การทดสอบสารพฤกษเคม และฤทธทางชวภาพของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน

นงลกษณ หวยหงษทอง

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาเคมศกษา

คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา กมภาพนธ 2559

ลขสทธเปนของมหาวทยาลยบรพา

กตตกรรมประกาศ วทยานพนธฉบบนส าเรจลงไดดวยความกรณาจาก ดร.ประภาพรรณ เตชะเสาวภาคย และดร.อนนต อธพรชย อาจารยทปรกษาทกรณาใหค าปรกษาแนะน าแนวทางทถกตอง ชวยเหลอในทกปญหาการวจยพรอมทงใหก าลงใจ ตลอดจนแกไขขอบกพรองตาง ๆ ดวยความละเอยดถถวนและเอาใจใสดวยดเสมอมา ขาพเจารสกซาบซงเปนอยางยง จงขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ โอกาสน ขอขอบพระคณ คณาจารยประจ าภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพาทกทาน ทชวยสอนวชาเคมในสวนของเนอหา และปฏบตการเคมอยางเขมขน เพอปลกฝงใหขาพเจาเปนนกวทยาศาสตร และเปนครวทยาศาสตรทมความรในภาคทฤษฎ และภาคปฏบตวชาเคมเปนอยางด ขอขอบพระคณเพอนนสตปรญญาโท สาขาเคมศกษาทกทานทมสวนชวยในการแนะน าชวยเหลอและใหก าลงใจในการท าวทยานพนธครงน ขอกราบขอบพระคณ คณพอยศปกรณ หวยหงษทอง คณแมอมรรตน หวยหงษทอง และสมาชกในครอบครวทกคนทใหก าลงใจ และสนบสนนขาพเจาเสมอมา คณคาและประโยชนของวทยานพนธฉบบน ขาพเจาขอมอบเปนกตญญกตเวทตาแดบพการ บรพาจารย และผมพระคณทกทานทงในอดตและปจจบนทท าใหขาพเจาเปนผมการศกษา และประสบความส าเรจมาจนตราบเทาทกวนน

นงลกษณ หวยหงษทอง

ง

55990026: สาขาวชาเคมศกษา; วท.ม. (วทยาศาสตรมหาบณฑต) ค าส าคญ: สารพฤกษเคม/ ฤทธตานอนมลอสระ/ แอลฟา-กลโคสเดส/ แอลฟา-อะไมเลส นงลกษณ หวยหงษทอง: การทดสอบสารพฤกษเคม และฤทธทางชวภาพของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน (PHYTOCHEMICAL SCREENING AND BIOLOGICAL ACTIVITIES OF SOME THAI MEDICINAL PLANTS USING IN THE DIABETES THERAPY) คณะกรรมการควบคมวทยานพนธ: ประภาพรรณ เตชะเสาวภาคย, Ph.D., อนนต อธพรชย, Ph.D., 81 หนา. ป พ.ศ. 2559. งานวจยนเปนการศกษาสารพฤกษเคมและฤทธทางชวภาพของสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน คอ ปอบด หกวาง สก และบอระเพด จากการศกษาสารพฤกษเคมของสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน พบสารพฤกษเคมตางๆ คอ เทอรพนอยด สเตอรอยด ซาโปนน ฟลาโวนอยด แทนนน คมารน และแอนทราควโนน นอกจากนสารสกดดงกลาวยงไดศกษาหาปรมาณสารประกอบ ฟนอลกรวม (8.02+1.14 ถง 121.20+3.06 mgGAE.g-1) ปรมาณฟลาโวนอยดรวม (6.72+0.25 ถง 68.28+1.44 mg QE.g-1) และปรมาณสารตานอนมลอสระรวม (69.84+2.01 ถง 151.61+2.97 mg AE.g-1) และจากการศกษาฤทธตานอนมลอสระดวยวธ DPPH free radical scavenging พบวาหกวางแสดงฤทธตานอนมลอสระสงทสด (96.63%) รองลงมาคอสก (82.49%) ปอบด (55.89%) และบอระเพด (18.41%) ตามล าดบ สวนการศกษาการยบย งการท างานของเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส พบวา หกวางแสดงคารอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสไดดทสด (98.83%) รองลงมาคอ ปอบด (89.79%) เถาบอระเพด (77.51%) และสก (55.53%) ตามล าดบ สวนการศกษาฤทธตานเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสทเกยวของกบโรคเบาหวานของสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรไทย 4 ชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน พบวาสารสกดเอทานอลจากใบหกวางมฤทธยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (97.29%) ซงมคาสงกวาสารมาตรฐาน อะคารโบสอกดวย และมฤทธยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (86.90%)ไดสงทสด ผลดงกลาวขางตนพบวาใบหกวางเปนแหลงของสารทสามารถปองกนหรอใชในการรกษาโรคเบาหวานไดดทสด และสามารถพฒนาสมนไพรไทยทง 4 ชนดไปใชประโยชนทางยารกษาโรคเบาหวานทชวยปองกนหรอลดภาวะแทรกซอนทเกดจากอนมลอสระในผปวยเบาหวานไดอยางมประสทธภาพ

จ

55990026: MAJOR: CHEMICAL EDUCATION; M.Sc. (CHEMICAL EDUCATION) KEWORDS: PHYTOCHEMICAL SCREENING/ ANTIOXIDANT ACTIVITY/ -GLUCOSIDAES/ -AMYLASE NONGLUK HUAYHONGTHONG: PHYTOCHEMICAL SCREENING AND BIOLOGICAL ACTIVITIES OF SOME THAI MEDICINAL PLANTS USING IN THE DIABETES THERAPY. ADVISORY COMMITTEE: PRAPAPAN TECHASAUVAPAK, Ph.D., ANAN ATHIPORNCHAI, Ph.D. 81 P. 2016. The present study was performed to evaluate the phytochemical screening and biological activities of the ethanolic extracts from some Thai medicinal plants using in the diabetes including Helicteres isora, Terminalia catappa, Tectona grandis and Tinospora crispa. Phytochemical studies of the ethanolic extracts of these plants revealed that the presence of secondary metabolites of terpenoids, steroids, saponins, flavonoids, tannins, coumarins and anthraquinones. The extracts were used to determine total phenolic content (8.02+1.14 to 121.20+3.06 mg GAE/g crude extract), total flavonoids content (6.72+0.25 to 68.28+1.44 mg QE/g crude extract) and total antioxidant capacity (69.84+2.01 to 151.61+2.97 mg AE/g crude extract). The highest antioxidant activity using DPPH free radical scavenging method was demonstrated by Terminalia catappa (96.63%) followed by Tectona grandis (82.49%), Helicteres isora (55.89%), and Tinospora crispa (18.41%), respectively. The ethanolic extract of four Thai medicinal plants using in the diabetes were studied to anti-diabetic activities against -glucosidase and -amylase. As a result, it was found that the ethanolic extract from Terminalia catappa leaves showed both highest -glucosidase (97.29%) and -amylase (86.90%) inhibitory activity. These results suggest the potential of Thai medicinal plants as anti-diabetic agent against free-radical-associated oxidative damage in diabetic patients.

สารบญ หนา บทคดยอภาษาไทย ……………………………………………………………………………... ง บทคดยอภาษาองกฤษ ……………………………………………………...………………….. จ สารบญ…………………………………………………………………………………….……. ฉ สารบญตาราง…………………………………………………………………………………… ซ สารบญภาพ…………………………………………………………………………..…………. ฌ บทท 1 บทน า………………………………………………………………………………….….… 1 1.1 ความเปนมาและความส าคญของปญหา……………………………………….….. 1 1.2 วตถประสงคของการวจย………………….………………………………….…… 2 1.3 ขอบเขตของการวจย……….………..……………………………………….…….. 2 1.4 ประโยชนทคาดวาจะไดรบจากงานวจย …………….……………………….……. 3 1.5 นยามศพทเฉพาะ………………………………………………………….….……. 3 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ……………………………………….…………………….. 4 2.1 ขอมลทวไปพฤษศาสตรของพชตวอยางทน ามาศกษา ………….………….……... 4 2.2 การสกดสารจากพช……………………………………………………………….. 8 2.3 การท าสารสกดใหเขมขน…………………………….…………………………… 8 2.4 สารพฤกษเคมเบองตน…………………………….………………………………. 9

2.5 สารตานอนมลอสระ...………………………….…………………………………. 13 2.6 สารประกอบฟนอลก……………………………………………………………… 14 2.7 ฤทธยบย งเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวาน………………………….…….….. 18 2.8 งานวจยทเกยวของ………………………………………………………………… 19 3 วธด าเนนการวจย…………………………………………………………………………… 24 3.1 เครองมอ อปกรณ และสารเคม……………………………………………………. 25 3.2 แผนการด าเนนการวจย…………………………………………………..………… 27 3.3 วธด าเนนการวจย………………………………………………………………….. 28 4 ผลการทดลองและอภปราย…………………………………………………………………. 35 4.1 การสกดสารสกดจากพชสมนไพร………………………………...……………….. 35

ช

สารบญ(ตอ) หนา 4.2 การตรวจสอบสารพฤกษเคมเบองตน……………………………… ……………… 36 4.3 การหาปรมาณฟนอลกรวม (Determination of total phenolic content: TPC)………. 37 4.4 การหาปรมาณฟลาโวนอยดรวม (Determination of total flavonoids content: TPC).. 38 4.5 การหาปรมาณสารตานอนมลอสระรวม (Determination of total antioxidant capacity: TAC)…………………………………………………………………….. 40 4.6 การทดสอบฤทธตานอนมลอสระโดยวธ DPPH radical scavenging……………..... 41 4.7 การทดสอบฤทธการยบย งเอนไซมเอลฟา-กลโคสเดส (Anti--glucosidase assay) 45 4.8 การทดสอบฤทธการยบย งเอนไซมเอลฟา-อะไมเลส (Anti--amylase assay) …..... 46 5 สรปผลการวจยและขอเสนอแนะ…………………………………………………………… 53 5.1 สรปผลการวจย…………………………………………………………………….. 53 5.2 ขอเสนอแนะ……………………………………………………………………….. 53 บรรณานกรม…………………………………………………………………………………… 54 ภาคผนวก………………………………………………………………………………………. 57 ประวตผวจย……………………………………………………………………………………. 82

ซ

สารบญตาราง ตารางท หนา 2.1 โครงสรางของสารประกอบฟนอลกลมตาง ๆ……….………………………………. 16 2-2 ความสามารถในการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสของสารสกดจากใบบอระเพด 23 4-1 น าหนกสารสกดหยาบ รอยละผลผลต และลกษณะทางกายภาพ……………………. 35 4-2 การตรวจสอบสารพฤกษเคมเบองตนของสารสกดหยาบชนเอทานอลจาก สมนไพรทใชรกษาโรคเบาหวานทง 4 ชนด…………………………………………... 36 4-3 รอยละของการตานอนมลอสระ ( % DPPH Radical inhibition) ของสารมาตรฐานกรดแกลลก เคอรซตน และ วตามนซ………………………………. . 42 4-4 รอยละของการตานอนมลอสระ (% DPPH Radical inhibition) ของสารสกดหยาบ เอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน………………………… 43 4-5 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) ของสารมาตรฐานอคารโบส และสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทย บางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน……………………………………………………... 45 4-6 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสารมาตรฐานอคารโบส และสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรไทย บางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน……………………………….…………...……….. 47

ฌ

สารบญภาพ ภาพท หนา 2-1 ลกษณะทางพฤษศาสตรของปอบด ……………………………………………………… 4 2-2 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของหกวาง ………………………………………………… . 5 2-3 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของสก ……………………………………………………..…… 6 2-4 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของบอระเพด …………………………………………………… 7 2-5 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมแอลคาลอยด………………………………… . 10 2-6 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมฟลาโวนอยด…………………………… 10 2-7 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมแทนนน……………………….…………….. 11 2-8 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมไกลโคไซด…………………………….. 12 2-9 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมเทอรพนอยด………………………………….. 12 2-10 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมสเตยรอยด……………….………………….. 13 2-11 กลไกการตานอนมลอสระของ DPPH ………………………………………….……… 14 2-12 ปฏกรยาไฮโดรไลซสของเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส……………………………………………………….… 18 2-13 โครงสรางของ Flavonoid glucuronides……………………………………………… 19 2-14 โครงสรางสารประกอบในกลมฟนอลกทพบในสารสกดชนน าจากใบหกวาง………. 20 2-15 โครงสรางของสารประกอบทแยกไดจากสารสกดจากเถาบอระเพด………………… 21 2-16 โครงสรางของสารประกอบในกลมฟลาโวนอยดทพบในสวนสกดหยาบเอทานอล จากใบบอระเพด…………………………………………………………………………. 22 3-1 แผนผงขนตอนการท าวจย……………………………………………....….………… 27 4-1 ลกษณะทางกายภาพของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใช รกษาโรคเบาหวาน…………………………………………………………………… 35 4-2 กราฟมาตรฐานของสารละลายกรดแกลลก………………………..………………… 37 4-3 ปรมาณฟนอลกรวมของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนด ทใชรกษาโรคเบาหวาน……………………………………………………………… 38 4-4 กราฟมาตรฐานของสารละลายเคอรซตน……………………………….…………… 39 4-5 ปรมาณฟลาโวนอยดรวมของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนด ทใชรกษาโรคเบาหวาน……………………………………………………………… 39

ญ

สารบญภาพ (ตอ) ภาพท หนา 4-6 กราฟมาตรฐานของสารละลายวตามนซ……………………………….…..……….…….. 40 4-7 ปรมาณสารตานอนมลอสระรวมของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทย บางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน……………………………………………..…….…….. 41 4-8 รอยละของการตานอนมลอสระ (% DPPH radical inhibition) ของสารมาตรฐาน กรดแกลลก เคอรซตน และวตามนซ…………………………………………………….. 42 4-9 รอยละของการตานอนมลอสระ (% DPPH radical inhibition) ของสารสกดหยาบ ชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน………………………… 44 4-10 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) ของสารมาตรฐานอคารโบส และสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทย บางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน…………………………………………….…………… 46 4-11 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสารมาตรฐานอคารโบส และสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทย บางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน…………………………………………….…………… 47 4-12 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และ รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสารสกดหยาบชนเอทานอลของฝกปอบด…………………….……………………... 48 4-13 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และ รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสารสกดหยาบชนเอทานอลของใบหกวาง…....……………….…………………….. 49 4-14 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และ รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสารสกดหยาบชนเอทานอลของใบสก….…….……..………………………………. 50 4-15 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และ รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสารสกดหยาบชนเอทานอลของเถาบอระเพด….…….……..……………………….. 51

ฎ

สารบญภาพ (ตอ) ภาพท หนา 4-16 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และ รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสารมาตรฐานอคารโบส และสกดหยาบชนเอทานอลของสมนไพรไทยบางชนด ทใชรกษาโรคเบาหวาน…………………………………………………………………. 52

บทท 1

บทน า

1.1 ความเปนมาและความส าคญของปญหา โรคเบาหวาน (diabetes mellitus) เปนโรคเรอรงซงเกดจากภาวะการขาดอนซลนหรอประสทธภาพในการท างานของอนซลนลดลง รางกายจงไมสามารถทจะน าน าตาลเขาไปในเนอเยอเพอเผาผลาญใหเกดพลงงานได ท าใหระดบน าตาลกลโคสในเลอดสงกวาปกต เกดการคงของน าตาลในเลอดและอวยวะตาง ๆ น ามาซงภาวะแทรกซอนตาง ๆ มากมาย ทส าคญและพบบอยคอหลอดเลอดแดงตบ จอตาเสอม ระบบประสาทเสอมและไตพการ (ดวงกมล อครนสรณ, 2527) การรกษาโรคเบาหวานโดยการใชยาเปนวธทใชกนมากในปจจบน ยาทใชในการรกษามทงชนดรบประทานและชนดฉด ตวอยางยาชนดรบประทาน เชน ยากลมซลโฟนลยเรย (sulfonylureas) ไดแก ไกลเบนคลาไมด (glibenclamide) ไกลคลาไซด (gliclazide) ไกลพไซด (glipezide) ซงออกฤทธในการกระตนเบตาเซลลใหหลงอนซลนมากขน ชวยใหเนอเยอตอบสนองตออนซลนเพมขน แตมกท าใหเกดอาการขางเคยง ไดแก มผนตามผวหนง คลนไส อาเจยน ตวเหลองซดเมดเลอดขาวและเกลดเลอดต า เปนตน (ภาวนา กรตยตวงศ, 2544) ดงนนภาครฐจงสนบสนนใหมการใชยาสมนไพรในการลดระดบน าตาลในเลอด เชน นโครธ ต าลง มะระ หอมใหญ บวหลวง บอระเพด มะตม กระเทยม กะเพรา หรอวานหางจระเข เปนตน (มาล บรรจบ และสธดา ไชยราช, 2541) ดงนน การน าสมนไพรมารกษาโรคเบาหวานจงเปนอกทางเลอกหนงทนยมในปจจบน จากขอมลขางตน ผวจยจงสนใจศกษาสารพฤกษเคมเบองตน (Phytochemical screening) ของสารสกดหยาบจากสมนไพรไทยบางชนดทหางายและมการน ามาใชปองกนหรอรกษาโรคเบาหวานและลดระดบน าตาลในเลอด ทมรายงานการใชอยในต ารายาแผนโบราณของไทย อาท ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด เปนตน พรอมทงศกษาฤทธทางชวภาพตาง ๆ เชนฤทธตานอนมลอสระและฤทธตานเบาหวานของสมนไพรดงกลาวอกดวย

2

1.2 วตถประสงคของงานวจย

1. เพอเตรยมสารสกดหยาบช นเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดท ใช รกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

2. เพอศกษาสารพฤกษเคมเบองตน (Phytochemical screening) ของสารสกดหยาบชน เอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

3. เพอหาปรมาณฟนอลกรวม ปรมาณฟลาโวนอยดรวม และปรมาณสารตานอนมลอสระรวม ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

4. เพอทดสอบฤทธทางชวภาพไดแก ฤทธตานอนมลอสระ และฤทธตานเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวาน คอเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส ของ สารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

1.3 ขอบเขตของงานวจย

1. เตรยมสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด โดยวธการสกดแบบแชหมก (Maceration)

2. ทดสอบสารพฤกษเคมเบองตน (Phytochemical screening) ของสารสกดหยาบชน เอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

3. หาปรมาณฟนอลกรวม ปรมาณฟลาโวนอยดรวมและปรมาณสารตานอนมลอสระรวม ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

4. ทดสอบฤทธทางชวภาพไดแก ฤทธตานอนมลอสระ และฤทธตานเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวาน คอเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

3

1.4 ประโยชนทคาดวาจะไดรบจากงานวจย

1. ท าใหทราบสารพฤกษเคมเบองตนของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

2. ท าใหทราบปรมาณฟนอลกรวม ปรมาณฟลาโวนอยดรวม และปรมาณสารตานอนมลอสระรวม ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

3. ท าใหทราบฤทธทางชวภาพไดแก ฤทธตานอนมลอสระ และฤทธตานเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวาน คอเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

4. น าขอมลทไดจากงานวจยไปใชประโยชนเปนแนวทางในการรกษาโรคเบาหวาน หรอผลตภณฑทางยาส าหรบรกษาโรคเบาหวาน

1.5 นยามศพทเฉพาะ 1. การทดสอบสารพฤกษเคมเบองตน (Phytochemical screening) เปนการทดสอบทาง

เคมเบองตน โดยใชปฏกรยาการเกดสซงจะใหผลการทดสอบเปนสตางๆหรอเกดตะกอน เพอบอกถงกลมสารเคมทส าคญ

2. ปรมาณฟนอลกรวม (Total phenolic content) หมายถง ปรมาณสารประกอบฟนอลกรวมในสารสกดหยาบของตวอยางทสนใจโดยใชวธ Folin-Ciocalteu colorimetric

3. ปรมาณฟลาโวนอยดรวม (Total flavonoids content) หมายถง ปรมาณสารประกอบ ฟลาโวนอยดรวมในสารสกดหยาบของตวอยางทสนใจโดยใชวธ Aluminium trichloride (AlCl3) colorimetric

4. ปรมาณสารตานอนมลอสระรวม (Total antioxidant capacity) หมายถง ปรมาณสารประกอบ ท มฤทธตานอนมลอสระในสารสกดหยาบของตวอยางทสนใจโดยใชว ธ Phosphomolybdate colorimetric

5. ฤทธตานอนมลอสระ (Antioxidant) หมายถง ความสามารถในการตอตานหรอยบย งการเกดปฏกรยาออกซเดชนในสารสกดหยาบของตวอยางทสนใจโดยใชวธ DPPH radical scavenging

6. ฤทธตานเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวาน (Anti--diabetic activity) หมายถงความสามารถในการยบย งการการท างานของเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส โดยใชวธ p-nitrophenol colorimetric

