicando el número total se calculó en primer lugar para el paso 2.
La diferenciación in Vitro de fibroblastos dérmicos humanos normales (PromoCell) sirve como controles negativos en los tres estudios diferenciación.
Diferenciación osteogénico
Diferenciación de cada una de las muestras se realizó en define pas- de la siguiente manera: BM-FACs, pasajes 0 y 5 (n 7); BM-CFU-F, en el que se
comparan MSCs de tejidos diferentes
pasajes 2- 6 (n 14); UCB-CFU-F, pasajes 1-7 (n 8); DE FACs, pasajes 0 y 5 (n 14); DE CFU-F, pasajes 2- 6 (nO 28). Diferenciación osteogénico a fin de promover, las células fueron
3 sembrada en una densidad de 3.1 10 2 células por cm en ocho- cámara de diapositivas (Nunc) y cultivadas en MSCGM o DMEM-lg 10% MSCGS hasta que alcanzaron el 70 %- 80% confluencia. Tan pronto como se alcanza subconfluence osteogénico, diferenciación de las células fue inducida mediante la alimentación de 2,5 semanas, dos veces a la semana, con inducción medio que consta de 100 nm la dexametasona, 10 mM -glicerofosfato, 0,2 mM ascorbato, y 10% FCS en medio basal osteogénico (Cambrex). Para el control negativo, las células se mantuvieron en MSCGM o DMEM-lg 10% MSCGS. Diferenciaci� osteogï¿ ½ica fue confirmada por el aumento de la fosfatasa alcalina (AP) expresión de histo- manchas químicas siguiendo las instrucciones del fabricante (fosfatasa alcalina kit 85L-3R; Sigma-Aldrich ).
Más tarde se detectaron diferencias etapas por la von Kossa mancha, demostrando la deposición de un matriz hidroxiapatita.
de tiosulfato sódico ( Sigma-Aldrich ) durante 5 minutos. Pyrogallol %5 (Merck) y, después, se fija con %1 nitrato de plata ( Sigma-Aldrich ). La mancha fue desarrollado incu- arrastraba las células en %5 El von Kossa mancha se realizó de acuerdo al protocolo descrito anteriormente [ 17] con algunas modificaciones. Las células fueron fijadas con formol al 10% ( Sigma-Aldrich ) durante 15 minutos a temperatura ambiente y se tiñe para 10 a 15 minutos con
diferenciación adipogénica
Diferenciación de cada una de las muestras se realizó en define pas- de la siguiente manera: BM-FACs, pasajes 0 y 5 (n 9); BM-CFU-F, pasajes 2- 6 (n 14); UCB-CFU-F, pasajes 1-7 (n 11); DE FACs, pasajes 0 -5 (n 16); DE CFU-F, pasajes 2- 6 (nO 28). Para inducir diferenciación adipogénica, las células se sembraron a una densidad de 2.1 4 10 2 células por cm en ocho portaobjetos con cámara (Nunc) y cultivadas en MSCGM o DMEM-lg 10 MSCGS hasta llegar al 100% confluencia o postconfluence.
A continuación, las células fueron inducidos por tres ciclos de inducción y mantenimiento [ 1] usando inducción preadipociticos medio compuesto de 1 mM la dexametasona, 0,5 mm 3-isobutil-1-metil-xan- tus, 10 g/ml insulina humana recombinante, 100 mM indometh de acin, y el 10% FCS (Cambrex) y con preadipociticos- municada medio compuesto únicamente de 10 g/ml insulina humana recombinante y el 10% FCS (Cambrex). Después de completar los tres ciclos de inducción y de mantenimiento, el inducido células fueron incubadas durante otros 7 días en medio de mantenimiento adipogénica. Las células control noninduced fueron alimentados sólo con preadipociticos medio de mantenimiento. Diferenciación adipogénica fue confirmado por la formación de vacuolas de lípidos neutros mancha de aceite con rojo ( Sigma-Aldrich ). Para el aceite rojo O manchas, las células fueron fijadas con formol al 10% ( Sigma-Aldrich ), lavado y teñido con una solución de trabajo de 0,18 % de aceite rojo O
durante 5 minutos. Los núcleos son contrastados con Mayer la hema toxylin solución ( Sigma-Aldrich ).
