รายงานการวิจัยฉบับสมบูรณ์...
TRANSCRIPT
53
รายงานการวจยฉบบสมบรณ
การสงเคราะหและฤทธตานการอกเสบของสารไตรเอรลมเทน
แบบสมมาตร
Synthesis and anti-inflammatory activity of symmetrical
triarylmethanes
โดย
ผศ.ดร. จเร จรสจรญพงศ
อ. ดร. ประภาพรรณ เตชะเสาวภาคย
ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา
ผศ.ดร. กลาวขวญ ศรสข
ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา
ไดรบเงนอดหนนทนการวจยงบประมาณเงนรายได (เงนอดหนนจากรฐบาล)
งบประมาณป 2557
บทคดยอ
การผลตไนตรกออกไซด (NO) ทเกดจากเอนไซม inducible nitric oxide synthase (iNOS) และพรอสตาแกลนดน E2 (PGE2) ทเกดจากเอนไซม cyclooxygenase-2 (COX-2) ทมากเกนไปโดยแมคโครฟาจมสวนเกยวของในการเกดพยาธสภาพของกบโรคทเกดจากการอกเสบหลายชนด ดงนนการยบยงการผลตสารสอกลางการอกเสบเหลานเปนวธการหนงในการรกษาโรคการอกเสบตางๆ สาร tris(5-ethyl-1H-pyrrol-2-yl)methane (JJST5) เปนอนพนธไตรเอรลมเทนแบบสมมาตรทถกสงเคราะหขนมาใหม มประสทธภาพในการยบยงการผลตไนตรกออกไซด ในการศกษานท าการตรวจสอบกลไกระดบโมเลกลในการออกฤทธการตานการอกเสบของ JJST5 ในเซลลแมคโคร-ฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าดวยไลโพพอลแซกคารไรด (LPS) สาร JJST5 ยบยงการผลตไนตรกออกไซด และพรอสตาแกลนดน E2 ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าดวย LPS ในลกษณะทขนกบความเขมขนอยางมนยส าคญทางสถต JJST5 สามารถลดการแสดงออกของ iNOS ทงในระดบ mRNA และโปรตนในลกษณะทขนกบความเขมขน แตไมสามารถยบยงการแสดงออกของเอนไซม COX-2 อกทง JJST-5 ไมมผลตอการแสดงออกของเอนไซม COX-1 นอกจากน JJST5 ไมสามารถลดการเคลอนทเขาสนวเคลยสของ nuclear factor-κB p65 (NF-κB) ในขณะท JJST5 ยบยงการฟอสโฟรเลชนของ c-Jun N-terminal kinases (JNKs) แตไมมผลตอ extracellular-signal-regulated kinases (ERKs) และ p38 kinases จากผลการทดลองทไดทงหมดแสดงใหเหนวา JJST5 ลดการตอบสนองการอกเสบทถกเหนยวน าดวย LPS ผานการยบยงการกระตน JNK ผลการศกษานแสดงใหเหนถงศกยภาพของสารสงเคราะห JJST5 ในการเปนสารน าในการพฒนายาตานการอกเสบชนดใหมได ค ำส ำคญ : ไตรเอรลมเทนแบบสมมาตร, ไนตรกออกไซด, พรอสตาแกลนดน E2, iNOS, COX-2, ฤทธตานการอกเสบ
2
ABSTRACT
Overproduction of inducible nitric oxide synthase (iNOS)-catalyzednitric oxide (NO)
and cyclooxygenase-2 (COX-2)-catalyzed prostaglandin E2 (PGE2) by macrophages is involved
in pathogenesis of various inflammation-related conditions. Thus, inhibition of such pro-
inflammatory mediator productions could be a therapeutic approach for treatment of
inflammatory diseases. The newly synthesized tris(5-ethyl-1H-pyrrol-2-yl)methane (JJST5), a
symmetrical triarylmethanes derivative has been shown potent inhibitory effect on NO
production. This study, the molecular mechanism underlying anti-inflammatory effect of
JJST5 was investigated in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. JJST5
significantly inhibited the production of NO and PGE2 in LPS-stimulated macrophages in a
dose-dependent manner. The compound alsodose-dependently suppressed the expression
of inducible nitric oxide synthase (iNOS) at mRNA and protein levels but did not inhibit
significantly cyclooxygenase-2 (COX-2) expression. The expression of COX-1 mRNA was not
affected by JJST5. Furthermore, JJST5 had no effect on the nuclear translocation of nuclear
factor-κB p65 (NF-κB) whereas it inhibited the phosphorylation of c-Jun N-terminal kinases
(JNKs) but not extracellular-signal-regulated kinases (ERKs) and p38 kinases. Taken together,
these data indicate that JJST5 suppresses LPS-stimulated inflammatory responses via
blockade of JNK activation. The obtained results present the potential utilization of a
synthetic compound, JJST5 as a lead compound for the development of novel anti-
inflammatory drugs.
Keywords: Symmetrical triarylmethanes, Nitric oxide, ProstaglandinE2, iNOS, COX-2, Anti-inflammatory effect
3
กตตกรรมประกำศ
การศกษาครงนส าเรจลงไดดวยความชวยเหลอดานตางๆ คณะผวจยขอขอบคณภาควชาชวเคม
ภาควชาเคม และโครงการบณฑตศกษา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา ส าหรบความอนเคราะห
เครองมอและอปกรณในการท าวจย ขอขอบคณมหาวทยาลยบรพาส าหรบเงนทนอดหนนการวจยใน
โครงการวจยน สดทายขอขอบคณ นางสาวเพชรรตน ไสว นางสาวกาญจนา ดวงเกต และนางสาวสรนพร อดม
พงษ ส าหรบความชวยเหลอทางเทคนค
4
สำรบญ
หนา
บทคดยอ 1
ABSTRACT 2
กตตกรรมประกาศ 3
บทน า 5
วธการทดลอง 17
ผลการทดลอง 27
อภปรายและสรปผลการทดลอง 43
บรรณานกรม 47
ผลผลตของโครงการวจย 52
5
บทท 1
บทน ำ
1.1 ควำมส ำคญและทมำของปญหำทท ำกำรวจย
สารในกลม triarylmethane (TRAMs) เปนสารกลมหนงทพบไดในผลตภณฑธรรมชาตและสาร
ส ง เคราะหท ม ฤทธ ทา งช วภาพ สามารถใช เปนยาร กษาโ รคได เช น 4,4-dihydroxy-3,4-
methylenedioxytriphenylmethane มฤทธยบยงเชอไวรสชนด herpes simplex virus type 1 (Anti-
HSV-1) (Mibu et al., 2005), 4,4-dihydroxytriphenylmethane ยบยงเชอ KSC Kinesin (Podder et
al, 2007) 1,1-((4-chlorophenyl)methylene)dinaphthalen)-2-ol มฤทธตานการอกเสบ (anti-
inflammatory) และยบยงเชอรา (antifungal) (Lewis et al., 1952) ดงแสดงในรปท 1-1 เมอเรวๆนยง
พบวาอนพนธของ triarylmethane บางชนดมฤทธเปน antitubercular (anti-TB) (Parai et al., 2008)
นอกจากนในทางอตสาหกรรมสามารถน าอนพนธของสาร triarylmethane มาใชเปนสยอม (dyes) เปนหม
ปองกนการเกดปฏกรยา (protective group) และใชเปน photochromic agent (Esquivias et al., 2006)
ไดอกดวย
HO OH
anti-HSV-1 activitycytotoxicity
O
O
4,4'-Dihydroxy-3'',4''-methylene-dioxytriphenylmethane
HO OH
4,4'-Dihydroxytriphenylmethane
KSP Kinesin inhibitor
Cl
OH OH
Anti-inflammatoryAntifungal
1,1'-((4-chlorophenyl)methylene)dinaphthalen-2-ol
รปท 1-1 ตวอยางของสารอนพนธของ triarylmethane ทมฤทธทางชวภาพ
สารประกอบ symmetrical triarylmethane หรอ สารประกอบไตรเอรลมเทนแบบสมมาตร เปน
สารประกอบ triarylmethane ชนดหนงทคารบอนอะตอมสรางพนธะกบหม aryl ทเหมอนกนทงสามหม
สวนใหญเปนสารตงตนทส าคญในทางอตสาหกรรมการผลตสยอม (dyes) เปนสาร photochromic agent
เปนหมปองกนการเกดปฏกรยา (protective group) ในปฏกรยาของสารประกอบนวคลโอไซด โอลโกนวคล
6
โอไซด เปปไทนและคารโบไฮเดรต ใชเปนโครงสรางพนฐานส าหรบการสรางระบบโครงตาขายแบบสามมต
(three-dimensionalnetwork system) และใชเปนสารเทยบมาตรฐานในการวเคระหดวย mass
spectrometry (Nair et al., 2006) ดงแสดงในรปท 1-2
NR2
NR2
R = Me, Crystal VioletR = H, Pararosanilin
R2NNR2
NR2
R2N
triphenylmethane
OO
O
trifurylmethane
SS
S
trithienylmethane
HN
HN
NH
triindoylmethane
synthon for the construction of complex three-dimensional network systmes
รปท 1-2 ตวอยางของสารอนพนธของ symmetrical triarylmethane ทส าคญ
นอกจากนยงสามารถน าอนพนธของ symmetrical triarylmethane เปน ligand ชนด tripodal
triaryloxide (Akagi et al., 2005) ดงแสดงในรปท 1-3
tBu
O
tBu
O
tBu
tBuO
M
tBu
tBu
tripodal triaryloxide ligand
รปท 1-3 tripodal triaryloxide ligand
7
การสงเคราะหสารในกลม triarylmethane ทเคยมรายงานมากอนหนานมหลายวธแตสวนใหญ
จะตองจะไดผลตภณฑเปน triarylmethane ทมหม aryl เหมอนกน 2 หม ขณะทวธการสงเคราะห
symmetrical triarylmethane หรอ triarylmethane ทมหมแทนทซ ากนสามหมยงมอยนอยและสวนใหญ
จะใชรเอเจนตทมราคาแพง ใชเบสทไวตอความชน หรอตองท าภายใตสภาวะทรนแรง (Nair et al., 2006)
ดงนนการศกษาหาปฏกรยาการเตรยม symmetrical triarylmethane วธใหมๆ และใชตวเรงปฏกรยาทท า
ใหเกดผลตภณฑ symmetrical triarylmethane ทมประสทธภาพสง ราคาถก ไมมหรอมความเปนพษตอ
สงแวดลอมนอย และใชสภาวะในการทดลองทไมรนแรงยงเปนหวขอของงานวจยทนาสนใจเปนอยางมาก