บทท 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ

2.1 ขอมลพฤกษศาสตรของพชตวอยางทน ามาศกษา 2.1.1 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของปอบด

ปอบด หรอปอกะบด มชอเรยกตามทองถนอกหลายชอเชน ปอทบ มะปด ขอนใหญ ปอลงไซ มชอทางวทยาศาสตรวา Helicteres isora L. อยในวงศ Malvaceae เปนไมพม สง 1-3 เมตร ทกสวนมขนรปดาว ใบเดยว เรยงสลบ รปไข กวาง 6-18 เซนตเมตร ยาว 8-20 เซนตเมตร ปลายใบเปนตงแหลม 3-5 ตง ดอกออกเปนชอทซอกใบ กลบดอกสสมอมแดง รปใบหอกกลบ ยาว 2.5-3.0 เซนตเมตร ผลเปนฝกยาวบดเปนเกลยว ยาว 3-4 เซนตเมตร เมอแกจะแตก มสน าตาลด า เปนพชทขนเองตามรมปาเบญจพรรณ ปาเตงรง ทรกราง พบไดทวไปในเอเชยตะวนออกเฉยงใต จน และอนเดย จากขอมลในต ารบยาไทยใชเปลอกและราก บ ารงธาต ผล ใชแกบด แกปวดเบง ทองเสย ขบเสมหะ ต าพอกแกปวดเคลดบวม การศกษาวจยประสทธภาพของปอบดเกยวกบโรคเบาหวานคอ พบวาสารสกดน าจากเปลอกปอปดมฤทธลดระดบไขมนในเลอดในหนขาวทถกท าใหเปนโรคเบาหวาน และปองกนไมใหระดบไขมนสงขน ซงมกพบอาการหลงจากการเปนโรคเบาหวาน อกทงฤทธของสารสกดคลายกบ Tolbutamide ทใชรกษาผปวยเบาหวานชนดท 2 (Kumar and Murugesan, 2008)

ภาพท 2-1 ลกษณะทางพฤษศาสตรของปอบด (ก) ฝก (ข) ใบ (ค) ดอก (เขาถงไดจาก: http://health.kapook.com/view65196.html)

(ก) (ค) (ข)

5

2.1.2 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของหกวาง หกวาง มชอวทยาศาสตร Terminalia catappa L. จดอยในวงศ Combretaceae ชอสามญ Bengal almond, Indian almond, Sea almond ชอทองถน เชน ตาปง (พษณโลก, สตล), โคน (นราธวาส), หลมปง (สราษฎรธาน), คดมอ (ตรง), ตาแฟห (มลาย-นราธวาส)เปนตน ลกษณะของตนหกวาง จดเปนไมยนตนผลดใบขนาดกลาง ใบเดยวรปหอกปลายกวางแหลม โคนสอบกวาง 8-15 เซนตเมตร ยาว 12-25 เซนตเมตร ดอกสขาวเปนรปหอกกลม เลก ๆ ผลรปไขหวทายแหลมเปนพ สขยว สแดง สเหลอง ปลกใหรมเงาโดยทวไป ปลกโดยใชเมลด (จไรรตน เกดดอนแฝก, 2552) มการ ศกษาเกยวกบการรกษาโรคเบาหวานในประเทศอนเดย พบวาสารสกดจากผลหกวางสามารถลดระดบน าตาลในเลอดของหนทดลองทถกกระตนเปนเบาหวานได (Nagappa, Thakurdesai, Rao, and Singh, 2003)

ภาพท 2-2 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของหกวาง (ก) ตน (ข) ล าตน ค) ผล (ง) ใบ

2.1.3 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของสก สกมชอวทยาศาสตร Tectona grandis L. อยในวงศ Lamiaceae ชอพนเมองอนไดแกเคาะเยยโอ (ละวา-เชยงใหม), ปาย (กะเหรยง-กาญจนบร) ปฮ, ปฮอ (กะเหรยง-แมฮองสอน) เสบาย (กะเหรยง-ก าแพงเพชร) สกหรอสกทองเปนไมยนตนขนาดใหญสง 15-30 เมตร ล าตนตงตรง แตกกงกานสาขาเฉพาะสวนยอดของเรอนตน เปลอกล าตนสน าตาลเรยบ ใบเดยวขนาดใหญ เนอหนาและสาก มขนใตใบ ออกดอกตามปลายกงเปนชอ ดอกยอยสขาวขนาดเลก ผลทรงกลมขนาดเลก เสนผาศนยกลางประมาณ 1 เซนตเมตร (พมลพรรณ อนนตกจไพศาล, 2554) การศกษาวจยเกยวกบการรกษาโรคเบาหวานพบวาสารสกดชนเมทานอลของเปลอกตนสกสามารถลดระดบน าตาลในเลอด และระดบไตรกลเซอไรดได รวมทงมฤทธตานอนมลอสระอกดวย (Ghaisas et al. 2009)

(ข) (ก) (ง) (ค)

6

ภาพท 2-3 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของสก (ก) ตน (ข) ล าตน (ค) ใบ

2.1.4 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของบอระเพด

บอระเพดมชอวทยาศาสตรวา Tinospora crispa (L.) Hook. f. & Thomson อยในวงศ Menispermaceae ชออน เครอเขาฮอ, จงจง, เจตมลหนาม, เจตมลยาน บอระเพดเปน ไมเลอยเนอแขง ยาวไดถง 15 เมตร ล าตนเปนเถาผวขรขระ มยางขาว รสขม มรากอากาศยาวคลายเสนดาย ใบ เปนใบเดยวเรยงเวยน รปหวใจ รปไขกวาง หรอรปคอนขางกลม กวาง 6-12 เซนตเมตร ยาว 7-17 เซนตเมตร ปลานเรยวแหลม โคนรปหวใจลก หรอตน แผนใบคลายกระดาษ เสนใบออกจากโคนใบรปฝามอม 3-5 เสน และมเสนแขนงใบอก 1-3 ค กานใบยาว 5-15 เซนตเมตร โคนปองและงอ ชอดอก คลายชอกระจะ ชอดอกเพศผยาว 9-20 เซนตเมตร ม 1-3 ชอ ดอกตดเปนกระจก กระจกละ 1-3 ดอก เรยงบนแกนชอ กานดอกเลกเรยว ยาว 2-4 มลลเมตร กลบเลยงสเขยวออน วงนอกม 3 กลบ รปไขหนาทโคน ยาว 1-1.5 มลลเมตร วงในม 3 กลบ รปไขกลบ ยาว 3-4 มลลเมตร มกานกลบ หรอโคนแหลม กลบดอกม 3 กลบ กลบวงนอกเทานนทเจรญขน รปใบหอกกลบแคบแบน ไมมตม ยาวประมาณ 2 มลลเมตร สวนกลบวงในลดรป เกสรเพศผม 6 อน ยาวประมาณ 2 มลลเมตร ชอดอกเพศเมยออกตามซอกใบยาว 2-6 เซนตเมตร มกออกเปนชอเดยว ดอกเพศเมยมกลบเลยงและกลบดอกคลายดอกเพศผ เกสรเพศผเปนหมนม 6 อน รปลมแคบ ยาวประมาณ 1 มลลเมตร เกสรเพศเมยม 3 คารเพล รปรโคง ยาวประมาณ 2 มลลเมตร ยอดเกสรเพศเมยเปนพสนมาก ผล แบบผลผนงชนในแขงออกเปนชอ มกานชอยาว 1.5-2 เซนตเมตร มกานผลเปนรปกงพระมด ยาว 2-3 มลลเมตร ใตลงมาเปนกลบเลยงทตดแนน รปไข ยาว ประมาณ 2 มลลเมตร โคงกลบ ผลแกสสมรปร ยาวประมาณ 2 เซนตเมตร ผนงผลชนในสขาว รปรกวาง 7-9 มลลเมตร ยาว 1.1-1.3 เซนตเมตร ผวยนเลกนอย หรอเกอบเรยบ มสนทดานบนชด มชองเปดรปรเลกทดานบน จากต าราสรรพคณยาไทยน า

(ก) (ข) (ค)

7

บอระเพดมรสมน เถาแกพษฝดาษ แกไขเหนอ ไขพษ แกฝดาษ โรคแทรกจากไขทรพษ แกไขทกชนด บ ารงก าลง เจรญไฟธาต แกรอนใน แกสะอก (วชย โชคววฒน, 2552) การศกษาสรรพคณลดน าตาลในเลอด มรายงานการศกษาโดยทดสอบฤทธในหนขาวปกตและหนทเปนเบาหวานจากการเหนยวน าดวย alloxan เมอผสมสวนสกดดวยน าจากล าตนใหสตวทดลองขนาด 4 กรมตอน า 1 ลตร ตดตอกนเปนเวลา 2 สปดาห พบวาสตวทดลองมระดบน าตาลในเลอดลดลง ระดบอนซลนในเลอดเพมขนและมความทนตอกลโคสเพมขน และเมอฉดเขาเสนเลอด 50 มลลกรมตอน าหนกตว 1 กโลกรมจะเพมระดบอนซลนเชนกน และเมอศกษากลไกลการออกฤทธในหลอดทดลอง พบวาสวนสกดจากบอระเพดมฤทธกระตนการหลงอนซลนของ islets of Langerhans ของคนและหนขาว และของเซลล HIT-T15 ส าหรบการศกษาบอระเพดทมผลตอระดบน าตาลในเลอดในประเทศไทย พบวาสวนสกดดวยแอลกอฮอลจากล าตนขนาด 250 มลลกรมตอน าหนกตว 1 กโลกรม ท าใหหนขาวปกตมความทนตอกลโคสดขนเมอเปรยบเทยบกบกลมควบคม และลดน าตาลในเลอดของหนทเปนเบาหวานได แตไมมผลตอระดบน าตาลในเลอดของหนปกต (มาล บรรจบ และสทธดา ไชยราช, 2541)

ภาพท 2-4 ลกษณะทางพฤกษศาสตรของบอระเพด (ก) ตน (ข) ใบ (เขาถงไดจาก: http://dmsc2.dmsc.moph.go.th/webroot/Plant/Mpri2013/Q_boraped.shtm)

(ก) (ข)

8

2.2 การสกดสารจากพช (วรพร ศลศร, 2554) การสกดสารส าคญจากพชอาจท าไดหลายวธ ขนอยกบชนดของสารทสกด คณสมบตของ

สารในการทนความรอนและชนดของตวท าละลายทใช ซงแตละวธจะมขอดขอจ ากดแตกตางกน ไดแก 2.2.1 การหมก (Maceration) เปนวธการสกดสารส าคญจากพชโดยวธหมกตวอยางพชกบ

ตวท าละลายในภาชนะทปด เชน ขวดปากกวาง ขวดรปชมพ หรอโถทปดสนท ทงไว 5-7 วน หมนเขยาและคนบอย ๆ เมอครบก าหนดเวลาจงคอย ๆ รนเอาสารสกดออก พยายามบบเอาสารละลายออกจากกากใหมากทสด รวมสารสกดทไดแลวน าไปกรอง อาจสกดซ าหลาย ๆ ครง เพอใหไดสารสกดทงหมด ขอดของวธนสารไมถกความรอนแตเปนวธทเปลองตวท าละลายมาก

2.2.2 การแชสกดตอเนอง (Percolation) เปนวธสกดสารส าคญแบบตอเนองโดยใชเครองมอ Percolator น าตวอยางพชมาหมกกบตวท าละลายพอชน ทงไว 1 ชวโมง เพอใหพองตวเตมท แลวคอย ๆ บรรจตวอยางพชทละนอยเปนชนลงใน Percolator เตมตวท าละลายลงไปใหระดบตวท าละลายสงเหนอตวอยางพชประมาณ 0.5 เซนตเมตร ทงไว 24 ชวโมง จงเรมไขเอาสารสกดออกโดยการเตมตวท าละลายเหนอตวอยางพชอยาใหแหง เกบสารสกดจนการสกดเสรจสมบรณ บบกากเอาสารสกดออกใหมากทสด รวมสารสกดทไดแลวน าไปกรอง

2.2.3 การสกดแบบตอเนอง (Soxhlet extractor) เปนวธสกดแบบตอเนองโดยใชความรอนท าใหตวท าละลายใน Flask ระเหยขนไป แลวกลนตวลงมาใน Thimble ซงบรรจตวอยางพชไว เมอตวท าละลายใน Extracting chamber สงถงระดบจะเกดกาลกน า สารสกดจะไหลกลบลงไปใน Flask ดวยวธ กาลกน า Flask ไดรบความรอน ตวท าละลายจงระเหยขนไปทงสารสกดไวใน Flask ตวท าละลายเมอกระทบ Condenser จะวนเวยนมาสกดใหมจบเวยนเชนนจนกระทงการสกดสมบรณ วธการสกดดวยวธนใชความรอนอาจท าใหสารส าคญบางตวสลายไป

2.3 การท าสารสกดใหเขมขน (นพมาศ สนทรเจรญนนท, 2544) เมอสกดสารจากพชดวยตวท าละลายทเหมาะสมแลว สารสกดทไดจะมปรมาตรมาก และ

เจอจาง ท าใหน าไปแยกสวนไดไมสะดวกและไมมประสทธภาพ จงจ าเปนตองน ามาท าใหเขมขนกอน ซงอาจท าไดหลายวธดงน

2.3.1 Free evaporation คอการระเหยใหแหงโดยใชความรอนจากหมอองไอน า หรอ hot plate บางครงอาจจะเปาอากาศรอนลงไปในสารสกดดวยเพอใหระเหยไดเรวขน

2.3.2 Distillation in vacuum เปนวธการระเหยแหงโดยกลนตวท าละลายออกทอณหภมต า และลดความดนลงใหเกอบเปนสญญากาศโดยใช Vacuum pump เครองมอนเรยกวา Rotary evaporator ประกอบดวย 3 สวนคอ distillation flask, condenser และ receiving flask โดย

9

distillation flask จะหมนตลอดเวลาทท างาน และแชอยในหมอองไอน าเพอใหการกระจายของความรอนทวถงและสม าเสมอ

2.3.3 การแชแขง (Freezing) ถาเปนสารสกดดวยน า วธทเหมาะสมคอใชวธแชแขงโดยใช lyophilizer หรอ Freeze dryer แตถาเปนตวท าละลายอนเฉพาะตวท าละลายเทานนทแขง ซงแยกไดจาก concentrated extract โดย centrifuge วธนมขอดเหมาะสมกบสารทสลายตวงายดวยความรอน

2.3.4 Ultrafiltration เปนการท าสารสกดดวยน าใหเขมขนโดยใชแผนเมมเบรน ใชกบสารทมน าหนกโมเลกลสงกวา 5,000 เปนตน

2.4 สารพฤกษเคมเบองตน สารเคมทพบในพชมจ านวนมาก เราสามารถแบงกลมสารเคมในพชตามสารตงตน (biosynthesis origin) ของสารเคมเหลานไดเปน 2 กลมใหญ คอสารปฐมภม (primary metabolites) และสารทตยภม (secondary metabolites) สารปฐมภม เปนสารเคมพนฐานทพบในพชชนสงโดยทวไป พบไดในพชเกอบทกชนด เปนกลมสารทเกยวของกบเมตาโบลซมทจ าเปน (essential metabolism) ของเซลล สวนใหญเปนสารทไดจากกระบวนการสงเคราะหแสงของพช และกระบวนการชวสงเคราะหกรดอะมโนบางชนด สารปฐมภมไดแก คารโบไฮเดรต (carbohydrates) ไขมน (lipid) โปรตน กรดอะมโน และเอนไซม (enzymes) สารทตยภม เปนสารประกอบทพบแตกตางกนในพชแตละชนด เชอวาสารเหลานเกดจากกระบวนการชวสงเคราะหในพช สารเหลานมกจะแสดงฤทธทางเภสชวทยาอยางชดเจน อยางไรกตามสารทตยภมกยงเกยวของในวงจรเมตาบอลซมพนฐานของเซลลทมชวต (นพมาศ สนทรเจรญนนท, 2544) สารทตยภมทพบในพชแตละชนด ตวอยางเชน

2.4.1 แอลคาลอยด (Alkaloids) เปนสารอนทรยทมฤทธเปนดาง มไนโตรเจนเปนสวนประกอบ มกพบในพชชนสง แอลคาลอยดมสตรโครงสรางซบซอนและแตกตางกนมากมาย คณสมบตของแอลคาลอยด คอ ไมละลายน า แตละลายไดในสารอนทรย สวนใหญมรสขม แอลคาลอยดสวนมากจะเปนผลกไมมส ยกเวน ชนดทมพนธะคสลบกบพนธะเดยว (Conjugated double bond) เชน Berberine มสเหลอง แอลคาลอยดมประโยชนในการรกษาโรคอยางกวางขวาง เชน ใชเปนยาระงบปวด (สาร Morphine ในยางของผลฝน) ยาชาเฉพาะท ยาแกไอ ยาแกหอบหด ยารกษาแผลในกระเพาะและล าไส ยาลดความดน รกษาโรคมาเลเรย (Quinine) ในเปลอกตนซงโคนา) ยาควบคมการเตนของหวใจ เปนตน

10

HO

NH

H3CO

NQuinine

HO

O

HOH N CH3

Morphine

N

OO

H3COOCH3Berberine

ภาพท 2-5 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมแอลคาลอยด

2.4.2 ฟลาโวนอยด (Flavonoids) พบไดทกสวนของพช เปนสารมสท าใหดอกไมมสสน

สวยงาม คณสมบตของฟลาโวนอยด คอ เปนสารโพลฟนอล (Polyphenolic compound) สวนใหญเปน o-glycoside พบเปน c-glycoside บาง และน าตาลมกจบต าแหนง 3, 5 หรอ 7 ของ Aglycone บางชนดมฤทธทางเภสชวทยา เชน ท าใหเสนเลอดฝอยแขงแรง ตานเชอไวรส ลดการอกเสบ สาระส าคญกลมน ไดแก Hesperidin และ Rutin ซงมฤทธท าใหผนงเสนเลอดฝอยแขงแรง ไมเปราะ ใชรกษาโรครดสดวงทวาร

O O

HO OHOH

H3CO

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

HO

O

Rutin

O

HO

O

OHOH

H3CO

OH

OH

OH

O O

OOH

OH

OCH3

Hesperidin

24

78

3

5'6'

6

4'

3'2'5

1'

ภาพท 2-6 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมฟลาโวนอยด

2.4.3 แทนนน (Tannins) เปนสารทพบในพชทวไป มรสฝาด มฤทธเปนกรดออน และ

สามารถตกตะกอนโปรตนได เชน ตกตะกอนเจลาตน และเปนสารทไมตกผลก เมอน ามาละลาย ในน าจะใหสารละลายคอลลอยด มฤทธฝาดสมานและฤทธฆาเชอแบคทเรย พบในใบฝรง เนอของกลวยน าวาดบ ประโยชนของแทนนน ใชในอตสาหกรรมฟอกหนง ท าใหหนงเปนเงางามและทนทาน เปนยาแกทองเสย เนองจากมฤทธฝาดสมาน

11

OO

OHO OH

O OHO

HOOH

HOOH

OH

O

O

HOOH

OH

Tannin

ภาพท 2-7 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมแทนนน

2.4.4 ไกลโคไซด (Glycoside) เกดจาก Aglycone หรอ Genin จบกบสวนทเปนน าตาล (Glycone part) ละลายน าไดด ไกลโคไซดจ าแนกตามโครงสรางของ Aglycone ไดหลายประเภทเชน คารดแอก ไกลโคไซด (Cardiac glycosides) แอนทราควโนน ไกลโคไซด (Antrawquinone glycosides)ซาโปนน ไกลโคไซด (Saponin glycosides) ไซยาโนเจนนตก ไกลโคไซด (Cyanogenatic glycosides) ไอโซไทโอไซยาเนท ไกลโคไซด (Isothiocyanate glycosides) ฟลาโวนอยด ไกลโคไซด (Favonoid glycosides) และแอลกอฮอลค ไกลโคไซด (Alcoholic glycosides) เปนตน (อดมเดชา พลเยยม, 2556)

12

OHOHO OH X

OH

R

Glycoside compounds

ภาพท 2-8 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมไกลโคไซด

2.4.5 เทอรพนอยด (Terpenoids) หรอเทอรพน (Terpene) เปนสารทตยภมทพบมากทสดทในธรรมชาต สามารถพบไดทงในพชและสตว เชน sesquiterpenes พบในฮอรโมนของแมลง diterpenes พบในสตวทะเลจ าพวกฟองน า triterpenes มกพบในรปของ cardiac glycosides, saponin และ phytosterol ตวอยางเชน -amyrin และ Lupenol ทพบในพชแทบทกชนดเปนตน