Diferenciación diferenciación condrogénica de cada muestra y CFU-F fue definido en los conductos de la siguiente manera: BM-FACs, pasajes 0 -5 (n 8); BM-CFU-F, pasajes 2- 6 (n 14); UCB-CFU-F, pasajes 1-7 (n 15); DE FACs, pasajes 0 -5 (n 18); DE CFU-F, pasajes 2- 6 (nO 28). Diferenciación condrogénica de células,
5 fueron cultivados en micromasa cultura. Por lo tanto 2,5 10 células
Kern, Eichler, Stoeve et al.
se centrifugaron en un 15-ml tubo de polipropileno (Greiner) a 150g para formar un precipitado. Sin perturbar el precipitado, que las células se cultivaron durante 4 semanas en 0,5 ml de medio completo diferenciación condrogénica (Cambrex) incluyendo a 10 ng/ml TGF- -3 (Strathmann Biotec AG, Hamburgo, Alemania, http://www.
strathman-biotec-ag.de). Las células fueron alimentados dos veces a la semana. Después del período de cultivo, criosecciones fueron analizados por Safranina O mancha. Para las manchas, las secciones fueron fijados con acetona fría de hielo ( Sigma-Aldrich ) y tiñe con 0,1 % acuosa Safra- nen O durante 5 minutos y los núcleos fueron contrastados con de hematoxilina férrica de Weigert ( Sigma-Aldrich ).
Inmunofenotï análisis
de caracterización, antígeno de superficie celular se realizó la prueba fenotípica en BM-MSCs en los pasajes 0 y 7, de UCB-MSCs en los pasajes 3-7, y de MSCS en los pasajes 1-5. La siguiente superficie celular de epítopos fueron marcados con anti-anticuerpos humanos:
CD14-isotiocianato de fluoresceína (FITC), CD34-ficoeritrina (PE), CD73-PE, CD90-Cy5 (Becton Dickinson), CD29-PE, CD44-FITC, CD45-Peridium-clorofila complejo proteico (PerCP), el HLA de clase I-FITC, el HLA de clase II-FITC (Beckman Coulter, Fullerton, CA, http://www.beckmancoulter.com), CD133-PE (Miltenyi biotec, Bergisch Gladbach, Alemania, http://www.miltenyibiotec.com), CD105-FITC, y CD106-PE (Immunokontakt; AMS La biotecnología, Wiesbaden, Alemania, http://www.immunok.com). Isotipo anticuerpos ratón sirve como control (Becton Dickinson; Beckman Coulter). 10.000 Células marcadas fueron adquiridos y analizados por medio de un flujo FACScan cytom- eter CellQuest ejecuta software (Becton Dickinson).
Análisis estadístico
Los datos se presentan como promedios desviación estándar. UNA de dos caras, nonpaired prueba t se utilizó para analizar la citometría de flujo y la duplicación de datos acumulados. La
prueba U de Mann-Whitney se utilizó para comparar la eficacia de aislamiento CFU-F derivado de UCB, BM, y en. UN 2 se aplicó la prueba de comparar la renciarse- capacidad de las células aisladas de los diferentes tejidos y la proporción de muestras con un fenotipo senescente. Las diferencias se consideraron significativas para p .05. El programa SPSS (versión 12.0; SPSS Inc. , Chicago, http://www.spss.com) fue utilizado para las pruebas estadísticas.
RESULTADOS
aislamiento de células adherentes de Morfología fibroblastoides de BM, UCB, y a partir de las
6 en una densidad de siembra inicial 1 2 células por 10 cm , tanto BM- y en derivados de células fibroblastoides una monocapa 4 y 5 días después de la primera y se denominó FACs. A diferencia de BM, UCB derivado de células fibroblastoides CFU-F y se puede detectar en primer lugar 2 a 4 semanas después de cuando se aplica la misma densidad de siembra inicial. A diferencia de UCB, para la generación de CFU-F de BM y a menor densidad de siembra inicial fue necesario. El número de UFC-F calculado en base a 1 6 10 chapado en inicialmente fue mayor para las células EN (557 673), seguido de BM (83 61); que fue la más baja de UCB (0.002 0.004 ) (p .001).