ไอโอดน (I2) เปนรเอเจนททมการคนพบมาอยางยาวนาน (>100 ป) อยางไรกตามการน าไอโอดนมา
ใชประโยชนดานการเปนตวเรงปฏกรยาไดมการศกษาเมอประมาณสบกวาปทผานมา ในปจจบนนกวจยดาน
เคมอนทรยสงเคราะหพบวาสามารถน าไอโอดนมาใชท าปฏกรยาไดหลายชนด เชน ปฏกรยาออกซเดชนของอล
กอฮอล เอมน ซลไฟดและสารอะโรมาตก เปนตวเรงส าหรบปฏกรยา protection และ deprotection ของ
หมฟงกชนตางๆ ปฏกรยาการปดวงแหวน (iodocyclization) ปฏกรยาการสรางพนธะระหวางอะตอม
คารบอนกบคารบอน และปฏกรยาการสงเคราะหสารประกอบเฮทเทอโรอะโรมาตก เปนตน นอกจากไอโอดน
สามารถใชสงเคราะหสารชนดตางๆไดอยางมประสทธภาพ สงทนาสนใจของไอโอดน กคอ เปนสารทมราคาถก
มความเปนพษตอสงแวดลอมนอย ใชวธการทงายไมซบซอน และสามารถใชสงเคราะหสารในปรมาณมากๆได
ซงมประโยชนในการน าไปใชเปนวธการสงเคราะหในระดบอตสาหกรรม (Togo, H. & Iida, S., 2006, Jereb
et.al, 2011)
สารเคมทใชเปนยารกษาโรคในปจจบนสวนใหญเปนสารทสกดแยกไดมาจากธรรมชาตทงจากพชและ
สตว อยางไรกตามกระบวนการแยกสารจากธรรมชาตมาใชประโยชนนนมขอจ ากดในเรองปรมาณทไดรบไม
เพยงพอกบความตองการ ดงนนการสงเคราะหสารขนมาใชเปนยาจงกาวมามบทบาทอยางมากเนองจาก
สามารถสงเคราะหสารไดในปรมาณมากๆ อกทงยงสามารถปรบปรงโครงสรางของสารเพอใหไดสารทมฤทธ
ทางยาทเพมสงขน มความจ าเพาะเจาะจงมากขนและมผลขางเคยงลดนอยลง
การอกเสบ (inflammation) เปนปฏกรยาอนซบซอนทเนอเยอตางๆ ตอบสนองตอเชอจลชพ และสง
ทเปนอนตรายตอรางกาย กอใหเกดการเปลยนแปลงทางชวเคมในรางกาย ท าใหเกดการหลงของสารสอกลาง
ในการอกเสบ (inflammatory mediators) ชนดตางๆ รวมทง ไนตรกออกไซด (nitric oxide) และโพรสตา
แกลดน E2 (Prostaglandins E2) ออกจากเซลลเมดเลอดขาวและเซลลแมคโครฟาจ ทงไนตรกออกไซด และ
โพรสตาแกลดน E2 มฤทธสงเสรมการอกเสบ ในปจจบนมรายงานวาการอกเสบเปนสาเหตทท าใหเกดโรค
ตางๆ เชน โรคมะเรง โรคไขขอเสอม โรคหลอดเลอดแดงแขงตว ภาวะชอคจากการตดเชออยางรนแรง
(Septic shock) การปฏเสธของเนอเยอในการปลกถายอวยวะ โรคสมองเสอม เชน โรคอลไซเมอร
8
(Alzheimer’s disease) โรคพารกนสน (Parkinson’s disease) โรคเบาหวาน โรคกระเพาะและล าไสอกเสบ
เปนตน ดงนนงานวจยดานการสงเคราะหสารเพอหาตวยาใหมทมฤทธตานการอกเสบจงเปนหวของานวจยท
นาสนใจ
อนพนธ triarylmethanes (TRAMs) มโครงสรางเปนวงเฮเทอโรอะโร-มาตกทมอะตอมของไนโตรเจน
เปนองคประกอบอยภายในวง ซงมรายงานหลายฉบบทแสดงถงฤทธทางชวภาพ รวมทงฤทธในการตานการ
อกเสบของอนพนธ triarylmethane และสารทมโครงสรางเปนวงเฮเทอโรอะโรมาตกทมอะตอมของ
ไนโตรเจนเปนองคประกอบอยภายในวง เชน 1,5-diaryl-2-ethyl pyrrole derivatives (Biava et al.,
2009), 3-(4-hydroxyphenyl)-4-(4-thiomethoxyphenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (HMP) (Shin et al.,
2012), 1,5-diarylpyrrole Nitrooxyalkyl (Anzini et al., 2013), 1,1’-(((4-chlorophenyl)-
methylene)dinaphthalen)-2-ol (Lewis and Goland, 1952), 4,4′-dihydroxy-3′′,4′′-
methylenedioxytriphenylmethane (Mibu et al., 2003), 4,4′-dihydroxytriphenyl methane (Roy
et al., 2007) และ triarylmethane ทม thiophene เปนองคประกอบ (Parai et al., 2008) เปนตน
งานวจยนท าการพฒนาการสงเคราะหสารอนพนธชนดตาง ๆ ของ symmetrical triarylmethane เพอ
ตองการหายาหรอสารทสามารถรกษาโรคทเกยวของกบการอกเสบและตองการพฒนาการสงเคราะหสารใหม
ประสทธภาพทดยงขน จงไดท าการสงเคราะหสารประกอบ symmetrical triarylmethane หรอ
สารประกอบไตรเอรลมเทนแบบสมมาตรซงเปนสารประกอบ triarylmethanes ชนดหนงทคารบอนอะตอม
สรางพนธะกบหม aryl ทเหมอนกนทงสามหมขนเปนจ านวนเกาชนดมาทดสอบฤทธในการตานการอกเสบแลว
พบวาสาร tris(5-ethyl-1H-pyrrol-2-yl)methane (JJST5) ซงโครงสรางเปนวงเฮเทอโรอะโรมาตกทม
อะตอมของไนโตรเจนเปนองคประกอบอยภายในวงนนสามารถยบยงการผลตไนตรกออกไซดในเซลลแมคโคร
ฟาจ RAW 264.7 ไดมประสทธภาพสงสด และไมมความเปนพษตอเซลล (จเร จรสจรญพงศ และคณะ, 2556)
ดงนนผวจยจงเลอกสาร tris(5-ethyl-1H-pyrrol-2-yl)methane (JJST5) มาท าการทดสอบฤทธในการตาน
การอกเสบในระดบโมเลกลตอไป เพอเปนขอมลพนฐานเพอรองรบการใชประโยชนจากสารสงเคราะหอนพนธ
triarylmethanes (tris(5-ethyl-1H-pyrrol-2-yl)methane) และเปนขอมลในการพฒนาสารสงเคราะหชนด
ใหมทมฤทธในการตานการอกเสบทดกวาเดม
9
1.2 วตถประสงคของกำรทดลอง
1. เพอสงเคราะหอนพนธของสาร symmetrical triarylmethane ทมประสทธภาพสงทสดในการ
ออกฤทธตานการอกเสบ
2. เพอศกษากลไกการออกฤทธในระดบโมเลกลของสาร symmetrical triarylmethane ทม
ประสทธภาพสงทสดในการออกฤทธตานการอกเสบ
1.3 ขอบเขตของกำรทดลอง
ท าการสงเคราะหสารอนพนธ triarylmethanes (tris(5-ethyl-1H-pyrrol-2-yl)methane, JJST5)
ซงเปนสารอนพนธของ symmetrical triarylmethane ทมประสทธภาพสงทสดในการตานอกเสบในการ
โครงการวจยในปท 1 จากนนน าสารสงเคราะหอนพนธ JJST5 มาทดสอบความมชวตรอดของเซลลแมคโคร
ฟาจ RAW 246.7 ทดสอบฤทธในการยบยงการผลตไนตรกออกไซด และพรอสตาแกลนดน E2 ทดสอบฤทธใน
การยบยงการแสดงออกของยน iNOS และ COX-2 ในระดบโปรตนและ mRNAรวมทงทดสอบการยบยงการ
เคลอนทเขาสนวเคลยสของ transcription factor NF-κB p65 ในเซลลแมคโคร-ฟาจ RAW 246.7 และการ
ยบยงการฟอสโฟรเลชนของ mitogen-activated protein kinase (MAPKs)
1.4 ผลงำนวจยทเกยวของ (literature review) และเอกสำรอำงอง
1.4.1 การสงเคราะหสาร symmetrical triarylmethane
จากการคนหาขอมล พบวา การสง เคราะหอนพนธของสารประกอบ symmetrical
triarylmethanes เปนงานทนกวทยาศาสตรใหความส าคญและมรายงานอยางตอเนองในวารสารนานาชาต
เนองจากพบวาสารประกอบเหลานเปนสวนประกอบของยาและสารทมฤทธทางชวภาพมากมาย อกทง
สารประกอบเหลานยงเปนสารทใชในอตสาหกรรมส การสงเคราะห symmetrical triarylmethanes สวน
ใหญสงเคราะหจากปฏกรยาระหวาง electrophilic reagents เชน triethyl orthoformate หรอ
คลอโรฟอรม กบ arenes nucleophile (Nair et al., 2006) อยางไรกตามปฏกรยาสวนใหญท าภายใตสภาวะ
กรดทรนแรง ตองใชกรดเปนปรมาณมาก และยงมขอจ ากดในการเตรยม symmetrical triarylmethane บาง
ชนด ตวอยางการสงเคราะหทเคยมรายงานไวมดงน
1) การสงเคราะห symmetrical triarylmethanes ดวยปฏกรยาระหวาง aromatic aldehyde
กบ arenes
10
จากการรวบรวมงานวจยของ Nair และคณะ (Nair et al., 2006) พบวา ในป 1900 Gombergได
รายงานการสงเคราะห triphenylmethane จากปฏกรยาระหวาง benzaldehyde กบ benzene ในสภาวะ
ทมกรดอะซตกและกรดซลฟรก เปนตวเรงปฏกรยา (รปท 4)
CHO
+
MeCO2HH2SO4
triphenylmethane รปท 4
ในป 2005 Cannella และคณะ (Cannella et al. 2005) ไดรายงานการสงเคราะห symmetrical
triarylmethane จากปฏกรยาการเตม alkyl radical ทสารละลายผสมระหวาง aldehyde กบ aniline
อยางไรกตามวธนจะไดผลตภณฑต า (รปท 5)
CHO
+1) PhN2
+, Tk(III)
NHPh
45%
NH2
2) H+, H2O
18%
+
รปท 5
ในปเดยวกน Rudzevich และคณะ (Rudzevich et al., 2005) ไดสงเคราะห tri-(2-alkoxy-5-
ureido-phenyl)methanes จากปฏกรยา condensation ระหวาง 2-hydroxy-5-nitrobenzalde-hyde
กบ p-nitrophenol 2 equivalent โดยมกรดซลฟรกเปนตวเรงปฏกรยา (รปท 6)
OH
+
OH
155 oC
89%
CHO
NO2 NO2
2
H2SO4
O2N
OH
NO2
HO
OH
NO2
รปท 6
11
ในป 2005, Nair และคณะ (Nair et al., 2006a) ไดใช gold(III) chloride เปนตวเรงปฏกรยาในการ
สงเคราะห symmetrical และ unsymmetrical triheteroaylmethanes โดยเมอใช 2-methylfuran ท า
ปฏกรยากบ 5-methyl-2-furylcarbaldehyde พบวาจะได tri(5-methylfur-2-yl)methane ในเปอรเซนต
สงถง 90% (รปท 7)
OO
O
OOHC+O
AuCl3 (1 mol%)
CH3CN, argonrt, 12 h
93% รปท 7
นอกจากน ในรายงานวจยของ Nair และคณะ (Nair et al., 2006b) ยงไดเตรยม tris-2-
trienylmethane และ tris-2-furylmethane โดยวธการของ Nakayama โดยการน า thiophene หรอ
furan มาท าปฏกรยากบ thienyl-2-carbaldehyde หรอ furyl-2-carbaldehyde ในตวท าละลายเบนซน
และม phosphorus pentaoxide เปนตวเรงปฏกรยา (รปท 8 และ 9)
SS
S
SOHC+S Benzene
P2O5
รปท 8
OO
O
OOHC+O Benzene
P2O5
รปท 9
ในป 2002, Chakrabarty และคณะ (Chakrabarty et al., 2002) ไดพฒนาวธการสงเคราะห
symmetrical triindolylmethanes จากปฏกรยาระหวาง indole กบอนพนธ indol-3-carbaldehyde โดย
ม clay เปนตวเรงปฏกรยา (รปท 10)