H

HH

H

HHO

H

H

HO

-amyrin Lupeol

ภาพท 2-9 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมเทอรพนอยด 2.4.6 ส เ ต ย รอยด (Steroids) เ ป นส าร ท ม โครงส ร า งพ นฐ าน เ ปน cyclopentano

perhydrophenanthrene nucleus สารจ าพวกสเตยรอยดมโครงสรางคลายคลงกบสารในกลม tetracyclic triterpenes มาก เปนกลมทมความส าคญเนองจากน ามาใชประโยชนเปนยาลดการอกเสบ ยารกษาโรคหวใจ (cardiac glycoside) ยาขบปสสาวะ ตลอดจนน ามาสงเคราะหเปนฮอรโมนเพศ และยาคมก าเนดหลายชนด เชน hecogenin ซงไดจาก Agave sisalana ใชเปนสารตง

น าตาลไกลโคน อะไกลโคน (Aglycone)

13

ตนในการสงเคราะห corticosteroids สาร diosgenin ซงไดจาก Dioscorea spp. เปนสารตงตนทใชในการสงเคราะหยาคมก าเนด และฮอรโมนเพศ เปนตน (นพมาศ สนทรเจรญ, 2544)

O

O

HO

H

O

H

H

H

HH

Hecogenin

O

O

HO

H

H HH

H

Diosgenin

ภาพท 2-10 โครงสรางทางเคมของสารประกอบในกลมสเตยรอยด

2.5 สารตานอนมลอสระ (Antioxidants) สารอนมลอสระ (Free radicals) หรอ Reactive Oxygen Species (ROS) เปนโมเลกล

หรอ ไอออนทมอเลกตรอนโดดเดยวอยรอบนอกและมอายส นมาก จดเปนโมเลกลทไมเสถยร และวองไวตอการเกดปฏกรยาเคม จงท าปฏกรยากบโมเลกลตาง ๆ ภายในรางกายเพอใหสารอนมลอสระนนมความเสถยรมากขน แหลงทท าใหเกดอนมลอสระในตวคน ม 2 แหลง คอ จากภายในรางกาย เชน การเผาผลาญอาหาร การหายใจ การออกก าลงกาย และจากแหลงภายนอกรางกายทเปนตวกระตนใหเกดอนมลอสระ ไดแก ความเครยด การตดเชอ มลพษในอากาศ เปนตน อนมลอสระมหลายชนด โดยชนดทส าคญ ไดแก ซเปอรออกไซด แอนไอออน (Superoxide anion) ไฮโดรเจนเพอรออกไซด (Hydrogen peroxide) ไฮดรอกซลแรดดเคล (Hydroxyl radical) เมอมอนมลอสระเกดขน จงเกดการท าลายโมเลกลอน ๆ ตอเนองกนเปนลกโซ สงผลใหเกดการอกเสบของเนอเยอรางกาย เกดรวรอยเหยวยนบนใบหนา รอบดวงตา และผวพรรณ รวมทงเปนสาเหตของการเกดโรคเรอรงตาง ๆ เชน โรคหวใจขาดเลอด ตอกระจก ความดนโลหตสง อลไซเมอร เบาหวาน และมะเรง เปนตน ปกตภายในรางกายมกลไกปองกนการโจมตจากอนมลอสระ โดยอาศยการท างานของสารตานอนมลอสระทสรางขนในรางกาย เชน เอนไซม Superoxide dismutase (SOD), Catalase และ Glutathione peroxidase เปนตน แตการสรางสารตานอนมลอสระยงไมเพยงพอและมขดจ ากด ประกอบกบเมออายมากขน รางกายจะสรางสารตานอนมลอสระไดนอยลง ดงนนรางกายจงควรรบสารตานอนมลอสระจากภายนอกดวยเชนกน สารตานอนมลอสระหรอสารแอนตออกซแดนซ (Antioxidants) ทรจกกนด ไดแก วตามนซ วตามนอ ซลเนยม เบตาแคโรทน วตามนเอ

14

และพฤกษเคมตาง ๆ (Phytochemical) เ ชน โพลฟนอล (Polyphenol) และไอโซฟลาโวน (Isoflavone) เปนตน ปจจบนสารตานอนมลอสระถกน ามาใชเปนสวนผสมของผลตภณฑเสรมอาหารหลายชนด นอกจากนยงมการใชสารตานอนมลอสระธรรมชาตในเภสชภณฑ และสวนประกอบอน ๆ ในผลตภณฑอตสาหกรรม เชน สารกนบดในอาหาร และเครองส าอางอกดวย (วรพร ศลศร, 2554) ส าหรบวธการทดสอบทนยมใชเพอทดสอบฤทธตานอนมลอสระนนจะเรยกวา DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) กลไกการตานอนมลอสระของ DPPH ของสารจ าพวกฟนอล เกดจากการใหอเลกตรอนแกอนมลอสระ DPPH ของสารจ าพวกฟนอล เมออนมลอสระ DPPH ไดรบอเลกตรอนจากสารจ าพวกฟนอลแลวจะไดเปนโมเลกลทมความเสถยร โดยจะเหนเปนสเหลอง (ขนท 1) สวน phenoxy radical ทเกดขนจะจบกน ท าใหปฏกรยาลกโซของการเกดอนมลอสระหมดไป (ขนท 2) (ระววรรณ แกวอมตวงศ และทรงพร จงมนคง, 2549) ขนท 1

PhOH

NO2

NO2

O2NHN N

Ph

PhPhO

DPPH (purple) Phenolic compounds DPPH (yellow) Phenoxy radical

NO2

NO2

O2N N NPh

Ph

ขนท 2

PhO PhO+ PhOOPhPhenoxyradical Phenoxyradical Phenolic compounds

ภาพท 2-11 กลไกการตานอนมลอสระของ DPPH

2.6 สารประกอบฟนอลก (Phenolic Compounds) เปนกลมสารทพบมากในพช มคณสมบตเปนสารตานอนมลอสระ ตานการอกเสบ ปองกนความเสยหายทเกดจากรงสอลตราไวโอเลต และปองกนการสรางสารกอมะเรง สารกลมน ถกจ าแนกตามโครงสรางทางเคมออกเปนกลมยอยหลายกลม ซงสารในกลมฟลาโวนอยด (Flavonoids) เปนหนงในกลมยอยเหลานทมการศกษาฤทธตานอนมลอสระและถกน ามาใช

15

ประโยชนเปนอาหาร ยา และเครองส าอางอยางแพรหลายในปจจบน สารประกอบฟนอลก (Phenolic compounds) คอ สารทมสตรโครงสรางทมหม ไฮดรอกซล (OH group) บนวงแหวน อะโรมาตก (Aromatic ring) ตงแต 1 หมขนไป สารในกลมนจงมคณสมบตทละลายน าไดด พบไดในพช ผก และผลไมทวไป อาจแบงออกไดเปน 3 กลมใหญ ๆ ไดแก

2.6.1 Simple phenols หรอ phenolic acid และอนพนธ เชน Gallic acid, Ellagic acid, Tannic acid, Vanillin, Catechol, Resorcinol และ Salicylic acid เปนตน สารกลมนพบไดในผลไมหลายชนด เชน Raspberry และ Blackberry

2.6.2 Phenylpropanoids ไดแก Phenolic compound ท Aromatic ring ม Three-carbon side chain เกาะอย แยกยอยไดหลายกลม ไดแก Hydroxycinnamic acid (Ferulic acid, Caffeic acid หรอ Coumaric acid), Coumarins (Umbelliferone, Scopoletin, Aesculetin หรอ Psoralen), Lignans (Pinoresinol, Eugenol หรอ Myristicin) พบไดในแอปเปล แพร และกาแฟ

2.6.3 Flavonoids เปนกลมส าคญของ Phenolic compounds ไดแก สารทมสตรโครงสรางเปน C6-C3-C6 แยกยอยออกไดเปนหลายกลม ไดแก Catechins, Proanthocyanins, Anthocyanidines, Flavones, Flavovols, Flavonones และ Isoflavones จากการทพบ Flavonoid อยางกวางขวาง ทงพช ผกและผลไม รวมทงเครองดมทเตรยมจากพช เชน ชา พบวาในใบชาจะม Catechins อยถง 30% ของน าหนกแหง และเชอวาเปนสารส าคญในการออกฤทธตานอนมลอสระและ Chemoprevention โดย Anthocyanins เปนสารทมสในพช สวนกลม Flavones, Flavonols และ Isoflavones พบไดทวไปและเชอวาเปนสารทมประโยชนตอรางกาย

16

ตารางท 2-1 โครงสรางของสารประกอบฟนอลกลมตาง ๆ

Class Basic skeleton Sample

Simple phenols

C6

OH

Phenol

Phenolic acid

C6-C1

COOH

HO

HO

HOGallic acid

Phenylpropenes

C6-C3

OH

OH3CO

HOFerulic acid

Flavonoids

C6-C3-C6

O

OHOH

HO

OQuercetin

OHOH

สารประกอบฟนอลก (Phenolic compounds) เปนสารทถกสรางขนเพอใชประโยชนใน

การเจรญเตบโตและการขยายพนธของพชแตละชนด ดงนนรปแบบของสารประกอบฟนอล ในพชแตละชนดจงมความแตกตางกนไป ปจจบนพบวามสารประกอบฟนอลททราบโครงสรางแนนอนแลวมากกวา 8000 ชนด ตงแตกลมทมโครงสรางอยางงาย เชน กรดฟนอลก (Phenolic acids) ไปจนถงกลมทมโครงสรางเปนโพลเมอร เชน ลกนน (Lignins) โครงสรางพนฐานของสารประกอบฟนอลกจะเกดจากการรวมตวของโมเลกลน าตาลตงแต 1 โมเลกลขนไปกบหมไฮดรอกซล

17

(OH-group) โดยน าตาลดงกลาว อาจเปนน าตาลโมเลกลเดยว (Monosaccharides) น าตาลโมเลกลค (Disaccharides) หรอ โอลโกแซคคาไรด (Oligosaccharides) กได น าตาลชนดทพบมากทสดในโมเลกลของสารประกอบฟนอลก คอ กลโคส (Glucose) นอกจากนยงพบวาอาจมการรวมตวกนระหวางสารประกอบฟนอลกดวยกนเอง หรอสารประกอบฟนอลกกบสารประกอบอน ๆ เชน กรดคารบอกซลก (Carboxylic acids) กรดอนทรย (Organic acids) เอมน (Amines) และไขมน ปจจบนสารประกอบฟนอลกไดรบความสนใจในฤทธตานออกซเดชน (Antioxidation) และฤทธตานการกลายพนธ (Antimutagenic activity) ทเกดจากอนมลอสระ (Free radicals) และการใชสารประกอบฟนอลกในการปองกนโรคตาง ๆ โดยเฉพาะ โรคหวใจขาดเลอด และมะเรง โดยสารประกอบฟนอลกจะท าหนา ทก าจดอนมลอสระและไอออนของโลหะทสามารถเรง การเกดปฏกรยาออกซเดชนของไขมนและโมเลกลอน ๆ ดวยการใหอะตอมไฮโดรเจนแกอนมลอสระอยางรวดเรว ดงปฏกรยาตอไปน

ROO + PPH ROOH + PP

RO + PPH ROH + PP เมอ RO ,ROO คอ Free radicals, PPH คอ Polyphenolic Compounds

เมอสารประกอบฟนอลกใหอะตอมไฮโดรเจนแกอนมลอสระไปแลว อนมลอสระของสารประกอบฟนอลกจะคอนขางมเสถยรภาพ ดงนนจงไมท าปฏกรยาอนตอไป ยงไปกวานนอนมลอสระของสารประกอบฟนอลบางชนดยงคงสามารถรวมตวกบอนมลอสระอนไดดวย จงท าใหสารประกอบฟนอลกเหลานนลดจ านวนอนมลอสระลงไดถง 2 เทา ดงปฏกรยาตอไปน

ROO + PP ROOPP

RO + PP ROPP

สารประกอบฟนอลกทมคณสมบตเปนสารตานออกซเดชนนน สามารถพบไดในสวนตาง ๆ ของพช เชน เมลด (ไดแก ถวเหลอง ถวลสง เมลดฝาย ขาว และงา) ผล (ไดแก องน สม และพรกไทยด า) ใบ (ไดแก ชา และเครองเทศตาง ๆ) ดอก (ไดแก กลวยไม) และสวนอน ๆ (ไดแก มนเทศ และหวหอม) สารประกอบฟนอลกทเปนทรจกกนด คอ Flavonoids และ Cinnamic acid derivatives

18

โดยสามารถพบไดในเกอบทกสวนของพช แตจะมความแตกตางกนในดานของชนดและปรมาณ (วรพร ศลศร, 2554) 2.7 ฤทธยบยงเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวาน กระบวนการเกดโรคเบาหวานนนจะเกยวของกบเอนไซม 2 ชนด คอ เอนไซมแอลฟา- กลโคสเดส และ เอนไซมแอลฟา-อะไมเลสซงท าหนาทในกระบวนการยอยแปง (Polysaccharide) ใหกลายเปนน าตาลกลโคส ดงนนถาสามารถยบย งเอนไซมดงกลาวได กระบวนการเปลยนแปลงขางตนจะเกดขนไดนอย ท าใหสามารถรกษาระดบน าตาลในเลอดของผปวยโรคเบาหวานได เอนไซมแอลฟากลโคซ เดสเปนเอนไซมท มความส าคญตอการยอยแปงและคารโบไฮเดรตใหเปนน าตาลโมเลกลเดยว ดงสมการท 1 ดงนนในผปวยโรคเบาหวานการยบย งการท างานของเอนไซมแอลฟากลโคซเดสชวยลดระดบน าตาลในเลอดลงได (วมลพรรณ รงพรม และคณะ, 2552)

ภาพท 2-12 ปฏกรยาไฮโดรไลซสของเอนไซมแอลฟา-กลโคสดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส การศกษาฤทธการยบย งเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวาน ของสารทสกดไดจากสมนไพรนน จะใชเทคนคทางสเปกโทรสโกป เพอตดตามปฏกรยาไฮโดรไลซสารตงตนไปเปนผลตภณฑดงปฎกรยา p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (PNP-G) เปนสารละลายไมมส ท าหนาทเปนซบสเตรตในปฏกรยา เมอมเอนไซมแอลฟากลโคซเดส จะถกไฮโดรไลซไปเปน p-nitrophenol ซงเปนสารละลายใสสเหลอง และน าตาลกลโคส ดงภาพท 2-12 ซงสามารถตรวจสอบ

O

OO

OO

HO

HOHO

OH

HO

HO

OH

OH

O

HO

HO

O

OO

O

HO

HOHO

OH

HO

HO

OH

O

OH

HO

HOHO

OH

-glucosidase

หรอ -amylase

19

ผลตภณฑทเกดขนโดยใชเทคนค UV-Visible spectroscopy โดยวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 405 นาโนเมตร (Kim, Wang, and Lee, 2004) ถาการทดลองใหคาการดดกลนแสงมากแสดงวาไมสามารถยบย งการท างานของเอนไซมได แตถาการทดลองใหคาการดดกลนแสงนอยแสดงวาสามารถยบย งการท างานของเอนไซมไดอยางมประสทธภาพ (ปนดดา ทนบตร และจนดารตน พมพสมาน, 2554) ยาทสามารถยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดสในปจจบนไดแก acarbose,

miglitol และ vogilbose เปนตน แตพบวายาเหลานอาจมผลตอผปวยโรคเบาหวาน ท าใหมอาการทองอด ทองเฟอ และทองรวง จงไดมการน าพชสมนไพรมาใชในการบ าบดรกษาโรคเบาหวานมากขนในปจจบน

2.8 งานวจยทเกยวของ Kamiya et al (2001) ศกษาองคประกอบทางเคมของฝกปอบด (Helicteres isora Linn.) ในสวนสกดชนเมทานอล พบสารในกลม Flavonoid glucuronides 5 ชนด (1-5) ซงเปนสารทยงไมมรายงานมากอน 3 ชนดคอ isoscutellarein-4'-methyl ether 8-O- -D-glucuronide 6''-n-butyl ester (2), isoscutellarein 4'-methyl ether 8-O--D-glucuronide 2'',4-disulfate (4) และ isoscutellarein 8-O--D-glucuronide 2'',4''-disulfate (5) โดยโครงสรางทงหมดยนยนดวยเทคนคทางสเปคโทสโกป

O

O

HO

OH

OR1

OR3OHO OR2

R4OOCO 1: R1 = Me, R2= R3= R4= H

2: R1= Me, R2= R3= H, R4= n-Bu3: R1= Me, R2= SO3, R3= R4= H4: R1= Me, R2= R3= SO3, R4= H5: R1= H, R2= R3= SO3, R4= H

ภาพท 2-13 โครงสรางของ Flavonoid glucuronides (1-5)

Chakrabati et al (2002) ศกษาฤทธการตานเบาหวานในสตวทดลองโดยใชสวนสกดเอทานอลจากรากของปอบด (Helicteres isora L.) ศกษาโดยใหสวนสกดปรมาณ 300 mg/kg กบหน mice ทถกกระตนใหเปนเบาหวานดวยวธ insulin resistant และ diabetic C57BL/KsJdb/db พบวาสารสกดชนเอทานอลจากรากปอบดสามารถมฤทธในการยบย งเบาหวานในสภาวะตาง ๆ เชน ลด

20

ปรมาณกลโคสในกระแสเลอด (plasma glucose level) ลดปรมาณไตรกลเซอไรด และลดระดบปรมาณของอนซลนไดอกดวย Kumar and Murugesan (2008) ศกษาผลของ hypolipidaemic จากสวนสกดชนน า (H2O) ของเปลอกตนปอบด (Helicteres isora L.) ดวยวธ streptozotocin (STZ)-induced ในหน rat เมอใหสารสกดจากเปลอกตนปอบดปรมาณ 100 และ 200 mg/kg เปนเวลา 21 วน พบวาปรมาณ cholesterol, phospholipid, กรดไขมนอสระ และ triglycerides ของหน rat ลดลง Nagappa, Thakurdesai, Rao, and Singh (2003) ศกษาฤทธตานเบาหวานจากสวนสกดปโตรเลยมอเทอร, เมทานอล และน า ของผลตนหกวาง (Terminalia catappa L.) ตอระดบน าตาลในเลอด และสารชวเคมตาง ๆ ในน าเลอด ดวยวธ alloxan induced diabetic rats พบวาระดบของ cholesterol, triglycerides, creatinine, urea และ alkaline phosphatase ในเลอดของหนทดลองทไดรบสารสกดจากผลหกวางมระดบลดลงเมอเปรยบเทยบกบหนทถกเหนยวน าใหเปนเบาหวาน Chyau, Ko, and Mau (2006) ศกษาสมบตตานอนมลอสระของสวนสกดชนน าของใบหกวาง (Terminalia catappa L.) ในสภาวะตาง ๆ กนคอ ใบสเขยว, ใบสเหลองทรวง และใบสแดงทรวง พบวาสารสกดชนน าจากใบหกวางทง 3 ชนดแสดงฤทธตานอนมลอสระดวยวธการตาง ๆ ทด และมฤทธปานกลางส าหรบการทดสอบดวยวธ hydroxyl radicals scavenging ทระดบความเขมขน 1 mg/mL รวมทงศกษาองคประกอบทางเคมของสารในสวนสกดชนน าดวยวธ Gas chromatography mass spectrometry พบสารในกลมฟนอลก 6 ชนด ไดแก p-hydroxybenzoic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, gallic acid, m-coumaric acid, p-coumaric acid และ 4-hydroxyphenylpropionic acid

HO

OH

O

HO

OH

O

OH

OHO

HOOH

OH

O

OH

O

HO

HOOH

HO OH

O

p -hydroxybenzoic acid

4-hydroxyphenylpropionic acidm-coumaric acid

3,4-dihydroxybenzoic acid

p -coumaric acid

gallic acid

ภาพท 2-14 โครงสรางสารประกอบในกลมฟนอลกทพบในสารสกดชนน าจากใบหกวาง

21

Ghaisas et al. (2009) ศกษาฤทธตานเบาหวานดวยวธ dexamethasone-induced insulin resistance in mice ของสารสกดชนเอทานอล จากเปลอกตนสก (Tectona grandis L.) พบวาระดบน าตาลและระดบไตรกลเซอไรดในเลอดของหนทดลองมระดบลดลง รวมทงสารสกดดงกลาวยงท าใหปรมาณของเอนไซมทชวยตานอนมลอสระ คอ GSH (reduced glutathione), SOD (superoxide dismultase) และ catalase เพมขนและสามารถลดระดบของ LPO (lipid peroxidation) ในเลอดของหนทดลองไดอกดวย Ramachandran, Rajasekaran, and Kumar (2011) ศกษาฤทธตานเบาหวาน,ความสามารถในการลดไขมน, และประสทธภาพในการตานอนมลอสระของสวนสกดชนเมทานอลจากดอกสก (Tectona grandis L.) ดวยวธ streptozotocin (STZ) induced พบวาสารสกดชนเมทานอล ทความเขมขน 100 และ 200 mg/mL สามารถลดระดบน าตาลในเลอดของหนดวยวธการทดสอบแบบ Oral glucose tolerance test (OGTT) และ streptozotocin (STZ) induced รวมทงเพมน าหนกตวของหน, เพมระดบอนซลนในน าเลอด, เพมปรมาณเมดเลอดแดง และเพมระดบโปรตนโดยรวมในหนททดสอบอกดวย Ruan, Lam, Lee, and Su (2013) ศกษาฤทธตานเบาหวานโดยดผลของ hypoglycemic ในหน mice ของสาร Borapetoside A ซงแยกไดมาจากเถาของตนบอระเพด (Tinospora crispa (L.) Hook.f. & Thomson) พบวา Borapetoside A ท าใหเพมปรมาณของ glycogen และลดระดบน าตาลในเลอด (plasma glucose) ดวยการทดสอบท าวธ dose dependent manner in vitro และ dose dependent manner in vivo และเมอเปรยบเทยบการออกฤทธทางชวภาพกบความสมพนธจากโครงสรางของ Borapetoside A, B, C พบวาเสตอรโอเคมต าแหนงท 8 ของ Borapetoside A และ Borapetoside C มผลตอการออกฤทธตานเบาหวาน

