การพัฒนาวิธีดีพีพีเอชบนอุปกรณ์แบบกระดาษเพื่อการวิเคราะห์...

การพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณแบบกระดาษเพอการวเคราะหแบบรผลรวดเรว

ของฤทธตานอนมลอสระในอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาต

วมล แสงนาค

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต

สาขาวชาเคมศกษา

คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา

สงหาคม 2558

ลขสทธเปนของมหาวทยาลยบรพา

การวจยนไดรบทนอดหนนการวจย

งบประมาณเงนรายไดจากเงนอดหนนจากรฐบาล (งบประมาณแผนดน) มหาวทยาลยบรพา

ประจาปงบประมาณ 2558

กตตกรรมประกาศ

วทยานพนธฉบบนสาเรจลงไดดวยความกรณาจาก ดร. ยภาพร สมนอย อาจารยทปรกษา

ทกรณาใหคาปรกษาแนะนาแนวทางทถกตอง ชวยเหลอในทกปญหาการวจยพรอมทงใหกาลงใจ

ตลอดจนแกไขขอบกพรองตาง ๆ ดวยความละเอยดถถวนและเอาใจใสดวยดเสมอมา ขาพเจารสก

ซาบซงเปนอยางยง จงขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ โอกาสน

ขอขอบพระคณ คณาจารยประจาภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา

ทกทาน ทชวยสอนวชาเคมในสวนของเนอหา และปฏบตการเคมอยางเขมขน เพอปลกฝงให

ขาพเจาเปนนกวทยาศาสตร และเปนครวทยาศาสตรทมความรในภาคทฤษฎ และภาคปฏบต

วชาเคมเปนอยางด

ขอกราบขอบพระคณ คณพอวเชยร แสงนาค คณแมสายทพย กลาศร และสมาชกใน

ครอบครวทกคนทใหกาลงใจ และสนบสนนขาพเจาเสมอมา

คณคาและประโยชนของวทยานพนธฉบบน ขาพเจาขอมอบเปนกตญ�กตเวทตาแด

บพการ บรพาจารย และผมพระคณทกทานทงในอดตและปจจบน ททาใหขาพเจาเปนผมการศกษา

และประสบความสาเรจมาจนตราบเทาทกวนน

วมล แสงนาค

บทท 1

บทนา

1.1 ความเปนมาและความสาคญของปญหา

อนมลอสระ (free radical) หมายถงสารทมอเลกตรอนโดดเดยวในอะตอมหรอโมเลกล

พบในสงแวดลอม เชน บรรยากาศ ควนบหร ในสงมชวตและในเซลล โดยเฉพาะอยางยง

กระบวนการผลตพลงงานภายในเซลล หรอกระบวนการเมทาบอลซม (metabolism) โดยมการ

เคลอนยายอเลกตรอนออกจากโมเลกลของออกซเจน ทาใหอเลกตรอนในโมเลกลออกซเจนไม

สมดลกลายเปนอนมลอสระและวองไวในการเขาทาปฏกรยา เมออยภายในรางกายสามารถทาลาย

ชวโมเลกลทกประเภท ทาใหเกดความเสยหายแกโมเลกลทไดรบผลกระทบ ซงเปนสาเหตทาให

เซลลตาย การเกดการกลายพนธของดเอนเอในเซลลและกอใหเกดโรคตาง ๆ เชน โรคชรา

โรคมะเรง โรคหลอดเลอดหวใจตบตน โรคความจาเสอม เปนตน ถาอนมลอสระปนเปอนอยใน

อาหาร จะทาใหอาหารมกลน สและรสชาตเปลยนแปลงไป เนองจากอนมลอสระสามารถเขาทา

ปฏกรยากบกรดไขมนในอาหารได

สารตานอนมลอสระ (antioxidants) เปนสารพวกเอนไซมหรอสารอนทสามารถชะลอ

หรอทาปฏกรยากบอนมลอสระโดยตรงเพอกาจดอนมลอสระใหหมดไปหรอหยดปฏกรยาลกโซ

ไมใหดาเนนตอไป โดยปกตแลวในรางกายของคนเราจะสรางเอนไซมตานอนมลอสระขนมา

ควบคมปรมาณสารอนมลอสระใหอยในภาวะสมดล แตถารางกายอยในพนททเสยงจะทาให

รางกายผลตอนมลอสระมากเกนไป เกดภาวะเครยดออกซเดชน (oxidative stress) ซงจะทาใหเกด

โรคตาง ๆ ผทอยในภาวะเสยงจาเปนตองไดรบสารตานอนมลอสระจากภายนอกเขาไปดวยเปน

ประจา ซงสารดงกลาวอยใน ผก ผลไมและสมนไพร นอกจากนทางดานเศรษฐกจ ธรกจสงออก

อาหารไดนาสารตานอนมลอสระมาใชในการชะลอการเนาเสยของอาหาร ดวยเหตนสารตานอนมล

อสระจงมความสาคญ ปจจบนจงมการศกษาคนควาเกยวกบสารตานอนมลอสระเพอเปนขอมลแก

ผบรโภค อตสาหกรรมเกยวกบการผลตยารกษาโรคและธรกจสงออกอาหาร

ปจจบนไดมการศกษาเกยวกบการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระเชงคณภาพและเชง

ปรมาณ วธการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระเชงคณภาพทนยม ไดแก การตรวจวดสารโพลฟนอล

ชนดตาง ๆ โดยการทาใหเกดส โครมาโตกราฟแบบชนบาง (TLC) และการตรวจหาสารตานอนมล

อสระชนดตางๆ โดยใชเครอง HPLC สวนวธการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระเชงปรมาณทนยม

ไดแก วธ FRAP assay, วธ ABTS radical cation decolorization assay และ วธ DPPH radical

2

scavenging assay ซงวธ DPPH radical scavenging assay เปนวธทใชทดสอบฤทธตานอนมลอสระ

อยางกวางขวาง เพราะเปนวธททงาย สามารถรผลฤทธตานอนมลอสระไดอยางรวดเรว เนองจาก

ปฏกรยาทใชในการวเคราะหจะเกยวของกบ DPPH และสารตานอนมลอสระในตวอยางเทานน

วธ DPPH radical scavenging assay แบบดงเดม เปนการทดสอบโดยใชสารอนมลอสระ

ดพพเอช (DPPH • , 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical) ซงเปนสารสมวงทาปฏกรยากบสารตาน

อนมลอสระในสารละลายเอทานอล เปนระยะเวลาประมาณ 30 นาท สมวงของดพพเอชจะจางลง

ทาใหสามารถหาการเปนสารตานอนมลอสระไดโดยวดสทจางลงดวยเครองสเปกโตโฟโตรมเตอร

(spectrophotrometer) ทความยาวคลน 515 นาโนเมตร ขอเสยของวธ DPPH radical scavenging

assay แบบดงเดมคอ ตองใชสารตวอยางและรเอเจนทปรมาตรมากในการวเคราะหแตละตวอยาง

และใชเวลานานในการวเคราะห

ตอมาไดมการพฒนาการวเคราะหสารตานอนมลอสระดวยการวเคราะหบนถาดหลม

(96 well microtiter plate) โดยใสสารละลายดพพเอชผสมกบตวอยางสารตานอนมลอสระบนถาด

แลวใชเครอง microplate reader spectrophotometer วเคราะหสทจางลงของสารละลายดพพเอช ซง

สามารถวเคราะหครงเดยวไดหลายตวอยาง แตเครอง microplate reader spectrophotometer เปน

เครองมอเฉพาะ มราคาแพง และผใชตองมความรในการใช

เทคโนโลยของไหลจลภาค (microfluidic technology) เปนเทคโนโลยทสามารถนามา

ประยกตใชในการตรวจวเคราะหเชงชวเคม หรอทางการแพทยไดอยางมประสทธภาพเนองจากม

ขอดคอใชปรมาณสารตวอยางในการตรวจวเคราะหในปรมาณตา ระยะเวลาในการตรวจวเคราะห

สน อกทง ณ ปจจบน กระดาษกรอง (filter paper) เปนวสดทไดรบความสนใจในการนามาสราง

อปกรณตรวจวดของไหลจลภาค เนองจากเปนวสดทมราคาถก

ในงานวจยนจะไดพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพอวเคราะหแบบ

รผลเรวของความสามารถการตานอนมลอสระในตวอยางทสนใจ โดยอปกรณทพฒนาขนม

คณสมบต ไดแก ทดสอบตวอยางไดหลายๆตวอยางในคราวเดยวกน ใชสารตวอยางและรเอเจนท

ในการวเคราะหปรมาณนอย ใชเวลาการวเคราะหนอย มคาการวเคราะหถก และใชเครองมอการ

ตรวจวดสญญาณทไมแพง อกทงใหผลการวเคราะหสารตานอนมลอสระในตวอยางมความถกตอง

และแมนยา

3

1.2 วตถประสงคของงานวจย

เพอพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพอการวเคราะหคณสมบต

ในการตานอนมลอสระในตวอยางทสนใจ

1.3 ขอบเขตของงานวจย

1.พฒนาวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพอการวเคราะหคณสมบตในการ

ตานอนมลอสระของสารตานอนมลอสระมาตรฐาน (gallic acid , trolox, caffeic acid, quercetin

และ L-ascorbic acid)โดยใชเอทานอลเปนตวทาละลาย

2. ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระดวย DPPH assay บน

อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ สภาวะทศกษา ไดแก ความเขมขนของ DPPH เรมตนทเหมาะสม

เวลาในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH และสารตานอนมลอสระ (gallic Acid และ trolox)ท

เหมาะสม โดยสภาวะทดจะตองสามารถตรวจวดความสามารถในการตานอนมลอสระไดรวดเรว

แมนยา มความไวสง และมอตราการเกดปฏกรยาทรวดเรว

3.ทดสอบประสทธภาพของวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

ทพฒนาขนดวยสารมาตรฐานทมฤทธตานอนมลอสระ(gallic acid , trolox, caffeic acid, quercetin

และ L-ascorbic acid) โดยหาคาการวเคราะห (analytical feature) ไดแก ชวงความเปนเสนตรง

(linear range) ความสามารถในการทาซ า

(reproducibility, %RSD) ขดจากดการตรวจวด (limit of detection)

4. เปรยบเทยบประสทธภาพความสามารถในการวดความสามารถในการตานอนมล

อสระในอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาตระหวางวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษท

พฒนาขน กบวธดพพเอชแบบดงเดม โดยใชตวอยางใบชาแหง

1.4 ประโยชนทคาดวาจะไดรบจากงานวจย

1. วธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ เปนประโยชนแกหนวยงานทตองการ

ทดสอบฤทธตานอนมลอสระของอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาตทคนพบ เพอนาไปรกษา

สภาพผกผลไมทสงออก

2.วธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ เปนประโยชนแกประชาชนทตอง

การทราบถงคณสมบตสารตานอนมลอสระทมอยในผกและผลไมทวไป

4

1.5 นยามศพทเฉพาะ

1. วธดพพเอช (DPPH assay) หมายถง วธการวเคราะหความสามารถในการเปนสาร

ตานออกซเดชน (antioxidant) ซงใช รเอเจนต คอ 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

2. Intensity หมายถง คาความเขมสทไดจากการวเคราะหในโปรแกรม ImageJ

3. อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (A microfluidic paper-based analytical device,

microPAD) หมายถงตวตรวจวดของไหลจลภาคททามาจากกระดาษกรอง whatman เบอร 1

สรางบรเวณสวนกนทไมชอบน า (hydrophobic barrier) ดวยการตดกระดาษกรองขนาด

1 cm. x 1 cm. และเคลอบกระดาษกรองดงกลาวดวยพลาสตกเคลอบบตรทมการเจาะรขนาดเสน

ผานศนยกลาง 0.5 cm.ไวสาหรบในการวเคราะหสาร

ภาพท 1-1 แสดงอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

พลาสตกเคลอบบตร กระดาษกรองขนาด

1cm.x1cm.