12
HN
HN
NH
NH
OHC+NH
rt, 15 min
M, clay 10 clay
รปท 10
2) การสงเคราะห symmetrical triarylmethanes ดวยปฏกรยาระหวาง aromatic or
heteroaromatic aldehyde กบ ethylene glycol
ในป 2000 Stroganova และคณะ (Stroganove et al., 2000) ไดรายงานการสงเคราะห
symmetrical trifurylmethane จากปฏกรยาระหวางอนพนธของ furyl 2-carbaldehyde กบ ethylene
glycol ภายใตสภาวะกรดแก (TsOH) ขณะทถาท าปฏกรยาภายใตกรดออน เชน ion-exchange resin จะได
dioxolane เปนผลตภณฑหลก ดงรปท 11
OO
O
O CHO+
HO
HO H+
OO
O+
รปท 11
นอกจากน Stroganova และคณะ ยงไดใชวธการเดยวกนน ในการเตรยม symmetrical triarayl
methane และ tripyrrolylmethane (รปท 12 และ 13)
OO
O
O CHO+
HO
HO H+
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R1 = H, R2 = Me 86%
R1 = H, R2 = Br 93%
R1 = NO2, R2 = H 90%
รปท 12
13
HN
NH
HN
NH
CHOEtO2C+
HO
HO H+
EtO2C
CO2Et
EtO2C รปท 13
3) การสงเคราะห symmetrical triarylmethanes ดวยปฏกรยาระหวาง arenes กบ
chloroform
จากการรวบรวมงานวจยของ Nair และคณะ (Nair et al., 2006) พบวา Gomberg ไดน า benzene
มาท าปฏกรยากบ chloroform โดยม aluminium trichloride เปนตวเรงปฏกรยา ไดผลตภณฑเปน
triphenylmethane (รปท 14)
CCl3/AlCl3
รปท 14
ในป 1986 Ballaster และคณะ (Ballaster et al., 1986) ไดรายงานวธการสงเคราะห chlorinated
aryl-, diaryl- และ triarylmethane อยางมประสทธภาพจากปฏกรยาระหวาง chloroform และ
chlorinated benzene โดยใช aluminium trichloride เปนตวเรงปฏกรยาทอณหภมระหวาง 70-150 oC
(รปท 15) จากการทดลองพบวาปรมาณของ chlorinated benzene ทใชในปฏกรยาเปนตวควบคมชนดของ
ผลตภณฑ
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
CCl3/AlCl3
Cl
Cl
70-150 oCCl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl Cl
ClCl
Cl Cl
Cl
ClCl
Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl Cl Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl+
รปท 15
14
4) การสงเคราะห symmetrical triarylmethanes ดวยปฏกรยาระหวาง arenes กบ trialkyl
orthoformate
ในป 2001 Reese และ Yan (Reese. & Yan, 2001) ไดศกษาปฏกรยาระหวาง triehtyl
orthoformate, trimethyl orghoacetate และ triethyl orthopropionate กบ pyrrole และ
chloroacetic aicd จากผลการทดลองพบวาเมอใช ethyl orthoformate (1 equiv) ท าปฏกรยากบ
pyrrole (9 equiv) และ chloroacetic acid (9 equiv) ในตวท าละลาย dichloromethane ท 0 oC เปน
เวลา 30 นาท จะให tri-pyrrole-2-yl)methane เปนผลตภณฑหลงจากตกผลกดวย ethanol/น า 34% (รป
ท 16)
HN
NH
HN
NH
+EtO
chloroacetic acid
OEt
OEt
CH2Cl20 oC, 30 min
34%(cryltalization fromaqueosu ethanol)
รปท 16
ในการทดลอง Reese และ Yan (Reese,. & Yan, 2001) ยงพบวา เมอเปลยนจาก triethyl
orthoformate เปน trimethyl orthobenzoate จะไดผลตภณฑเปน meso-substituted dipyrrin เปน
น ามนสน าตาล (brown oil) 51% ดงรปท 17
NH
N
NH
+
dichloroacetic acid
CH2Cl20 oC, 30 min
51%(brown oil)
O
O
O
trimethyl orthobenzoate
รปท 17
5) การสงเคราะห symmetrical triarylmethanes ดวยปฏกรยาระหวาง arenes กบ dialkyl
carbonate และ strong base
ในป 1989 Avendano และคณะ (Nair et al., 2006) ไดสงเคราะหสารประกอบ tris-[(1,3-
dimethyl)-2-indolyl]methane ดวยปฏกรยาระหวางอนพนธ 2-lithio ของ 1,3-dimethylindole กบ
15
diethyl carbonate แตวธการนไดผลตภณฑเพยง 23% เทานน และตองใชสภาวะการทดลองทแหงและใช
เบสทรนแรง (รปท 18)
N
N
NN
BuLi, (EtO)2CO
CH3
CH3
CH3
H3C
H3C
H3C
H3C
CH3
23% รปท 18
1.4.2 การทดสอบฤทธตานการอกเสบของ asymmetrical triarylmethanes
ไนตรกออกไซด เปนอนมลอสระทถกผลตขนจากเอนไซม nitric oxide synthase (NOS) มทงหมด
3 ไอโซฟอรม คอ neuronal nitric oxide synthase (nNOS) และ endothelial nitric oxide synthase
(eNOS) ซงมการแสดงออกตลอดเวลา (constitutive isoforms) ผลตไนตรกออกไซดในปรมาณต า และ
inducible nitric oxide synthase (iNOS) จะมการแสดงออกของยนเมอถกกระตนโดยสงเราตางๆ มการ
ผลตไนตรกออกไซดในปรมาณมาก ไนตรกออกไซดมหนาทเกยวของกบกระบวนการตางๆ ในรางกาย เชน
การสอสญญาณประสาท (neurotransmission) ควบคมความดนโลหตโดยท าใหหลอดเลอดขยายตว
(vascular relaxation) ปองกนการเกาะตวของเกลดเลอด (platelet aggregation) และการจบตวกนของ
เมดเลอดขาว (leukocyte adhesion) รวมทงยงเกยวของกบระบบภมคมกนแบบ innate immunity ในการ
ก าจดจลชพทบกรกโดยเซลลแมคโครฟาจ ไนตรกออกไซดทสรางในเซลลแมคโครฟาจน ถกผลตโดยเอนไซม
iNOS ซงถกกระตนการแสดงออกของยนเมอมการสมผสกบ cytokine endotoxin ของแบคทเรย หรอ
lipopolysaccharide (LPS) จากแบคทเรย โดยไนตรกออกไซดท าหนาทเปนสารสอกลางของการอกเสบท
ส าคญทถกผลตขนโดยเซลลแมคโครฟาจ ถงแมวาไนตรกออกไซดจะมหนาทเกยวของกบการก าจดจลชพท
รกรานรางกายมนษย แตไนตรกออกไซดทถกผลตขนในปรมาณทมากเกนไปจาก iNOS พบวามสวนรวมในการ
เกดอาการของโรคตางๆ เชน โรคจากการอกเสบตางๆ ภาวะชอคจากการตดเชออยางรนแรง การปฏเสธของ
เนอเยอในการปลกถายอวยวะ โรคสมองเสอม เชน โรคอลไซเมอร โรคพารกนสน และ
ischemia/reperfusion injury
16
โพรสตาแกลดน เปนฮอรโมนทมผลตอหลอดเลอด ระบบประสาท และเซลล ในการตอบสนองตอ
การอกเสบ ในการสงเคราะหโพรสตาแกลดนจาก arachidonic acid ถกควบคมโดยเอนไซมหลกคอ
cyclooxygenase (COX) เอนไซมนม 2 ไอโซฟอรม คอ COX-1 ซงมการแสดงออกเปนประจ าเพอผลตโตรส
ตาแกลนดนเพอควบคมระบบหลอดเลอดและปองกนเซลลเยอบกระเพาะอาหารและอกไอโซฟอรม คอ COX-
2 เปนเอนไซมทถกกระตนโดยสงเรากลมเดยวกบ iNOS ท าใหเกดการหลงของโพรสตาแกลดน E2 ในปรมาณ
มากและเกยวของกบการอกเสบ (Katzung, 2001) มยาทใหผลยบยงตอ COX-2 อยางเฉพาะเจาะจงถก
พฒนาขน และใชในการรกษาอาการอกเสบ (Dhikav, 2002) แตอยางกตามยงไมทราบแนชดตอการ
ตอบสนองตอการผลตไนตรกออกไซด (Tunctan, 2003)
การอกเสบ เปนปฏกรยาของรางกาย ทท าการตอบโต ตอบสนอง หรอผอนคลายความรนแรงของ
อนตราย ทก าลงกระท าตอรางกาย การอกเสบ เปนกระบวนการปกปอง คมครองตงแตระดบเซลล จนถงชวต
มนษย การอกเสบมสาเหตจากการตดเชอ ( infection) และสาเหตทไมใชการตดเชอ เชน สารเคม หรอ
ปฏกรยาของภมคมกนของรางกาย เปนตน เมอมอนตรายแบบใดๆ กระท าตอรางกาย ระบบภมคมกนรางกาย
ทซบซอน จะท าการตอบสนองในขนแรก ดวยระบบภมคมกนแบบไมจ าเพาะเจาะจง เพอควบคม ลด จ ากด
และท าลายสาเหตกอนการอกเสบในทนท รวมทงก าจดเนอเยอทเสยหาย หรอตายดวย เรยกการตอบสนอง
เชนนวา การอกเสบเฉยบพลน (acute inflammation) ซงมการเปลยนแปลงทส าคญ คอ การขยายตวของ
หลอดเลอด ท าใหเลอดมาเลยงเพมขน มการเปลยนแปลงของหลอดเลอดท าใหเซลลเมดเลอดออกนอกหลอด
เลอดได และเซลลเมดเลอดขาวเคลอนเขาสเนอเยอทเกดภยนตราย ความเสยหายหรอผลจากการอกเสบ
เชนน รางกายมกจะซอมแซมจนหายไดด แทบไมพบความผดปกตของอวยวะหรอการท างานของระบบ
บกพรองรนแรง แตหากระบบภมคมกน ควบคมสาเหตกอการอกเสบเฉยบพลนไมไดด ท าใหการท าลาย
ลกลาม รกรานอยางตอเนองนานออกไปอก ระบบภมคมกนจะขยายผลการควบคม เพมประสทธภาพการ
ท าลายสาเหตกอการอกเสบอก เรยกภาวะเชนนวา การอกเสบเรอรง (chronic inflammation) สงทแตกตาง
ไปจากการอกเสบเฉยบพลนคอ เซลลหรอเนอเยอถกท าลายมากขนและหากการควบคมยงท าไดไมดจะท าให
เกดความบกพรองของระบบและเปนสาเหตของโรคตางๆ เชน โรคมะเรง โรคไขขอเสอม โรคหลอดเลอดแดง
แขงตว โรคอลไซเมอร โรคพารกนสน โรคเบาหวาน โรคกระเพาะและล าไสอกเสบ
17
บทท 2
วธกำรทดลอง
2.1 กำรเพำะเลยงเซลล (กลาวขวญ ศรสข, 2555a)
เพาะเลยงเซลลแมคโครฟาจของหนสายพนธ RAW 264.7 ในอาหารเลยงเซลลชนด DMEM ทไรเชอ
และเสรมดวยซรมเขมขนรอยละ 10 (V/V) สารละลายยาเพนซลลน (100 U/ml) และสเตรปโตไมซน (100
µg/ml) บนจานเพาะเลยงเซลลแบบจานเดยวเสนผานศนยกลางขนาด 100 มลลเมตร และน าไปบมเซลลใน
ตอบแบบใชคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส ในอากาศทมคารบอนไดออกไซดเขมขนรอยละ
5 (v/v) เปนเวลา 2 คน จากนนเปลยนอาหารเลยงเซลล แลวน าเซลลไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซด
ตออก 1 คน เมอเซลลเจรญเตมโตประมาณรอยละ 80 ของจานเพาะเลยง จงท าการเกบเซลลออกจากผว
ภาชนะโดยการขดเกบเซลล (cell scraping).