O

OH

H

H

O

O

Borapetoside A

OO

O

O

HO

HO

OHHO

OH

H

O

O

Borapetoside B

HO

OH3CO OO

HO

OH

OH

HO

OH

H

O

O

Borapetoside C

OH3CO OO

HO

OH

OH

HO

ภาพท 2-15 โครงสรางของสารประกอบทแยกไดจากสารสกดจากเถาบอระเพด

22

Chang, Ho, and Lee (2015) ศกษาองคประกอบทางเคมจากสวนสกดหยาบเอทานอลของใบบอระเพดพบสาร acylated glycosylflavonoids ชนดใหม 4 สารไดแก (11, 13, 14 และ 20) โดยโครงสรางทงหมดยนยนดวยเทคนคทางสเปกโทสโคป นอกจากนยงน าสารทแยกไดไปทดสอบฤทธยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดส พบวาสาร isovitexin 2''-(E)-p-coumarate (13) มฤทธในการยบย ง (IC50 = 4.3 + 1.4 M) ดงตารางท 2-2

O

OOH

OHOHO

HO

OR1

R2OH

A C

B3'

133"

5"1"

6

O

OOH

R2OHR1

HO 8

6 R1=H, R2=OH 7 R1=glc, R2=OH, R3=H 8 R1=R2=H 17 R1=R2=H, R3=H 11 R1=(E)- sinipic acid, R2=OH 19 R1=H, R2=OMe, R3=H 12 R1=(E)-p- coumaric acid, R2=OH 21 R1=H, R2=OH, R3=glc

13 R1=(E)-p- coumaric acid, R2=H 22 R1=R3=H, R2=OH

O

OOH

OH

OO

OH

RO

HOHO7

6"

O

OOH

OH

OO

OH

RO

HOHO

6"OH

glc(R=H) ภาพท 2-16 โครงสรางของสารประกอบในกลมฟลาโวนอยดทพบในสวนสกดหยาบเอทานอลจาก ใบบอระเพด

10 R=H

14 R=(E)-ferulic acid 15 R=(E)-p-coumaric acid

16 R=(Z)-p- coumaric acid

20 R=(E)-p- coumaric acid

9 R=H

18 R=(E)-sinipic acid

23

ตารางท 2-2 ความสามารถในการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส ของสารสกดจากใบบอระเพด

Compound IC50 (M) 6 1525.7+3.7 8 61.2 +2.5

12 35.7 +5.7 13 4.3 +1.4 14 8.8 +2.9 15 14.6 +4.8 16 10.1+3.5 17 34.6+3.9 20 11.3+2.0 22 86.1+4.3

Acarbose 0.033+0.006

บทท 3 วธด ำเนนกำรวจย

3.1 เครองมอ อปกรณ และสำรเคม 3.3.1 เครองมอและอปกรณ

1. เครองระเหยสารแบบหมนภายใตสญญากาศ (Rotary evaporator) บรษท Buchi รน R-3 2. เครองชงไฟฟาทศนยม 2 และ 4 ต าแหนง บรษท Mettler รน AE200 3. เครอง UV-Vis spectrophotometer บรษท Thermo Scientific รน Genesys 20 4. เครององน า (Water bath) บรษท Heto DT Hetrotherm 5. เครองผสมสารละลาย (vortex mixer) บรษท Wisemix รน VM-10 6. เครองดดจายสารละลายปเปต ( Micropipette) บรษท eppendorf 7. เครองวดคาการดดกลนแสงของสารละลายในไมโครเพลท (Microplate

Reader) บรษท Biotek รน EPOCH-2 microplate reader 8. เครองเขยา 96 well plate บรษท Oragon Lab รน MX-M 9. เครองวดพเอช (pH-meter) บรษท Mettler toledo 10. จานหลม (96-well plate) 11. ไมโครปเปตทป (Micropipette tip) 12. บกเกอร (Beaker) 13. กระบอกตวง (Cylinder) 14. ขวดรปชมพ (Erlenmeyer Flask) 15. กรวยแกว (Glass funnel) 16. ขวดกนกลม (Round bottom flask) 17. ขวดวดปรมาตร (Volumetric flask) 18. ขวดบรรจสารขนาดเลก (vial) 19. แทงแกวคนสาร (Stirring rod) 20. หลอดทดลอง (Test tube) 21. หลอดหยด (Dropper) 22. กระดาษฟอยด (Foil)

25

23. ชอนตกสาร (Spatula) 24. ทตงหลอดทดลองสแตนเลส (Stainless Test Tube Stand) 25. สามขา (Tripod) 26. หมอสแตนเลส

3.3.2 สำรเคม 1. น ากลน (Distilled water) 2. เอทานอล (Ethanol, C2H5OH) 3. เมทานอล (Methanol, CH3OH) 4. คลอโรฟอรม (Chloroform, CHCl3) 5. กรดซลฟวรก (Sulfuric acid, H2SO4) 6. กรดไฮโดรคลอรก (Hydrochloric acid, HCl) 7. กรดแกลเชยลแอซตก (Glacial acetic acid, CH3COOH) 8. แอมโมเนย (Ammonia, NH3) 9. โซเดยมคารบอเนต (Sodium carbonate, Na2CO3) No.A463-500 G, Univar 10. โซเดยมไฮดรอกไซด (Sodium hydroxide, NaOH) No.480507, Carlo erba 11. โซเดยมฟอสเฟต (sodium phosphate tribasic dodecahydrate, Na3PO4.12H2O)

No. 10101-89-0, Sigma-Aldrich 12. โซเดยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต มอโนไฮเดรต (Sodium Dihydrogen

Phosphate Monohydrate, NaH2PO4.H2O) No.10049-21-5, Merck 13. ไดโซเดยม ไฮโดรเจน ฟอสเฟต (di-Sodium hydrogen phosphate, Na2HPO4)

No. 7558-79-4, Merck 14. เฟอรกคลอไรด (Ferric chloride, FeCl3) No.803945, Merck-Schuchardt 15. อะลมเนยมไตรคลอไรด (Aluminium trichloride, AlCl3) No.801081, Merck-

Schuchardt 16. แอมโมเนยมโมลบเดต (Ammonium molybdate, (NH4)6Mo7O24.4H2O)

No.0716-01, Baker Analyzed 17. ลวดแมกนเซยม (Mg ribbon) 18. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) No.43180, Fluka 19. กรดแกลลก (Gallic acid) No.48630, Fluka 20. วตามนซ (Ascorbic acid) No.1.00127.0100, Merck

26

21. เคอรซตน (Quercetin) No.33795-1, Aldrich 22. อคารโบส (Acarbose) No.P500253, Fluka 23. น ายาทดสอบดราเจนดอรฟ (Dragendroff’s reagent) 24. น ายาทดสอบ ฟอลน ซโอแคลต (Folin-Ciocalteu reagent) No.463562,

Carlo erba 25. เอนไซมแอลฟา-กลโคซเดส (-glucosidase) No.G0660-750 (U.N), Sigma-

Aldrich, -glucosidase from Saccharomyces cerevisiae 26. เอนไซมแอลฟาอะไมเลส (-amylase) No.10065-10G, Sigma-Aldrich,

-Amylase from Aspergillus oryzae 27. p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (PNP-G) No.N1377-1G, Sigma

Aldrich 28. 2-chloro-4-nitrophynyl--D-maltotrioside No.93834-100MG, Sigma

Aldrich

27

3.2 แผนกำรด ำเนนกำรวจย

ภาพท 3-1 แผนผงขนตอนการท าวจย

การตรวจสอบสารพฤกษเคมเบองตน

เกบและเตรยมตวอยางพช

ทดสอบฤทธทางชวภาพ

แอลคาลอยด

ฟลาโวนอยด

แอทราควโนน

คมารน

ซาโปนน

แทนนน

โพบาแทนนน

เทอรปนอยด

สเตยรอยด

คารดแอกไกลโคไซด

ท าการสกดดวยตวท าละลายเอทานอล

สารสกดหยาบเอทานอลของพชทง 4 ชนด

ฝกปอบด ใบสก ใบหกวาง เถาบอระเพด

หาปรมาณฟนอลกทงหมด

หาปรมาณฟลาโวนอยดทงหมด

หาปรมาณการตานอนมลอสระทงหมด

ทดสอบฤทธตานอนมลอสระ

หาปรมาณการตานอนมลอสระทงหมด ทดสอบฤทธตานเบาหวาน

หาปรมาณการตานอนมลอสระทงหมด

28

3.3 วธด ำเนนกำรวจย 3.3.1 กำรเกบตวอยำงพช

1. ฝกปอบด เกบจากจงหวดกาญจนบร ในชวงเดอน มนาคม 2557 2. ใบหกวาง เกบจากคณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา อ าเภอเมอง จงหวด

ชลบร โดยเลอกใบสดทอยบนตน ในชวงเดอน มนาคม 2557 3. ใบสก เกบจากต าบลดานทบตะโก อ าเภอจอมบง จงหวดราชบร โดยเลอกใบ

สดทอยบนตน ในชวงเดอน พฤศจกายน 2557 4. เถาบอระเพด เกบจากต าบลดานทบตะโก อ าเภอจอมบง จงหวดราชบร ในชวง

เดอน พฤศจกายน 2557

3.3.2 วธกำรสกดสำรตวอยำง 1. น าตวอยางพชทง 4 ชนด ไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด

มาบดใหละเอยดดวยเครองปน โดยท าการแยกบดพชตวอยางทละชนด และน าสวนทบดละเอยดมาชงใหทราบน าหนกทแนนอน

2. น าพชตวอยางแตละชนดทบดละเอยดจากขอ 1. สกดดวยเอทานอล 95% ดวยวธการแชหมก (Maceration) ทอณหภมหอง เปนเวลา 2 สปดาห

3. น าสารละลายของสวนสกดจากพชตวอยางทง 4 ชนด มากรองผานส าล 4. น าสารละลายของสวนสกดจากพชตวอยางทง 4 ชนด มาระเหยตวท าละลาย

ออกดวยเครองระเหยแบบหมน (Rotary evaporator) ไดสารสกดหยาบชนเอทานอล 5. น าสารสกดหยาบชนเอทานอลทสกดไดของพชแตละชนดไปตรวจสอบสาร

ทางพฤกษเคม และทดสอบฤทธทางชวภาพ

3.3.3 กำรตรวจสอบสำรพฤกษเคมเบองตน (Phytochemical Screening)

การตรวจสอบสารพฤษเคมเบองตนของสารสกดหยาบเอทานอลจากฝกปอบด (Helicteres isora L.), ใบหกวาง (Terminalia catappa L.), ใบสก (Tectona grandis L.) และเถาบอระเพด (Tinospora crispa (L.) Hook. f. & Thomson) แบงการทดสอบสารทตยภม (Secondary metabolites) ออกเปน 10 กลม ไดแก แอลคาลอยด ฟลาโวนอยด แอนทราควโนน คมารน ซาโปนน แทนนน โฟลบาแทนนน เทอรพนอยด สเตอรรอยด และคารดแอกไกลโคไซด โดยอาศยปฏกรยาการเกดสหรอตะกอน (Ayoola et al, 2008; Sazada et al, 2009; and Shyam-Krishnan et al, 2013) ดงน

29

1. การตรวจสอบแอลคาลอยด (Alkaloids) ชงสารสกด 0.2 กรม เตมสารละลาย 10% H2SO4 ปรมาตร 1.0 มลลลตร เขยา น าไปอนบนเครององน า (water bath) 5 นาท กรองสวนทไมละลายออก แลวปลอยใหสารละลายเยนลงทอณหภมหอง น าของเหลวทไดจากการกรอง (Filtrate) ไปหยดสารละลายดราเจนดอรฟ (Dragendorff’s reagent) จ านวน 5 หยด เขยา ถาปรากฏตะกอนสสมแดงแสดงวาพบแอลคาลอยด

2. การตรวจสอบฟลาโวนอยด (Flavonoids) ชงสารสกด 0.2 กรม ละลายดวย 50% เอทานอล ปรมาตร 1.0 มลลลตร เขยา กรองสวนทไมละลายออก น าของเหลวทไดจากการกรอง (Filtrate) ใสลวดแมกนเซยมชนเลก ๆ ลงไป 1 ชน และหยดกรดไฮโดรคลอรกเขมขน (conc. HCl) จ านวน 5 หยด เขยา แลวน าไปอนบนเครอง องน า (water bath) 5 นาท ถาสารละลายเปลยนเปนสเหลองเขมแสดงวาพบฟลาโวนอยด

3. การตรวจสอบแอนทราควโนน (Anthraquinones) ชงสารสกด 0.2 กรม เตมสารละลาย 10% H2SO4 ปรมาตร 1.0 มลลลตร เขยา น าไปอนบนเครององน า (water bath) 5 นาท กรองสวนทไมละลายออก แลวปลอยใหสารละลายเยนลงทอณหภมหอง น าของเหลวทไดจากการกรอง (Filtrate) ไปเตมสารละลายแอมโมเนย (10% NH3) ปรมาตร 0.5 มลลลตร เขยา ถาปรากฏสารละลายเปนสชมพแดงเกดขนแสดงวาพบ แอนทราควโนน

4. การตรวจสอบคมารน (Coumarin) ชงสารสกด 0.2 กรม ละลายดวย 50% เอทานอล ปรมาตร 1.0 มลลลตร เขยา กรองสวนทไมละลายออก น าของเหลวทไดจากการกรอง (Filtrate) เตมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (6M NaOH) ปรมาตร 1.0 มลลลตรเขยา ถาสารละลายเปลยนเปนสเหลองเขมแสดงวาพบ คมารน

5. การตรวจสอบซาโปนน (Saponins) ใชการทดสอบแบบการเกดฟอง โดยชงสารสกด 0.2 กรม เตมน ากลน ปรมาตร

5.0 มลลลตร น าไปอนบนเครององน า (water bath) 5 นาท เขยาอยางแรง ถาปรากฏฟองถาวรเกดขนในหลอดทดลองแสดงวาพบซาโปนน

6. การตรวจสอบแทนนน (Tannins) ชงสารสกด 0.2 กรม เตมน ากลน ปรมาตร 1.0 มลลลตร น าไปอนบนเครององ

น า (water bath) 5 นาท กรองสวนทไมละลายออก น าของเหลวทไดจากการกรอง (Filtrate) เตมสารละลายเฟอรกคลอไรด (1% FeCl3) จ านวน 5 หยด เขยา ถาปรากฏสารละลายเปนสเขยวด าหรอน าเงนด าแสดงวาพบแทนนน

30

7. การตรวจสอบโฟลบาแทนนน (Phlobatannins) ชงสารสกด 0.2 กรม เตมน ากลน ปรมาตร 1.0 มลลลตร น าไปอนบนเครององ

น า (water bath) 5 นาท กรองสวนทไมละลายออก น าของเหลวทไดจากการกรอง (Filtrate) เตมสารละลายกรดไฮโดรคลอรก (10% HCl) จ านวน 5 หยด เขยา แลวน าไปอนบนเครองอางน า 5 นาท ถาปรากฏสารละลายเปนสเขยวด าหรอน าเงนด าแสดงวาพบโพลบาแทนนน

8. การตรวจสอบเทอรปนอยด (Terpenoids) ชงสารสกด 0.2 กรม ละลายดวยคลอโรฟอรม ปรมาตร 1.0 มลลลตร เขยา

กรองสวนทไมละลายออก น าของเหลวทไดจากการกรอง (Filtrate) คอย ๆ เตมกรดซลฟวรกเขมขน (conc. H2SO4) ปรมาตร 0.5 มลลลตร ลงไป ถาปรากฏวงแหวนสน าตาลตรงรอยตอระหวางชนของสารสกดกบกรดซลฟวรกแสดงวาพบเทอรปนอยด

9. การตรวจสอบสเตยรอยด (Steroids) ชงสารสกด 0.2 กรม ละลายดวยคลอโรฟอรม ปรมาตร 1.0 มลลลตร เขยา

กรองสวนทไมละลายออก น าของเหลวทไดจากการกรอง (Filtrate) เตมกรดแกลเชยลแอซตก (Glacial acetic acid) ปรมาตร 0.5 มลลลตร เขยา แลวเตมกรดซลฟวรกเขมขน (conc. H2SO4) จ านวน 3 หยด ถาปรากฏสารละลายเปนสน าเงนหรอน าเงนเขยวแสดงวาพบสเตยรอยด

10. การตรวจสอบคารดแอคไกลโคไซด (Cardiac glycosides) ชงสารสกด 0.2 กรม ละลายดวยคลอโรฟอรม ปรมาตร 1.0 มลลลตร เขยา

กรองสวนทไมละลายออก น าของเหลวทไดจากการกรอง (Filtrate) เตมสารละลายเฟอรกคลอไรด (1% FeCl3) จ านวน 5 หยด เขยา เตมกรดแกลเชยลแอซตก (Glacial acetic acid) จ านวน 5 หยด เขยา และคอย ๆ เตมกรดซลฟวรกเขมขน (conc. H2SO4) ปรมาตร 0.5 มลลลตร ลงไป ถาปรากฏวงแหวนสน าตาลตรงรอยตอระหวางชนของสารสกดกบกรดซลฟวรกแสดงวาพบคารดแอคไกลโคไซด

3.3.4 กำรหำปรมำณฟนอลกรวม (Total Phenolic Content)

การหาปรมาณฟนอลกรวมดวยวธ Folin-Ciocalteu colorimetric เปนวธทดดแปลงจาก Majhenic, Skerget, and Knez (2007) ใชกรดแกลลก (gallic acid) เปนสารมาตรฐาน มหลกการคอ สารประกอบฟนอลกทงหมดจะท าปฏกรยากบ Folin-Ciocalteu reagent ซงประกอบดวย phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents สารดงกลาวจะถกรดวซโดย phenolic hydroxyl groups ของสารประกอบฟนอลกทงหมดเกดเปน tungsten และ molybdenum blue ซงใหสน าเงนและดดกลนแสงทความยาวคลน 760 นาโนเมตร

31

โดยผสมสารละลายมาตรฐานกรดแกลลก (ความเขมขน 0.1-0.0001 mg/mL) หรอสารตวอยางทตองการทดสอบ ปรมาตร 0.3 มลลลตร กบสารละลาย Folin-Ciocalteu reagent ความเขมขน 10% (v/v) ปรมาตร 0.7 มลลลตร ใหเขากน บมทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท จากนนเตมสารละลายโซเดยมคารบอเนต (Na2CO3) ความเขมขน 2.5% (w/v) ปรมาตร 1.0 มลลลตร เขยาใหเขากน บมทอณหภมหองเปนเวลา 20 นาท วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 760 nm ดวยเครอง UV-Vis spectrophotometer ท าการทดลองทงหมด 3 ซ า และหาปรมาณฟนอลกทงหมดของสารตวอยางจากกราฟมาตรฐานกรดแกลลก ในหนวยมลลกรมสมมลของกรดแกลลก ตอน าหนกสารสกดแหง 1 กรม (Gallic acid equivalents, mg GAE/g dried extract)

3.3.5 กำรหำปรมำณฟลำโวนอยดรวม (Total Flavonoids Content)

การหาปรมาณฟลาโวนอยดทงหมดดวยวธ Aluminium trichloride (AlCl3) colorimetric เปนวธทดดแปลงจาก Arvouet-Grand, Vennat, Pourrat, and Legret (1994) โดยใชเคอรซตน (quercetin) เปนสารมาตรฐาน มหลกการคอ สารประกอบฟลาโวนอยดทงหมดจะใช phenolic hydroxyl groups ท าปฏกรยากบ AlCl3 เกดเปนสารประกอบเชงซอนทมสเหลองและดดกลนแสงทความยาวคลน 415 นาโนเมตร