สวนทชอบน าสาหรบวเคราะหสาร

บทท 2

เอกสารและงานวจยทเกยวของ

การวจยครงนไดศกษาเอกสารและงานวจยทเกยวของเพอนามาประกอบการดาเนนการ

ตามลาดบดงน

2.1 อนมลอสระและสารตานอนมลอสระ

2.2 Diphenylpicryhydrazyl (DPPH) Radical Scavenging Assay

2.3 อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper based device)

2.4 ขอมลเกยวกบใบชาแหง

2.5 งานวจยทเกยวของ

2.1 อนมลอสระและสารตานอนมลอสระ

บหรน พนธสวรรค (2556,หนา 277-279) ไดกลาวถงอนมลอสระและสารตาน

อนมลอสระไวดงน

อนมลอสระ (free radicals) หมายถง สารทมอเลกตรอนโดดเดยว (unpaired

electrons) ในอะตอมหรอโมเลกล พบไดทกแหงทงในสงแวดลอม ในสงมชวต และในเซลล

โดยเฉพาะอยางยงกระบวนการผลตพลงงานภายในเซลล หรอจากกระบวนการเมทาบอลซม

(metabolism) โดยมการเคลอนยายอเลกตรอนออกจากโมเลกลของออกซเจนทาใหอเลกตรอนใน

โมเลกลออกซเจนไมสมดลกลายเปนอนมลอสระและวองไวในการเขาทาปฏกรยามาก และสามารถ

ดงอเลกตรอนจากโมเลกลอนมาแทนทอเลกตรอนทขาดหายไปเพอใหตวเองเกดความสมดลหรอ

เสถยร ซงปฏกรยานจะเกดขนอยางตอเนองเปนปฏกรยาลกโซ และเกดขนในเซลลตลอดเวลา

ดงสมการ 1 และ 2

สมการ 1 : R• + O2 ROO•

สมการ 2 : ROO• + RH ROOH + R•

นอกจากนอนมลอสระสามารถทาลายชวโมเลกลทกประเภททงในเซลลและ

สวนประกอบของเซลลสงมชวต ซงเปนสาเหตใหเซลลตาย การเกดการกลายพนธของดเอนเอ

ในเซลล และกอใหเกดโรคตาง ๆ ไดแก โรคชรา (aging)โรคมะเรง (cancer) โรคหวใจขาดเลอด

(coronary heart disease) โรคความจาเสอม (Alzheimer’s disease) โรคขออกเสบ (arthritis) โรค

ภมแพ(allergies) โรคความดนโลหต โรคเหงอก โรคเกยวกบสายตา ความผดปกตของปอดและ

ระบบประสาท โรคเกยวกบทางเดนหายใจ โรคเกยวกบความผดปกตของผวหนง และโรคลาไส

6

อกเสบ เปนตน อนมลอสระนอกจากจะเกดภายในสงมชวตแลวอนมลอสระสามารถเกดจาก

ภายนอกสงมชวตหรอในสงแวดลอม ไดแก การไดรบเชอโรค เชน การตดเชอโรคไวรสหรอเชอ

แบคทเรย โรคเกยวกบภมคมกน (immune diseases) เชน ขออกเสบ รมาตอยด เปนตน จากรงส เชน

รงสอลตราไวโอเลต รงสเอกซ รงสแกมมา จากมลภาวะ เชน ควนบหร แกสจากทอไอเสย

เชน ไนตรสออกไซด ไนโตรเจนไดออกไซด เขมาจากเครองยนต ฝ นจากกระบวนการประกอบ

อาหาร เชน การยางเนอสตวทมสวนประกอบของไขมนสง การนาน ามนทใชทอดอาหารทม

อณหภมสง ๆ กลบมาใชอก การทาใหเกดอาหารประเภทเกรยม ไหม หรอเกดจากการปงยาง จากยา

บางชนด เชน โดโซรบซน (doxorubicin) เพนนซลลามน (penicillamine) พาราเซตามอล

(paracetamol)

สารตานอนมลอสระ (antioxidants) เปนสารทมความสาคญตอกระบวนการออกซไดซ

อนมลอสระ หรอสามารถยบย งปฏกรยาออกซเดชน โดยในสงมชวตจะมระบบการปองกนการ

ทาลายเซลลและเนอเยอจากอนมลอสระ ประกอบดวยสารตานอนมลอสระมากมายหลายชนดททา

หนาทแตกตางกนไป โดยสารตานอนมลอสระเหลานมกลไกการทางานตานอนมลอสระดวยกน

หลายแบบ เชน ดกจบอนมลอสระ(radical scavenging) การยบย งการทางานของออกซเจนทขาด

อเลกตรอน (singlet oxygen quenching) จบกบโลหะทสามารถเรงปฏกรยาออกซเดชนได (metal

chelation) หยดปฏกรยาการสรางอนมลอสระ (chain-breaking) เสรมฤทธ (synergism) และยบย ง

การทางานของเอนไซม (enzyme inhibition) ทเรงปฏกรยาอนมลอสระ เปนตน ตวอยางแสดงการ

ดกจบอนมลอสระดงสมการ 3 และ 4

สมการ 3 : R• + AH RH + A•

สมการ 4 : RO• + AH ROH + A•

โดย R• และ RO• คอ อนมลอสระ และ AH คอ สารตานอนมลอสระ

แหลงทมาของสารตานอนมลอสระม 2 แหลง ไดแก สารตานอนมลอสระสงเคราะห

(synthetic antioxidants) และสารตานอนมลอสระจากธรรมชาต (natural antioxidants) ซงสารตาน

อนมลอสระสงเคราะหเกดจากการกระบวนการสงเคราะหทางเคม โดยเปนสารประกอบฟนอลก

ไดแก propylgallate, 2-butylated hydroxyanisole, 3-butylatehydroxyanisole, BHT (butylated

hydroxytoluene) และ tertiary butylhydroquinone สารสงเคราะหดงกลาวนยมนามาใชใน

อตสาหกรรมอาหารเพอยบย งการเกดปฏกรยาออกซเดชนของไขมนทเปนสาเหตททาใหอาหารม

กลน ส และรสชาตเปลยนแปลงไป สารสงเคราะหนมสภาพคงตวกวาสารตานอนมลอสระจาก

ธรรมชาตแตมขอจากดในดานความปลอดภยในการบรโภค ขณะทสารตานอนมลอสระจาก

ธรรมชาตสามารถพบไดในสงมชวตทงพชและสตว ซงเปนไดทงเอนไซม วตามนและสารอน ๆ

7

ตวอยางของสารตานอนมลอสระทเปนวตามน เชน vitamin C (เปนสารตานอนมลอสระทไซโต

พลาซม) vitamin E (เปนสารตานอนมลอสระทเมมเบรน) และglutathione (เปนสารตานอนมล

อสระทปองกนอนตรายจากอนมลอสระทไซโตพลาซมและเมมเบรน) สวนสารตานอนมลอสระ

ทเปนเอนไซมไดแก glutathione peroxidase (GPX), glutathionereductase และ glutathione

transferase ซงทาหนาททาใหโมเลกลของไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) เปนออกซเจนและน า

สวนเอนไซม superoxid dismutase(SOD) สามารถเปลยน O2•- เปน H2O2 สารตานอนมลอสระอน

ๆ ไดแก carotenoids และ ubiquinones เปนสารตานอนมลอสระสามารถปองกนอนมลอสระ

ออกซเจนทงภายในเซลลและภายนอกเซลล

ในภาวะปกตรางกายของคนเราจะมการปองกนการสะสมสารอนมลอสระโดยการสราง

เอนไซมตานอนมลอสระขนมาควบคมปรมาณสารอนมลอสระใหอยในภาวะทสมดล และอกสวน

ไดจากสารตานอนมลอสระทรางกายรบประทานเขาไปจาพวกวตามน เบตาแคโรทน และแคโรท

นอยด รวมทงสารประกอบโพลฟนอล ซงสารดงกลาวไดจากพชผกและผลไม ตวอยางอาหารท

มเบตาแคโรทนสง ไดแก ผกใบเขยว เชน ตาลง และผกบง อาหารทมสเหลอง เชน แครอท มะละกอ

สก มะมวงสก มะเขอเทศ ฟกทอง อาหารทมวตามนซ (vitamin Cหรอ ascorbic acid) สง ไดแก พช

ผกสเขยว และผลไมรสเปรยว เชน ตาลง ผกบง พรกหยวก ฝรง มะขามปอม สม มะนาว สบปะรด

(วตามนซจากพชผกดงกลาวมฤทธตอตานอนมลอสระทแรงมากและละลายน าไดด) วตามนอ

(vitamin E หรอtocopherol) ละลายไดดในน ามน โดยวตามนอมในน ามนจากเมลดพชชนดตาง ๆ

เชน ราละเอยดในพวกธญพชทไมขดขาว ขาวโพด ขาวกลอง ถวแดง ถวเหลอง ผกกาดหอม เมลด

ทานตะวน งา น ามนรา

2.2 Diphenylpicryhydrazyl (DPPH) Radical Scavenging Assay

เปนการทดสอบดวยวธทางเคมโดยใชอนมลอสระดพพเอช (DPPH•,diphenyl-

picryhydrazyl radical) (Pisoschi และ Negulescu ; 2011) ซงเปนสารสงเคราะหทอยในรปอนมล

อสระทเสถยรและมสมวง สามารถดดกลนแสงไดสงสดโดยใชเครองสเปกโตโฟโตรมเตอร

(spectrophotometer) ทความยาวคลน 515 นาโนเมตร เมอ DPPH• ทาปฏกรยากบสารตานอนมล

อสระ (สารทใหอเลกตรอน) DPPH จะกลายเปนโมเลกลทเสถยร ซงจะทาใหสมวงจางลงจนเปนส

เหลอง ดงสมการ 5

8

สมการ 5 :

สมวง สเหลอง

ทาใหสามารถหาการเปนสารตานอนมลอสระของสารตวอยางได โดยสรางกราฟมาตรฐานระหวาง

คาการดดกลนแสงทลดลงกบความเขมขนของสารตานอนมลอสระ ซงมการนาวธดงกลาวไป

ประยกตใชวเคราะหหาปรมาณสารตานอนมลอสระในสารสกดของผลไมและน าผลไม

โดยสารมาตรฐานทใชในการเทยบฤทธตานอนมลอสระ คอ โทรลอกซ (trolox, 6-hydroxy-2,5,7,8-

tetramethylchlorman-2-carboxylic acid) แสดงคาเปน TEAC (trolox equivalent antioxidant

capacity) มหนวยเปน mM/mg หรอ µM/mg และรายงานผลเปนคา µM TE/fresh mass

หรอกรดแกลลก (gallic acide) แสดงคาเปน GAE (gallic acid equivalent) ซงมหนวยคลายคา

TEAC ขอดของวธน คอ เปนวธทสามารถวเคราะหฤทธตานอนมลอสระไดงาย สะดวก และรวดเรว

กวาวธอนๆ เนองจากการวเคราะหเกยวของกบรเอเจนทเพยงตวเดยวคอ DPPH จงนยมใชเปนวธ

ทดสอบฤทธตานอนมลอสระเบองตนแบบคดกรองของสารตวอยางทสนใจ สวนขอเสย คอDPPH•

คอนขางเสถยรไมไวตอปฏกรยาเหมอนอนมลอสระทเกดขนในรางกายจรง จงทาใหเกดปฏกรยาได

ชา ทาใหคาการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระทวดไดนอยกวาความเปนจรง และตองวดในปฏกรยา