2.2 กำร subculture โดยวธ scraping (กลาวขวญ ศรสข, 2555a)
ดดอาหารเลยงเซลลในจานเพาะเลยงเซลลทง เตมสารละลายบฟเฟอร HBSS [5 mM KCl, 0.4 mM
KH2PO4, 5.6 mM glucose, 4 mM NaHCO3] ทปราศจากแคลเซยมและแมกนเซยม ทเยนจ านวน 10 ml
ลงในจานเพาะเลยงเซลล แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน
10 นาท น าจานเพาะเลยงออกจากตอบ และน ามาเขาตปลอดเชอ จากนนใชทขดเซลล (cell scraper) ขด
เซลลเบาๆ เพอใหเซลลหลดออกจากผวภาชนะ ใชปเปตพลาสตกขนาด 10 ml ดดสารละลายบฟเฟอรเพอลาง
เอาเซลลทยงตดอยบนจานเพาะเลยงเซลลออกใหหมดพรอมกบเอยงจานเพาะเลยงเซลลเลกนอยเพอดด
สารละลายแขวนลอยเซลลใสในหลอดพลาสตก จากนนน าไปปนเหวยงท 1,200 g นาน 4 นาท แลวดด
สารละลายบฟเฟอรทง เตมอาหารเลยงเซลล DMEM ทไรเชอ และเสรมดวยซรมเขมขนรอยละ 10 (V/V) ลง
ในหลอดแลวท าการกระจายเซลลโดยการใชปเปตดดขนลงเพอใหเซลลกระจายตวด ท าการนบเซลลทมชวต
ดวยการยอมส 0.4% trypan blue แลวนบเซลลบน hemocyto- meter ภายใตกลองจลทรรศนหวกลบ
แลวแบงเซลลลงในภาชนะอนใหมในอตราสวนทตองการ
2.3 กำรทดสอบควำมมชวตรอดโดยวธ MTT assay (กลาวขวญ ศรสข, 2555a)
ท าการกระจายเซลลลงในจานเพาะเลยงเซลลแบบ 24 หลม จ านวน 1.5 ×105 เซลลตอหลม แลว
น าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 15 ชวโมง ดดอาหารเลยง
เซลลทง แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJST5 ทความเขมขนตางๆ ทงทม LPS (1 μg/ml) และไมม LPS
18
แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง ดดอาหารเลยง
เซลลทง แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสารละลาย MTT ทความเขมขน 0.1 mg/ml หลมละ 500 μl แลวน าไป
บมตอทตอบแบบใชคารบอนไดออกไซด 37 องศาเซลเซยสเปนเวลา 2-4 ชวโมง โดย MTT เปนสารสเหลอง
ละลายน าได จะเขาไปในไมโทคอนเดรยของเซลล ในเซลลทมชวตจะพบแอกตวตของเอนไซมซกซเนตดไฮโดร
จเนส (succinate dehydrogense) จะท าการรดวซ MTT ไปเปนผลกฟอรมาแซน (formazan) ทมสมวงน า
เงน ปรมาณของสารฟอรมาแซนทเกดขนเปนสดสวนโดยตรงกบปรมาณเซลลทมชวต เมอครบเวลาแลวดด
อาหารเลยงเซลลทงกอน เตมไดเมทลซลฟอกไซด (DMSO) หลมละ 500 μl เพอละลายผลกฟอรมาแซน น าไป
บมตอ 5 นาท จะไดสารละลายสมวงน าเงน ดดสารแขวนลอยเซลลจากแตละหลม ปรมาตร 200 μl ใสในไม
โครเพลทแบบ 96 หลม และน าไปวดการดดกลนแสงท 550 nm ดวยเครองวดการดดกลนแสงแบบไมโคร
เพลท ค านวณคาความมชวตรอดของเซลลในเชงสมพทธ เทยบกบสภาวะของเซลลควบคมทไมไดสมผสกบสาร
ทดสอบจากสตรดงตอไปน
เปอรเซนความมชวตรอดของเซลล = คาการดดกลนแสงของหลมเซลลทดสอบ
คาการดดกลนแสงของหลมเซลควบคม × 100
2.4 กำรวเครำะหปรมำณไนไตรทโดยปฏกรยำ Griess (เอกรฐ ศรสข และกลาวขวญ ศรสข, 2554)k
ท าการทดลองโดยการกระจายเซลลลงในจานเพาะเลยงเซลลแบบ 24 หลม จ านวน 1.5 ×105 เซลล
ตอหลม แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 15 ชวโมง ดด
อาหารเลยงเซลลทง แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJST5 ทความเขมขนตางๆ ทงทม LPS (1 μg/ml) และ
ไมม LPS รวมทง amino guanidine (AG) ทความเขมขน 50 μM ซงเปนสารควบคม แบบบวก และ 0.2%
(v/v) DMSO ซงเปนตวท าละลายสารทดสอบ แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37
องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง เมอครบเวลาจงเกบอาหารเลยงเซลลใสหลอดทดลองขนาด 1.5 ml และปน
เหวยงท 13,700 g นาน 4 นาท แลวน าอาหารเลยงเซลล 100 μl ใสในไมโครเพลทแบบ 96 หลมแลวผสมกบ
สารละลาย Griess [1% N-(1-Naphyl)ethylene-diamine dihydrocholide และ 1% sulfanilamide ใน
5% phosphoric acid] ปรมาตร 100 μl และบมทอณหภมหองนาน 10 นาท กอนน าไปวดคาการดดกลน
แสง 546 nm ดวยเครองวดการดดกลนแสงแบบ ไมโครเพลท ค านวณคาความเขมของไนไตรทในอาหารเลยง
เซลลทไดจากกราฟมาตรฐานของโซเดยมไน-ไตรท (NaNO2) ทความเขมขน 0-50 μM
19
2.5 กำรวเครำะหปรมำณพรอสตำแกลนดน (PGE2)
ท าการทดลองโดยการกระจายเซลลลงในจานเพาะเลยงเซลลแบบ 24 หลม จ านวน 1.5 ×105 เซลล
ตอหลม แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 15 ชวโมง ดด
อาหารเลยงเซลลทง แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJST5 ทความเขมขนตางๆ ทงทม LPS (1 μg/ml) และ
ไมม LPS รวมทง indomethacin (IMC) ทมความเขมขน 1 µM ซงเปนสารควบคมแบบบวก แลวน าไปบมใน
ตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง เมอครบเวลาจงเกบอาหารเลยง
เซลลมาวเคราะหปรมาณพรอสตาแกลนดน E2 โดยชดตรวจสอบส าเรจรป PGE2 competitive enzyme
immune assay kit (R&D Systems) ตามวธทผผลตแนะน าดงน น าอาหารเลยงเซลลมาปนเหวยงท 13,700
g นาน 5 นาท แลวเจอจางอาหารเลยงเซลลปรมาตร 150 μl ดวย calibrator diluent RD5-56 ปรมาตร
300 µl จากนนปเปตอาหารเลยงเซลลทเจอจางแลวปรมาตร 150 µl ลงในไมโครเพลททเคลอบกนหลมดวย
goat anti-mouse polyclonal antibody เตมสารละลาย primary antibody ปรมาตร 50 μl แลวบมท
อณหภมหองนาน 1 ชวโมง ปดฝาไมโครเพลทใหสนท เมอบมเสรจเตม PGE2 conjugate ปรมาตร 50 μl แลว
บมทอณหภมหองนาน 2 ชวโมงพรอมเขยา จากนนลางหลมไมโครเพลทดวย wash buffer ปรมาตร 400 μl
จ านวน 4 ครง แลวเตม substrate solution ปรมาตร 200 μl บมทอณหภมหองนาน 30 นาทพรอมทงหอ
ฟอยดเพอปองกนแสงโดยสารละลายจะเปลยนเปนสฟา แลวหยดปฏกรยาดวย stop solution ปรมาตร 100
μl โดยสารละลายจะเปลยนเปนสเหลองซงความเขมของสจะขนอยกบปรมาณของพรอสตาแกลนดน E2 ผสม
ใหเขากนกอนน าไปวดคาการดดกลนแสง 450 และ 540 nm ดวยเครองวดการดดกลนแสงแบบไมโครเพลท
ค านวณหาความเขมขนของพรอสตาแกลนดน E2 ในอาหารเลยงเซลลไดจากกราฟมาตรฐานทไดจาก
สารละลายพรอสตาแกลนดน E2 ททราบความเขมขน (0-2,500 pg/ml)
2.6 กำรเตรยมโปรตนส ำหรบวเครำะหดวยเทคนค Western blot
2.6.1 การเตรยมโปรตนรวมส าหรบวเคราะห iNOS และ COX-2 (สาวนย สมาขนธ, 2554)
ท าการทดลองโดยการกระจายเซลลลงบนจานเพาะเลยงเซลลแบบจานเดยวเสนผานศนยกลางขนาด
60 มลลเมตร จ านวน 1 ×106 เซลลตอจาน แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37
องศาเซลเซยส นาน 15 ชวโมง ดดอาหารเลยงเซลลทง แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJST5 ทความเขมขน
ตางๆ ทงทม LPS (1 μg/ml) และไมม LPS รวมทง 0.2% (v/v) DMSO แลวน าไปบมในตอบแบบใช
คารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 24 ชวโมง จากนนเทอาหารเลยงเซลลทง แลวลางดวย
บฟเฟอร 1X PBS [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4, 10 mM Na2HsPO4] ทเยน 1 ครง
แลวเตม RIPA protein lysis buffer [150 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0.1% SDS, 1%
20
sodium deoxycholate, 1% nonidet P-40, 1 mM DTT, 1X protease inhibitors (PI)] ปรมาตร 50 μl
จากนนใชทขดเซลล ขดเกบเซลลลงในหลอดพลาสตกขนาด 1.5 ml และเตม RIPA protein lysis buffer อก
50 μl ขดเกบเซลลลงในหลอดพลาสตกเดม แลวน าไปปนเหวยงท 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปน
เวลา 10 นาท เกบสารละลายสวนใสดานบนแบงใสในหลอดพลาสตกใหม น าโปรตนรวมทไดไปวเคราะห
ปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford และท าการวเคราะหโปรตนดวยเทคนค Western blot สามารถเกบโปรตน
สวนทเหลอทอณหภม -80 องศาเซลเซยส
2.6.2 การเตรยมโปรตนของนวเครยสส าหรบวเคราะห NF-κB (สาวนย สมาขนธ, 2554)
ท าการทดลองโดยการกระจายเซลลลงบนจานเพาะเลยงเซลลแบบจานเดยวเสนผานศนยกลางขนาด
100 มลลเมตร จ านวน 5 ×106 เซลลตอจาน แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJST5 ทความเขมขนตางๆ
แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท แลวน ามาใส LPS
(1 μg/ml) แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง เมอ
ครบเวลาจากนนท าการสกดโปรตนจากนวเคลยส โดยเทอาหารเลยงเซลลทง แลวลางดวยบฟเฟอร 1X PBS ท
เยนจ านวน 2 ครง จากนนขดเกบเซลลโดยใชทขดเซลล ขดเกบเซลลลงในหลอดพลาสตกขนาด 1.5 ml 2 ครง
โดยใช 1X PBS ครงละ 500 μl และปนเหวยงท 9,500 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เท
สารละลายสวนใสทงและเกบสวนทเปนตะกอนไว (สามารถเกบไวทอณหภม -80 องศาเซลเซยส) จากนนเตม
สารละลายบฟเฟอร 1 [25 mM HEPES (pH 7.9), 5 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.5 mM
PMSF, 10X PI] ปรมาตร 200 μl ลงไปพรอมท าลายตะกอนใหแตกดวยการ vortex ใหเซลลแยกออกเปน
เซลลเดยว บมในน าแขงพรอมเขยานาน 20 นาท โดยเขยาผสมสารทก 5 นาท (จะสงเกตเหนวาสารละลายจะ
ขน) จากนนเตมสารละลายบฟเฟอร 2 [5% (v/v) nonidet P-40 ในสารละลายบฟเฟอร 1] ปรมาตร 200 μl
บมในน าแขงพรอมเขยานาน 15 นาท แลวน าไปปนเหวยงท 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 6
นาท เกบสวนใส (cytoplasmic protein) ในหลอดพลาสตก 1.5 ml (สามารถเกบไวทอณหภม -80 องศา