โดยผสมสารละลายมาตรฐานเคอรซตน (ความเขมขน 0.1-0.0001 mg/mL) หรอสารตวอยางทตองการทดสอบ ปรมาตร 0.3 มลลลตร กบสารละลายอะลมเนยมไตรคลอไรด (AlCl3 reagent) ความเขมขน 1.0% (w/v) ปรมาตร 1.7 มลลลตร ใหเขากน บมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 415 นาโนเมตร ดวยเครอง UV-Vis spectrophotometer ท าการทดลองทงหมด 3 ซ า และหาปรมาณฟลาโวนอยดท งหมดของสารตวอยางจากกราฟมาตรฐานเคอรซตน ในหนวยมลลกรมสมมลของเคอรซตนตอน าหนกสารสกดแหง 1 กรม (Quercetin equivalents, mg QE/g dried extract)

3.3.6 กำรหำปรมำณสำรตำนอนมลอสระรวม (Total Antioxidant Capacity) การหาปรมาณสารตานอนมลอสระทงหมดดวยวธ Phosphomolybdate colorimetric

เปนวธทดดแปลงจาก Prieto, Pineda, and Aguilar (1999) โดยใชวตามนซ (L-ascorbic acid) เปนสารมาตรฐาน มหลกการคอ สารตานอนมลอสระทงหมดจะท าปฏกรยากบ Phosphomolybdate reagent สารดงกลาวจะถกรดวซโดย phenolic hydroxyl groups ของสารตานอนมลอสระทงหมดเกดเปน molybdenum blue ซงใหสน าเงนและดดกลนแสงทความยาวคลน 695 นาโนเมตร

32

โดยผสมสารละลายมาตรฐานวตามนซ (ความเขมขน 0.5-0.01 mg/mL) หรอสารตวอยางทตองการทดสอบ ปรมาตร 0.2 มลลลตร กบสารละลาย Phosphomolybdate reagent ปรมาตร 1.8 มลลลตร ใหเขากน บมบนเครององน า (water bath) ทอณหภม 78 C เปนเวลา 30 นาท วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 695 นาโนเมตร ดวยเครอง UV-Vis spectrophotometer ท าการทดลองทงหมด 3 ซ า และหาปรมาณสารตานอนมลอสระทงหมดของสารตวอยางจากกราฟมาตรฐานวตามนซ ในหนวยมลลกรมสมมลของวตามนซตอน าหนกสารสกดแหง 1 กรม (Ascorbic acid equivalents, mg AE/g dried extract)

3.3.7 กำรทดสอบฤทธตำนอนมลอสระ โดยวธ DPPH radical scavenging การทดสอบฤทธตานอนมลอสระดวยวธ DPPH radical scavenging เปนวธท

ดดแปลงจาก Braca, Sortino, Politi, Morelli, and Mendez (2002) โดยใชกรดแกลลก (gallic acid) เคอรซตน (quercetin) และวตามนซ (L-ascorbic acid) เปนสารมาตรฐาน มหลกการคอสารละลาย 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) จะเปนสารละลายสมวงและดดกลนแสงทความยาวคลน 517 นาโนเมตร เมออนมลอสระ DPPH ท าปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ (Antioxidant) จะท าใหสารละลายสมวงของ DPPH จางลงจนเปนสารละลายสเหลองออนและไมดดกลนแสงทความยาวคลน 517 นาโนเมตร

โดยผสมสารละลายมาตรฐาน (ความเขมขนเรมตน 0.02 mg/mL) หรอสารตวอยางทตองการทดสอบ (ความเขมขนเรมตน 5.0 mg/mL) ปรมาตร 0.2 มลลลตร กบสารละลาย DPPH ทละลายในตวท าละลายเมทานอล ความเขมขน 0.05 mM ปรมาตร 1.8 มลลลตร ใหเขากน บมทอณหภมหองในทมด เปนเวลา 30 นาท วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 517 นาโนเมตร ดวยเครอง UV-Vis spectrophotometer ท าการทดลองทงหมด 3 ซ า และค านวณหาคารอยละของการตานอนมลอสระ (% DPPH radical inhibition) จากสตรดงตอไปน

% DPPH radical inhibition = [(A-B)/A] × 100

เมอ A คอ คาการดดกลนแสงของสารละลาย DPPH ทไมมสารทดสอบ B คอ คาการดดกลนแสงของสารละลาย DPPH ทมสารทดสอบ

33

3.3.8 กำรทดสอบฤทธกำรยบยงเอนไซมแอลฟำ-กลโคซเดส (Anti--glucosidase assay) การทดสอบฤทธการย บย งเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดสดวยวธ p-nitrophenol

colorimetric เปนวธทดดแปลงจาก Matsui, Yoshimoto, Osajima, Oki, and Osajima (1996) โดยใช อคารโบส (Acarbose) เปนสารมาตรฐาน มหลกการคอเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดสเปนเอนไซมซงอยบรเวณผนงเซลลของล าไสเลก ท าหนาทยอยแปงและคารโบไฮเดรตใหเปนน าตาลโมเลกลเดยวดวยปฏกรยาไฮโดรไลซสของเอนไซม ในการทดลองจะใช p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-G) เปนสารละลายใสไมมส ท าหนาทเปนสบสเตรทในปฏกรยา โดยเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดสจะท าปฏกรยาไฮโดรไลซสกบ PNP-G ไดเปนน าตาลกลโคส และ p-nitrophenol ซงเปนสารละลายใสสเหลองและดดกลนแสงทความยาวคลน 405 นาโนเมตร

โดยผสมสารละลายมาตรฐาน (ความเขมขนเรมตน 20.0 mg/mL) หรอสารตวอยางทตองการทดสอบ (ความเขมขนเรมตน 20.0 mg/mL) ปรมาตร 20 ไมโครลตร กบสารละลาย sodium phosphate buffer (pH 6.8) ความเขมขน 50 mM ปรมาตร 100 ไมโครลตร และสารละลายเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดส ความเขมขน 1.0 U/mL ใน sodium phosphate buffer (pH 6.8) ปรมาตร 20 ไมโครลตร ลงในจานหลม (96-well plate) บมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตมสารละลาย p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-G) ความเขมขน 2.0 mM ปรมาตร 20 ไมโครลตร ลงในแตละหลม เขยาใหเขากน บมทอณหภมหองตอเปนเวลา 5 นาท สดทายเตมสารละลายโซเดยม คารบอเนต (Na2CO3) ความเขมขน 1.0 mM ปรมาตร 40 ไมโครลตร แลววดการดดกลนแสงทความยาวคลน 405 นาโนเมตร ดวยเครอง Microplate Reader ค านวณหาคารอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดส (% α-glucosidase inhibition) จากสตร

% α-glucosidase inhibition = [(A-B)/A] × 100

เมอ A คอ คาการดดกลนแสงของสารละลายทไมมสารทดสอบ B คอ คาการดดกลนแสงของสารละลายทมสารทดสอบ

3.3.9 กำรทดสอบฤทธกำรยบยงเอนไซมแอลฟำ-อะไมเลส (Anti--amylase assay) การทดสอบฤทธการย บย ง เอนไซมแอลฟา-อะไมเลสดวยว ธ 2-chloro-4-

nitrophenol colorimetric เปนวธทดดแปลงจาก Gella et al (1997) โดยใช อคารโบส (Acarbose) เปนสารมาตรฐาน มหลกการคอเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสเปนเอนไซมซงพบไดในน าลายและตบออนมบทบาทในการยอยแปงเปนโอลโกแซคคาไรดและไดแซคคาไรดซงจะถกยอยตอในล าไสเลก

34

ปฏกรยาไฮโดรไลซสของเอนไซม ในการทดลองจะใช 2-chloro-4-nitrophenyl--D-maltatrioside (CNPG3) เปนสารละลายใสไมมส ท าหนาทเปนสบสเตรทในปฏกรยา โดยเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส จะท าปฏกรยาไฮโดรไลซสกบ CNPG3ไดเปนน าตาลกลโคส และ 2-chloro-4-nitrophenol (CNP) ซงเปนสารละลายใสสเหลองและดดกลนแสงทความยาวคลน 405 นาโนเมตร

โดยผสมสารละลายมาตรฐาน (ความเขมขนเรมตน 20.0 mg/mL) หรอสารตวอยางทตองการทดสอบ (ความเขมขนเรมตน 20.0 mg/mL) ปรมาตร 20 ไมโครลตร กบสารละลาย sodium phosphate buffer (pH 6.8) ความเขมขน 50 mM ปรมาตร 100 ไมโครลตร และสารละลายเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส ความเขมขน 300.0 U/mL ใน sodium phosphate buffer (pH 6.8) ปรมาตร 20 ไมโครลตร ลงในจานหลม (96-well plate) บมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท จากนนเตมสารละลาย 2-chloro-4-nitrophenyl--D-maltatrioside (CNPG3) ความเขมขน 2.0 mM ปรมาตร 20 ไมโครลตร ลงในแตละหลม เขยาใหเขากน บมทอณหภมหองตอเปนเวลา 10 นาท สดทายเตมสารละลายโซเดยม คารบอเนต (Na2CO3) ความเขมขน 1.0 mM ปรมาตร 40 ไมโครลตร แลววดการดดกลนแสงทความยาวคลน 405 นาโนเมตร ดวยเครอง Microplate Reader ค านวณหาคารอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% α-amylase inhibition) จากสตร

% α-amylase inhibition = [(A-B)/A] × 100

เมอ A คอ คาการดดกลนแสงของสารละลายทไมมสารทดสอบ B คอ คาการดดกลนแสงของสารละลายทมสารทดสอบ

บทท 4 ผลการทดลองและอภปราย

4.1 การสกดสารสกดจากพชสมนไพร จากการสกดสารสกดจากพชสมนไพรทง 4 ชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด โดยการแชหมก (Maceration) ดวยตวท าละลาย 95% เอทานอล และเมอระเหยตวท าละลายดวยเครองกลนระเหยแบบลดความดน (Rotary evaporator) จะไดเปนสารสกดหยาบ (Crude extract) ของสมนไพรทง 4 ชนดดงภาพท 4-1 โดยสารสกดดงกลาวมน าหนก รอยละผลผลต และลกษณะทางกายภาพแสดงดงตารางท 4-1

ตารางท 4-1 น าหนกสารสกดหยาบ รอยละผลผลต และลกษณะทางกายภาพ สารสกดชนเอทานอลของสมนไพรทใชรกษาโรคเบาหวาน

น าหนกสารสกด (กรม)

รอยละผลผลต ลกษณะของสารสกดทได

ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก เถาบอระเพด

69.50 111.92 75.13 159.43

3.58 5.47 11.51 8.38

ของเหลวขนหนดสน าตาลด า ของเหลวขนหนดสน าตาลด า ของเหลวขนหนดสน าตาลแดง ของเหลวขนหนดสน าตาลเขยว

ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก เถาบอระเพด ภาพท 4-1 ลกษณะทางกายภาพของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใช รกษาโรคเบาหวาน

36

4.2 การตรวจสอบสารพฤกษเคมเบองตน

การตรวจสอบสารพฤกษเคมเบองตนโดยอาศยปฏกรยาการเกดสหรอตะกอนของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน ไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด ไดผลดงตารางท 4-2 ตารางท 4-2 การตรวจสอบสารพฤกษเคมเบองตนของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทย บางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน

สารพฤกษเคม สารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรทใชรกษาโรคเบาหวาน

ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก เถาบอระเพด แอนทราควโนน

แอลคาลอยด ฟลาโวนอยด คมารน

แทนนน

โพรบาแทนนน ซาโปนน

สเตยรอยด เทอรพนอยด คารดแอกไกลโคไซด

- -

++ ++

+++ -

+++ +++ +++

-

- -

++ +++ +++

- -

+++ + -

+++ -

++ +++ +++

- -

+++ ++ -

- - + + - -

+++ +++ +++

-

หมายเหต - หมายถง ตรวจสอบไมพบ + หมายถง ตรวจสอบพบนอย ++ หมายถง ตรวจสอบพบปานกลาง +++ หมายถง ตรวจสอบพบมาก จากการทดสอบพฤษเคมเบองตน ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน ไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด พบสารพฤกษเคมทเหมอนกน แตพบในปรมาณมากนอยแตกตางกน ไดแก ฟลาโวนอยด คมารน สเตยรอยด และ

37 เทอรพนอยด สวนแทนนนจะพบในฝกปอบด ใบหกวาง และใบสก ซาโปนนพบในฝกปอบด และ เถาบอระเพด และแอนทราควโนนจะพบในใบสกเทานน สวนแอลคาลอยด โพรบาแทนนน และคารดแอกไกลโคไซด ตรวจไมพบในสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรทง 4 ชนด

4.3 การหาปรมาณฟนอลกรวม (Determination of Total Phenolic Content: TPC)โดยใชวธ Folin-Ciocalteu colorimetric การหาปรมาณฟนอลกรวมดวยวธ Folin-Ciocalteu colorimetric เปนวธทดดแปลงจาก Majhenic, Skerget, and Knez (2007) ซงใชกรดแกลลก (Gallic acid) เปนสารมาตรฐานพบวาไดกราฟมาตรฐานกรดแกลลกดงภาพท 4-2 (y = 0.0977x+0.1054, R2 = 0.9989)

y = 0.0977x + 0.1054R² = 0.9989

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

ค าการด

ดกลน

แสง ท

760 n

m

ความเขมขนของกรดแกลลก (g/mL)

ภาพท 4-2 กราฟมาตรฐานของสารละลายกรดแกลลก จากกราฟมาตรฐานกรดแกลลก สามารถน าไปค านวณหาปรมาณฟนอลกรวมของสารสกดหยาบชนเอทานอลของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน ไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด ไดผลดงภาพท 4-3 โดยรายงานในหนวยของมลลกรมสมบรณของกรดแกลลกตอน าหนกสารสกดแหง 1 กรม (mgGAE.g-1)

38

0.00

50.00

100.00

150.00

ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก เถาบอระเพด

31.33+ 0.82

121.20 + 3.06

67.45 + 1.35

8.02 +1.14

mg G

AE.g-

1

ภาพท 4-3 ปรมาณฟนอลกรวมของสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษา โรคเบาหวาน จากผลการหาปรมาณฟนอลกรวมของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน พบวาสารสกดหยาบชนเอทานอลของใบหกวางใหปรมาณฟนอลกรวมสงทสด (121.20+3.06 mgGAE.g-1) รองลงมาไดแกใบสก (67.45+1.35 mgGAE.g-1) ฝกปอบด (31.33+0.82 mgGAE.g-1) และบอระเพด (8.02+1.14 mgGAE.g-1) ตามล าดบ

4.4 การหาปรมาณฟลาโวนอยดรวม (Determination of Total Flavonoids Content: TFC) โดยใชวธ Aluminium trichloride (AlCl3) colorimetric การหาปรมาณฟลาโวนอยดรวมดวยวธ Aluminium trichloride (AlCl3) colorimetric เปนวธทดดแปลงจาก Arvouet-Grand, Vennat, Pourrat, and Legret (1994) ซงใชเคอรซตน (Quercetin) เปนสารมาตรฐาน พบวาไดกราฟมาตรฐานเคอรซตนดงภาพท 4-4 (y = 0.0504x+0.0266, R2 = 0.999)

39

y = 0.0504x + 0.0266R² = 0.9998

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 2 4 6 8 10 12 14 16

ค าการด

ดกลน

แสง ท

415 n

m

ความเขมขนของเคอร ตน (g/mL)

ภาพท 4-4 กราฟมาตรฐานสารละลายเคอรซตน จากกราฟมาตรฐานสารละลายเคอรซตน สามารถน าไปค านวณหาปรมาณฟลาโวนอยดรวมของสารสกดหยาบชนเอทานอลของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด ไดผลดงภาพท 4-5 โดยรายงานในหนวยของมลลกรมสมบรณของเคอรซตนตอน าหนกสารสกดแหง 1 กรม (mgQE.g-1)

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก เถาบอระเพด

38.06 + 2.1144.78 + 1.49

68.28 + 1.44

6.72 + 0.25

mg Q

E.g-1

ภาพท 4-5 ปรมาณฟลาโวนอยดรวมของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดท ใชรกษาโรคเบาหวาน

40 จากผลการหาปรมาณฟลาโวนอยดรวมของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานพบวาสารสกดหยาบชนเอทานอลของใบสกใหปรมาณฟลาโวนอยดรวมสงทสด (68.28+1.44 mgQE.g-1) รองลงมาไดแกใบสก (44.78+1.49 mgQE.g-1) ปอบด (38.06+2.11 mgQE.g-1) และบอระเพด (6.72+0.25 mgQE.g-1) ตามล าดบ

4.5 การหาปรมาณสารตานอนมลอสระรวม (Determination of Total Antioxidant Capacity: TAC) โดยใชวธ Phosphomolybdate colorimetric การหาปรมาณสารตานอนมลอสระรวมดวยวธ Phosphomolybdate colorimetric เปนวธทดดแปลงจาก Prieto, Pineda, and Aguilar (1999) ซงใชวตามนซ (L-ascorbic acid) เปนสารมาตรฐาน พบวาไดกราฟมาตรฐานวตามนซดงภาพท 4-6 (y = 0.0309x-0.0093, R2 = 0.9991)

y = 0.0309x - 0.0093R² = 0.9991

0.00.20.40.60.81.01.2

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0

ค าการด

ดกลน

แสงท

695 n

m

ความเขมของวตามน (g/mL)

ภาพท 4-6 กราฟมาตรฐานสารละลายวตามนซ จากกราฟมาตรฐานสารละลายวตามนซ สามารถน าไปค านวณหาปรมาณสารตานอนมลอสระรวมของสารสกดหยาบชนเอทานอลของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด ไดผลดงภาพท 4-7 โดยรายงานในหนวยของมลลกรมสมบรณของวตามนซตอน าหนกสารสกดแหง 1 กรม (mgAE.g-1)

41

0.0020.0040.0060.0080.00

100.00120.00140.00160.00

ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก เถาบอระเพด

121.19 + 4.39

69.84 + 2.01

151.61 + 2.97

105.50 + 6.51mg

AE.

g-1

ภาพท 4-7 ปรมาณสารตานอนมลอสระรวมของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทย บางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน จากผลการหาปรมาณสารตานอนมลอสระรวมของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน พบวาสารสกดหยาบช นเอทานอลของใบสกใหสารตานอนมลอสระรวมสงทสด(151.61+2.97 mgAE.g-1) รองลงมาไดแกฝกปอบด (121.19+4.39 mgAE.g-1) เถาบอระเพด (105.50+6.51 mgAE.g-1) และใบหกวาง (69.84+2.01 mgAE.g-1) ตามล าดบ

4.6 การทดสอบฤทธตานอนมลอสระ โดยวธ DPPH radical scavenging การทดสอบฤทธตานอนมลอสระ โดยวธ DPPH radical scavenging ซงดดแปลงจากวธ

ของ Braca, Sortino, Politi, Morelli, and Mendez (2002) โดยใชกรดแกลลก (Gallic acid), เคอรซตน (Quercetin) และวตามนซ (L-ascorbic acid) เปนสารมาตรฐาน และวดคาการดดกลนแสงท ความยาวคลน 517 นาโนเมตร จากการทดสอบฤทธตานอนมลอสระของสารมาตรฐานทง 3 ชนด ทความเขมขนเรมตน 0.02 g/mL ไดผลการทดลองแสดงเปนคารอยละของการตานอนมลอสระ (% DPPH Radical Inhibition) ดงแสดงในตารางท 4-3 และภาพท 4-8

42 ตารางท 4-3 รอยละของการตานอนมลอสระ ( % DPPH Radical inhibition) ของสารมาตรฐาน กรดแกลลก, เคอรซตน และ วตามนซ

ความเขมขน (g/mL) % DPPH Radical inhibition กรดแกลลก เคอรซตน วตามนซ

0.02 4.29+0.86 3.19+1.34 1.11+0.58

0.03 6.36+0.41 5.06+0.35 2.45+1.59

0.06 11.69+0.42 6.99+1.40 5.38+3.61 0.13 18.57+1.13 11.60+1.42 5.36+0.73

0.25 30.19+2.33 23.13+8.67 16.90+6.05

0.50 44.70+1.33 33.01+0.82 27.33+0.29

1.00 71.95+5.18 66.83+3.98 58.50+3.75 2.00 95.19+0.30 95.84+0.13 97.25+0.11

0102030405060708090

100110

% D

PPH

Rad

ical I

nhib

ition

ความเขมขนของสารมาตร าน (g/mL)

กรดแกลลก

เคอรซตน

วตามนซ

ภาพท 4-8 รอยละของการตานอนมลอสระ (% DPPH radical inhibition) ของสารมาตรฐาน กรดแกลลก เคอรซตน และวตามนซ