La tasa de éxito de aislar FACs y CFU-F de BM (n 21) y EN (n 18) fue del 100 %, En contraste, la tasa de éxito de UCB (n 59) fue sólo el 29% de todas las unidades
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Tabla 1. La senescencia y la máxima relación potencial de expansión de células madre mesenquimales (MSCs) derivados de BM, UCB y
senescencia en relación al conducto de paso máximo 2
BM (n 21) 23,6 % (P 7 (9,5 %) UCB (n 26) 34,6 % P 10 (3,9 %) A (n 18) 5,6 % P 8 (5,6 %) p b .02
Los datos representan la relación entre el número de muestras que envejecer temprano hasta el segundo pasaje y muestras que podrían ser cultivadas hasta el máximo paso hasta que en senescencia. La senescencia proporciones se determina calculando el número de muestras adoptar una morfología alterada (Fig. 1E y 1G) y cesar proliferación en el número total de muestras cultivadas.
ala cultura pueden ser cultivadas como mínimo hasta el paso, ya que se tuvo que descartar debido a contaminaciones.
bSignificant las diferencias de la senescencia se observaron relación entre AL y UCB.
Abreviaturas: A, y el tejido adiposo; BM, la Médula ósea, UCB, sangre de cordón umbilical
. La tasa podría ser mayor a 63% de FCS precoat- y teniendo en cuenta únicamente las unidades de calidad óptima [ 8].
Sin embargo, no existen diferencias en lo que respecta a la morfología de las células adherentes procedentes de los tres tejidos eran evidentes (Fig.
1A y 1C).
Características de Expansión
capacidades Análisis de la proliferación de los CSM derivados de las tres fuentes pone de manifiesto que BM-MSCs poseen el menor duplicación de la población los números a través de los conductos 4 - 6, siguie- por MSCs de después de pasar 3 (Fig. 1D). Sin embargo, UCB-MSCs los más altos números de duplicar todos los conductos analizados.
Durante el cultivo in vitro, MSCs poseen una vida útil limitada y finalmente someterse a senescencia replicativa se indica por la pérdida de pro- proliferación y morfología alterada. Análisis de la senescencia tasas potenciales y la máxima expansión de BM-MSCs (n 21, gobernadores), de UCB-MSCs (n 26 CFU-F, UCB 16 unidades), y de MSCs (n 18 donantes) demostraron que UCB contiene la mayor proporción de MSCs en senescencia a los pasajes, seguida de BM-MSCs (Fig. 1E- 1G) (Tabla 1). La relación más baja en senescencia temprana muestra pasajes en Microsoft Cluster Server (MSCS). A pesar de las muchas colonias llegando a la senescencia en las primeras etapas, otros UCB-MSCs puede ser cultivada más largo, seguido por al-MSCs, mientras que BM-MSCs mostró el menor período de cultivo (Cuadro 1).
Potencial de diferenciación multilinaje
para demostrar el aislamiento de células madre mesenquimales y de investigar su potencial de diferenciación, el fibroblastoides las células que se derivan de las tres fuentes se orientaron hacia la osteogï¿ ½ica, adipogénica y linajes condrogénica en los respectivos pasajes. Fibro- blastos sirvió como controles negativos.
Diferenciaci� osteogï¿ ½ica Capacidad
diferenciación osteogénico fue confirmado por la detección de un fenotipo osteogénico que consta de un incremento en la expresión de la AP y de la deposición de un matriz mineralizada teñidas con plata.