เซลเซยส) เตมสารละลายบฟเฟอร 3 [ผสมสารละลายบฟเฟอร 1 และสารละลายบฟเฟอร 2 ในอตราสวน
1:1] ปรมาตร 200 μl ลงสวนทเปนตะกอนนวเคลยส พรอมทง vortex ใหตะกอนหลดออกจากกนหลอดเพอ
ลางตะกอนนวเคลยส แลวน าไปปนเหวยงท 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 6 นาท ดด
สารละลายบฟเฟอร 3 ทง แลวเตมสารละลายบฟเฟอร 4 [25 mM HEPES (pH 7.9), 420 mM NaCl, 0.2
mM EDTA, 1.5 mM MgCl2, 20% (v/v) glycerol, 0.5 mM DTT, 0.5 mM PMSF] ปรมาตร 70 μl พรอม
ละลายตะกอนใหแตก บมในน าแขงพรอมเขยานาน 40 นาท โดยเขยาผสมสารทก 5 นาท แลวน าไปปนเหวยง
ท 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท เกบสารละลายสวนใส (nuclear protein) ลงใน
21
หลอดทดลองขนาด 1.5 ml (สามารถเกบทอณหภม -80 องศาเซลเซยส) หรอน าไปวเคราะหปรมาณโปรตน
โดยวธ Bradford และท าการวเคราะหโปรตนดวยเทคนค Western blot……
2.6.3 การเตรยมโปรตนรวมส าหรบวเคราะห MAPKs
ท าการทดลองโดยการกระจายเซลลลงบนจานเพาะเลยงเซลลแบบจานเดยวเสนผานศนยกลางขนาด
100 มลลเมตร จ านวน 5 ×106 เซลลตอจาน แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJST5 ทความเขมขนตางๆ
แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท แลวน ามาใส LPS
(1 μg/ml) แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท เมอ
ครบเวลาจากนนท าการสกดโปรตน โดยเทอาหารเลยงเซลลทง แลวลางดวยบฟเฟอร 1X PBS ทเยนจ านวน 2
ครง จากนนขดเกบเซลลโดยใชทขดเซลล ขดเกบเซลลลงในหลอดพลาสตกขนาด 1.5 ml 2 ครง โดยใช RIPA
protein lysis buffer ปรมาตร 50 μl จากนนใชทขดเซลล ขดเกบเซลลลงในหลอดพลาสตกขนาด 1.5 ml
และเตม RIPA protein lysis buffer อก 50 μl ขดเกบเซลลลงในหลอดพลาสตกเดม และปนเหวยงท
13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เกบสารละลายสวนใสดานบนแบงใสในหลอดพลาสตก
ใหม น าโปรตนรวมทไดไปวเคราะหปรมาณโปรตนโดยวธ Bradford และท าการวเคราะหโปรตนดวยเทคนค
Western blot สามารถเกบโปรตนสวนทเหลอทอณหภม -80 องศา-เซลเซย
2.7 กำรวเครำะหปรมำณโปรตนโดยวธ Bradford
ท าการวเคราะหโดยน าโปรตนตวอยางทสกดไดปรมาตร 2 ไมโครลตร ผสมน ากลน 8 μl ลงในไม-โคร
เพลทแบบ 96 หลม แลวท าการผสมกบสารละลาย 1x quick start Bradford dye reagent ปรมาตรหลมละ
200 ไมโครลตร เขยาทอณหภมหอง 2 นาท น าไปวดคาการดดกลนแสงท 595 นาโนเมตร ดวยเครองวดการ
ดดกลนแสงแบบไมโครเพลทและค านวณความเขมขนของโปรตนจากกราฟมาตรฐานของโปรตน BSA ทม
ปรมาณ 0, 4, 8, 12, 16 และ 20 ไมโครกรม…
2.8 กำรวเครำะหโปรตนดวยเทคนค Western blot (กลาวขวญ ศรสข, 2555b)
ท าการเตรยม 10% SDS-PAGE จากนนน าสารละลายโปรตนตวอยางทสกดได ซงโปรตน iNOS,
COX-2, NF-κB และ MAPKs จะใชโปรตน 25, 25, 40 และ 40-60 ไมโครกรม ตามล าดบ น าโปรตนมาหยอด
ลงในหลมโดยท าการเจอจางสารละลายโปรตนตวอยางดวย 6X protein loading buffer [0.0625 M Tris-
HCl (pH 6.8), 12% (w/v) SDS, 0.06% (w/v) bromophenol blue, 60% (v/v) glycerol, 1.2 M β-
mercaptoethanol] ในอตราสวน 5:1 และใหความรอนท 100 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท กอนน า
สารละลายไปหยอดลงในเจล ท าการแยกโปรตนในสารละลาย 1X Running buffer [0.0625 M Tris, 0.192
22
M Glycine, 0.1% (w/v) SDS] ผานกระแสไฟฟาทความตางศกยไฟฟาคงทท 80 V จน Bromophenol
blue tracking dye เคลอนทเขาส Separating gel จงปดสวทชเครอง Power supply กอนเพมความตาง
ศกยไฟฟาเปน 100 V และใหกระแสไฟฟาผานเจลเปนเวลา 1.5 ชวโมง จงปดสวทชเครอง Power supply
แลวยายแถบโปรตนทอยบนแผนเจลไปยงแผนเมมเบรน PVDF ทท าการpretreated โดยแชใน absolute
methanol ประมาณ 30 วนาท ลางดวยน ากลน จากนนแชเมมแบรนใน Transfer buffer [192 mM
glycine, 25 mM Tris, 10% (w/v) methanol] ประมาณ 5 นาท และผานกระแสไฟฟาทความตาง
ศกยไฟฟาคงทท 25 V เปนเวลาประมาณ 14 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส
2.8.1 การวเคราะหโปรตน iNOS และ COX-2 s
เมอยายโปรตนลงบนเมมเบรนแลว จงน าเมมเบรนมาบมดวยสารละลาย TBS-T buffer [10 mM
Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween 20] ทม 5 (w/v) skim milk ทอณหภมหองเปน
เวลา 1 ชวโมง แลวน าเมมเบรนแชในสารละลาย primary antibody ทจ าเพาะตอโปรตน iNOS และ COX-2
ทเจอจางในบฟเฟอร 1X PBS ทม 0.5% BSA และ 0.05% (v/v) Tween 20 ในอตราสวน 1:500 และ
1:1,000 ตามล าดบ ทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง พรอมทงเขยาภาชนะหรอน าเมมเบรนแชใน primary
antibody solution ทจ าเพาะตอโปรตน β-actin ทเจอจางในสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม 5 (w/v) skim
milk ในอตราสวน 1:5,000 ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมม-เบรน จากนนลาง
เมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน น า
เมมเบรนไปแชในสารละลาย secondary antibody (horse-radish peroxidase-conjugated anti-mouse
IgG (H+L)) ทเจอจางในสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม 5 (w/v) skim milk ในอตราสวน 1:5,000 ส าหรบ
โปรตน iNOS และ COX-2 และในอตราสวน 1:10,000 ส าหรบโปรตน β-actin ทอณหภมหองเปนเวลา 1
ชวโมงพรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน ลางเมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3
ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน ผสมสารละลายซบสเตรท enhanced chemiluminescence (ECL)
ในอตราสวน 1:1 ทงไวประมาณ 1 นาท แลวน าเมมเบรนมาบมกบสารละลายซบสเตรทจนทวแผนเมมเบร
นกอนน าไปประกบฟลม X-ray ในหองมด วเคราะหผลความเขมของแถบโปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D
เวอรชน 12.10a โดยเทยบกบมวลโมเลกลของ iNOS COX-2 และ β-actin กบโปรตนมาตรฐาน
2.8.2 การวเคราะหโปรตน NF-κB
เมอยายโปรตนลงบนเมมเบรนแลว จงน าเมมเบรนมาบมดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม 5 (w/v)
skim milk ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง แลวน าเมมเบรนแชในสารละลาย rabbit anti NF-κB p65
monoclonal antibody ทเจอจางในบฟเฟอร 1X PBS ทม 0.5% BSA และ 0.05% (v/v) Tween 20 ใน
23
อตราสวน 1:1,000 ทอณหภมหองเปนเวลา 4 ชวโมง หรอน าเมมเบรนแชใน primary antibody solution ท
จ าเพาะตอโปรตน Lamin A ทเจอจางในสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม 5 (w/v) skim milk ในอตราสวน
1:1,000 ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมงพรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน จากนนลางเมม-เบรนดวย
สารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน น าเมมเบรนไปแช
ใน secondary antibody solution (horse-radish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (H+L)) ท
เจอจางในสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม 5 (w/v) skim milk ในอตราสวน 1:5,000 ทอณหภมหองเปน
เวลา 1 ชวโมงพรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน ลางเมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท
จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยาภาชนะทใส เมมเบรน ผสมสารละลายซบสเตรท enhanced
chemiluminescence (ECL) ในอตราสวน 1:1 ทงไวประมาณ 1 นาท แลวน าเมมเบรนมาบมกบสารละลาย
ซบสเตรทจนทวแผนเมมเบรน กอนน าไปประกบฟลม X-ray ในหองมด วเคราะหผลความเขมของแถบโปรตน
ทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอรชน 12.10a โดยเทยบกบมวลโมเลกลของ NF-κB p65 และ Lamin A กบ
โปรตนมาตรฐาน
2.8.3 การวเคราะหโปรตน MAPKs
เมอยายโปรตนลงบนเมมเบรนแลว จงน าเมมเบรนมาบมดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม 5 (w/v)
skim milk ทอณหภมหองเปนเวลา 1.30 ชวโมง แลวน าเมมเบรนแชในสารละลาย primary antibody
ขามคน ไดแก rabbit anti p-ERK1/2 และ rabbit anti p-p38 ทเจอจางในบฟเฟอร TBS-T ทม 5% (w/v)
BSA ในอตราสวน 1:1,000, mouse anti p-SAPK/JNK ทเจอจางในบฟเฟอร 1X PBS ทม 0.5% BSA และ
0.05% (v/v) Tween 20 ในอตราสวน 1:2,000 หรอบมในสารลาย rabbit anti ERK1/2 ทเจอจางใน
บฟเฟอร TBS-T ทม 5% (w/v) BSA ในอตราสวน 1:2,500, rabbit anti p38 และ rabbit anti SAPK/JNK
ทเจอจางในบฟเฟอร 1X PBS ทม 0.5% BSA และ 0.05% (v/v) Tween 20 ในอตราสวน 1:2,500, 1:500
ตามล าดบ) จากนนลางเมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง พรอมทงเขยา
ภาชนะทใสเมมเบรน น าเมมเบรนไปแชใน horse-radish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG (H+L)
แตส าหรบ p-SAPK/JNK ใช horse-radish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG (H+L) ทเจอจางใน
สารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม 5 (w/v) skim milk ในอตราสวน 1:5,000 ทอณหภมหองเปนเวลา 1 ชวโมง
พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน ลางเมมเบรนดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T นาน 5 นาท จ านวน 3 ครง
พรอมทงเขยาภาชนะทใสเมมเบรน ผสมสารละลายซบสเตรท enhanced chemiluminescence (ECL) ใน
อตราสวน 1:1 ทงไวประมาณ 1 นาท แลวน าเมมเบรนมาบมกบสารละลายซบสเตรทจนทวแผนเมมเบรน กอน
น าไปประกบฟลม X-ray ในหองมด วเคราะหผลความเขมของแถบโปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอรชน
12.10aโดยเทยบกบมวลโมเลกลของโปรตนทศกษากบโปรตนมาตรฐาน
24
2.8.4 การรโพรบแผนเมมเบรน PVDF
น าแผนเมมเบรนลางดวยบฟเฟอร TBS-T 5 นาท แลวน ามาแชในสารละลาย stripping [10% SDS,
2M Tris-HCl (pH 7.4), 98 mM β-mercaptoethanol] ควรเตรยมสารละลาย stripping แชไวในอณหภม
55 องศาเซลเซยสกอน 30 นาท แลวเอาเมมเบรนใสลงในสารละลาย stripping พรอมเขยาทอณหภม 55
องศาเซลเซยส เปนเวลา 50 นาท แลวลางดวยบฟเฟอร TBS-T 5 นาท จ านวน 3 ครง จากนนจงน าเมม
เบรนมาบมดวยสารละลายบฟเฟอร TBS-T ทม 5 (w/v) skim milk ทอณหภมหองเปนเวลา 1-1.5 ชวโมง
แลวน าเมมเบรนแชในสารละลาย primary antibody และสารละลาย secondary antibody ตอไป ตามวธ
ในขอ 2.8.1-2.8.3
2.9 กำรสกด RNA
ท าการทดลองโดยการกระจายเซลลลงบนจานเพาะเลยงเซลลแบบจานเดยวเสนผานศนยกลางขนาด
60 มลลเมตร จ านวน 1×106 เซลลตอจาน แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซด ทอณหภม 37
องศาเซลเซยส นาน 15 ชวโมง ดดอาหารเลยงเซลลทง แลวเตมอาหารเลยงเซลลทมสาร JJST5 ทความเขมขน
ตางๆ ทงทม LPS (1 μg/ml) และไมม LPS แลวน าไปบมในตอบแบบใชคารบอนไดออกไซดทอณหภม 37
องศาเซลเซยส นาน 9 ชวโมง จากนนดดอาหารเลยงเซลลทง เตมสารละลาย Tri-reagent ปรมาตร 1 ml ลง
ในจานเพาะเลยงเซลลใหทวพรอมทงดดสารละลายขนลงแลวดดสารละลายเกบลงในหลอดพลาสตก 1.5 ml
(สามารถเกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส) เตมคลอโรฟอรม 200 µl ผสมใหสารละลายเขากนโดยการกลบ
หลอดไปมา 15 ครง แลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท น าไปปนเหวยง 13,700 g ทอณหภม 4
องศาเซลเซยส นาน 15 นาท จากนนดดสารละลายสวนใสทอยดานบนจ านวน 400 µl ใสในหลอดพลาสตก
หลอดใหมแลวเตมไอโซโพรพานอล (isopropanol) หลอดละ 400 µl พรอมผสมใหเขากน ตงทงไวท
อณหภมหองเปนเวลา 5 นาท น าไปปนเหวยง 13,700 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท กอนเท
สารละลายสวนใสทงและใชกระดาษทชชซบตรงปลายหลอดใหสารละลายสวนใสออกใหมากทสด แลวลาง
ตะกอน RNA ดวย 75% เอทานอล 1 มลลลตร พรอม vortex จนตะกอนหลด น าไปปนเหวยง 13,700 g ท
อณหภม 4 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท เทสารละลายเอทานอลทงและใชกระดาษทชชซบตรงปลายหลอดให
สารละลายสวนใสออกใหมากทสด จากนนน ามาใหความรอนดวยเครองท าความรอน (heat box) ทอณหภม
55 องศาเซลเซยส ใหเอทา-นอลระเหยออกใหหมด แลวเตมน าทปราศจาก DNase และ RNase ปรมาตร 50
µl บมทอณหภม 55 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท เพอใหตะกอน RNA ละลายไดดขน น าสารละลาย RNA 5
µl มาเจอจางกบน ากลนทผสมกบ 0.1% (v/v) DEPC ปรมาตร 495 µl แลวท าการวดปรมาณ RNA โดย
น าไปวดคาการดดกลนแสงท 260 และ 280 นาโนเมตรดวยเครอง UV-VIS Spectrophotometer (UV-
25
2501PC) จากนนน าคาการดดกลนแสงท 260 นาโนเมตร หารดวยคาการดดกลนแสงท 280 นาโนเมตร ซง
คาทอยในชวง 1.6 -1.8 แสดงใหเหนวา RNA ทสกดไดมความบรสทธและสามารถน าไปใชได…
2.10 กำรวเครำะหปรมำณ mRNA โดยเทคนค real-time reverse transcription-polymerase
chain reaction (Real-time RT-PCR) d
ท าการสงเคราะห cDNA จากสารละลาย RNA ทสกดได และ 5X iScriptTM Reverse Transcription
Supermix [iScript MMLV-RT (RNseH+), RNase inhibitor, dNTPs, oligo (dT), random primers,
buffer, MgCl2, stabilizers] ปรมาตร 4 μl แลวเตมน าทปราศจาก nuclease ใหมปรมาตรสดทายเปน 20
μl ลงในหลอด PCR ซงสามารถค านวณหาความเขมขน RNA ไดจากสมการตอไปน
ความเขมขน RNA (µg/ml) = A260 × 40 × dilution factor
โดยท RNA ความเขมขน 40 µg/ml สามารถดดกลนแสงท 260 นาโนเมตร ได 1 หนวย s
สภาวะทใชสงเคราะห cDNA คอ 25 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท, 42 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท
และ 85 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท แลวท าการตรวจสอบ cDNA ทไดดวยเทคนคอะกาโรสเจลอเลกโทรโฟร
ซส (agarose gel electrophoresis) ในสารละลาย (1X) TBE บฟเฟอร [90 mM Tris-borate และ 0.2 mM
EDTA] เพอตรวจสอบปรมาณ cDNA ทได จากนนน า cDNA ทไดมาวเคราะหปรมาณ mRNA ดวยเทคนค
real-time RT-PCR โดยใช SYBR Green และไพรเมอรทจ าเพาะตอยน iNOS, COX-1, COX-2 และ
elongation factor (EF-2)
ปฏกรยาส าหรบวเคราะหปรมาณ mRNA ประกอบดวย 2X iTagTM Universal SYBR® Green
supermix [antibody-mediated hot-start iTagTM DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, SYBR® Green I
dye, enhancers, stablizers, blend of passive reference dyes] จ านวน 10 μl forward primer ทม
ความเขมขน 10 μM จ านวน 0.5 μl reverse primer ทมความเขมขน 10 μM จ านวน 0.5 μl และ cDNA
จ านวน 2 μl แลวเตมน าทปราศจาก nuclease ใหมปรมาตรสดทายเปน 20 μl โดยท าซ าปฏกรยาละ 2
หลอด (duplicate) สภาวะทใชในปฏกรยา real-time PCR ของยน iNOS, COX-1, COX-2 และ EF-2 แสดง
ในตารางท 2-1 จากนนท า melting curve ทอณหภม 65 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 วนาท แลวเพมอณหภม
ขนทละ 0.5 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 วนาท จนถงอณหถม 95 องศาเซลเซยส แลวน ามาวเคราะหหา
cycle of threshold (Cq) น ามาหาปรมาณดเอนเอดวย comparative threshold method เปนวธทใชใน
การหาปรมาณดเอนเอ โดยการเปรยบเทยบคา Cq ของปฏกรยา PCR ของดเอนเอทเราศกษากบคา Cq ของ
housekeeping gene จากตวอยางเดยวกนโดยค านวณไดจากสมการตอไปน (Giulietti et al., 2001)f
26
2-∆∆Ctq = ปรมาณดเอนเอ
โดยท ∆∆Cq = ∆Cq (sample) - ∆Cq (calibrator)
และ ∆Cq = Cq of target gene – Cq of housekeeping gene
คาทไดเปนปรมาณดเอนเอเปาหมายทผานการ normalized ดวยดเอนเอของ housekeeping gene
โดยเปรยบเทยบเชงสมพทธกบตวอยางควบคม (calibrator)
ตำรำงท 2-1 สภาวะทใชในปฏกรยา real-time PCR ของยน iNOS, COX-1, COX-2 และ EF-2……………
ยน จ านวนรอบ (cycle) อณหภม (องศาเซลเซยส) เวลา (นาท)
iNOS, COX-1, COX-2,
EF-2
Cycle 1: (1X) Step 1: 95.0 3.00
Cycle 2: (40X)Step 1: 95.0 0.10
(40X)Step 2: 63.0 0.20
Cycle 4: (1X) Step 1: 95.0 0.10
2.11 กำรวเครำะหทำงสถต ส
ผลการทดลองแสดงขอมลในรปของคาเฉลย ± คาเฉลยเบนมาตรฐานของการทดลองอสระตอกน
อยางนอยจ านวน 3 ครง แตละครงท า 3 ซ า การวเคราะหขอมลโดยการวเคราะหความแปรปรวน (Analysis
of Variance) ซงเปนการทดสอบคาเฉลยจากขอมลทไดจากกลมตวอยางหลายกลมเปนการเปรยบเทยบความ
แตกตางตงแต 3 กลมขนไป และใช Student' t-test ส าหรบวเคราะหความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต
ระหวางการทดลองทเปนอสระตอกนของ 2 กลมขอกลมขอมล โดยใชโปรแกรม SPSS…
27
บทท 3
ผลกำรทดลอง
3.1 ผลของสำร JJST5 ตอควำมมชวตรอดของเซลล
ผลการศกษาความมชวตรอดของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกสมผสกบสาร JJST5 ทความ
เขมขน 6.25-100 μM พบวาเปอรเซนตความมชวตรอดของเซลลมมากกวา 90 เปอรเซนต ยกเวนเซลลท
สมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 100 µM จะมเปอรเซนตความมชวตรอดของเซลลลดลงเหลอเพยง 85.13
± 16.56 แตเมอเซลลถกเหนยวน าดวย LPS จะมเปอรเซนตความมชวตรอดของเซลลเพมขนเปน 92.42 ±
5.09 สวนความมชวตรอดของเซลลทสมผสกบ aminoguanidine (AG) ซงเปนสารควบคมแบบบวก และ
DMSO ทใชเปนตวท าละลาย ไมแตกตางอยางมนยส าคญ เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม (ภาพท 3-1 และ
3-2)
ภำพท 3-1 ผลการมชวตรอดของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJST5 ทความ
เขมขนตางๆ เปนเวลา 24 ชวโมงทดสอบโดยวธ MTT ขอมลทแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของ
การทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน แตละครงท า 3 ซ า #P < 0.05 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม DMSO
= เซลลทสมผสกบ 0.2% (v/v) dimethyl sulfoxide
28
ภำพท 3-2 ผลการมชวตรอดของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJST5 ทความ