43 หลงจากนนท าการทดสอบฤทธตานอนมลอสระของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด ดวยวธการทดลองเชนเดยวกน โดยท าการทดลองทความเขมขนเรมตน 500.0 g/mL ไดผลการทดลองแสดงเปนคารอยละของการตานอนมลอสระ (% DPPH Radical Inhibition) ดงแสดงในตารางท 4-4 และภาพท 4-9 ตารางท 4-4 รอยละของการตานอนมลอสระ (% DPPH Radical inhibition) ของสารสกดหยาบชน เอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน

ความเขมขน (g/mL) % DPPH Radical Inhibition

ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก เถาบอระเพด

3.91 0.47+0.23 15.46+0.62 0.22+1.85 0.14+0.12 7.81 1.40+0.62 44.67+0.24 3.75+1.80 0.28+0.33

15.63 3.64+0.97 93.54+0.72 10.82+0.22 1.42+0.44

31.25 12.40+1.75 95.33+0.12 23.99+0.34 3.41+0.43

62.50 28.99+3.31 96.01+0.12 48.20+0.25 8.74+0.93 125.00 55.89+2.33 96.63+0.12 82.49+0.58 18.41+1.92

250.00 93.88+0.13 97.11+0.21 95.00+0.58 35.32+2.70

500.00 95.35+0.00 95.81+0.43 99.12+0.25 60.20+4.39

44

0102030405060708090

100110

% D

PPH

Rad

ical I

nhibi

tion

ความเขมขนสารสกดหยาบจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน (g/mL)

ฝกปอบด

ใบหกวาง

ใบสก

เถาบอระเพด

ภาพท 4-9 รอยละของการตานอนมลอสระ (% DPPH radical inhibition) ของสารสกดหยาบชน เอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน

จากภาพท 4-9 พบวาทความเขมขนของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานทง 4 ชนดเพมขน คารอยละของการตานอนมลอสระจะเพมขน โดยทความเขมขน 125.0 g/mL สารสกดหยาบจากใบหกวางสามารถแสดงคารอยละของการตานอนมลอสระไดดทสด (96.63%) รองลงมาคอใบสก (82.49%) ฝกปอบด (55.89%) และเถาบอระเพด (18.41%) ตามล าดบ จากการศกษาฤทธตานอนมลอสระและการหาปรมาณฟนอลกรวมปรมาณฟลาโวนอยดรวม และปรมาณสารตานอนมลอสระรวมของสารสกดหยาบเอทานอลของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน คอ ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด พบวาใบหกวางมฤทธตานอนมลอสระ (DPPH) ทดทสด ซงสอดคลองกบปรมาณฟนอลกรวมทตรวจพบมากทสดดวย แตในการหาปรมาณสารตานอนมลอสระรวม (Total Antioxidant ) พบวาใบสกมปรมาณสารตานอนมลอสระสงทสด ผลดงกลาวนนไมสอดคลองกบฤทธตานอนมลอสระ (DPPH) อาจเปนผลมาจากสารแอนทราควโนนทตรวจพบเฉพาะในใบสกเทานน ทแสดงฤทธในการรดวซ Mo(VI) เปน Mo(V) ไดดกวาการท าปฏกรยากบอนมลอสระ DPPH สวนฝกปอบดและเถาบอระเพดมฤทธตานอนมลอสระปานกลาง ซงกสอดคลองกบสารทตยภมทพบ คอสวนใหญจะพบสารในกลม ซาโปนน สเตยรอยด และเทอรพนอยด

45

4.7 การทดสอบฤทธการยบยงเอนไ มแอลฟา-กลโค เดส (Anti--glucosidase assay) การทดสอบฤทธการยบย งแอลฟา-กลโคซเดสดวยวธ p-nitrophenol colorimetric เปนวธทดดแปลงจาก Matsui, Yoshimoto, Osajima, Oki, and Osajima (1996) โดยใชอคารโบส (Acarbose) เปนสารมาตรฐาน และวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 405 นาโนเมตร จากการทดสอบฤทธการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดส ของสารมาตรฐานและสารสกดหยาบของสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวานทง 4 ชนด ทความเขมขนเรมตน 2.00 mg/mL ไดผลการทดลองแสดงเปนคารอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดส (% -glucosidase inhibition) แสดงดงตารางท 4-5 และภาพท 4-10 ตารางท 4-5 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) ของสารมาตรฐานอคารโบส และสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบาง ชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน

ความเขมขน(mg/mL)

รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition)

อคารโบส ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก เถาบอระเพด 0.03 30.98+0.63 11.16+0.34 46.01+0.46 15.06+0.32 17.07+0.46 0.06 35.05+0.56 16.81+0.34 60.22+0.22 16.25+0.12 20.07+0.34 0.13 48.33+0.31 25.18+0.25 78.32+0.25 17.58+0.12 31.79+0.13 0.25 55.19+0.16 38.33+0.22 91.36+0.25 19.05+0.24 40.51+0.34 0.05 67.21+0.54 53.23+0.25 95.46+0.13 30.11+0.44 52.82+0.46 1.00 81.03+0.94 74.82+0.13 97.29+0.34 42.65+0.36 67.91+0.58 2.00 86.09+0.87 89.79+0.13 98.83+0.34 55.53+0.32 77.51+0.34

46

0

20

40

60

80

100

120

%

-gluc

osida

se In

hibiti

on

ความเขมขนของสารมาตร านและสารสกดหยาบเอทานอลจากพชสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน (mg/mL)

อคารโบส

ฝกปอบด

ใบหกวาง

ใบสก

เถาบอระเพด

ภาพท 4-10 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) ของสารมาตรฐานอคารโบส และสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบาง ชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน

จากการทดสอบฤทธการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน โดยใช p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (PNP-G) เปนซบสเตรทและใชอคารโบสเปนสารมาตรฐาน พบวาทความเขมขน 1.00 mg/mLใบหกวางมฤทธในการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสไดดทสด (97.29%) รองลงมาคอฝกปอบด (74.82%) เถาบอระเพด (67.91%) และใบสก (42.65%) ตามล าดบ นอกจากนยงพบวาใบหกวางมฤทธยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสไดดกวาสารมาตรฐานอคารโบส (81.03%) อกดวย

4.8 การทดสอบฤทธการยบยงเอนไ มแอลฟา-อะไมเลส (Anti--amylase assay) การทดสอบฤทธการยบย งแอลฟา-อะไมเลสดวยวธ 2-chloro-4-nitrophenol colorimetric เปนวธทดดแปลงจาก Gella et al (1997) โดยใช อคารโบส (Acarbose) เปนสารมาตรฐาน และวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 405 นาโนเมตร จากการทดสอบฤทธการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคซเดสของสารมาตรฐานทความเขมขนเรมตน 2.00 mg/mL ไดผลการทดลองแสดงเปนคารอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ดงแสดงในตารางท 4-6 และภาพท 4-11

47 ตารางท 4-6 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสารมาตรฐานอคารโบส และสวนสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยทใช รกษาโรคเบาหวาน

ความเขมขน(mg/mL)

รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition)

อคารโบส ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก เถาบอระเพด 0.03 44.44+0.19 0.32+0.32 19.26+0.19 1.11+0.19 10.56+0.57 0.06 48.76+0.75 0.75+0.49 28.03+0.50 4.98+0.58 12.32+0.19 0.13 55.99+0.86 8.31+0.32 39.61+0.32 13.73+0.38 15.84+0.66 0.25 70.87+0.32 14.70+0.55 53.03+0.50 21.82+0.69 27.17+0.69 0.05 80.80+0.37 25.35+0.37 68.18+0.32 38.98+0.69 36.85+0.50 1.00 87.59+0.19 35.25+0.18 86.90+0.19 63.79+0.33 44.44+0.38 2.00 92.56+0.32 54.21+0.74 99.24+0.19 91.69+0.58 52.04+0.50

0

20

40

60

80

100

120

%

-amyla

se In

hibi

tion

ความเขมขนของสารมาตร านและสารสกดหยาบเอทานอลจากพชสมนไพรไทยบางชนด

ทใชรกษาโรคเบาหวาน (mg/mL)

อคารโบส

ฝกปอบด

ใบหกวาง

ใบสก

เถาบอระเพด

ภาพท 4-11 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสาร มาตรฐานอคารโบสและสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใช รกษาโรคเบาหวาน

48 จากการทดสอบฤทธการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน โดยใช 2-chloro-4-nitrophenyl-alpha-D-maltatrioside (CNPG3) เปนซบสเตรทและใชอคารโบสเปนสารมาตรฐาน พบวาทความเขมขน 1.00 mg/mL ใบหกวางมฤทธในการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสไดดทสด (87.59%) รองลงมาคอใบสก (63.79%) เถาบอระเพด (44.44%) และฝกปอบด (35.25%) ตามล าดบ เมอเปรยบเทยบผลการยบย งเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวานทง 2 ชนดคอ แอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสของปอบดพบวาสารสกดหยาบเอทานอลของฝกปอบดมฤทธยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสมากกวา แอลฟา-อะไมเลส ในทก ๆ ความเขมขนทท าการทดลองดงแสดงในภาพท 4-12

0

20

40

60

80

100

% In

hibiti

on

ความเขมขนของสารสกดหยาบเอทานอลของฝกปอบด (mg/mL)

แอลฟา-กลโคสเดส

แอลฟา-อะไมเลส

ภาพท 4-12 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และรอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของ สารสกดหยาบเอทานอลของฝกปอบด เปรยบเทยบผลการยบย งเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวานทง 2 ชนด คอ แอลฟา- กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส ของใบหกวางพบวาสารสกดหยาบเอทานอลของใบหกวางมฤทธยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสมากกวา แอลฟา-อะไมเลส ดงแสดงในภาพท 4-13

49

020406080

100120

% In

hibiti

on

ความเขมขนของสารสกดหยาบเอทานอลของใบหกวาง (mg/mL)

แอลฟา-กลโคสเดส

แอลฟา-อะไมเลส

ภาพท 4-13 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และรอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition)ของ สารสกดหยาบชนเอทานอลของใบหกวาง เปรยบเทยบผลการยบย งเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวานทง 2 ชนดคอ แอลฟา- กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส ของใบสกพบวาสารสกดหยาบเอทานอลของใบสกมฤทธยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสมากกวาแอลฟา-อะไมเลส ทความเขมขนต า ๆ แตเมอความเขมขนเพมขนจะมฤทธย บย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสไดมากกวาแอลฟา-กลโคสเดสดงแสดงในภาพท 4-14

50

020406080

100120

% In

hibiti

on

ความเขมขนของสารสกดหยาบเอทานอลของใบสก (mg/mL)

แอลฟา-กลโคสเดส

แอลฟา-อะไมเลส

ภาพท 4-14 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และคารอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของ สารสกดหยาบชนเอทานอลของใบสก เปรยบเทยบผลการยบย งเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวานทง 2 ชนดคอ แอลฟา- กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส ของเถาบอระเพดพบวาสารสกดหยาบเอทานอลของเถาบอระเพดมฤทธยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสมากกวา แอลฟา-อะไมเลส ในทก ๆ ความเขมขนทท าการทดลองดงแสดงในภาพท 4-15

51

0

20

40

60

80

100

% In

hibiti

on

ความเขมขนของสารสกดหยาบเอทานอลของเถาบอระเพด (mg/mL)

แอลฟา-กลโคสเดส

แอลฟา-อะไมเลส

ภาพท 4-15 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และรอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition) ของสารสกดหยาบชนเอทานอลของเถาบอระเพด จากการศกษาผลของสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรทใชรกษาโรคเบาหวานทง 4 ชนด ไดแก ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด ในการยบย งการท างานของเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส พบวาใบหกวางใหผลการทดสอบทดทสดโดยทความเขมขน 1.00 mg/mL (97.29% และ 86.90% ตามล าดบ) และพบวามรอยละการยบย งเอนไซมทสงกวาสารมาตรฐานอคารโบสอกดวยแสดงดงภาพท 4-16

52

0

20

40

60

80

100%

Inhib

ition

แอลฟา-กลโคสเดสแอลฟา-อะไมเลส

ภาพท 4-16 รอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส (% -glucosidase inhibition) และรอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส (% -amylase inhibition)ของ สารมาตรฐานอคารโบส และสารสกดหยาบชนเอทานอลของสมนไพรไทยบางชนดท ใชรกษาโรคเบาหวาน ทความเขมขน 1.00 mg/mL

จากการศกษาสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน คอ ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด โดยการสกดดวยตวท าละลายเอทานอลพบวา ใบหกวางมฤทธในการตานเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวานท ง 2 ชนด คอ แอลฟา-กลโคสเดส และแอลฟา-อะไมเลสไดดทสด ผลดงกลาวสอดคลองกบฤทธตานอนมลอสระ DPPH ของใบหกวางทมฤทธตานอนมลอสระ DPPH สงทสด โดยเปนผลมาจากสารในกลมฟนอลก ซงตรวจพบในปรมาณสงทสดเชนเดยวกนในใบ หกวางอกดวย สวนสมนไพรชนดอน ๆ มฤทธทางชวภาพในการตานอนมลอสระ DPPH และฤทธตานเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวานทด และสอดคลองกบผลการทดสอบสารทตยภมทไดดวย ดงนนสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน คอ ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด สามารถน าไปพฒนาเปนยารกษาโรคเบาหวานได ทงนอาจตองท าการทดสอบความเปนพษเพมเตมเพอความปลอดภยในการน าไปใชดวย

บทท 5 สรปผลการวจยและขอเสนอแนะ

5.1 สรปผลการวจย จากการศกษาสมนไพรทใชในการรกษาโรคเบาหวาน เพอลดระดบน าตาลในเลอดตามต ารายาแผนโบราณของไทย คอ ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด โดยแบงการศกษาเปนการตรวจสอบสารพฤกษเคมเบองตนพบสารพฤกษเคม 7 ชนด คอ แอนทราควโนน ฟลาโวนอยด คมารน แทนนน ซาโปนน สเตอรอยด และเทอรพนอยด และพบปรมาณสารประกอบฟนอลกรวม (8.02+1.14 ถง121.20+3.06 mgGAE.g-1) ปรมาณฟลาโวนอยดรวม (6.72+0.25 ถง 68.28+1.44 mg QE.g-1) และปรมาณสารตานอนมลอสระรวม (69.84+2.01 ถง 151.61+2.97 mg AE.g-1) รวมทงฤทธตานอนมลอสระ DPPH พบวาใบหกวางมฤทธทดทสด รองลงมาคอใบสก ฝกปอบด และ เถาบอระเพด ตามล าดบ นอกจากนยงศกษาฤทธในการยบย งเอนไซมทเกยวของกบโรคเบาหวาน 2 ชนด คอ เอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลส พบวาใบหกวางมฤทธในการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส และเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสดทสด (97.29% และ 86.90% ตามล าดบ) และยงพบวาสารสกดหยาบเอทานอลของใบหกวางมฤทธยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสและเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสดทดกวาและใกลเคยงกบสารมาตรฐานอคารโบส (80.29% และ 87.59% ตามล าดบ) อกดวย สวนใบสก ฝกปอบด และเถาบอระเพดมฤทธการยบย งเอนไซมดงกลาวทด และมคาการยบย งใกลเคยงกนและใกลเคยงกบสารมาตรฐานอคารโบส ดงนนสามารถน าสมนไพรไทยทง 4 ชนดคอ ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพดไปพฒนาเปนยารกษาโรคเบาหวานได ทงนอาจตองท าการทดสอบความเปนพษเพมเตมเพอความปลอดภยในการน าไปใชดวย

5.2 ขอเสนอแนะ 1. ควรมการศกษาความเปรยบเทยบผลของสารสกดจากสมนไพรไทยทง 4 ชนดคอ ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด ดวยตวท าละลายชนดอน เพอเปรยบเทยบประสทธภาพการท างานของสารสกดในตวท าละลายทแตกตางกน 2. ควรมการศกษาความเปนพษของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากสมนไพรไทยทง 4 ชนดคอ ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก และเถาบอระเพด เพอลดความเสยงตอการน าไปใชรกษาคนไขโรคเบาหวานตอไป

บรรณานกรม จไรรตน เกดดอนแฝก. (2552). สมนไพรบ าบดเบาหวาน 150 ชนด (พมพครงท 2). กรงเทพฯ: เซเวน พรนตง กรป. ดวงกมล อครนสรณ. (2527). การศกษาภาวะควบคมโรค ความรวมมอในการรกษาความเชอดาน สขภาพและความเชออ านาจในตน-นอกตนดานสขภาพ ของผปวยเบาหวานชนดไมพง อนซลนทมารบบรการจากแผนกผปวยนอก. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต, สาขาวชาพยาบาลศาสตร, คณะแพทยศาสตรโรงพยาบาลรามาธบด, มหาวทยาลยมหดล. พมลพรรณ อนนตกจไพศาล. (2554). 108 สมนไพรไทย ใชเปน หายปวย. กรงเทพฯ: เพอนอกษร. ภาวนา กรตยวงศ. (2544) โรคเบาหวาน. วารสารพยาบาลศาสตรมหาวทยาลยบรพา, (24) มถนายน-สงหาคม, 23-25. นพมาศ สนทรเจรญนนท. (2544). เภสชวนจฉย ยาและผลตภณฑจากธรรมชาต (พมพครงท 3). กรงเทพฯ: แสงเทยนการพมพ. เตม สมตนนท. (2557). ชอพรรณไมแหงประเทศไทย เตม สมตนนท (ฉบบแกไขเพมเตม พ.ศ. 2557). กรงเทพฯ: โรงพมพส านกงานพระพทธศาสนาแหงชาต. มาล บรรจบ และสธดา ไชยราช. (2541). การศกษาสรรพคณลดน าตาลในเลอดของพนธไมไทย. กรงเทพฯ: เอส อาร พรนตง. ระววรรณ แกวอมตวงศ และทรงพร จงมนคง. (2549). ฤทธตานอนมลอสระ DPPH และปรมาณ สารฟนอลรวมของสารสกดพชสมนไพรไทยบางชนด. วารสารวชาการ ม.อบ., 8(2), 1-13. วรพร ศลศร. (2554). การเตรยมสารสกดมาตรฐานกลวยไมหวายมวงแดงเพอใชประโยชนทาง เครองส าอาง. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต, สาขาวชาวทยาศาสตรเครองส าอาง, คณะวทยาศาสตร, มหาวทยาลยแมฟาหลวง. วชย โชคววฒน. (2552). ต าราอางองยาสมนไพรไทย เลม 1. กรงเทพฯ: อมรนทรพรนตงแอนด พบลชซง. อดมเดชา พลเยยม. (2556). การศกษาโครงสรางทางเคมของสารออกฤทธทางชวภาพจากมะเดอ. รายงานวจย, ทนอดหนนจากงบประมาณเงนรายได, คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย, มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลพระนคร. วมลพรรณ รงพรหม, ศรรตน ศรพรวศาล และสมฤด เลยมทอง. (2552, กนยายน-ธนวาคม). สาร ยบย งเอนไซมแอลฟากลโคซเดสจากมะรม (α-Glucosidase Inhibitor from Moringa oleifera Lamk). วทยาศาสตรเกษตร, 40(3พเศษ), 49-52.

55 ปนดดา ทนบตร และจนดารตน พมพสมาน. (2554). ฤทธยบย งแอลฟา-กลโคซเดสของสารสกด จากพชตระกลเฟนเพอใชบ าบดโรคเบาหวาน. ใน การประชมวชาการนานาชาต วศวกรรมเคม และเคมประยกตแหงประเทศไทย ครงท 21 (หนา 1-5). สงขลา: มหาวทยาลยสงขลานครนทร. Arvouet, G. A., Vennat, B., Pourrat, A., & Legret, P. (1994). Standardisation d' un extrait de propoliset indentification des principaux constituants. J. de Phamacie de Belgique, 49, 462-468. Ayoola, G. A., Coker, H. A. B., Adesegun, S. A., Adepoju-B., A. A., Obaweya, K., Ezennia, E. C., & Atangbayila, T. O. (2008). Phytochemical screening and antioxidant activities of some selected medicinal plants used for malaria therapy in southwestern Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 7(3), 1019-1024. Braca, A., Sortino, C., Politi, M., Morelli, I., & Mendez, J. (2002). Antioxidant activity of flavonoids from Licania licaniaeflora. Journal of Ethnopharmacology, 79(3), 379- 381. Chang, C. C., Ho, L. S., & Lee, S. S. (2015). Acylated glucosylflavones as a-glucosidase inhibitors from Tinospora crispa leaf. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 23, 3388- 3396. Chakrabarti, R., Reeba, K. V., Mullangi, R., Sharma, V. M., Jagadheshan, H., Rao, Y. N., Sairam, P., & Rajagopalan, R. (2002). Antidiabetic and hypolipidemic activity of Helicteres isora in animal models. Ethnopharmcology Journal, 81, 343-349. Chyau, C. C., Ko, P., & Mau, J. (2006). Antioxidant properties of aqueous extracts from Terminalia catappa leaves. LWT, 39, 1099-1108. Gell, F. J., Gubern, G., Vidal, R., & Canalias, F. (1997). Determination of total and pancreatic -amylase in human serum with 2-chloro-4-nitrophenyl--D-maltotrioside as substrate. Clin. Chim Acta, 259, 147-160. Ghaisas, M., Navghare, V., Takawale, A., Zope, Vinit., Tanwar, M., & Deshpande, A. (2009). Effect of Tectona grandis Linn. On dexamethasone-induced insulin resistance in mice. Ethnopharmcology Journal, 122, 304-307. Kamiya, K., Saiki, Y., Hama, T., Fujimoto, Yasuo, F., Endang, H., Umar, M., & Satake, T. (2001). Flavonoid glucuronides from Helicteres isora. Phytochemistry, 57, 297-301.