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Después de 2,5 semanas de inducción, no hubo diferencias significativas en la capacidad osteogï¿ ½ica se detectaron diferencias (p .4), ya que el 100% (ocho de ocho) de la UCB muestras, 71,4 % (cinco de siete) de la BM muestras y 78,8 % (11 de 14) de las muestras mostraron un fenotipo osteogénico (Fig. 2B, 2D, 2I, 2K, 2P, 2R). No se ha observado fenotipo osteogénico de 28,6 % (dos de los siete) del BM o muestras de 21,4 % (3 de 14), en la que se
comparaba MSCs de distintos tipos de tejidos
La Figura 2. Diferenciación multilinaje calificacio- de células madre mesenquimales. Las células en los pasajes 1- 4 derivado del fibroblas- toid monocapas de células adherentes de BM (A-G) o EN (O-U) y de UCB-fibroblastoides de las unidades formadoras de colonias (H-N) se alcanza valores de multilinaje in vitro la absti- inicio capacidad. Osteogénesis quedó plasmado mediante el aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina, que se muestra en (B), (I) y (P) (A, H, O, noninduced controles), y por la precipitación de una matriz mineralizada señalada por
von Kossa mancha, se muestra en (D), (K) y (R) (C, J, Q, noninduced controles). Ad- ipogenesis fue detectado por la formación de vacuolas lipídicas tinción positiva neutral con aceite rojo O, como se demostró en el caso de BM- y que se encuentran en células derivadas, que se muestra en (F) y (T) (E, S, nonin presenta controles), mientras que UCB-células derivadas no pueden ser diferenciadas en este lin- eage, como se muestra en (M) (L, noninduced control).
Condrogénesis fue indicado por Safranina O tinción de criosecciones de las tres fuentes (G, N, U). Todo representante examen- fía se muestran con una ampliación de 100.
Abreviaturas: A, y el tejido adiposo; BM, la Médula ósea, UCB, sangre del cordón umbilical
de la muestras, ya que sólo un aumento de la expresión de AP y no deposición de una matriz. No osteogénico tipo vehí- fue inducida en los fibroblastos (no se muestra).
Diferenciación adipogénica Capacidad
diferenciación adipogénica se puso de manifiesto con la acumulación de punto muerto vacuolas lipídicas indicado por el aceite rojo O mancha.
Kern, Eichler, Stoeve et al.
Después inducción preadipociticos, 100% (nueve de nueve) de los BM las muestras y el 94% (15 de 16) de las muestras poseen células con un fenotipo preadipociticos (Fig. 2F, 2T). Sin embargo, ninguno de los UCB-derivados CFU-F muestra un fenotipo preadipociticos diferenciación en condiciones estándar. Incluso después de aplicar un protocolo diferenciación fortificado en el que las células fueron inducidos por 5 semanas en inducción preadipociticos medio solo, no eran detectables adipocitos (Fig. 2M). Por lo tanto, un número significativamente mayor de BM y muestras de UCB que incluyó una diferenciación adipogénica capacidad (p .01). No preadipociticos fenotipo fue inducida en los fibroblastos (no se muestra).
Diferenciación condrogénica
diferenciación condrogénica Capacidad fue confirmada por la formación de una esfera en la micromasa cultura y la secreción de los cartílagos de los proteoglicanos tinción positiva con safranina O. Todas las muestras estudiadas, independientemente de su origen, así como los fibroblastos, demostró un cartílago de condrocitos con fenotipo de lagunas (Fig. 2G, 2N, 2U; fibroblastos no se muestra).
Comparación de diferenciación multilinaje Capacidad
comparando la diferenciación multilinaje capacidad, se analizó sólo las muestras para que los resultados de las tres diferentes capacidades diferenciación se obtuvieron. Diferenciación las capacidades en los tres linajes se demostró de 71,4 % de BM y muestras (cinco de los siete; 10 de 14). Todos (seis de seis) UCB- CFU-F analizado sólo podría dirigirse hacia dos linajes, debido
a la diferenciación adipogénica capacidad no detectable. UNA de dos linajes diferenciación capacidad sólo se observó en sig- menos BM y amplifica en muestras de muestras para UCB (BM, 28,6 % [dos de los siete]; A, 28,6 [4 de 14]; p .008); todos BM y casi todos en las muestras mostraron un adipo gasta capacidad de diferenciación condrogénica. Sólo una muestra de un osteo-diferenciación condrogénica capacidad.