ทเปนแอลกอฮอล

2.3 อปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (Paper based device)

อปกรณตรวจวดของไหลจลภาคแบบกระดาษ หรออปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

(microfluidic paper-based analytical device, µPADs) เปนเทคโนโลยทางเลอกหนงของการสราง

อปกรณตรวจวนจฉยโรคทางคลนก ททาไดงาย ตนทนตา พกพาได สามารถใชแลวทง สาหรบใช

ในประเทศกาลงพฒนา

Martine et al.(2008) ไดกลาววาการผลตอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทาไดโดยสราง

สวนทไมชอบน า (hydrophobic barrier) ตามรปแบบทตองการลงบนกระดาษ ซงมผคดคน รเรมคอ

Whiteside Group ในป ค.ศ. 2007โดยไดสรางสวนทไมชอบน าดวยวธการฉายแสง

(photolithography) ผานเขาไปในพอลเมอรทมความวองไวแสง (photoresist polymer) และกระดาษ

โครมาโทรกราฟ (chromatography paper)

9

ในปจจบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถสรางสวนทไมชอบน าใหเปนลวดลาย

ตาง ๆไดดวยเทคนคตาง ๆ เชน การฉายแสง (photolithography) (Martine et al., 2008) การพมพ

ดวยไข (wax printing) (Carrilho et al., 2009) การวาดดวยปากกากนนา (permanent marker

plotting) (Jana et al., 2012) การฉาบเคลอบ (screen-printing)( Dungchai et al.,2011)และการใชมด

ตด (cutting knives) (Fenton et al., 2009) เปนตน รปแบบลวดลายของอปกรณตรวจวดแบบ

กระดาษมอยสองแบบ ไดแก แบบชองการไหลดานขาง (lateral flow) ดงภาพท 2-1 (A) ซงสาร

ตวอยางสามารถไหลไปบนแผนกระดาษในทอการไหลดวยแรงแคปปลลาร (capillary action) เรยง

ตามเยอกระดาษไปยงบรเวณตรวจวด (test zone) แลวเกดปฏกรยาระหวางสารตวอยางกบรเอเจนท

และแบบหลม (well) (Lisowski & Zarzycki, 2012) ดงภาพท 2-1(B) วเคราะหไดโดยการนาสาร

ตวอยางผสมกบรเอเจนทหยดลงไปในบรเวณทชอบน าของกระดาษ การวเคราะหปฏกรยาทเกดขน

ระหวางสารตวอยางกบรเอเจนท สามารถทาไดโดยการถายภาพ จากนนนาเขาโปรแกรมประมวล

ภาพ ImageJ แลววดคาความเขมส ซงคาความเขมสจะแปรผนตรงกบปรมาณสารทมอยในตวอยาง

(A) (B)

ภาพท 2-1 แสดงรปแบบของอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทสรางสวนทไมชอบน า (hydrophobic

barrier) ลงบนกระดาษ (A) แบบชองการไหลดานขาง (lateral flow) (B) แบบหลม (well)

(Jokerst et al., 2012)

2.4 ขอมลเกยวกบใบชาแหง

พชรย พรบดเวช (2552) ไดกลาวถงชาเกยวกบลกษณะทวไป และสรรพคณไวดงน

ชามชอสามญ คอ Tea ชอวทยาศาสตร คอ Camellia sinensis ชาแบงไดเปน 6 ประเภท ไดแก ชา

ขาว ชาเหลอง ชาเขยว ชาอหลง ชาดา และชาผเออร แตทพบเหนไดทวไป ไดแก ชาขาว ชาเขยว ชา

อหลง และชาดา ซงชาทกชนดสามารถทาไดจากตนชาตนเดยวกน แตผานกรรมวธแตกตางกน

ออกไป องคประกอบทางเคมในยอดใบชาสดจะประกอบดวยความชนประมาณ 75-80 % สวนท

10

เหลอเปนของแขงทงหมด องคประกอบทางเคมในสวนทเปนของแขงทงหมดแสดงดงตารางท 2-1

ซงองคประกอบเหลานจะสงผลตอคณภาพของชา

ตารางท 2-1 แสดงองคประกอบทางเคมของยอดใบแหงชา

Components Dry weight (%)

Flavanois

(-)-EGCG

(-)-EGC

(-)-ECG

(-)-EC

(+)-GC

(+)-C

Flavonal glucosides

Proanthocyanidins

Caffeine

Amino acids

Carbohydrates

Organic acids

Saponins

Pigments

Vitamins

Soluble minerals

Cellulose

Lignin

Polysaccharides

Lipids

Volatiles

18-32

9-14

4-7

2-4

1-3

1-2

0.5-1

3-4

2-3

3-4

2-4

3-5

0.5-2

0.04-0.07

0.5-0.8

0.6-1.0

2-4

6-8

4-6

4-10

2-4

0.01-0.02

11

ภาพท 2-2 แสดงลกษณะยอดใบชาและ ใบชาแหง (http://www.icontea.com/article-49.html)

ภาพท 2-3 แสดง13โครงสรางของคาเทชนทพบในใบชา

(-)-Epicatechin (EC)

(-)-Epigallocatechin gallate (EGCG)

(-)-Epicatechin gallate (ECG) (-)-Epigallocatechin (EGC)

(+)-catechin (C) (+)-Gallocatechin (GC)

(-)-catechin gallate(CG) (-)-Gallocatechin gallate(GCG)

O

OHOH

HO

OH

OH

OH

O

OOH

HO

OH

OH

OH

OH

OH

O

O

OOH

HO

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

OHOH

HO

OH

OH

O

OHOH

HO

OH

OH

OH

O

OOH

HO

OH

OH

OH

OH

OH

O

O

OHOH

HO

OH

OH

O

OOH

HO

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

12

ในยอดใบชาจะมปรมาณโพลฟนอล (polyphenols) ทงหมดประมาณ 10-35% (dry

weight) โดยสารประกอบโพลฟนอลนสวนใหญเปนสารในกลมฟลาโวนอยด (Flavonoids) ฟลาโว

นอยดเปน secondary metabolite ทแบงได 6 กลมคอ Flavones, flavanones, isoflavones, flavonols,

flavanols และ anthocyanins กลมของฟลาโวนอยดทพบมากทสดในชาคอ Flavanols ซงเรยกวา

Catechins (คาเทชน)

คาเทชน (Catechins) เปนชอเรยก Flavanols ในชา ซงมประมาณ 60-70% ของโพลฟ

นอลทงหมด กลมของ Catechins ทพบมากในชา ไดแก (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG),

(-)-Epigallocatechin (EGC), (-)-Epicatechin-3-gallate (ECG) และ (-)-Epicatechin (EC)

โดย Catechins เหลานมอยประมาณ 90% ของคาเทชนทงหมด กลมของ Catechins ทพบในปรมาณ

นอยลงมาไดแก (-)-Gallocatechin (GC), (+)-Catechin (C), (-)-Gallocatechin gallate (GCG)

และ (-)-Catechin gallate (CG) คาเทชนเปนสารไมมส ละลายน าได ใหรสขม และฝาด

ในชาประกอบดวยสารตานอนมลอสระประเภทฟลาโวนอยด ททรงพลงหลายชนด

โดยเฉพาะสาร Epigallocatechin gallate (EGCG) ซงเปนสารตานอนมลอสระทมฤทธแรง โดยม

ฤทธมากกวาวตามนอถง 20 เทา คาเทชนเปนสารตานอนมลอสระ สามารถจบกบอนมลอสระทเปน

สาเหตของโรคหลายชนด เชน โรคมะเรง โรคหวใจ และภาวะไขมนในเลอดสง เปนตน

2.5 งานวจยทเกยวของ

Fenton et al. (2009, pp. 124-129) ไดสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษรปแบบชองการ

ไหลดานขางใชสาหรบวเคราะหสารชวภาพทหลากหลาย โดยสรางอปกรณแบบกระดาษดวย

วธการตดดวยเครองตดอตโนมต (craft cutting machine) เคลอบกระดาษดวยพลาสตกใส

(larmination) ซงอปกรณทสรางมขอดไดแก ชวยลดการระเหยของรเอเจนท ชวยปองกนไมให

พนผวทจะทาการทดสอบปนเปอนและไมใหสารตวอยางและรเอเจนทรวออกจากอปกรณ มราคา

ถก เหมาะสาหรบไปใชในประเทศทกาลงพฒนา ผลตอปกรณไดครงละหลายอปกรณ

Zhang et al. (2006, pp. 219-224) ไดใชวธ 96-well microplate method วเคราะหหา

ปรมาณสารโพลฟนอล (polyphenol) ในสาหราย ณ ประเทศแคนนาดา ดวยวธ DPPH ทาการ

วเคราะหโดยผสมสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยางลงใน 96-well microplate แลววดสท

จางลงของ DPPH ดวยเครอง microplate reader จากการทดลองพบวา การวเคราะหดวยวธ96-well

microplate method จะใชเวลาในการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระของสารไดนอย วเคราะหไดครง

ละหลายตวอยางและสามารถทาซ าไดด

13

Piletska et al. (2012, pp. 2038-2043) ไดพฒนารปแบบใหมของ Microtiter Plate

สาหรบตรวจวเคราะหทางการแพทย ซงพฒนาโดยมการตรงสารชวภาพและรเอเจนทไวทกระดาษ

ดงภาพท 2-4(A) แลวนาไปไวทถาดหลมทเปดแลววเคราะหการเกดปฏกรยาดวย microtiter plate

readers 7โดยไมมขนตอนอน ๆ เพมเตม แนวคดดงกลาวสามารถประยกตใชกบการวเคราะหได

หลากหลาย เชน การตรวจสอบสารบงชชวภาพชนดตางๆโดยอาศยปฏกรยาทางเอนไซม เชน การ

วเคราะหกลโคส และกรดยรก การตรวจสอบโปรตน การวเคราะหคา pH และการวเคราะหสาร

ตานอนมลอสระ การวเคราะหดวยวธนสามารถทาไดงายโดย7มเพยงขนตอนการเตมสารและ

ขนตอนการตรวจวด จงทาใหสามารถคดกรองสารตวอยางไดรวดเรวเหมาะสาหรบการวเคราะห

ทางการแพทยทตองวเคราะหสารหลายๆอยางในคราวเดยวกน อยางไรกตามวธวเคราะหดงกลาว

จาเปนตองทาในหองปฏบตการ (laboratory based analysis) เนองจากเครอง microplate reader เปน

เครองมอทมขนาดใหญไมสามารถพกพาไปตรวจวดภาคสนามได

(A)

(B)