56 Kim, Y. M., Wang, M. H., & Rhee, H. I. (2004). A novel -glucosidase inhibition from pine bark. Carbohydate Research, 339, 715-717. Kuma, G., & Murugesan, A. G. (2008). Hypolipidaemic activity of Helicteres isora L. bark extracts in streptozotocin induced diabetic rats. Ethnopharmcology Journal, 116, 161-166. Majhenic, L., Skerget, M., & Knez, Z. (2007). Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extract. Food Chemistry, 104(3), 1258-1268. Matsui, T., Yoshimoto, C., Osajima, K., Oki, T., & Osajima, Y. (1996). In vitro survey of alpha-glucosidase inhibitory food components. Biosci. Biotechnol. Biochem 60, 2019-2022. Nagappa, A. N., Thakurdesai, P. A., Venkat, R., & Singh, J. (2003). Antidiabetic activity of Terminalia catappa Linn fruits. Ethnopharmcology Journal, 88, 45-50. Prieto. P., Pineda, M., & Aguilar, M. (1999). Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a Phosphomolybdenum Complex: Specific application to the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry, 269, 337-341. Ramachandran, S., Rajasekaran, A., & Kumar, K. T. M. (2011). Antidiabetic antihyperlipidemic and antioxidant potential of methanol extract of Tectona grandis flowers in streptozotocin induced diabetic rats. Asian pacific Journal of tropical medicine, 624-631. Ruan, C. T., Lam, S. H., Lee, S. S., & Su, M. J. (2013). Hypoglycemic action of barapetoside A from the plant Tinospora crispa in mice. Phytomedicine, 20, 667-675. Sazada, S., Verma, A., Rather, A. A., Jabeen, F., & Meghvansi, M. K. (2009). Preliminary phytochemicals analysis of some important medicinal and aromatic plants. Advances in Biological Research, 3, 188-195. Shyam-Krishnan, M., Dhanalakshmi, P., Sudhalakshmi, G. Y., Gopalakrishnan, S., Manimaran, A., Sindhu, S., Sagadevan, E., & Arumugam, P. (2013). Evaluation of phytochemical constituents and antioxidant activity of Indian medicinal plant Hydnocarpuspentandra. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5, 453-458.

ภาคผนวก

58 การค านวณรอยละผลผลต (% yield) จากสตร % yield = (น าหนกสารสกดหยาบ/น าหนกตวอยาง) x 100 ฝกปอบด น าหนกของสารสกดหยาบ = 69.50 กรม น าหนกของฝกปอบด = 1,942.08 กรม แทนคา % yield = (น าหนกสารสกดหยาบ/น าหนกตวอยาง) x 100 % yield = (69.50/1,942.08) x 100 % yield = 3.58 สารสกดหยาบจากฝกปอบดในชนเอทานอลม % yield = 3.58 ตารางท ผ-1 แสดงน าหนกสมนไพร น าหนกสารสกดหยาบ และรอยละผลผลต

สารสกดหยาบอาทานอล ของสมนไพรทใชรกษา

โรคเบาหวาน

น าหนกสมนไพร (กรม)

น าหนกสารสกดหยาบ (กรม)

รอยละผลผลต (% yield)

ฝกปอบด ใบหกวาง ใบสก

เถาบอระเพด

1,942.08 2,045.70

652.71 1,902.02

69.50 111.92 75.13 159.43

3.58 5.47

11.51 8.38

การหาปรมาณฟนอลกรวม (Total Phenolic Content) ดวยวธ Folin-Ciocalteu การเตรยมสารละลายในการทดสอบ

1. สารละลาย Folin-Ciocalteu โดยเจอจางเปน 1:10 (v/v) ดวยน ากลน

2. เตรยมสารละลายกรดแกลลกทมความเขมขน 0.1 mg/mL ในเมทานอล โดยชงกรด

แกลลก0.1 มลลกรม ละลายในตวท าละลายเมทานอล 1 มลลลตร จากนนเจอจางใหมความเขมขน

100-0.19 g/mL เพอใชในการสรางกราฟมาตรฐาน

3. เตรยมสารละลายตวอยางเขมขน 0.5 mg/mL ในเมทานอล โดยชงสารตวอยาง 0.5

มลลกรม ละลายในตวท าละลายเมทานอล 1 มลลลตร จากนนน ามาท าปฏกรยากบ Folin-Ciocalteu

วดคาการดดกลนแสงท 760 นาโนเมตร

59 ตารางท ผ-2 คาการดดกลนแสงท 760 นาโนเมตร ของสามาตรฐานกรดแกลลก (Gallic acid)

ภาพท ผ-1 กราฟมาตรฐานแสดงความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงท 760 นาโนเมตร กบความเขมขนตางๆของสารมาตรฐานแกลลก (Gallic acid)

y = 0.0977x + 0.1054R² = 0.9989

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

ค าการด

ดกล น

สงท

760 n

m

ความเขมขนของกรด กลลก (g/mL)

กราฟมาตรฐานของสารละลาย Gallic acid ไดสมการ Y = 0.0977x+0.1054, R2 = 0.9989

ความเขมขน ของกรดแกลลก

(µg/mL)

คาการดดกลนแสงท 760 nm เฉลย

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3

0.03 0.017 0.024 0.019 0.020+0.00 0.06 0.043 0.045 0.049 0.046+0.00 0.12 0.107 0.104 0.105 0.105+0.00 0.23 0.121 0.122 0.123 0.122+0.00 0.47 0.158 0.155 0.159 0.157+0.00 0.94 0.229 0.226 0.164 0.206+0.04 1.88 0.285 0.289 0.283 0.286+0.00 3.75 0.488 0.524 0.437 0.486+0.04 7.50 0.831 0.832 0.832 0.832+0.00

60 ตารางท ผ-3 คาการดดกลนแสงท 760 นาโนเมตรทใชในการค านวณหาปรมาณฟนอลกรวม

สารสกดหยาบ เอทานอล

ความเขมขน คาการดดกลนแสงท 760 nm เรมตน (mg/mL) สดทาย (mg/mL) ครงท1 ครงท2 ครงท3

ฝกปอบด 0.50 0.0750 0.335 0.341 0.329 ใบหกวาง 0.51 0.0765 1.021 0.988 1.032 ใบสก 0.52 0.0780 0.631 0.625 0.611

เถาบอระเพด 0.53 0.0795 0.177 0.160 0.173 การค านวณหาปรมาณฟนอลกรวม การหาปรมาณฟนอลกรวมของสารสกดหยาบเอทานอลจากฝกปอบดในหนวย mgGAE.g-1 โดยการน าคาการดดกลนแสงทไดมาแทนในสมการเสนตรงทไดจากกราฟมาตรฐาน จากสมการ Y = 0.0977x+0.1054 แทนคา Y = 0.335 จะได 0.335 = 0.0977x+0.1054 X = 2.350 สารตวอยาง 0.075 มลลกรม มปรมาณฟนอลกรวม2.350 gGAE.g-1

ดงนนถาสารตวอยาง 1,000 มลลกรม จะมปรมาณฟนอลกรวมเทากบ 33.33 mgGAE.g-1 จากนนน าคาปรมาณฟนอลกรวมทค านวณไดทง 3 ครงมาหาคาเฉลยกจะไดปรมาณ ฟนอลกรวมในสารสกดหยาบจากฝกปอบด ตารางท ผ-4 ปรมาณฟนอลกรวมของสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใชรกษา โรคเบาหวาน

สารสกดหยาบ เอทานอล

ความเขมขน (mg/mL)

ปรมาณฟนอลกรวม mgGAE.g-1

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย ฝกปอบด 0.0750 31.33 32.15 30.52 31.33+0.82 ใบหกวาง 0.0765 122.50 118.09 123.98 121.20+3.06 ใบสก 0.0780 68.97 68.18 66.35 67.45+1.35

เถาบอระเพด 0.0795 9.22 7.03 8.70 8.32+1.14

61 การหาปรมาณฟลาโวนอยดรวม (Total Flavonoids Content) ดวยวธ Aluminium trichloride (AlCl3) colorimetric การเตรยมสาร

1. สารละลาย aluminum trichoride (AlCl3) ความเขมขน 2.0 % (w/v) ในตวท า

ละลายเมทานอล

2. เตรยมสารละลายเคอรซตน (Quercetin) ทมความเขมขน 0.1 mg/mL ในเมทานอล

โดยชงเคอรซตน (Quercetin) 0.1 มลลกรมละลายในตวท าละลายเมทานอล 1 มลลลตร จากนนเจอจาง

ใหมความเขมขน100-0.19 g/mL เพอใชในการสรางกราฟมาตรฐาน

3. เตรยมสารละลายตวอยางเขมขน 0.5 mg/mL ในตวท าละลายเมทานอล โดยชงสาร

ตวอยาง 0.5 มลลกรม ละลายในตวท าละลายเมทานอล 1 มลลลตร จากนนน ามาท าปฏกรยากบ AlCl3

วด คาการดดกลนแสงท 415 นาโนเมตร

ตารางท ผ-5 คาการดดกลนแสงท 415 นาโนเมตร ของสามาตรฐานเคอรซตน (Quercetin)

ความเขมขน ของเคอรซตน (µg/mL)

คาการดดกลนแสงท415 nm เฉลย

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3

0.12 0.026 0.028 0.025 0.026+0.00 0.23 0.036 0.038 0.040 0.038+0.00 0.47 0.050 0.055 0.058 0.054+0.00 0.94 0.074 0.079 0.076 0.076+0.00 1.88 0.123 0.131 0.123 0.126+0.00 3.75 0.212 0.213 0.213 0.213+0.00 7.50 0.399 0.408 0.401 0.403+0.00

15.00 0.787 0.786 0.780 0.784+0.00

62 ภาพท ผ-2 กราฟมาตรฐานแสดงความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงท 415 นาโนเมตร กบความเขมขนตางๆของสารมาตรฐานเคอรซตน (Quercetin)

y = 0.0504x + 0.0266R² = 0.9998

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 2 4 6 8 10 12 14 16

ค าการด

ดกล น

สงท

415 n

m

ความเขมขนของเคอร ตน (g/mL)

กราฟมาตรฐานของสารละลาย เคอรซตน(Quercetin) ไดสมการ Y = 0.0504x+0.0266, R2 = 0.999 ตารางท ผ-6 คาการดดกลนแสงท 415 นาโนเมตรทใชในการค านวณหาปรมาณฟลาโวนอยดรวม สารสกดหยาบ เอทานอล

ความเขมขน คาการดดกลนแสงท 415 nm เรมตน (mg/mL) สดทาย (mg/mL) ครงท1 ครงท2 ครงท3

ฝกปอบด 0.51 0.0765 0.179 0.177 0.164 ใบหกวาง 0.59 0.0885 0.228 0.232 0.219 ใบสก 0.54 0.0810 0.303 0.312 0.301

เถาบอระเพด 5.30 0.7950 0.303 0.289 - การค านวณหาปรมาณฟลาโวนอยดรวม วธการค านวณหาปรมาณฟลาโวนอยดรวมในสารสกดหยาบเอทานอลจากฝกปอบด ในหนวย mgQE.g-1 โดยการน าคาการดดกลนแสงทไดมาแทนในสมการเสนตรงทได จากกราฟมาตรฐาน

63 จากสมการ Y = 0.0504x+0.0266 แทนคา Y = 0.179 จะได 0.179 = 0.0504x+0.0266 X = 3.024 สารตวอยาง 0.0765 มลลกรม มปรมาณฟลาโวนอยดรวม 3.024 gQE.g-1

ดงนนถาสารตวอยาง 1000 มลลกรมจะมปรมาณฟลาโวนอยดรวมเทากบ 39.53mgQE.g-1 จากนนน าคาปรมาณฟลาโวนอยดรวมทค านวณไดทง 3 ครงมาหาคาเฉลยกจะไดปรมาณฟลาโวนอยดรวมในสารสกดหยาบจากฝกปอบด ตารางท ผ-7 ปรมาณฟลาโวนอยดรวมของสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรไทยบางชนดทใช รกษาโรคเบาหวาน

สารสกดหยาบ เอทานอล

ความเขมขน (mg/mL)

ปรมาณสารประกอบฟลาโวนอยดรวม mgQE.g-1

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย ฝกปอบด 0.0765 39.53 39.01 35.64 38.06+2.11 ใบหกวาง 0.0885 45.15 46.05 43.14 44.78+1.49 ใบสก 0.0810 67.71 69.91 67.22 68.28+1.44

เถาบอระเพด 0.7950 6.90 6.55 - 6.72+0.25 การหาปรมาณสารตานอนม ลอสระรวม (Determination of total antioxidant capacity) การเตรยมสาร

1. สารละลาย Phosphomolybdate reagent โดยผสมสารดงตอไปน

(1) 0.6 M sulfuric acid (H2SO4) ปรมาตร 100 mL

(2) 4.0 mM ammonium molydate ปรมาตร 100 mL

(3) 28.0 nM sodium phosphate (Na3PO4) ปรมาตร 100 mL

2. เตรยมสารละลายวตามนซ (Ascorbic acid) ทมความเขมขน 5 mg/mL ในตวท า

ละลายเมทานอลโดยชง Ascorbic acid 5.0 มลลกรม ละลายในตวท าละลายเมทานอล 1 มลลลตร

จากนน เจอจางใหมความเขมขน 0.625-0.002 mg/mL เพอใชในการสรางกราฟมาตรฐาน

64

3. เตรยมสารละลายตวอยางเขมขน 2 mg/mL ในตวท าละลายเมทานอลโดยชงตวอยาง

2 มลลกรม ละลายในตวท าละลายเมาทานอล 1 จากนนน ามาท าปฏกรยากบ Phosphomolybdate

reagent จากนนวดคาการดดกลนแสงท 695 นาโนเมตร

ตารางท ผ-8 คาการดดกลนแสงท 695 นาโนเมตร ของสามาตรฐานวตามนซ (Ascorbic acid)

ความเขมขน ของวตามนซ (µg/mL)

คาการดดกลนแสงท 695 nm เฉลย

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3

0.24 0.009 0.008 0.012 0.010+0.00 0.49 0.020 0.021 0.018 0.020+0.00 0.98 0.021 0.024 0.024 0.023+0.00 1.95 0.040 0.043 0.044 0.042+0.00 3.91 0.099 0.095 0.101 0.098+0.00 7.81 0.216 0.222 0.222 0.220+0.00

15.63 0.484 0.473 0.471 0.476+0.01 31.25 0.957 0.968 0.951 0.959+0.01

65 ภาพท ผ-3 กราฟมาตรฐานแสดงความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงท 695 นาโนเมตร กบความเขมขนตางๆของสารมาตรฐานวตามนซ (Ascorbic acid)

y = 0.0309x - 0.0093R² = 0.9991

0.00.20.40.60.81.01.2

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0

ค าการด

ดกล น

สงท

695 n

m

ความเขมของวตามน (g/mL)

กราฟมาตรฐานของสารละลาย Ascorbic acid ไดสมการ Y = 0.0309x-0.0093, R2 = 0.9991

ตารางท ผ-9 คาการดดกลนแสงท 695 นาโนเมตร ทใชในการค านวณการหาปรมาณสารตาน อนมลอสระรวม

สารสกดหยาบเอทานอล

ความเขมขน คาการดดกลนแสงท 695 nm เรมตน(mg/mL) สดทาย(mg/mL) ครงท1 ครงท2 ครงท3

ฝกปอบด 2 0.2 0.711 0.765 0.743 ใบหกวาง 2 0.2 0.408 0.429 0.43 ใบสก 2 0.2 0.934 0.942 0.907

เถาบอระเพด 2 0.2 0.617 0.689 0.622 การค านวณหาปรมาณสารตานอนมลอสระรวม วธการค านวณหาปรมาณสารตานอนมลอสระรวมของสารสกดหยาบเอทานอลจากฝกปอบดในหนวย mgAE.g-1 โดยการน าคาการดดกลนแสงทไดมาแทนในสมการเสนตรงทไดจากกราฟมาตรฐาน

66 จากสมการ Y = 0.0309x-0.0093 แทนคา Y = 0.711 จะได 0.711 = 0.0309x-0.0093 X = 23.311 สารตวอยาง 0.2 มลลกรม มปรมาณสารตานอนมลอสระรวม 23.311gAE.g-1

ดงนนถาสารตวอยาง 1000 มลลกรมจะมปรมาณสารตานอนมลอสระรวมเทากบ 116.55 mgGAE.g-1 จากนนน าคาสารตานอนมลอสระรวมทค านวณไดทง 3 ครงมาหาคาเฉลยกจะไดสารตานอนมลอสระรวมในสารสกดเอทานอลหยาบจากฝกปอบด ตารางท ผ-10 ปรมาณสารตานอนมลอสระรวมของสารสกดหยาบเอทานอลจากสมนไพรไทยบาง ชนดทใชรกษาโรคเบาหวาน

สารสกดหยาบ เอทานอล

ความเขมขน (mg/mL)

ปรมาณสารตานอนมลอสระรวม mgAE.g-1

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย ฝกปอบด 0.2 116.55 125.29 121.73 121.19+ 4.39 ใบหกวาง 0.2 67.52 70.92 71.08 69.84+ 2.01 ใบสก 0.2 152.64 153.93 148.27 151.61+ 2.97

เถาบอระเพด 0.2 101.34 112.99 102.15 105.50+ 6.51 การทดสอบฤทธตานอนม ลอสระ โดยวธ DPPH radical scavenging การเตรยมสาร

1. สารละลาย DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ความเขมขน 0.05 มลลโมลาร

(20 g/mL) โดยชง DPPH 10 มลลกรม ละลายในตวท าละลายเมทานอล 500 มลลลตร

2. เตรยมสารละลายมาตรฐานกรดแกลลก (Gallic acid), เคอรซตน (Quercetin) และ

วตามนซ (Ascorbic acid) ทมความเขมขน 1 mg/mL ในเมทานอล โดยชงสารมาตรฐาน อยางละ 0.10

มลลกรม ละลายในตวท าละลายเมทานอล 1 มลลลตรจากนนเจอจางใหมความเขมขนเรมตน

20.00-0.16 g/mL เพอใชในการสรางกราฟมาตรฐาน

3. เตรยมสารละลายตวอยางใหมความเขมขนเรมตน 5 mg/mL ในตวท าละลายเมทานอล

จากนนเจอจางใหมความเขมขนลดลงอยางนอย 8 ความเขมขน

67 ตารางท ผ-11 คาการดดกลนแสงท 517 นาโนเมตร และคารอยละของการตานอนมลอสระของสาร มาตรฐานกรดแกลลก (Gallic acid)

ความเขมขน ของกรดแกลลก

(g/mL)

คาการดดกลนแสงท 517 nm (B)

% DPPH radical inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.02 0.431 0.431 0.431 3.36 4.43 5.07 4.29+0.86 0.03 0.419 0.423 0.423 6.05 6.21 6.83 6.36+0.41 0.06 0.396 0.397 0.400 11.21 11.97 11.89 11.69+0.42 0.13 0.369 0.364 0.367 17.26 19.29 19.16 18.57+1.13 0.25 0.315 0.323 0.305 29.37 28.38 32.82 30.19+2.33 0.50 0.253 0.244 0.250 43.27 45.90 44.93 44.70+1.33 1.00 0.035 0.110 0.144 92.15 75.61 68.28 71.95+5.18 2.00 0.023 0.021 0.021 94.84 95.34 95.37 95.19+0.30

Control (A) 0.446 0.451 0.454

68 ตารางท ผ-12 คาการดดกลนแสงท 517 นาโนเมตร และคารอยละของการตานอนมลอสระของสาร มาตรฐานเคอรซตน (Quercetin)

ความเขมขน ของเคอรซตน (g/mL)

คาการดดกลนแสงท 517 nm (B)