Capacidad de diferenciación multilinaje BM- y CFU-F
desde UCB MSCs de diferenciación adipogénica no se ca- pacity, en contraste con EN- y BM-MSCs, presumimos que podría estar relacionada con el UFC-F-origen de UCB de Microsoft Cluster Server (MSCS). BM- y de los CAA se originó a partir de una monocapa, que podría contener una mezcla heterogénea de más células precursoras en contraste con UFC-F. Por lo tanto, CFU-F se genera también a partir de BM y EN y se analizan para su diferenciación.
La diferenciación capacidad de CFU-F de ambos tejidos no se limita: la diferenciación de capacidad hacia los tres linajes podía observarse en 28,6 % (4 de 14) de BM-CFU-F y de 89,3 % (25 de 28) de la CFU-F (p .001). Una diferenciación en dos linajes sólo fue observado al 64,2 % (9 de 14) de BM-CFU-F y de 7,1 % (2 de 28) de CFU-F (p .001): todos los DE CFU-F y casi todos los BM-CFU-F
mostró un adipo gasta capacidad de diferenciación condrogénica, puesto que una BM-CFU-F poseía un osteo-diferenciación condrogénica de capacidad. Un BM- y a partir de CFU-F puede ser dif radiología médica hacia uno sólo, el linaje condrogénica.
Inmunofenotipo Linfocitario Caracterización
de caracterización de los CSM, proteína de superficie- bertad de CSM de nueve BM los donantes en los pasajes 0 y 7, de 13 UCB-CFU-F (8 unidades UCB) en los pasajes 3-5, y de nueve a
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Tabla 2. Comparación de la expresión de proteínas que se encuentran en la superficie de las células madre mesenquimales procedentes de BM, UCB, y en tal y como lo ha analizado por citometría de flujo BM ( %) UCB ( %) EN ( %) anticuerpo (n 9) (nO 10) (n 9),
CD44 97,5 5,1 99,7 0,5 99,8 0,2 CD73 90,0 20,0 99,3 1,3 99,6 0,5 CD90 99,1 2,5 97,8 7,1 99,9 0,2 CD14 1.2 1.1 0.8 0.9 2.4 5.0 CD34 1.6 1.4 1.2 1.5 5.0 5.1 CD45 5.2 3.7 3.8 3.6 3.8 5.1
un CD105 88,1 7,4 72,4 20,0 90,4 5,9 CD133 1.3 1.1 2.9 5.5 2.9 3.5 CD29 99,0 1,5 99,8 0,4 99,5 1,3 HLA I 95,2 6,0 94,3 6,8 98,8 2,8
b CD106 66,3 22,7 70,0 23,6 30,3 18,6 EL HLA II 4,2 6,1 0,8 1,2 4,4 6,2 4,5 9,3 CD144 2,4 4,0 2,4 2,5
La tabla muestra los valores del porcentaje de células positivas desviación estándar y el número total de células analizadas.
una se observan diferencias entre UCB en comparación con el BM y EN (p .05).
bSignificant se observaron diferencias en comparación con el BM y UCB (p .05).
Abreviaturas: A, y el tejido adiposo; BM, la Médula ósea, UCB, sangre de cordón umbilical, en el que
los donantes en los pasajes 2-5 fueron examinados por citometría de flujo. Cada muestra fue analizada en un conducto (Tabla 2).
sin embargo, ninguno de los MSCs expresó HLA II. CD105 fue expresada por un porcentaje significativamente menor de UCB de MSCs en comparación con BM- o DE MSCs (UCB en comparación con el BM, p .02; UCB en comparación con, p .008) (Fig. 3). ;I MSCs derivados de las tres fuentes no muestra- laciones de marcadores hematopoyã© (CD14, CD34, CD45), de la célula de vástago marcador CD133, o el marcador de células endoteliales CD144. Más del 90% de MSCs derivadas de las tres fuentes expresaron el típico MSC proteínas marcadoras DEL CD73 y CD44, CD29, CD90. Sin embargo, la intensidad de la expresión de CD90 de UCB de MSCs es muy inferior a la de los otros tejidos (media intensidad de la fluorescencia: UCB, 738 715.9; BM, 1.512,1 754.9; EN, 2.200,6 896.9; UCB en comparación con el BM, p .02; UCB en comparación con AL, p .001) (Fig. 3). Más del 90% de los CSM derivados de las tres fuentes expresaron HLA
significativamente más UCB y BM-MSCs expresaron CD106 de MSCs (UCB en comparación con AL, p .008; BM en comparación con AL, p .002) (Fig. 3). Lo mismo se observó para la intensidad de la expresión de esta molécula, que fue significativamente más alto en UCB y BM-MSCs en comparación con MSCs (BM, 28,37 plantilla 21.18 ; UCB, 41,90 31.81; EN 8,26 4,77 ; en comparación con el BM, p .02; en comparación con UCB, p .001) (Fig. 3).