ภาพท 2-4 (A) แสดงรปรางของกระดาษกรองทตรงดวยสารรเอเจนท (B) แสดงการใชอปกรณ

microtiter plate ททางานรวมกบกระดาษในการทดสอบฤทธตานอนมลอสระ

ของ Gallic acid ดวย DPPH assay

14

Sharpe et al. (2012) ไดพฒนาอปกรณตรวจสอบแบบพกพาสาหรบวเคราะหสารตาน

อนมลอสระในตวอยางอาหารโดยใชการตรงอนภาคนาโนซเรย (Ce)ไวทกระดาษ ซงมลกษณะ7

คลายคลงกบ7เซนเซอรขนาดเลก อปกรณดงกลาววเคราะหไดโดยวดการเปลยนแปลงสทเกดขน

ของปฏกรยารดอกซระหวางสารตานอนมลอสระกบพนผวของอนภาคนาโนซเรย ซงจะเปลยนจาก

สเหลองกลายเปนสน าตาล อปกรณแบบพกพาดงกลาวนาไปวเคราะหสารตานอนมลอสระ เชน

ascorbic acid, gallic acid, vanillic acid, quercetin, caffeic acid, epigallocatechin gallate และได

นาไปวเคราะหกบสารตวอยางจรง ไดแก ชาและเหด ซงไดผลการวเคราะหเชนเดยวกบการ

วเคราะหแบบดงเดม แตวธนมขอด คอ สามารถทดสอบไดโดยไมตองใชเครองมอทมราคาแพง

เนองจากมการใชโปรแกรมประมวลภาพแทน microplate reader spectrophotometer จงมศกยภาพ

ในการวเคราะหในสถานททนอกเหนอจากหองปฏบตการ

ภาพท 2-5 แสดง กราฟมาตรฐานแสดงทไดจากการพลอตความเขมสของอนภาคนาโนซเรยท

เปลยนไปเมอเพมความเขมขนของสารมาตรฐาน และ gallic acid (GA)

และ epigallocatechin gallate(EGCG)

Kriengsak (2006) ไดวเคราะหหาสารตานอนมลอสระของสารสกดผลฝรง ดวยวธ

DPPH assay วดการลดลงของ DPPH ดวยเครอง spectrophotometer ทความยาวคลน 515 nm โดย

ใช trolox เปนสารตานอนมลอสระมาตรฐาน ดวยวธนสามารถสรางกราฟมาตรฐานของ trolox ทม

ชวงความเปนเสนตรงระหวาง 25 -800µM จากนนวเคราะหตวอยางโดยเจอจางสารตวอยางใหม

ความเขมขนทใหสญญาณการวเคราะหอยในชวงความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐาน

รายงานผลการวเคราะหในรปของ µMTE/g fresh mass

15

พชรย พรบดเวช (2552) ไดศกษาฤทธการตานอนมลอสระของสารสกดชา พบวาสาร

สกดชามฤทธตานอนมลอสระสง เนองจากมปรมาณสารฟนอลสง ซงการทดลองพบวา ชาเขยวม

ฤทธการตานอนมลอสระสงทสด รองลงมา คอ ชาสฤด ชาอหลงกานออน ชาพนธ ชาเขยวอหลง

และชาอหลง ตามลาดบ

บทท 3

วธดาเนนการวจย

3.1 เครองมอ อปกรณ และสารเคม

3.1.1 เครองมอและอปกรณ

1. กระดาษกรอง Whatman เบอร 1 (Whatman, China)

2. พลาสตกเคลอบบตร ขนาด A4 216mm x 303mm 100 micron

3. ไมโครปเปต ขนาด 10, 20, 200, 1000 ไมโครลตร

4. มดคตเตอร

5. กรรไกร

6. ทเจาะกระดาษแบบรเดยว

7. เครองเคลอบบตร

8. ขวดสชาขนาด 5 มลลลตร

9. บกเกอรขนาด 50 มลลลตร

10. ปเปตทป

11. ปเปตขนาด 10 มลลลตร

12. เครองปรนพรอมสแกน (Epson รน L210)

13. เครองชง 4 ตาแหนง (METTLER TOLEDO AG 204)

3.1.2 สารเคม

1. gallic acid (3,4,5-trihydroxybenzoic acid) (M.W. 170.12 g/mol, Sigma

Aldrich CAS 149-91-7)

2. trolox (106-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-Carboxylic Acid) (M.W.

250.29 g/mol, Sigma Aldrich CAS53188-07-1)

3.caffeic acid (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid) (M.W. 180.16

g/mol, Sigma Aldrich CAS 331-39-5)

4. L-ascorbic acid (2-oxo-L-threo-hexono-1,4- lactone-2,3-enediol )

(M.W. 176.12 g/mol, Sigma Aldrich CAS 50-81-7)

17

5. quercetin(2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-

one)(M.W. 302.24 g/mol, Sigma Aldrich CAS 117-39-5)

6. DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) (M.W. 394.32 g/mol,

Sigma Aldrich CAS 1898-66-4)

7. เอทานอล (ethanol) (M.W. 46.07 g/mol, Emsure CAS 64-17-5)

3.1 3 สารตวอยางในการทดลอง

ใบชาแหงชนดผง ไดแก ชาอหลงตรา ชาระมงค, ชาลปตน, ชาดาปรงสาเรจ

กลนเลมอน, กรนท(ใบชาเขยวตราจสอะมนท), ชาเขยวมะลตราบานไร 5 ดาว, ชาเขยวจน ตรา

Tops, ชาเขยวญป น ตรา Tops, ชาเขยวกลนขาวคว (ฟจเกนมยชะ) และชาเขยวคาเมลเลย

3.2 แผนการดาเนนการวจย

ภาพท 3-1 แผนผงขนตอนการทาวจย

สรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

ศกษาความเขมขนเรมตนของ DPPH ทเหมาะสม

วเคราะหสารตานอนมลอสระ

- เวลาทเหมาะสม

- ชวงความเปน

เสนตรง,LOD

- %RSD

สารตวอยาง

(ใบชาเขยว

อหลงแหง)

วธ DPPH

แบบดงเดม

เปรยบเทยบ µMGAE/g tea

สารตานอนมลอสระมาตรฐานตาง ๆ ไดแก gallic acid,

trolox, caffeic acid, quercetin และ L-ascorbic acid

18

3.3 วธการทดลอง

3.3.1 การเตรยมสารละลาย

3.3.1.1 การเตรยมสารละลาย DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)

เตรยม stock DPPH ความเขมขน 6.590 mM ปรมาตร 1mLโดยชง DPPH

0.0026 g ละลายในเอทานอล 1 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 0.1, 0.4, 0.7, 1.0, 1.5,

2.0, 2.5, 3.0, 3.5 และ 4.0 mM

3.3.1.2 การเตรยมสารละลาย gallic acid

เตรยม stock gallic acid ความเขมขน 1763 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง

gallic acid 0.0030 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20, 40,

50, 60, 80, 100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM

3.3.1.3 การเตรยมสารละลาย trolox

เตรยม stock trolox ความเขมขน 1199 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง trolox

0.0030 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20, 40, 50, 60, 80,

100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM

3.3.1.4 การเตรยมสารละลาย caffeic acid

เตรยม stock caffeic acid ความเขมขน 1665 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง

caffeic acid 0.0030 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20, 40,

50, 60, 80, 100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM

3.3.1.5 การเตรยมสารละลาย L-ascorbic acid

เตรยม stock L-ascorbic acid ความเขมขน 1703 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง

L-ascorbic acid 0.0030 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20,

40, 50, 60, 80, 100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM

3.3.1.6 การเตรยมสารละลาย quercetin

เตรยม stock quercetin ความเขมขน 1654 µM ปรมาตร 10 mLโดยชง

quercetin 0.0050 g ละลายในเอทานอล 10 mL แลวเจอจางสารละลายใหมความเขมขน 20, 40, 50,

60, 80, 100, 120, 150, 160, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 และ 1,000 µM

3.3.1.7 การเตรยมสารละลายตวอยาง (ใบชาแหง)

ตมน ากลน ปรมาตร 200 mL บนแทนใหความรอนทอณหภม 80 องศา

เซลเซยสแลวจงใสผงชาบดหนก 2 g ลงในบกเกอร ตมเปนระยะเวลา 5 นาท จากนนนาบกเกอรลง

19

จากแทนใหความรอนรอใหสารละลายเยน กรองเอากากออกแลวนาสวนทเปนสารละลายไปใช

วเคราะห

3.4 การสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

วธทใชสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษจะสรางบรเวณสวนกนทไมชอบน า

(hydrophobic barrier) ดวยการตดและเคลอบดวยพลาสตก มขนตอนการสรางโดยเตรยมกระดาษ

กรอง Whatman เบอร 1 ตดใหขนาด 1 cm. x 1 cm. เตรยมพลาสตกเคลอบบตรโดยใชทเจาะ

กระดาษเจาะแผนพลาสตกดานบนมลกษณะเปนวงกลมทมเสนผานศนยกลาง 0.5 cm. ดงภาพท3-2

หลงจากนนนากระดาษกรองทเตรยมไว มาจดเรยงบรเวณพลาสตกทเปนรแลวเขาเครองเคลอบบตร

ดงภาพท3-3

ภาพท 3-2 แสดงการเตรยมกระดาษกรองและแผนพลาสตกเคลอบบตร

ภาพท 3-3 แสดงขนตอนการสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

20

3.5 การวเคราะหฤทธตานอนมลอสระดวยวธ DPPH โดยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

3.5.1 การศกษาความเขมขนเรมตนของ DPPH ทเหมาะสม

เตรยมสารละลาย DPPH ความเขมขน 0.1, 0.4, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5

และ 4.0 mM แลวหยดสารละลาย DPPH ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษโดยในแตละหลม

หยดปรมาตร 0.5 µL และในแตละความเขมขนหยดจานวน 3 หลม จากนนสแกนแตละความ

เขมขนแลวนาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดความเขมของสมวงทเกดขน แลวนา

คาความเขมสมาสรางกราฟมาตรฐาน ซงพลอตระหวางความเขมขน DPPHและคาความเขมส แลว

เลอกความเขมขน DPPH ทเหมาะสมสาหรบใชในการทดสอบดวยวธ DPPH บนอปกรณตรวจวด

แบบกระดาษ

3.5.2 การวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐานดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

3.5.2.1 สารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid

- ศกษาเวลาในการเกดปฏกรยา

เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสาร

ตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 0, 40, 100, 150, 200 µM ในเอทานอล ทาการ

ทดสอบโดยหยดสารละลาย gallic acid ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลม

ละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL จากนนสแกนภาพ

โดยสแกนทกๆ 3 นาทเปนเวลา 39 นาท นาภาพไปเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอ

ตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟระหวางระยะเวลาและคาความเขมส แลวเลอกเวลา ท

เหมาะสมสาหรบใชในการทดสอบดวยวธ DPPH บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

-ศกษาชวงความเปนเสนตรงของสารตานอนมลอสระของสารตานอนมลอสระ

มาตรฐาน gallic acid

เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตาน

อนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 200, 300,

400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 µM ในเอทานอล ทาการทดสอบโดยหยดสารละลาย gallic acid

ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจาก

นนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท แลวนาไปสแกนภาพ

นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส พลอตกราฟระหวางความ

เขมขน gallic acid และคาความเขมสเพอใชสาหรบหาชวงความเปนเสนตรงของ gallic acid

21

- ศกษาความสามารถในการทาซา (reproducibility)


ตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 60 และ100 µM ในเอทานอลทาการทดสอบ

โดยหยดสารละลาย gallic acid ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5

µL (n=10) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปน

เวลา 30 นาท แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขม

ส หลงจากนนคานวณคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (percentage of relative standard

deviation, %RSD)

- ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (Limit of detection)