% DPPH radical inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.02 0.431 0.433 0.441 4.22 3.13 1.56 2.97+1.34 0.03 0.428 0.423 0.423 4.89 5.37 5.58 5.28+0.35 0.06 0.415 0.423 0.413 7.78 5.37 7.81 6.99+1.40 0.13 0.391 0.401 0.397 13.11 10.29 11.38 11.60+1.42 0.25 0.359 0.300 0.375 20.22 32.89 16.29 23.13+8.67 0.50 0.301 0.296 0.304 33.11 33.78 32.14 33.01+0.82 1.00 0.129 0.162 0.155 71.33 63.76 65.40 66.83+3.98 2.00 0.019 0.019 0.018 95.78 95.75 95.98 95.84+0.13

Control (A) 0.450 0.447 0.448

69 ตารางท ผ-13 คาการดดกลนแสงท 517 นาโนเมตร และคารอยละของการตานอนมลอสระของสาร มาตรฐานวตามนซ (Ascorbic acid)

ความเขมขน ของกรดแอสคอบก

(g/mL)

คาการดดกลนแสงท 517 nm (B)

% DPPH radical inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.02 0.440 0.444 0.444 0.68 0.89 1.77 1.11+0.58 0.03 0.440 0.435 0.435 0.68 2.90 3.76 2.45+1.59 0.06 0.401 0.436 0.434 9.48 2.68 3.98 5.38+3.61 0.13 0.421 0.426 0.424 4.97 4.91 6.19 5.36+0.73 0.25 0.384 0.341 0.391 13.32 23.88 13.50 16.90+6.05 0.50 0.323 0.326 0.327 27.09 27.23 27.65 27.33+0.29 1.00 0.203 0.177 0.177 54.18 60.49 60.84 58.50+3.75 2.00 0.012 0.012 0.013 97.29 97.32 97.12 97.25+0.11

Control (A) 0.443 0.448 0.452

70 ตารางท ผ-14 คาการดดกลนแสงท 517 นาโนเมตร และคารอยละของการตานอนมลอสระของสาร สกดหยาบเอทานอลจากฝกปอบด

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(g/mL)

คาการดดกลนแสงท 517 nm (B)

% DPPH radical inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 3.91 0.427 0.431 0.429 0.70 0.00 0.23 0.47+0.23 7.81 0.423 0.422 0.427 1.63 1.86 0.70 1.40+0.62

15.63 0.411 0.413 0.419 4.42 3.95 2.56 3.64+0.97 31.25 0.368 0.381 0.381 14.42 11.40 11.40 12.40+1.75 62.50 0.289 0.315 0.312 32.79 26.74 27.44 28.99+3.31

125.00 0.186 0.182 0.201 56.74 57.67 53.26 55.89+2.33 250.00 0.026 0.026 0.027 93.95 93.95 93.72 93.88+0.13 500.00 0.020 0.020 0.020 95.35 95.35 95.35 95.35+0.00 Control (A) 0.425 0.432 0.432

71 ตารางท ผ-15 คาการดดกลนแสงท 517 นาโนเมตร และคารอยละของการตานอนมลอสระของสาร สกดหยาบเอทานอลจากใบหกวาง

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(g/mL)

คาการดดกลนแสงท 517 nm (B)

% DPPH radical inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 3.91 0.410 0.407 0.413 15.46 16.08 14.85 15.46+0.62 7.81 0.269 0.269 0.267 44.54 44.54 44.95 44.67+0.24

15.63 0.028 0.031 0.035 94.23 93.61 92.78 93.54+0.72 31.25 0.022 0.023 0.023 95.46 95.26 95.26 95.33+0.12 62.50 0.019 0.020 0.019 96.08 95.88 96.08 96.01+0.12

125.00 0.016 0.017 0.016 96.70 96.49 96.70 96.63+0.12 250.00 0.013 0.015 0.014 97.32 96.91 97.11 97.11+0.21 500.00 0.022 0.021 0.018 95.46 95.67 96.29 95.81+0.43 Control (A) 0.425 0.432 0.432

72 ตารางท ผ-16 คาการดดกลนแสงท 517 นาโนเมตร และคารอยละของการตานอนมลอสระของสาร สกดหยาบเอทานอลจากใบสก

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(g/mL)

คาการดดกลนแสงท 517 nm (B)

% DPPH radical inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 3.91 0.451 0.453 0.456 0.44 0.00 0.00 0.22+0.25 7.81 0.433 0.438 0.437 4.42 3.31 3.53 3.75+0.58

15.63 0.402 0.407 0.403 11.26 10.15 11.04 10.82+0.58 31.25 0.343 0.345 0.345 24.28 23.84 23.84 23.99+0.25 62.50 0.236 0.233 0.235 47.90 48.57 48.12 48.20+0.34

125.00 0.073 0.082 0.083 83.89 81.90 81.68 82.49+1.22 250.00 0.017 0.032 0.019 96.25 92.94 95.81 95.00+1.80 500.00 0.003 0.017 0.002 99.34 96.25 99.56 98.38+1.85 Control (A) 0.443 0.459 0.458

73 ตารางท ผ-17 คาการดดกลนแสงท 517 นาโนเมตร และคารอยละของการตานอนมลอสระของสาร สกดหยาบเอทานอลจากเถาบอระเพด

ตวอยางการค านวณ % DPPH radical inhibition ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากฝกปอบดทความเขมขน 0.5 mg/mL จากสมการ % DPPH radical inhibition = [(A-B)/A] × 100 แทนคา เมอ A = 0.430 B = 0.020

% DPPH radical inhibition = [(0.430-0.020)/0.430] × 100 % DPPH radical inhibition = 95.349 สารสกดหยาบชนเอทานอลจากฝกปอบดทความเขมขน 0.5 mg/mL ครงท 1 มรอยละของการตานอนมลอสระเทากบ 95.349

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(g/mL)

คาการดดกลนแสงท 517 nm (B)

% DPPH radical inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 3.91 0.468 0.471 0.470 0.21 0.21 0.00 0.21+0.25 7.81 0.466 0.468 0.469 0.64 0.21 0.00 0.28+0.33

15.63 0.460 0.462 0.464 1.92 1.28 1.07 1.42+0.44 31.25 0.451 0.454 0.453 3.84 2.99 3.41 3.41+0.43 62.50 0.425 0.428 0.426 9.38 7.68 9.17 8.74+0.93

125.00 0.374 0.382 0.382 20.26 16.42 18.55 18.41+1.92 250.00 0.289 0.292 0.308 38.38 33.26 34.33 35.32+2.70 500.00 0.179 0.165 0.171 61.83 55.22 63.54 60.20+4.39 Control (A) 0.468 0.469 0.471

74 การทดสอบฤทธการยบยงเอนไ ม อลฟา-กล โค เดส (–glucosidase inhibition )

1. การเตรยม phosphate buffer pH 6.8 50 mM โดยผสมสารดงตอไปน

1.1 เตรยม mono basic sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) 0.2 M

(stock A : ชง NaH2PO4 15.601 g (MW = 156.01 g/mol) ละลายในน าปรมาตร 500 mL)

1.2 เตรยม dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) 0.2 M

(stock B : ชง Na2HPO4 17.799 g (MW = 177.99 g/mol) ละลายในน าปรมาตร 500 mL)

1.3 น าสารละลาย A ปรมาตร 51 mL และสารละลาย B ปรมาตร 49 mL มาผสมกนวด

pH ใหได 6.8 ถาไมไดใหปรบ pH ดวยสารละลาย NaOH หรอ HCl เมอได pH 6.8 แลวปรบปรมาตร

ดวยน ากลนจนไดปรมาตร 200 mL (0.1 M) แลวเจอจางใหไดความเขมขน 50 mM

2. สารละลาย PNPG ในน ากลน ความเขมขน 2 mM โดยชง PNPG 3 mg ละลายในน า

กลนปรมาตร 5 mL

3. เอนไซม -glucosidase ละลายใน phosphate buffer 10 U/mL

4. สารละลาย sodium carbonate (Na2CO3) ในน ากลน ความเขมขน 1 mM

5. สารมาตรฐาน Acabose ในตวท าละลายเมทานอล ความเขมขน 20-0.15 mg/mL

6. การเตรยม Acabose 20 mg/mL: ชง Acabose 20 mg ละลายในเมทานอล 1 mL แลว

เจอจางแบบ 2-fold จนไดความเขมขนในชวง 20-0.15 mg/mL

7. สารละลายตวอยาง ในตวท าละลาย 80% เมทานอล ความเขมขน 20-0.15 mg/mL

75 ตารางท ผ-18 คาการดดกลนแสงท 405 นาโนเมตร และคารอยละการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส ของสารมาตรฐานอคารโบส

ตารางท ผ-19 คาการดดกลนแสงท 405 นาโนเมตร และคารอยละการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากฝกปอบด

ความเขมขน ของอคารโบส (mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-glucosidase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.256 0.252 0.256 30.62 31.71 30.62 30.98+0.63 0.06 0.239 0.238 0.242 35.23 35.50 34.42 35.05+0.56 0.13 0.190 0.192 0.190 48.51 47.97 48.51 48.33+0.31 0.25 0.165 0.166 0.165 55.28 55.01 55.28 55.19+0.16 0.50 0.121 0.123 0.119 67.21 66.67 67.75 67.21+0.54 1.00 0.070 0.064 0.070 81.03 82.66 81.03 81.57+0.94 2.00 0.055 0.05 0.049 85.09 86.45 86.72 86.09+0.87

Control (A) 0.37 0.366 0.37

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-glucosidase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.403 0.405 0.402 11.23 10.79 11.45 11.16+0.34 0.06 0.378 0.379 0.376 16.74 16.52 17.18 16.81+0.34 0.13 0.341 0.339 0.339 24.89 25.33 25.33 25.18+0.25 0.25 0.280 0.279 0.281 38.33 38.55 38.11 38.33+0.22 0.50 0.213 0.211 0.213 53.08 53.52 53.08 53.23+0.25 1.00 0.114 0.114 0.115 74.89 74.89 74.67 74.82+0.13 2.00 0.046 0.047 0.046 89.87 89.65 89.87 89.79+0.13

Control (A) 0.451 0.455 0.457

76 ตารางท ผ-20 คาการดดกลนแสงท 405 นาโนเมตร และคารอยละการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส ของสารสกดหยาบเอทานอลจากฝกใบหกวาง

ตารางท ผ-21 คาการดดกลนแสงท 405 นาโนเมตร และคารอยละการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากฝกใบสก

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-glucosidase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.245 0.244 0.248 46.15 46.37 45.49 46.01+0.46 0.06 0.180 0.181 0.182 60.44 60.22 60.00 60.22+0.22 0.13 0.100 0.098 0.098 78.02 78.46 78.46 78.32+0.25 0.25 0.040 0.038 0.040 91.21 91.65 91.21 91.36+0.25 0.50 0.021 0.02 0.021 95.38 95.60 95.38 95.46+0.13 1.00 0.012 0.011 0.014 97.36 97.58 96.92 97.29+0.34 2.00 0.004 0.007 0.005 99.12 98.46 98.90 98.83+0.34

Control (A) 0.46 0.452 0.454

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-glucosidase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.449 0.404 0.406 15.34 15.13 14.71 15.06+0.32 0.06 0.442 0.399 0.399 16.39 16.18 16.18 16.25+0.12 0.13 0.437 0.392 0.392 17.44 17.65 17.65 17.58+0.12 0.25 0.426 0.384 0.386 18.91 19.33 18.91 19.05+0.24 0.50 0.370 0.335 0.332 30.46 29.62 30.25 30.11+0.44 1.00 0.323 0.274 0.271 42.44 42.44 43.07 42.65+0.36 2.00 0.265 0.213 0.210 55.46 55.25 55.88 55.53+0.32

Control (A) 0.43 0.426 0.433

77 ตารางท ผ-22 คาการดดกลนแสงท 405 นาโนเมตร และคารอยละการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดส ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากเถาบอระเพด

ตวอยางการค านวณ % α-glucosidase inhibition ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากฝกปอบดทความเขมขน 0.5 mg/mL จากสมการ % α-glucosidase inhibition = [(A-B)/A] × 100 แทนคา เมอ A = 0.454 B = 0.213

% α-glucosidase inhibition = [(0.454-0.213)/0.454] × 100 % α-glucosidase inhibition = 53.08 สารสกดหยาบชนเอทานอลจากฝกปอบดทความเขมขน 0.5 mg/mL ครงท 1 มคารอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-กลโคสเดสเทากบ 53.08

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-glucosidase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.379 0.378 0.375 16.70 16.92 17.58 17.07+0.46 0.06 0.364 0.362 0.365 20.00 20.44 19.78 20.07+0.34 0.13 0.310 0.310 0.311 31.87 31.87 31.65 31.79+0.13 0.25 0.269 0.271 0.272 40.88 40.44 40.22 40.51+0.34 0.50 0.214 0.213 0.217 52.97 53.19 52.31 52.82+0.46 1.00 0.144 0.145 0.149 68.35 68.13 67.25 67.91+0.58 2.00 0.104 0.101 0.102 77.14 77.80 77.58 77.51+0.34

Control (A) 0.41 0.408 0.412

78 การทดสอบฤทธการยบยงเอนไ ม อลฟา-อะไมเลส (–amylase inhibition )

1. การเตรยม phosphate buffer pH 6.8 50 mM โดยผสมสารดงตอไปน

1.1 เตรยม mono basic sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) 0.2 M

(stock A:ชง NaH2PO4 15.601 g (MW = 156.01 g/mol) ละลายในน าปรมาตร 500 mL)

1.2 เตรยม dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) 0.2 M

(stock B:ชง Na2HPO4 17.799 g (MW = 177.99 g/mol) ละลายในน าปรมาตร 500 mL)

1.3 น าสารละลาย A ปรมาตร 51 mL และสารละลาย B ปรมาตร 49 mL มาผสมกนวด

pH ใหได 6.8 ถาไมไดใหปรบ pH ดวยสารละลาย NaOH หรอ HCl เมอได pH 6.8 แลว ใหปรบ

ปรมาตรดวยน ากลนจนไดปรมาตร 200 mL (0.1 M) แลวเจอจางใหไดความเขมขน 50 mM

2. สารละลาย 2-chloro-4-nitrophenyl--D-maltatrioside (CNPG3) ในน ากลน ความเขมขน

2 mM โดยชง CNPG3 6.60 mg ละลายในน ากลนปรมาตร 5 mL

3. เอนไซม -amylase ละลายใน phosphate buffer 324 U/mL

4. สารละลาย sodium carbonate (Na2CO3) ในน ากลน ความเขมขน 1 mM

5. สารมาตรฐาน Acabose ในตวท าละลายเมทานอล ความเขมขน 20-0.15 mg/mL

6. การเตรยม Acabose 20 mg/mL: ชง Acabose 20 mg ละลายในเมทานอล 1 mL แลว

เจอจางแบบ 2-fold จนไดความเขมขนในชวง 20-0.15 mg/mL)

7. สารละลายตวอยาง ในตวท าละลาย 80% เมทานอล ความเขมขน 20-0.15 mg/mL

79 ตารางท ผ-23 คาการดดกลนแสงท 405 นาโนเมตร และคารอยละการยบย งเอนไซม แอลฟาอะไมเลส ของสารมาตรฐานอคารโบส

ตารางท ผ-24 คาการดดกลนแสงท 405 nm และคารอยละการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสของ สารสกดหยาบชนเอทานอลจากฝกปอบด

ความเขมขน ของอคารโบส (mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-amylase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.172 0.172 0.171 44.34 44.34 44.66 44.44+0.19 0.06 0.161 0.157 0.157 47.90 49.19 49.19 48.76+0.75 0.13 0.137 0.133 0.138 55.66 56.96 55.34 55.99+0.86 0.25 0.091 0.090 0.089 70.55 70.87 71.20 70.87+0.32 0.50 0.058 0.060 0.060 81.23 80.58 80.58 80.80+0.37 1.00 0.039 0.038 0.038 87.38 87.70 87.70 87.59+0.19 2.00 0.022 0.023 0.024 92.88 92.56 92.23 92.56+0.32

Control (A) 0.309 0.308 0.309

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-amylase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.313 0.311 0.312 0.00 0.64 0.32 0.32+0.32 0.06 0.309 0.312 0.311 1.28 0.32 0.64 0.75+0.49 0.13 0.288 0.287 0.286 7.99 8.31 8.63 8.31+0.32 0.25 0.268 0.268 0.265 14.38 14.38 15.34 14.70+0.55 0.50 0.235 0.233 0.233 24.92 25.56 25.56 25.35+0.37 1.00 0.203 0.202 0.203 35.14 35.46 35.14 35.25+0.18 2.00 0.146 0.142 0.142 53.35 54.63 54.63 54.21+0.74

Control (A) 0.313 0.312 0.315

80 ตารางท ผ-25 คาการดดกลนแสงท 405 นาโนเมตร และคารอยละการยบย งเอนไซม แอลฟา-อะไมเลส ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากใบหกวาง

ตารางท ผ-26 คาการดดกลนแสงท 405 นาโนเมตร และคารอยละการยบย งเอนไซม แอลฟา-อะไมเลส ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากใบสก

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-amylase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.248 0.249 0.249 19.48 19.16 19.16 19.26+0.19 0.06 0.220 0.222 0.223 28.57 27.92 27.60 28.03+0.50 0.13 0.185 0.186 0.187 39.94 39.61 39.29 39.61+0.32 0.25 0.145 0.143 0.146 52.92 53.57 52.60 53.03+0.50 0.50 0.097 0.098 0.099 68.51 68.18 67.86 68.18+0.32 1.00 0.040 0.041 0.040 87.01 86.69 87.01 86.90+0.50 2.00 0.003 0.002 0.002 99.03 99.35 99.35 99.24+0.19

Control (A) 0.311 0.306 0.308

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-amylase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.298 0.298 0.297 1.00 1.00 1.33 1.11+0.19 0.06 0.284 0.287 0.287 5.65 4.65 4.65 4.98+0.58 0.13 0.259 0.261 0.259 13.95 13.29 13.95 13.73+0.38 0.25 0.236 0.233 0.237 21.59 22.59 21.26 21.82+0.69 0.50 0.182 0.183 0.186 39.53 39.20 38.21 38.98+0.69 1.00 0.109 0.11 0.108 63.79 63.46 64.12 63.79+0.33 2.00 0.024 0.024 0.027 92.03 92.03 91.03 91.69+0.58

Control (A) 0.305 0.301 0.302

81 ตารางท ผ-27 คาการดดกลนแสงท 405 นาโนเมตร และคารอยละการยบย งเอนไซม แอลฟา-อะไมเลส ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากเถาบอระเพด

ตวอยางการค านวณ % α-amylase inhibition ของสารสกดหยาบชนเอทานอลจากฝกปอบดทความเขมขน 0.5 mg/mL จากสมการ % α-amylase inhibition = [(A-B)/A] × 100 แทนคา เมอ A = 0.313 B = 0.235

% α-amylase inhibition = [(0.313-0.235)/0.313] × 100 % α-amylase inhibition = 24.92 สารสกดหยาบชนเอทานอลจากฝกปอบดทความเขมขน 0.5 mg/mL ครงท 1 มคารอยละของการยบย งเอนไซมแอลฟา-อะไมเลสเทากบ 24.92

ความเขมขน ของสารสกดหยาบ

(mg/mL)

คาการดดกลนแสงท 405 nm (B)

% α-amylase inhibition

ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 ครงท 1 ครงท 2 ครงท 3 เฉลย 0.03 0.272 0.272 0.269 10.23 10.23 11.22 10.56+0.57 0.06 0.266 0.266 0.265 12.21 12.21 12.54 12.32+0.19 0.13 0.253 0.257 0.255 16.50 15.18 15.84 15.84+0.66 0.25 0.223 0.219 0.22 26.40 27.72 27.39 27.17+0.69 0.50 0.191 0.19 0.193 36.96 37.29 36.30 36.85+0.50 1.00 0.169 0.167 0.169 44.22 44.88 44.22 44.44+0.38 2.00 0.144 0.147 0.145 52.48 51.49 52.15 52.04+0.50

Control (A) 0.303 0.303 0.302

82

ประวตยอของผวจย ชอ-สกล นางสาวนงลกษณ หวยหงษทอง วน เดอน ป เกด 29 กนยายน พ.ศ. 2529 สถานทเกด จงหวดราชบร สถานทอยปจจบน บานเลขท 40 หม 7 ต าบลดานทบตะโก อ าเภอจอมบง จงหวดราชบร ต าแหนงและประวตการท างาน พ.ศ. 2554-2558 ขาราชการครโรงเรยนกระทมแพววทยา ปราจนบร พ.ศ. 2558-ปจจบน ขาราชการครโรงเรยนสายธรรมจนทร ราชบร ประวตการศกษา พ.ศ. 2551 วทยาศาสตรบณฑต (เคม) มหาวทยาลยศลปากร พ.ศ. 2559 วทยาศาสตรมหาบณฑต (เคมศกษา) มหาวทยาลยบรพา