DISCUSIÓN
hemos comparado MSCs de BM y dos fuentes alternativas, a saber, UCB y en cuanto a características básicas MSC. Todas las células aisladas de estas tres fuentes exhiben características típicas MSC: un fibroblastoides morfología, la formación de CFU-F, un¿½ codiciadas diferenciación capacidad, y la expresión de un conjunto típico de proteínas que se encuentran en la superficie.
1300 Mientras que
la figura 3. Inmunofenotipo análisis de células madre mesenquimales (MSC) de BM (línea discontinua), UCB (línea gruesa), y en (línea de luz).
MSCs de nueve BM los donantes en los pasajes 0-7, 13 UCB-fibroblastoides de las unidades formadoras de colonias en los pasajes 3-5, y nueve de los donantes en los pasajes 2-5 se trypsinized, etiquetados con anticuerpos contra el antígeno, y analizados por citometría de flujo. Sólo algunos ejemplos representativos de importante expresión de antígenos diferentes se muestran los perfiles.
Abreviaturas: A, tejido adiposo; BM, la Médula ósea, FITC, fluores- cein isotiocianato; PE, ficoeritrina; PerCP, Peridium-clorofila complejo proteico, UCB, sangre del cordón umbilical.
MSCs derivadas de las tres fuentes expresan proteínas marcadoras MSC clásicos, pero le faltaban hematopoyéticas y marcadores endoteliales, se observaron diferencias significativas en cuanto a la expresión de CD90, CD105, CD106. Estas moléculas son descritos para ser asociado con hematopoyesis y la migración celular [18 - 20]. Es necesario que se investigó además si estas moléculas son funcionalmente importantes de estroma y homing capacidades. En una primera aproximación, hemos creado un amplio perfil de expresión de la proteína undifferenti- tizaciones UCB-CSM, que se extenderá a BM- y MSCs y, a continuación, correlacionados con propiedades funcionales [ 21].
Dado que la relevancia de las diferencias observadas de expresión de marcadores no ha sido investigado de manera adecuada y sin embargo, existen diferencias en lo que respecta a capacidad diferenciación parece ser más relevante para MSC calidad en la actualidad. Hemos demostrado una capacidad de diferenciación multilinaje BM- y Microsoft Cluster Server (MSCS). Interés- tente, UCB-MSCs no pudieron ser diferenciados preadipociticos hacia el linaje, que no estaba relacionada con la CFU-F origen. En realidad, hay datos contradictorios sobre la capacidad de diferenciación adipogénica UCB-MSCs [9 -12, 22, 23]. Sin embargo, suponemos que UCB-CSM son menos- sarrollar hacia la diferenciación adipogénica (apoyado por los resultados de Chang et al. [ 22]) que podría estar relacionada con la edad ontogenético de estas células. Esto se corrobora por el hecho de que resida en adipocitos humanos adultos BM y EN pero están ausentes en la vida del feto BM y por la observación de una mayor adipogénesis correlacionadas con la edad [ 24]. Genómica comparativa más o se necesitan enfoques proteómicos para evaluar la susceptibilidad hacia adipogénesis de Microsoft Cluster Server (MSCS).
Ninguno de nuestros UCB-MSCs mostró diferenciación adipogénica capacidad diferenciada, pero todos en el condro y so teogenic linajes. En contraste, un tri-diferenciación potencial calificacio- fue observado para la mayoría de las muestras pero sólo para unos pocos BM muestras. Una muestra de BM y se observó que en
la comparación de distintos tipos de tejidos MSCs
sólo someterse a la vía condrogénica. De acuerdo con esto, una estructura jerárquica o incluso limitado potencial de diferenciación de los CSM se ha informado [1, 13, 25].