ขดจากดการตรวจวดของวธการวเคราะหดวย DPPH คอความเขมขนของ

สารตานอนมลอสระททาใหสญญาณของ DPPH ตาวาสญญาณเรมตนเปนสามเทาของคาเบยงเบน

มาตรฐานของแบลงค นาคาความเขมสของของการวเคราะห 0 µM gallic acid (blank) ดวยวธ

DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด gallic acid จากความสมพนธ (Arinbruster และคณะ,

1994)

ILOD = I0 -3SDblank

เมอ ILOD คอคาความเขมสของ DPPH เมอเตม gallic acid ทความเขมขนระดบขดจากดการ

ตรวจวด

I0 คอคาความเขมสของ DPPH ทไมไดเตม gallic acid (blank)

SDblank คอคาเบยงเบนมาตรฐานของคาความเขมสของ DPPH

การคานวณคาขดจากดการตรวจวด gallic acid

จาก ILOD = - mxLOD + c

เมอ m และ c คอ ความชนและจดตดแกนในกราฟมาตรฐาน ตามลาดบ

xLOD คอ ขดจากดการตรวจวด

22

3.5.2.2 สารตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox

- ศกษาเวลาในการเกดปฏกรยา


ตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox ความเขมขน 0, 25, 100, 400, 625 µM ในเอทานอล ทาการ

ทดสอบโดยหยดสารละลาย trolox ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ

0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL จากนนสแกนภาพ

โดยสแกนทกๆ 3 นาทเปนเวลา 39 นาท นาภาพไปเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอ

ตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟระหวางระยะเวลาและคาความเขมส แลวเลอกเวลา ท

เหมาะสมสาหรบใชในการทดสอบดวยวธ DPPH บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

-ศกษาชวงความเปนเสนตรงของสารตานอนมลอสระของสารตานอนมลอสระ

มาตรฐาน trolox


อนมลอสระมาตรฐาน trolox ความเขมขน 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 200, 300, 400,

500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 µM ในเอทานอล ทาการทดสอบโดย

หยดสารละลาย trolox ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3)

ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท

แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส พลอตก

ราฟระหวางความเขมขน trolox และคาความเขมสเพอใชสาหรบหาชวงความเปนเสนตรงของ

trolox

-ศกษาความสามารถในการทาซา (reproducibility)


ตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox ความเขมขน 60 และ100 µM ในเอทานอลทาการทดสอบโดย

หยดสารละลาย trolox ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL

(n=10) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา

30 นาท แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส

หลงจากนนคานวณคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (percentage of relative standard

deviation, %RSD)

23

- ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (Limit of detection)

ทาการศกษาขดจากดการตรวจวดของสารตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox

คลายกบการศกษาในการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid

3.5.2.3 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐานตวอน ๆ

ทาการศกษาการวเคราะห caffeic acid, quercetin และ L-ascorbic acid และ คลายกบการศกษา

gallic acid และ trolox

3.5.3 การวเคราะหตวอยางสารตานอนมลอสระ(ใบชาแหง) ดวยอปกรณตรวจวดแบบ

กระดาษ


อนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 และ 600 µM ในเอ

ทานอลเพอใชในการสรางกราฟมาตรฐาน gallic acid ทาการทดสอบโดยหยดสารละลาย gallic

acid ความเขมขนตางๆลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาท

หลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท แลวนาไป

สแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ แลวสรางกราฟมาตรฐานพลอตระหวางคาความ

เขมขน gallic acid และคาความเขมส

หาปรมาณสารตานอนมลอสระ (ใบชาแหง) โดยเตรยมสารละลายตวอยางใบชา

ตาม 3.3.1.7 จากนนนามาตรวจวดบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ ทาการทดสอบโดยหยด

สารละลายตวอยางใบชาลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาท

หลงจากนนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท แลวนาไป

สแกนภาพ วเคราะหฤทธตานอนมลอสระของสารตวอยาง โดยการตรวจวดคาความเขมสเทยบกบ

กราฟมาตรฐาน gallic acid และคานวณปรมาณสารตานอนมลอสระในรปของคา µmol GA/g tea

3.6 การวเคราะหฤทธตานอนมลอสระแบบดงเดม

เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมล

อสระมาตรฐาน gallic acid ความเขมขน 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500 และ 600 µM ในเอทานอล

เพอใชในการสรางกราฟมาตรฐาน gallic acid โดยผสม DPPH 1.5 mM ปรมาตร 100 µL กบ

สารละลาย gallic acid 20 µL และ เอทานอล 2 mL ตงทงไวในทมด 30 นาท วดดวยเครอง

spectrophotometer ทความยาวคลน 515 nm

24

หลงจากนนผสมสารละลาย DPPH ทเตรยมไวปรมาตร 100 µL กบเอทานอล 2 mL วด

ดวยเครอง spectrophotometer ทความยาวคลน 515 nm เพอทาเปน blank แลวใสสารสารละลาย

ตวอยางใบชาปรมาตร 20 µL รอใหเกดปฏกรยาโดยการเกบไวในทมด 30 นาทหลงจากนนนาไป

วดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 515 nm วเคราะหหาปรมาณโดยใชกราฟมาตรฐานของ

gallic acid และถาสารตวอยางทวเคราะหวดคาไดนอกเหนอจากเสนตรง ตองนาสารละลายทไดมา

เจอจางแลววดคาใหม รายงานผลการวเคราะหในรปของ µmol GAE/g tea

3.7 การวเคราะหความเขมสดวยโปรแกรม ImageJ

1. เปดโปรแกรม ImageJ

2. เลอก open แลวเลอกรปทตองการประมวลผล

ภาพท 3-4 แสดงการเปดโปรแกรม ImageJ

25

3. Set scale ของบรเวณทตรวจวด

ภาพท 3-5 แสดง Set scale ของบรเวณทตรวจวดในโปรแกรม ImageJ

4. ปรบรปใหเหลอเฉพาะสทตองการโดยไปท Image--> adjust-->color threshold จะ

ปรากฏ box ขนมาดงรป เลอก pass ทงหมด เลอก Threshold color : White, Color space : RGB

ปรบสโดยเลอน scale บรเวณ Hue = 191 สวน scale อนใหปรบตามภาพท3-6

ภาพท3-6 แสดงการปรบสในโปรแกรม ImageJ

26

5. ปรบเปนส gray โดยไปท Image--> 8 bit

ภาพท3-7 แสดงการปรบเปนส gray ในโปรแกรม ImageJ

6. ปรบใหเปน gray intensity โดยเลอก Edit--> invert

ภาพท3-8 แสดงการปรบเปน gray intensity ในโปรแกรม ImageJ

7. ตงคาวดความเขมสโดยไปท set measurements จะปรากฏ box ดงรปใหเลอก Are,

Mean gray value, limit to threshold และ display label (ทาเฉพาะครงแรกทใชโปรแกรม) แลวคลก

OK

27

ภาพท3-9 แสดงการ set measurements ในโปรแกรม ImageJ

8. เลอกบรเวณทตองการวด intensity โดยเลอก shortcut ตามแบบรปทตองการ

จากนนลากครอบบรเวณทตองการวด เมอไดบรเวณแลวใหไปท Analyze Measurement หรอใช

Crtl+M ไดเลย คา Mean ทปรากฏคอคา mean gray scale intensity ทไดจากการประมวลภาพ

ภาพท3-10 แสดงการ Analyze Measurement ในโปรแกรม ImageJ

บทท 4

ผลการวจยและอภปราย

4.1 การศกษาความเขมขนเรมตนของ DPPH ทเหมาะสม

เนองดวยการศกษาฤทธตานอนมลอสระดวยวธ DPPH เปนการวดการลดลงของ

สญญาณของ DPPH เมอทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระแลว การศกษาความเขมขนเรมตนของ

DPPH ในการนาไปวเคราะหจงเปนปจจยสาคญ โดยความเขมขนเรมตนทเหมาะสมจะตองเปน

ความเขมขนเรมตนทใหสญญาณทสงและนอกจากนนยงตองสามารถเหนการเปลยนแปลงของ

สญญาณทลดลงไดอยางรวดเรวเมอเตมสารตานอนมลอสระลงไปเพยงเลกนอย งานวจยน

ทาการศกษาความเขมขนเรมตนของ DPPH ทเหมาะสมสาหรบใชในการทาปฏกรยากบสารตาน

อนมลอสระมาตรฐาน ศกษา DPPH เรมตนทความเขมขนตาง ๆ ตงแต 0.1-4 mM โดยเตรยม

สารละลาย DPPH ความเขมขนตาง ๆ ในตวทาละลายเอทานอล จากนนหยดสารละลาย DPPH แต

ละความเขมขนปรมาตร 0.5 µL ลงบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (n=3) ปลอยไวในทมดเปน

เวลา 30 นาท แลวนาอปกรณทไดไปสแกนแลวนาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวด

ความเขมของสมวงทเกดขน (ตารางท 4-2 ภาคผนวก) นาคาความเขมสมาสรางกราฟ โดยพลอต

แสดงความสมพนธระหวางความเขมขน DPPH และคาความเขมสจะไดกราฟดงแสดงในภาพท 4-1

ภาพท 4-1 (A) แสดงสของสารละลาย DPPH ทความเขมขนตาง ๆ (B) กราฟพลอตระหวางคา

ความเขมสและความเขมขนของสารละลาย DPPH (n=3)

29

จากกราฟมาตรฐานทแสดงความสมพนธระหวางความเขมขนและความเขมสของ DPPH

พบวาเมอเพมความเขมขนของ DPPH เพมขน ความเขมสของ DPPH กเพมขนตามไปดวย จดท

สญญาณเรมตนมการเปลยนแปลงมากทสดคอความเขมขนของ DPPH ประมาณ 1.5 mM ในการ

ทดลองนจงเลอก DPPH ทมความเขมขน 1.5 mM เปนความเขมขนทเหมาะสมทจะใชเปนความ

เขมขนเรมตนในการทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ เนองจากจะสามารถเหนการเปลยนแปลง

สญญาณไดอยางชดเจนเมอ DPPH ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระเพยงเลกนอยและความ

เขมขนของ DPPH ลดตาลง

4.2 การศกษาเวลาทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH และสารตานอนมล

อสระมาตรฐาน gallic acid และ trolox

ศกษาเวลาทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH และสารตานอนมลอสระ

มาตรฐาน gallic acid และ trolox ทาการทดสอบโดยหยดสารละลายสารตานอนมลอสระมาตรฐาน


นนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL จากนนสแกนภาพโดยสแกนทก ๆ 3 นาทเปนเวลา 39

นาท นาภาพไปเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส แลวพลอตกราฟ

ระหวางระยะเวลาและคาความเขมส จากการศกษาเวลาในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH และสาร

ตานอนมลอสระมาตรฐานทงสองชนดคอ gallic acid และ trolox ทความเขมขนตางๆ ไดผลการ

ทดลองดงแสดงในกราฟทพลอตระหวางความเขมสของ DPPH กบเวลาในการเกดปฏกรยาดงภาพ

ท 4-2 (A) และ 4-2 (B) สาหรบการวเคราะห gallic acid และ trolox ตามลาดบ

30

ภาพท 4-2 การศกษาเวลาในการเกดปฏกรยาบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษระหวาง DPPH กบ

สารตานอนมลอสระมาตรฐาน (A) gallic acid (n=3) (B) trolox (n=3)