En nuestro estudio, las investigaciones se limitan a los mesoder diferenciación capacidad de mal. Basándose en informes recientes, sin embargo, el espectro de diferenciación de MSCs no parece limitarse a este linaje. MSCs derivadas de los tres tejidos han demostrado que más diferencian en meso- cutánea y linajes en endo y linajes ectodérmica, así [ 10-13, 26- 33]. Experimentos comparativos deben llevarse a cabo para evaluar la respuesta hacia cardiomyogenic, endotelial, hepáticos, neuronas, y diferenciación pancreática.
Un alto impacto en los contextos clínicos explotación podría estar relacionada con la abundancia y ampliación de la capacidad de Microsoft Cluster Server (MSCS). Con base en nuestros resultados, tanto BM y son fuentes fiables para aislar y csm en el autotrasplante de que todos los preparativos dieron lugar a Microsoft Cluster Server (MSCS). UCB, en cambio, había un aislamiento eficacia de un máximo de 63% [ 8]. Se atribuyen estas diferencias a el hecho de que MSCS están circulando en el organismo prenatal y residen en los tejidos de los adultos [ 9]. A pesar de la baja frecuencia de UCB-MSCs, el potencial de expansión fue más
alto en comparación con otras fuentes celulares. Considerando las aplicaciones clínicas, el resultado de números celulares pueden ser similares a los de BM y, que pueden obtenerse en las frecuencias más altas. Uno de los argumentos en contra de la disponibilidad limitada en algunos pacientes. Sin embargo, creemos que debido a la alta frecuencia de MSCs, también a los pequeños depósitos grasa podría ser suficiente para MSC aislamiento. BM ha sido la principal fuente de aplicación clínica de los CSM, tales como el tratamiento de la osteogénesis imperfecta, injerto contra huésped- y el infarto agudo de miocardio [ 34- 36]. Como la cantidad, la frecuencia y la diferenciación capacidad de BM-MSCs correlaciona negativamente con la edad, pueden ser clínicamente ineficaz cuando se obtiene de los pacientes de edad avanzada. En ese caso, el trasplante alogénico noc- sería necesario. En el caso de es necesario, BM o HLA idéntico al de sus hermanos, haplo-idéntico parientes, o HLA-proyectó los donantes podrían ser mejor opción. Especular sobre un "off-the-shelf" producto que requiera producción en masa, podrían ser una sólida base de partida debido a la abundancia y relativamente fácil cosecha, MSCs y alta frecuencia.
Trasplante de Células Madre Mesenquimales es actualmente una procedimiento experimental, de manera parecida a los comienzos de trasplante de células madre hematopoyéticas. En este último, el BM ha sido reemplazada gradualmente por células progenitoras de sangre periférica y sangre de cordón umbilical. Asimismo, en la esfera de los CSM, las fuentes alternativas son intensamente investigado, y un día estas nuevas fuentes podrá sustituir BM. Teniendo en cuenta todas las ventajas y desventajas- zaciones de las tres fuentes mencionadas anteriormente, en función de las indicaciones terapéuticas, las aplicaciones clínicas pueden estar basadas en la diferenciación, pero más probable de la abundancia, fre- cuencia, y posibilidades de expansión de las células.
AGRADECIMIENTOS
agradecemos los colaboradores en el departamento de obstetricia del St. Hedwigsklinik en Mannheim, Alemania, el Hospital St. Rochus en Dieburg, Alemania, y especialmente Dudi Vutay (Departamento de Obstetricia y permite c?lculo- cology, el Hospital de la Universidad Mannheim), y de la Klinik am Lui senpark para el suministro de material la liposucción. Muchas gracias Daniela Griffiths para la edición del manuscrito. Este trabajo fue
Kern, Eichler, Stoeve et al.
apoyo de Forschungsfonds der fakulta¨t fu¨r Klinische Medizin Mannheim y por la Deutsche José Carreras Leu- ka¨mie-Stiftung eingetragener Verein.
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