จากการศกษาเวลาในการเกดปฏกรยาระหวาง DPPH 1.5 mM กบสารตานอนมลอสระ

มาตรฐาน gallic acid และ trolox ทมความเขมขนตาง ๆ พบวา การศกษาในสารตานอนมลอสระ

ทงสองใหผลคลายคลงกนกลาวคอสญญาณของ DPPH จะคอย ๆ ลดลงเมอเวลาเพมขนแสดงให

เหนถงการเกดปฏกรยาระหวางสารตานอนมลอสระทงสองกบ DPPH และคาความเขมสจะคงทเมอ

เกดปฏกรยาเปนระยะเวลา 30 นาท เปนตนไปในทกๆความเขมขนทศกษา แสดงวาระยะเวลา 30

นาท เปนระยะเวลาทเหมาะสมสาหรบการวเคราะหสารตานอนมลอสระดวยวธ DPPH บนอปกรณ

ตรวจวดแบบกระดาษทไดพฒนาขนซงสอดคลองกบวธ DPPH ทมระบบตรวจวดความเขมสดวย

เครองสเปกโตรโฟโตมเตอรทไดมการศกษากอนหนาน (Cheng et al., 2006; Mishra et al., 2012 ;

Noipa et al., 2011)

4.3 ศกษาคาทางการวเคราะห (Analytical features) ของอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ

ทพฒนาขนในการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน

4.3.1 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid

gallic acid เปนกรดอนทรยทาหนาทเปนสารตานอนมลอสระ ชวยปองกนเซลลจาก

ปฏกรยาออกซเดชน (oxidation reaction) ชวยปองกนเซลลจากความเครยดเมออายมากขนซงชวย

31

ลดโรคหวใจและโรคมะเรงในผสงอาย โดยสามารถพบไดในอาหาร เชน บลเบอรร แอปเปล ใบชา

วอลนท (Pulugurtha, 2011; Tremblay, 2011)

ภาพท 4-3 แสดงโครงสรางทางเคมของ gallic acid

ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะห gallic acid โดยเตรยมสาระลาย DPPH

ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid ชวงความ

เขมขน 0-100 µM ในเอทานอล ทาการทดสอบโดยหยดสารละลาย gallic acid ความเขมขนตางๆลง

บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษหลมละ 0.5 µL (n=3) ทงไว 4 นาทหลงจากนนหยดสารละลาย

DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาทไดผลดงแสดงในภาพท 4-4 และตารางท

2 ภาคผนวก จะเหนวา เมอความเขมขนของ gallic acid เพมขน ความเขมสของ DPPH มคาลดลง

เนองจากอนมลอสระ DPPH ทมสมวง ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ gallic acid สงผลใหส

จางลงเมอความเขมขนของสารตานอนมลอสระมคาเพมขนและกราฟดงแสดงในรปท 4-4B มชวง

ความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ gallic acid เทากบ 0-600 µM R² = 0.9879

ภาพท 4-4 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ gallic acid ความเขมขนตาง ๆ

ระยะเวลา 30 นาท (B) แสดงคาความเขมส (color intensity) หลงจากการทาปฏกรยา

ระหวางสารละลาย DPPH กบ gallic acid ความเขมขนตาง ๆ ทระยะเวลา 30นาท (n=3)

32

ศกษาความสามารถในการทาซ า (reproducibility) ของการวเคราะหสารตานอนมลอสระ

มาตรฐาน gallic acid โดยศกษาทความเขมขนของ gallic acid ในชวงความเปนเสนตรงคอ 50 และ

250 µM ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาคาเบยงเบนมาตรฐานของการวเคราะหซ าทง 2 ความเขมขน ม

คาใกลเคยงกน และจากการคานวณใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (percentage of

relative standard deviation, %RSD) เทากบ 5.88 และ 17.30 ตามลาดบ (ตารางท 4-4 ภาคผนวก) จะ

เหนวาท gallic acid ความเขมขนตา จะมคา %RSD ตา เนองจากสญญาณทไดจากการวเคราะหมคา

สง แตทความเขมขนของ gallic acid ทสงจะใหคา %RSD สงเนองจากสญญาณเฉลยมคาต า (วธการ

คานวณแสดงในภาคผนวก) อยางไรกตามเมอพจารณาทคาเบยงเบนมาตรฐานแลวจะเหนวาวธ

DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการวเคราะหสารมาตรฐาน gallic acid

ศกษาคาขดจากดการตรวจวด (limit of detection) โดยนาคาความเขมสของของการ

วเคราะห 0 µM gallic acid (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด gallic acid

(วธการคานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ gallic acid ทต าทสดทวธ DPPH บน

อปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 2.90 µM ซงพบวามคาใกลเคยงกบ

คาทมรายงานกอนหนาน (Piletska et al., 2012)

4.3.2 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox

trolox เปนอนพนธของวตามนอ ทดดแปลงโครงสรางโดยการเปลยนอลเคนเปนหม

คารบอกซลก ทาใหสามารถละลายน าไดดขน จงทาใหการออกฤทธเรวกวาวตามนอ พบวาวตามนอ

ตองใชเวลานานเปนชวโมงหรอเปนวน แต trolox ออกฤทธเกอบจะทนทในหลายโมเดล (ณฏฐา

รชตะนาวน, 2547) ดงนนในงานวจยจงไดศกษาการวเคราะหสารมาตรฐาน trolox ดวยอปกรณท

พฒนาขน

ภาพท 4-5 แสดงโครงสรางทางเคมของ trolox

ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน trolox โดย

เตรยมสาระลาย DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระ

33

มาตรฐาน trolox ความเขมขน 0-1500 µM ในเอทานอล ทาการทดสอบโดยหยดสารละลาย trolox


นนหยดสารละลาย DPPH หลมละ 0.5 µL วางทงไวในทมดเปนเวลา 30 นาท แลวนาไปสแกนภาพ

ไดผลดงแสดงในภาพท 4 - 6 จะเหนวา เมอเพมความเขมขนของ trolox จะพบวาความเขมสของ

DPPH มคาลดลง ดงแสดงในภาพท 4 - 6 (A) นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคา

ความเขมส (ตารางท 4-6 ภาคผนวก) จากนนพลอตกราฟแสดงความสมพนธระหวางความเขมส

มวงกบความเขมขนของ trolox พบวาสญญาณมคาลดลงเมอ trolox เพมขนดงภาพท 4 – 6 (B) และ

กราฟดงกลาวมชวงความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ trolox เทากบ

0-1000 µM R² = 0.9905

ภาพท 4 - 6 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ trolox ความเขมขนตาง ๆ

ระยะเวลา 30 นาท (B) แสดงคาความเขมส (Color Intensity) หลงจากการทาปฏกรยา

ระหวางสารละลาย DPPH กบ trolox ความเขมขนตาง ๆ ทระยะเวลา 30นาท (n=3)


มาตรฐาน trolox โดยศกษาทความเขมขนของ trolox ในชวงความเปนเสนตรงคอ 50 และ 500 µM

ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (Percentage of relative

34

standard deviation, %RSD) เทากบ 2.22 และ 7.64 ตามลาดบ (ตารางท 4-7 ภาคผนวก) ผลการ

ทดลองดงกลาวแสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการวเคราะห

สารมาตรฐาน trolox (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก)


วเคราะห 0 µM trolox (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด trolox (วธการ

คานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ trolox ทต าทสดทวธ DPPH บนอปกรณ

ตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 67.56 µM ซงพบวามคาใกลเคยงกบคาทเคย

ไดรายงานกอนหนาน (Cheng et al., 2006)

4.3.3 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน caffeic acid

caffeic acid สามารถพบไดในสวนตาง ๆ ของพช มสมบตตานปฏกรยาออกซเดชน ชวย

ปองกนการเกดโรคหวใจและยบย งการดดซม Cu2+ ทมสวนไปเรงใหเกดปฏกรยาออกซเดชน

ของไลโพโปรตนทมความหนาแนนตา (low density lipoprotein) ในรางกายมนษย (Gorinstein

et al., 2001)

ภาพท 4-7 แสดงโครงสรางทางเคมของ caffeic acid

ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะห caffeic acid โดยเตรยมสาระลาย DPPH

ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระมาตรฐาน caffeic acid ความ

เขมขน 0-1000 µM ในเอทานอล ทาการวเคราะหคลายกบการศกษา gallic acid และ trolox ไดผลดง

แสดงในภาพท 4-8 จะเหนวา เมอความเขมขนของ caffeic acid เพมขน ความเขมสของ DPPH มคา

ลดลง เนองจากอนมลอสระ DPPH ทมสมวง ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ caffeic acid

สงผลใหสจางลงเมอความเขมขนของสารตานอนมลอสระมคาเพมขนดงแสดงในภาพท 4-8 (A)

แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส (ตารางท

35

4-9 ภาคผนวก) พบวาใหกราฟทพลอตระหวางความเขมสและความเขมขนของ caffeic acid ดง

ภาพท 4-8 (B) และกราฟดงกลาวมชวงความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ caffeic acid

เทากบ 0-800 µM R² = 0.9919

ภาพท 4 - 8 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ caffeic acid ความเขมขนตาง ๆ


ระหวางสารละลาย DPPH กบ caffeic acid ความเขมขนตาง ๆ ทระยะเวลา 30นาท

(n=3)


มาตรฐาน caffeic acid โดยศกษาทความเขมขนของ caffeic acid ในชวงความเปนเสนตรงคอ 50

และ 300 µM ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (percentage

of relative standard deviation, %RSD) เทากบ 1.50 และ 2.87 ตามลาดบ (ตารางท 4-10 ภาคผนวก)

แสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการวเคราะหสารมาตรฐาน

caffeic acid (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก)


วเคราะห 0 µM caffeic acid (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด caffeic

36

acid (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ caffeic acid ทต าทสดทวธ DPPH

บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 7.01 µM

4.3.4 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน quercetin

quercetin เปนสารเคมทพบไดในพช มกจะอยตามเปลอกไมและผลไม เชน แอปเปล, ชา,

หวหอม และไวนแดง เปนไบโอฟลาโวนอยดทมประสทธภาพตอตานอนมลอสระและลดอาการ

อกเสบ ซงทาใหนามาใชชวยบารงสขภาพไดมากมาย เชน ใชลดอาการแพไดเนองจากชวยลดการ

ปลอยฮสตามนจากเซลลมาสโตไซทได (วนย ดะหลน, 2550)

ภาพท 4-9 แสดงโครงสรางทางเคมของ quercetin

ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะห quercetin โดยเตรยมสาระลาย DPPH

ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระมาตรฐาน quercetin ความ

เขมขน 0-1000 µM ในเอทานอล ทาการวเคราะหคลายกบการศกษา gallic acid และ trolox ไดผลดง

แสดงในภาพท 4-10 จะเหนวา เมอความเขมขนของ quercetin เพมขน ความเขมสของ DPPH มคา

ลดลง เนองจากอนมลอสระ DPPH ทมสมวง ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ quercetin สงผล

ใหสจางลงเมอความเขมขนของสารตานอนมลอสระมคาเพมขนดงแสดงในภาพท 4-10 (A) แลว

นาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวดคาความเขมส (ตารางท 4-12

ภาคผนวก) พบวากราฟทไดจากการพลอตระหวางความเขมสกบความเขมขนของ quercetin ม

ลกษณะดงภาพท 4-10 (B) และกราฟดงกลาวมชวงความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ

quercetin เทากบ 0-800 µM R² = 0.9951

37

ภาพท 4 - 10 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ quercetin ความเขมขนตาง ๆ


ระหวางสารละลาย DPPH กบ quercetin ความเขมขนตาง ๆ ทระยะเวลา 30นาท

(n=3)


มาตรฐาน quercetin โดยศกษาทความเขมขนของ quercetin ในชวงความเปนเสนตรงคอ 50 และ

400 µM ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพทธ (Percentage of

relative standard deviation, %RSD) เทากบ 3.32 และ 6.82 ตามลาดบ (ตารางท 4-13 ภาคผนวก)

แสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการวเคราะหสารมาตรฐาน

quercetin (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก)


วเคราะห 0 µM quercetin (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด quercetin

(วธการคานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ quercetin ทต าทสดทวธ DPPH บน

อปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 0.90 µM

4.3.5 ศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน L-ascorbic acid

L-ascorbic acid เปนรปทออกฤทธของวตามนซ วตามนซมลกษณะเปนผลกสขาว ท

สามารถละลายน าไดดมาก คงตวในอากาศเมออยในสภาวะบรสทธและแหง แตสลายตวอยาง

38

รวดเรวเมอโดนความชนและแสง (ณฏฐา รชตะนาวน, 2547) วตามนซแสดงสมบตเปนสารตาน

ปฏกรยาออกซเดชนโดยทาหนาทยบย งการเกดอนมลอสระทเกดขน บรเวณพนธะคของกรดไขมน

โดยทาลายอนมลอสระทเกดขนดวยการเปลยนไฮโดรเจนเปอรออกไซดทเกดขนจากปฏกรยา

ออกซเดชนไปเปนสารทมความเสถยรมากขน (Mitsumoto et al.,1991) และจบกบโลหะไอออนท

เปนสารเรงปฏกรยาออกซเดชน (Frankel, 1996)

ภาพท 4-11 แสดงโครงสรางทางเคมของ L-ascorbic acid

ศกษาชวงความเปนเสนตรงของการวเคราะห L-ascorbic acid โดยเตรยมสาระลาย

DPPH ความเขมขน 1.5 mM ในเอทานอล และเตรยมสารตานอนมลอสระมาตรฐาน L-ascorbic

acid ความเขมขน 0-1000 µM ในเอทานอล ทาการวเคราะหคลายกบการศกษา gallic acid และ

trolox ไดผลดงแสดงในภาพท 4-12 จะเหนวา เมอความเขมขนของ L-ascorbic acid เพมขน ความ

เขมสของ DPPH มคาลดลง เนองจากอนมลอสระ DPPH ทมสมวง ทาปฏกรยากบสารตานอนมล

อสระ L-ascorbic acid สงผลใหสจางลงเมอความเขมขนของสารตานอนมลอสระมคาเพมขนดง

แสดงในภาพท 4-12 (A) แลวนาไปสแกนภาพ นาเขาโปรแกรมประมวลภาพ ImageJ เพอตรวจวด

คาความเขมส (ตารางท 4-15 ภาคผนวก) พบวาคาความเขมสมคาลดลงเมอ L-ascorbic acid

เพมขนดงภาพท 4-10 (B) และกราฟดงกลาวมชวงความเปนเสนตรงในชวงความเขมขนของ L-

ascorbic acid เทากบ 0-900 µM R² = 0.9934

39

ภาพท 4 - 12 (A) แสดงลกษณะสของ DPPH หลงจากทาปฏกรยากบ L-ascorbic acid ความ

เขมขนตาง ๆ ระยะเวลา 30 นาท (B) แสดงคาความเขมส (Color Intensity) หลงจาก

การทาปฏกรยาระหวางสารละลาย DPPH กบ L-ascorbic acid ความเขมขนตาง ๆ

ทระยะเวลา 30นาท (n=3)


มาตรฐาน L-ascorbic acid โดยศกษาทความเขมขนของ L-ascorbic acid ในชวงความเปน

เสนตรงคอ 50 และ 400 µM ความเขมขนละ 10 ซ าพบวาใหคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐาน

สมพทธ (percentage of relative standard deviation, %RSD) เทากบ 0.52 และ 2.23 ตามลาดบ

(ตารางท 4-16 ภาคผนวก) แสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนมความเทยงสงในการ

วเคราะหสารมาตรฐาน L-ascorbic acid (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก)


วเคราะห 0 µM L-ascorbic acid (blank) ดวยวธ DPPH มาคานวณหาคาขดจากดการตรวจวด

L-ascorbic acid (วธการคานวณแสดงในภาคผนวก) พบวาความเขมขนของ L-ascorbic acid

ทต าทสดทวธ DPPH บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษสามารถวเคราะหไดมคาเทากบ 37.23 µM

40

จากการวเคราะหสามาตรฐานทง 5 ชนดดวยอปกรณทพฒนาขนสามารถสรปคาทางการ

วเคราะห (analytical features) ไดดงน

ตารงท4-1คาทางการวเคราะห (analytical features) จากการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน

ดวยอปกรณดพพเอชแบบกระดาษ

Antioxidant standards Linear range Reproducibility

(%RSD)

LOD

(µM) µM R2

gallic acid 0-600 0.9879 5.88-17.30 2.90

trolox 0-1000 0.9905 2.22-7.64 67.56

caffeic acid 0-800 0.9919 1.50-2.87 7.01

quercetin 0-800 0.9951 3.32-6.82 0.90

L-ascorbic acid 0-900 0.9934 0.52-2.23 37.23

4.4 การวเคราะหตวอยางสารตานอนมลอสระ (ใบชาแหง) ดวยอปกรณตรวจวดแบบ

กระดาษและวธ DPPH แบบดงเดม

จากการศกษาการวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐาน gallic acid, trolox, caffeic

acid, quercetin และ L-ascorbic acid พบวาสามารถทาไดโดยใชสารตานอนมลอสระมาตรฐาน

ปรมาตร 0.5 µL และDPPH ความเขมขน 1.5 mM ปรมาตร 0.5 µL ทาปฏกรยากนใชระยะเวลา 30

นาท สามารถวเคราะหตวอยางไดครงละหลายตวอยางพรอมกนและใชสารในการวเคราะหเพยง 1

µL ใหคาการวเคราะหทมความเทยงสง แสดงใหเหนวาวธ DPPH บนอปกรณทพฒนาขนสามารถ

ใชวเคราะหไดจรง ขนตอนตอไปจงทาการเปรยบเทยบระหวางการวเคราะหตวอยางสารตานอนมล

อสระในใบชาแหง ดวยอปกรณตรวจวดแบบกระดาษ (paper-based assay) และวธ DPPH แบบ

ดงเดม (spectrophotometric assay) โดยใชตวอยางชาชงทงหมด 9 ชนด แสดงฤทธตานอนมลอสระ

ของตวอยางชาในคา gallic acid equivalent (GAE) มหนวย µmol gallic acid equivalent/g tea ซง

หมายถงความสามารถในการตานอนมลอสระเทยบเทา µmol gallic acid ตอหนงกรมของชา จาก

การวเคราะหไดผลการทดลองดงแสดงภาพท 4-13 (แสดงขอมลการวเคราะหตารางท 4-17, 4-18

และแสดงวธการคานวณในภาคผนวก)

41

ภาพท 4 - 13 แผนภมแทงแสดง GAE ในหนวย µmol GA/g tea ของการวเคราะหตวอยางชา

sample 1-9 ดวยวธทพฒนาขน(paper-based assay) และวธ DPPH แบบดงเดม

(spectrophotometric assay)

จากการวเคราะหตวอยางชาทง 9 ชนดนาคาจาการทดลองไปเปรยบเทยบคาทางสถตโดย

ใช linear regression ในการวเคราะหความแตกตางของการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระทไดจาก

วธทงสอง ทาไดโดยพลอตกราฟคาฤทธตานอนมลอสระทวเคราะหไดจากวธดงเดม

(spectrophotometric assay) เทยบกบคาทไดจากการวเคราะหดวยวธทพฒนาขน (paper-based

assay) หากการวเคราะหตวอยางดวยวธทงสองมคาไมแตกตางกน จะไดคา slope และ intercept

ของกราฟ ใกลเคยง 1 และ 0 ตามลาดบ (Miller et al., 2000)

ดงแสดงภาพท 4-14

42

ภาพท 4 – 14 กราฟ linear regression แสดง GAE ในหนวย µmol GA/g tea ของการวเคราะห

ตวอยางชา sample 1-9 ระหวางวธทพฒนาขน (paper-based assay) และวธ DPPH

แบบดงเดม (spectrophotometric assay)

จากสมการ y = 1.1018 (±0.0653)x + 3.4085(±16.6245), R2 = 0.9956 กราฟมคา

intercept เทากบ 3.4085 (±16.6245) คาใกลเคยง 0 และกราฟมคา slope เทากบ 1.1018 (±0.0653)

ซงเปนคาทใกลเคยงกบ 1 ทระดบความเชอมน 95% แสดงใหเหนวาคา GAE ทวเคราะหไดระหวาง

วธทพฒนาขน (paper-based assay) และวธ DPPH แบบดงเดม (spectrophotometric assay) มคาไม

แตกตางกนอยางมนยสาคญ เปนการยนยนวาวธทพฒนาขนสามารถวเคราะหฤทธตานอนมลอสระ

ไดแมนยาเทยบเทากบวธวเคราะหแบบดงเดม นอกจากนนจะเหนวาวธทพฒนาขน (paper-based

assay) เปนวธทใชปรมาตรสารตวอยางและรเอเจนทปรมาตรรวมเพยง 1 µL ซงนอยกวาปรมาตรท

ใชในการวเคราะหแบบดงเดมถง 2000 เทา สามารถลดของเสยทเกดขนภายหลงจากการวเคราะห

ไดมาก อปกรณสามารถวเคราะหไดพรอมกนทละหลาย ๆ ตวอยาง (>20 ตวอยางตอครง) ใช

อปกรณแบบกระดาษทมราคาถกในการวเคราะหและใชสแกนเนอรรวมกบโปรแกรมประมวลผล

ภาพเปนระบบตรวจวดสญญาณ ทาใหการวเคราะหสามารถทาไดในสถานททไมมเครองมอใน

43

หองปฏบตการ อปกรณมแนวโนมสามารถตรวจวดฤทธตานอนมลอสระในสารตวอยางทสนใจ

คราวละมาก ๆ ไดเปนอยางด

บทท 5

สรปผลการวจย

ในงานวจยนไดพฒนาวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษเพอวเคราะหแบบร

ผลเรวของความสามารถการตานอนมลอสระในตวอยางทสนใจโดยอปกรณทพฒนาขนมคณสมบต

ไดแก ทดสอบตวอยางไดหลายๆตวอยางในคราวเดยวกน ใชสารตวอยางและรเอเจนทในการ

วเคราะหปรมาณนอย ใชเวลาการวเคราะหนอย มคาการวเคราะหถก และใชเครองมอการตรวจวด

สญญาณทไมแพงอกทงใหผลการวเคราะหสารตานอนมลอสระในตวอยางมความถกตองและ

แมนยา

จากการทดลองไดสรางอปกรณตรวจวดแบบกระดาษโดยสรางบรเวณสวนกนทไมชอบ

น า (hydrophobic barrier) ดวยการตดและเคลอบดวยพลาสตก มลกษณะบรเวณวเคราะหเปนแบบ

หลม พบวาอปกรณทพฒนาขนสามารถใชวเคราะหสารละลายสารตานอนมลอสระทมเอทานอล

เปนตวทาละลายไดด บรเวณทไมชอบน าสามารถกนสารละลายทใชวเคราะหใหอยภายในหลมได

เปนอยางด การศกษาสภาวะทเหมาะสมโดยการใชอปกรณตรวจวดแบบกระดาษวเคราะหฤทธตาน

อนมลอสระดวยวธ DPPH ในสารตานอนมลอสระมาตรฐาน ไดแก gallic acid, trolox, caffeic acid,

quercetin และ L-ascorbic acid พบวา DPPH ทมความเขมขน 1.5 mM เปนความเขมขนทเหมาะสม

ทจะใชเปนความเขมขนเรมตนในการทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระ เนองจากจะสามารถเหน

การเปลยนแปลงสญญาณไดอยางชดเจนเมอ DPPH ทาปฏกรยากบสารตานอนมลอสระเพยง

เลกนอยและความเขมขนของ DPPH ลดตาลง ระยะเวลา 30 นาท เปนระยะเวลาทเหมาะสมสาหรบ

การวเคราะหสารตานอนมลอสระดวยวธ DPPH บนอปกรณตรวจวดแบบกระดาษทไดพฒนาขน

เนองจากคาความเขมสจะคงทเมอเกดปฏกรยาเปนระยะเวลา 30 นาท เปนตนไปในทก ๆ ความ

เขมขนทศกษา ซงในการศกษาสภาวะทเหมาะสมโดยการใชอปกรณตรวจวดแบบกระดาษวเคราะห

ฤทธตานอนมลอสระดวยวธ DPPH ในสารตานอนมลอสระมาตรฐานนน สามารถทาไดโดยหยด

สารตานอนมลอสระ 0.5 µL หลงจากนนหยดสารละลาย DPPH 1.5 mM ปรมาตร 0.5 µL ปลอยทง

ไวใหสารตานอนมลอสระทาปฏกรยากบ DPPH เปนเวลา 30 นาทแลวนาไปสแกนและวเคราะห

ผลดวยโปรแกรม ImageJ ผลการทดสอบประสทธภาพของวธดพพเอชบนอปกรณตรวจวดแบบ

กระดาษ พบวาใหผลการวเคราะหทด มความสามารถในการทาซ าไดด และมขดจากดการตรวจวด

ตา เมอวเคราะหสารตานอนมลอสระในตวอยางชาทง 9 ชนดระหวางวธทพฒนาขน(paper-based

assay) และวธ DPPH แบบดงเดม (spectrophotometric assay) พบวาคา GAE ทวเคราะหไดทงสอง

45

วธมคาไมแตกตางกนอยางมนยสาคญ นอกจากนวธทพฒนาขน(paper-based assay)เปนวธทใช

ปรมาตรสารตวอยางและรเอเจนทปรมาตรรวมเพยง1µLซงเปนปรมาตรรวมในการวเคราะหทนอย

กวาการวเคราะหแบบดงเดมถง2000เทาอปกรณถกออกแบบใหสามารถวเคราะหไดพรอมกนทละ

หลายๆตวอยาง (>20ตวอยางตอครง) เหมาะกบการวเคราะหแบบรผลรวดเรว (high throughput

analysis) สามารถนาไปใชวเคราะหแบบคดกรอง (screening) ในการศกษาฤทธตานอนมลอสระใน

ตวอยางอาหารและผลตภณฑจากธรรมชาตทสนใจได อปกรณแบบกระดาษเปนอปกรณทมมราคา

ถกและใชสแกนเนอรรวมกบโปรแกรมประมวลผลภาพเปนระบบตรวจวดสญญาณไมจาเปนตอง

พงพาเครองมอราคาแพงในการวเคราะห อปกรณสามารถพกพาไปตรวจวดภาคสนามไดเนองจากม

ขนาดเลกและน าหนกเบา จากงานวจยนชใหเหนวาอปกรณทพฒนาขนสามารถตรวจวดฤทธตาน

อนมลอสระในสารตวอยางทสนใจไดจรง

บรรณานกรม

ณฎฐา รชตะนาวน. (2547). สารตานอนมลอสระ. แสงแดด และผวหนง, 433-449.

บหรน พนธสวรรค, ไมตร สทธจตต และสพกตร พวงบางโพ. (2553). ฤทธตานอนมลอสระของ

กะทกรก ทองพนชง ผกหวานปาเพกา และมะระขนก ในพนทมหาวทยาลยนเรศวร

พะเยา. รายงานวจย, มหาวทยาลยนเรศวรพะเยา.

ปรยนนท บวสด. (2549). การตรวจสอบความสามารถในการเปนสารแอนตออกซแดนทของ

เครองดมชาโดยวธไซคลกโวลแทมเมตร. ปรญญานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต,

สาขาวชาเคม, คณะวทยาศาสตร, มหาวทยาลยศลปากร.

เสาวนย เหลาสงห, ศรธร อางแกว และมะลวรรณ อมตธงไชย. (2554). เทคนคตรวจวด

ความสามารถตานอนมลอสระโดยรวมแบบใหมดวยเทคนคแอมเพอรโรเมทรในระบบ

ทมการไหลทขวไฟฟากลาสซคารบอนทดดแปรดวยคารบอนนาโนทวบ. ปรญญานพนธ

วทยาศาสตรมหาบณฑต, สาขาวชาเคม, คณะวทยาศาสตร, มหาวทยาลยอบลราชธาน.

Apak, R., Güçlü, K., Özyürek, M., & Karademir, S. E.(2004). Novel total antioxidant capacity

index fordietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing

capability in the presence15of neocuproine: CUPRAC method. Journal of agricultural

and food chemistry, 52(26), 7970-7981.

Benzie, I. F., & Strain, J.(1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of

“antioxidant power”: the FRAP assay. Analytical biochemistry, 239(1), 70-76.

Bortolomeazzi, R., Verardo, G., Liessi, A., & Callea, A.( 2010). Formation of

dehydrodiisoeugenol and dehydrodieugenol from the reaction of isoeugenol and

eugenol with DPPH radical and their role inthe radical scavenging activity. Food

Chemistry 2010, 118(2), 256-265.

Cao, G., Verdon, C. P., Wu, A., Wang, H., & Prior, R. L.(1995). Automated assay of oxygen

radical absorbance capacity with the COBAS FARA II. Clinical Chemistry, 41(12),

1738-1744.

Chevion, S., Roberts, M. A., & Chevion, M.(2000). The use of cyclic voltammetry for the

evaluation of antioxidant capacity. Free Radical Biology and Medicine , 28(6),

860-870.

47

Cheng, Z., Moore, J., &Yu, L. (2006). High-throughput relative DPPH radical scavenging

capacity assay. Journal of agricultural and food chemistry, 54(20), 7429-7436.

Dungchai, W., Chailapakul, O., & Henry, C. (2011). A low-cost, simple, and rapid fabrication

method for paper-based microfluidics using wax screen-printing. Analyst, 136(1),

77-82.

Hung, P. V., Maeda, T., Miyatake, K., & Morita, N. (2009). Total phenolic compounds and

antioxidantcapacity of wheat graded flours by polishing method. Food Research

International , 42(1), 185-190.

Halliwell, B. (1999). Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the

beginning). Free radical research , 31(4), 261-272.

Katsube, T., Tabata, H., Ohta, Y., Yamasaki, Y., Anuurad, E., Shiwaku, K., & Yamane, Y.

(2004). Screening for antioxidant activity in edible plant products: comparison of

low-density lipoprotein oxidation assay, DPPH radical scavenging assay, and

Folin-Ciocalteu assay. Journal of agricultural and food chemistry, 52(8), 2391-2396.

Kedare, S. B., & Singh, R. (2011). Genesis and development of DPPH method of antioxidant

assay. Journal of food science and technology , 48(4), 412-422.

Kriengsak, T. (2006). Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating

antioxidant activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and

Analysis, 19 (7), 669–675.

Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., & Whitesides, G. M. (2008). Patterned paper as a

platform for inexpensive, low‐volume, portable bioassays. Angewandte Chemie

International Edition, 46(8), 1318-1320.

Miller, J. C., & Miller, J. N. (2000). Statistics and chemometrics for analytical chemistry (4th ed.).

England: Pearson Education.

Miller, N. J., Rice-Evans, C., Davies, M. J., Gopinathan, V., & Milner, A. (1993). A novel

method formeasuring antioxidant capacity and its application to monitoring the

antioxidant status in prematureneonates. Clinical science, 84, 407-407.

Molyneux, P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for

estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol , 26(2), 211-219.

48

Mulholland, C. W., & Strain, J. J. (1991). Serum total free radical trapping ability in acute

myocardialinfarction. Clinical Biochemistry , 24(5), 437-441.

Nakabeppu, Y., Sakumi, K., Sakamoto, K., Tsuchimoto, D., Tsuzuki, T., & Nakatsu, Y. (2006).

Mutagenesis and carcinogenesis caused by the oxidation of nucleic acids. Biological

chemistry , 387(4), 373-379.

Piletska, E. V., Piletsky, S. S., Whitcombe, M. J., Chianella, I., & Piletsky, S. A. ( 2012).

Development of aNew Microtiter Plate Format for Clinically Relevant Assays.

Analytical Chemistry, 84(4), 2038-2043.

Pisoschi1, A .M., & Negulescu, G. (2011). Methods for Total Antioxidant Activity

Determination: A Review. Biochem & Anal Biochem, 1(106).

Prior, R. L., & Wu, X. ( 2005). Schaich, K., Standardized methods for the determination of

antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of

agricultural and food chemistry, 53(10), 4290-4302.

Sies, H., & Stahl, W.(1995). Vitamins E and C, beta-carotene, and other carotenoids as

antioxidants. The American journal of clinical nutrition , 62(6), 1315S-1321S.

Sharpe, E., Frasco, T., Andreescu, D., & Andreescu, S. (2013). Portable ceria nanoparticle-based

assay for rapid detection of food antioxidants (NanoCerac). Analyst 2012, 138(1),

249-262.

Shapoval, G., & Gromovaia, V. (2003). Mechanism of antioxidant protection of an organism

from oxidative stress]. Ukrainskiĭ biokhimicheskiĭ zhurnal, 75(2), 5.

Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., & Telser, J. (2007). Free radicals

and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The

international journal of biochemistry & cell biology , 39(1), 44-84.

Velioglu, Y., Mazza, G., Gao, L., & Oomah, B. (1998). Antioxidant activity and total phenolics in

selected fruits, vegetables, and grain products. Journal of agricultural and food

chemistry , 46(10), 4113-4117.

Zhang, Q., Zhang, J., Shen, J., Silva, A., & Dennis, D. A. (2007). A simple 96-well microplate

method for estimation of total polyphenol content in seaweeds. In C. J., Barrow. (Ed.),

Eighteenth International Seaweed Symposium, Springer (pp.219-224).

65

ประวตยอของผวจย

ชอ-สกล นางสาววมล แสงนาค

วน เดอน ป เกด 7 กรกฎาคม พ.ศ. 2529

สถานทเกด จงหวดนนทบร

สถานทอยปจจบน บานเลขท 28 หม 12 ตาบลหนองเพรางาย

อาเภอไทรนอย จงหวดนนทบร

ตาแหนงและประวตการทางาน

พ.ศ. 2553-ปจจบน ขาราชการครโรงเรยนนวลนรดศวทยาคม

รชมงคลาภเษก กรงเทพมหานคร

ประวตการศกษา

พ.ศ. 2552 การศกษาบณฑต (เคม) มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ

พ.ศ. 2558 วทยาศาสตรมหาบณฑต (เคมศกษา) มหาวทยาลยบรพา

การพัฒนาวิธีดีพีพีเอชบนอุปกรณ์แบบกระดาษเพื่อการวิเคราะห์...

Documents