เขมขนตางๆ ในสภาวะทถกเหนยวน าดวย LPS เปนเวลา 24 ชวโมง ทดสอบโดยวธ MTT ขอมลทแสดงเปน
คาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน แตละครงท า 3 ซ า #p < 0.05 และ ##p < 0.01 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม โดยให AG = เซลลทสมผสกบ aminoguanidine ท 50 μM
3.2 ผลของสำร JJST5 ตอกำรผลตไนตรกออกไซด การผลตไนตรกออกไซดของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ในอาหารเลยงเซลล ทเปนเซลลควบคม
และเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว พบวาปรมาณไนไตรทมคาเทากบ 0.81 ± 0.42 และ 19.24 ±
5.12 µM ตามล าดบ เมอใหเซลลสมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 12.5-100 µM และถกเหนยวน าดวย
LPS พบวาปรมาณไนไตรทลดลงตามความเขมขนของสารทเพมขน (ภาพท 3-3A) และพบวามเปอรเซนตการ
ยบยงการผลตไนตรกออกไซดเพมขนตามความเขมขนของสารทเพมขน (ภาพท 3-3B) โดยเซลลทสมผสกบ
JJST5 ทความเขมขน 25-100 µM มการยบยงการผลตไนตรกออกไซดซงแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต
เมอเปรยบเทยบกบเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว โดยมคา IC50 เทากบ 46.04 ± 3.41 µM สวน
aminoguanidine (สารยบยงเอนไซม iNOS) ทใชเปนตวควบคมแบบบวก ทความเขมขน 50 µM ม
เปอรเซนตการยบยงการผลตไนตรกออกไซดได 67.28 ± 6.55 µM ส าหรบเซลลทสมผสกบสาร JJST5 ท
ความเขมขน 25-100 µM เพยงอยางเดยว มปรมาณการผลตไนตรกออกไซดทนอยกวาเซลลควบคมอยางม
29
นยส าคญทางสถต (ภาพท 3-4) ในขณะทเซลลทสมผสกบ DMSO ทใชเปนตวท าละลาย มปรมาณการผลตไน
ตรกออกไซดมคาเทากบ 1.10 ± 0.35 µM ซงไมแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลล
ควบคม
30
ภำพท 3-3 ปรมาณไนไตรทในอาหารเลยงเซลล (A) และเปอรเซนตการยบยงการผลตไนตรกออกไซด
(B) เซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขนตางๆ ในสภาวะทถกเหนยวน าดวย
LPS เปนเวลา 24 ชวโมง ขอมลทแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 4 ครงทเปน
อสระตอกน แตละครงท า 3 ซ า ##P < 0.01 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม และ *p < 0.05, **p < 0.01,
***p < 0.001 เมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยว โดยให AG = เซลลท
สมผสกบ aminoguanidine ท 50 μM
ภำพท 3-4 ผลของสาร JJST5 ตอการผลตไนตรกออกไซดของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ท
สมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 12.5, 25, 50 และ 100 μM ในสภาวะทไมถกเหนยวน าดวย LPS เปน
เวลา 24 ชวโมง ขอมลทแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 4 ครงทเปนอสระตอกน
แตละครงท า 3 ซ า #p < 0.05, ##p < 0.01 และ ###p < 0.001 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม โดยให
DMSO = เซลลทสมผสกบ 0.2% (v/v) dimethyl sulfoxide
31
3.3 ผลของสำร JJST5 ตอกำรผลตพรอสตำแกลนดน E2
การผลตพรอสตาแกลนดน E2 ของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทเปนเซลลควบคม และเซลลท
สมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว พบวาปรมาณพรอสตาแกลนดน E2 มคาเทากบ 6.82 ± 2.45 และ 1148.89 ±
265.47 pg/ml ตามล าดบ เมอใหเซลลสมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 12.5-100 µM และถกเหนยวน า
ดวย LPS พบวาปรมาณพรอสตาแกลนดน E2 ลดลงตามความเขมขนของสารทเพมขน (ภาพท 3-5A) และ
พบวามเปอรเซนตการยบยงการผลตพรอสตาแกลนดน E2 เพมขนตามความเขมขนของสารทเพมขน (ภาพท
3-5B) โดยเซลลทสมผสกบ JJST5 ทความเขมขน 12.5-100 µM มการยบยงการผลตพรอสตาแกลนดน E2 ซง
แตกตางอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว โดยมคา IC50
เทากบ 23.06 ± 5.61 µM สวน indomethacin (IMC) (สารยบยงเอนไซม COX-2) ทใชเปนตวควบคมแบบ
บวก ทความเขมขน 1 µM มเปอรเซนตการยบยงการผลตพรอสตาแกลนดน E2 ได 98.80 ± 0.91µM
32
ภำพท 3-5 ปรมาณพรอสตาแกลนดน E2 ในอาหารเลยงเซลล (A) และเปอรเซนตการยบยงการผลต
พรอสตาแกลนดน E2 (B) เซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 สมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขนตางๆ ในสภาวะ
ทถกเหนยวน าดวย LPS เปนเวลา 24 ชวโมง ขอมลทแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการ
ทดลอง 4 ครงทเปนอสระตอกน แตละครงท า 2 ซ า #P < 0.05 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม และ *p <
0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 เมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยว โดยให
IMC = เซลลทสมผสกบ indomethacin ท ความเขมขน 1 µM
3.4 ผลของสำร JJST5 ตอกำรแสดงออกของปรมำณโปรตน iNOS และ COX-2
ผลของการศกษาปรมาณโปรตน iNOS จะเหนวาเมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยว
พบวาปรมาณโปรตน iNOS เพมสงขนอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม แตเมอให
เซลลถกเหนยวน าดวย LPS และสมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 6.25, 12.5, 25, 50 และ 100 µM จะ
เหนวาปรมาณโปรตน iNOS ลดลงตามความเขมขนของสาร JJST5 โดยเซลลทสมผสกบสาร JJST5 ทความ
เขมขน 25, 50 และ 100 µM สามารถลดปรมาณโปรตน iNOS ไดอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบ
กบเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว สวนโปรตน iNOS ของเซลลทสมผสกบ DMSO ทความเขมขน
0.2% และสาร JJST5 ทความเขมขน 100 µM เพยงอยางเดยวมปรมาณโปรตน iNOS ไมแตกตางกนกบเซลล
ควบคม (ภาพท 3-6)
33
เซลลทถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยวมปรมาณโปรตน COX-2 เพมสงขนอยางมนยส าคญทาง
สถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม เมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS และสมผสกบสาร JJST5 ทความ
เขมขน 6.25-100 µM จะเหนวาปรมาณโปรตน COX-2 ไมแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตกบเซลลทสมผส
กบ LPS เพยงอยางเดยว สวนเซลลทสมผสกบ DMSO ทความเขมขน 0.2% และสาร JJST5 ทความเขมขน
100 µM เพยงอยางเดยวมปรมาณโปรตน COX-2 ไมแตกตางกนกบเซลลควบคม (ภาพท 3-7)
ภำพท 3-6 การวเคราะหปรมาณโปรตน iNOS โดยวธ Western blot เซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7
ทสมผสกบสาร JJST5 และเหนยวน าดวย LPS หรอไมถกเหนยวน าดวย LPS ทความเขมขน 1 µg/ml
รวมทง 0.2% (v/v) DMSO ซงเปนตวท าละลายสารทดสอบ เปนเวลา 24 ชวโมง (A) ภาพตวอยางของผล
Western blot (B) กราฟแสดงจ านวนเทาของการเหนยวน า (Fold of induction) ของโปรตน iNOS หลงจาก
normalized ดวย β-actin ซงวเคราะหผลความเขมของแถบโปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอรชน
12.10a ขอมลแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน ###p < 0.001
34
เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม และ *p < 0.05, ***p < 0.001 เมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS
เพยงอยางเดยว
ภำพท 3-7 การวเคราะหปรมาณโปรตน COX-2 โดยวธ Western blot เซลลแมคโครฟาจ RAW
264.7 ทสมผสกบสาร JJST5 และเหนยวน าดวย LPS หรอไมถกเหนยวน าดวย LPS ทความเขมขน 1
µg/ml รวมทง 0.2% (v/v) DMSO ซงเปนตวท าละลายสารทดสอบ เปนเวลา 24 ชวโมง (A) ภาพตวอยางของ
ผล Western blot (B) กราฟแสดงจ านวนเทาของการเหนยวน า (Fold of induction) ของโปรตน COX-2
หลงจาก normalized ดวย β-actin ซงวเคราะหผลความเขมของแถบโปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอร
ชน 12.10a ขอมลแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน #p < 0.05
เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม
35
3.5 ผลของสำร JJST5 ตอกำรแสดงออกของยน iNOS, COX2 และ COX-1 ในระดบ mRNA
เมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยวพบวาปรมาณ mRNA ของยน iNOS เพมสงขน
อยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม แตเมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS และสมผสกบ
สาร JJST5 ทความเขมขน 25, 50 และ 100 µM จะเหนวาปรมาณ mRNA ของยน iNOS ลดลงตามความ
เขมขนของสาร JJST5 โดยเซลลทสมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 100 µM สามารถลดปรมาณ mRNA
ของยน iNOS ไดอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว สวน
mRNA ของยน iNOS ทสมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 100 µM เพยงอยางเดยวมปรมาณ mRNA ของ
ยน iNOS ไมแตกตางกนกบเซลลควบคม (ภาพท 3-8A)
ผลการศกษาปรมาณ mRNA ของยน COX-2 จะเหนวาเมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยาง
เดยวพบวาปรมาณ mRNA ของยน COX-2 เพมสงขนอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลล
ควบคม แตเมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS และสมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 25, 50 และ 100 µM
จะเหนวาปรมาณ mRNA ของยน COX-2 ลดลงแตไมแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบ
เซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว สวน mRNA ของยน COX-2 ทสมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน
100 µM เพยงอยางเดยวมปรมาณ mRNA ของยน COX-2 ไมแตกตางกนกบเซลลควบคม (ภาพท 3-8B)
เมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยวพบวาปรมาณ mRNA ของยน COX-1 ลดลงอยาง
มนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม แตเมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS และสมผสกบสาร
JJST5 ทความเขมขน 25, 50 และ 100 µM จะเหนวา ทความเขมขน 25, 50 และ 100 µM ปรมาณ mRNA
ของยน COX-1 เพมสงขนอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว
และไมแตกตางจากเซลลควบคมยกเวนทความเขมขน 25 µM สวน mRNA ของยน COX-1 ทสมผสกบสาร
JJST5 ทความเขมขน 100 µM เพยงอยางเดยวมปรมาณ mRNA ของยน COX-1 ไมแตกตางกนกบเซลล
ควบคม (ภาพท 3-8C)
36
37
ภำพท 3-8 การวเคราะหปรมาณ mRNA ของยน iNOS (A), COX-2 (B) และ COX-1 (C) โดย
เทคนค Real-time RT-PCR ของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJST5 ทถกเหนยวน าดวย
LPS และไมถกเหนยวน าดวย LPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 9 ชวโมง ขอมลทแสดงเปนคาเฉลย ±
คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลองอยางนอย 3 ครงทเปนอสระตอกน #p < 0.05, ##p < 0.01 และ ###p
< 0.001 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม *p < 0.05, ** p < 0.01 เมอเปรยบเทยบกบเซลลทสมผสกบ LPS
เพยงอยางเดยว
38
3.6 ผลของสำร JJST5 ตอปรมำณโปรตน NF-κB p65 ในนวเคลยส
เซลลทถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยวพบวาปรมาณโปรตน NF-B p65 ในนวเคลยสเพม
สงขนอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม แตเมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS และ
สมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 25, 50 และ 100 µM จะเหนวาปรมาณโปรตน NF-B p65 ทเคลอนเขาส
นวเคลยสไมแตกตางกนกบเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว ในขณะทสาร JJST5 ทความเขมขน 100 µM
เพยงอยางเดยวมปรมาณโปรตน NF-B p65 ทเคลอนเขาสนวเคลยสไมแตกตางกนกบเซลลควบคม (ภาพท 3-
9) เมอใหเซลลสมผสกบ PCTC (สารยบยง NF-B) ททราบกนด กบ LPS พบวามการผลตไนตรกออกไซดลดลง
แตเมอเซลลสมผสกบสาร PCTC, LPS และ JJST5 พบวามการยบยงการผลตไนตรกออกไซดมากยงขน
ภำพท 3-9 การวเคราะหปรมาณโปรตน NF-κB p65 ในนวเคลยส โดยวธ Western blot เซลลแมค-
โครฟาจ RAW 264.7 ถกเหนยวน าดวย LPS และไมถกเหนยวน าดวย LPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 1
ชวโมง หลงจากใหเซลลสมผสกบสาร JJST5 30 นาท (A) ภาพตวแทนผลการทดลอง วธ Western blot (B)
กราฟแสดงจ านวนเทาของการเหนยวน า (Fold of induction) ของโปรตน NF-κB หลงจาก normalized
ดวย Lamin A ซงวเคราะหผลความเขมของแถบโปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอรชน 12.10a ขอมล
39
แสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน ##p < 0.01 เมอเปรยบเทยบ
กบเซลลควบคม
ภำพท 3-10 เปอรเซนตการยบยงการผลตไนตรกออกไซดของเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ท
สมผสกบสาร JJST5 และ PDTC (pyrrolidine dithiocarbamate) เปนเวลา 1 ชวโมง กอนการสมผสกบ
LPS เปนเวลา 24 ชวโมง จากนนท าการวเคราะหปรมาณไนไตรทในอาหารเลยงเซลล ขอมลทแสดงเปน
คาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 2 ครงทเปนอสระตอกน แตละครงท า 3 ซ า
3.7 ผลของสำร JJST5 ตอกำรฟอสโฟรเลชนของ MAPKs
เมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยวพบวาปรมาณโปรตน JNK, ERK และ p38 รปท
เตมฟอสเฟต (p-JNK, p-ERK และ p-p38) เพมสงขนอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบเซลล
ควบคมดงแสดงในภาพ 3-11 ถง 3-13 แตเมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS และสมผสกบสาร JJST5 ทความ
เขมขน 25, 50 และ 100 µM จะเหนวาปรมาณโปรตน p-JNK ลดลงตามความเขมขนของ JJST5 โดยสาร
JJST5 ทความเขมขน 100 µM สามารถลดปรมาณโปรตน p-JNK ไดอยางมนยส าคญทางสถตเมอเปรยบเทยบ
กบเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 3-11) และเมอใหเซลลถกเหนยวน าดวย LPS และสมผสกบ
40
สาร JJST5 ทความเขมขน 25, 50 และ 100 µM จะเหนวาปรมาณโปรตน p-ERK และ p-p38 ไมแตกตาง
อยางมนยส าคญทางสถตกบเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 3-12 และ 3-13) สวนสาร
JJST5 ทความเขมขน 100 µM เพยงอยางเดยวมปรมาณโปรตน p-JNK, p-ERK และ p-p38 ไมแตกตางกน
กบเซลลควบคม
ภำพท 3-11 การวเคราะหปรมาณโปรตน p-JNK และ JNK โดยวธ Western blot เซลลแมคโคร-ฟาจ
ถกเหนยวน าดวย LPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 30 นาท หลงจากใหเซลลสมผสกบสาร JJST5 30 นาท
(A) ภาพตวแทนผลการทดลอง วธ Western blot (B) กราฟแสดงจ านวนเทาของการเหนยวน า ของโปรตน p-
JNK หลงจาก normalized ดวย JNK ซงวเคราะหผลความเขมของแถบโปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D
เวอรชน 12.10a ขอมลแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน ##p <
0.01 เมอเปรยบเทยบกบเซลลควบคม และ **p < 0.01 เมอเปรยบเทยบกบเซลลทสมผสกบ LPS เพยงอยางเดยว
41
ภำพท 3-12 การวเคราะหปรมาณโปรตน p-ERK และ ERK โดยวธ Western blot เซลลแมคโคร-ฟาจ
RAW 264.7 ถกเหนยวน าดวย LPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 30 นาท หลงจากใหเซลลสมผสกบสาร
JJST5 30 นาท (A) ภาพตวแทนผลการทดลอง วธ Western blot (B) กราฟแสดงจ านวนเทาของการเหนยวน า
(Fold of induction) ของโปรตน p-ERK หลงจาก normalized ดวย ERK ซงวเคราะหผลความเขมของแถบ
โปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอรชน 12.10a ขอมลแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการ
ทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน
42
ภำพท 3-13 การวเคราะหปรมาณโปรตน p-p38 และ p38 โดยวธ Western blot เซลลแมคโคร-ฟาจ
RAW 264.7 ถกเหนยวน าดวย LPS ทความเขมขน 1 µg/ml เปนเวลา 30 นาท หลงจากใหเซลลสมผสกบสาร
JJST5 30 นาท (A) ภาพตวแทนผลการทดลอง วธ Western blot (B) กราฟแสดงจ านวนเทาของการเหนยวน า
(Fold of induction) ของโปรตน p-p38 หลงจาก normalized ดวย p38 ซงวเคราะหผลความเขมของแถบ
โปรตนทไดดวยโปรแกรม BIO-1D เวอรชน 12.10a ขอมลแสดงเปนคาเฉลย ± คาเบยงเบนมาตรฐานของการ
ทดลอง 3 ครงทเปนอสระตอกน
43
บทท 4
อภปรำยและสรปผลกำรทดลอง
4.1 อภปรำยผลกำรทดลอง
โครงการวจยนมงหวงในการสงเคราะหสารทมฤทธตานอกเสบชนดใหม เพอน ามาพฒนาเปนยาตาน
อกเสบชนดใหมทมประสทธภาพสงขน จงไดท าการสงเคราะหสารประกอบ symmetrical triarylmethane
จ านวน 9 ชนดมาทดสอบฤทธตานการอกเสบในการยบยงการผลตไนตรกออกไซดในเซลลแมคโครฟาจ RAW
264.7 แลวพบวาสาร tris(5-ethyl-1H-pyrrol-2-yl)methane (JJST5) สามารถยบยงการผลตไนตรกออก
ไซด ไดมประสทธภาพสงสด โดยไมมความเปนพษตอเซลล (จเร จรสจรญพงศ และคณะ, 2556) ในการจะน า
สาร JJST5 ไปใชในการพฒนายาตานอกเสบชนดใหม จ าเปนตองทราบกลไกในการออกฤทธของสารดงกลาว
ดงนนการศกษานจงท าการประเมนศกยภาพและศกษากลไกการออกฤทธในการตานการอกเสบในระดบ
โมเลกลของสาร JJST5 ในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน าดวย LPS
การศกษานจะใชเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 เปนโมเดลในการศกษา แมคโครฟาจเปนเซลลทม
บทบาทส าคญในการอกเสบ ถกเหนยวน าดวย lipopolysaccharide (LPS) ซงเปนสารประกอบของแบคทเรย
แกรมลบเพอทจะจ าลองการตดเชอและกระบวนการอกเสบ (Kim et al., 2009) จากการศกษาเมอเซลลแมค
โครฟาจ RAW 264.7 ทสมผสกบสาร JJST5 ทความเขมขน 6.25-100 μM และ LPS พบวาความมชวตรอด
ของเซลลมมากกวา 90 เปอรเซนต และสาร JJST5 มฤทธในการลดการผลตไนตรกออกไซด และพรอสตา
แกลนดน E2 ไดในลกษณะทขนกบความเขมขน โดยมคา IC50 เทากบ 46.04 ± 3.41 µM และ 23.06 ± 5.61
µM ตามล าดบ จากขอมลขางตนแสดงใหเหนวา ความสามารถในการลดการผลตไนตรกออกไซดและพรอสตา
แกลนดน E2 ของสาร JJST5 นนมาจากความสามารถของสารเอง ไมไดมาจากความเปนพษตอเซลลของสาร
JJST5 เนองจากความมชวตรอดของเซลลมมากกวา 90 เปอรเซนต เมอเปรยบเทยบความสามารถในการ
ยบยงการผลตไนตรกออกไซดของสาร JJST5 กบ aminoguanidine (AG) ซงเปนสารควบคมแบบบวก ทความ
เขมขน 50 µM พบวาสาร JJST5 นนมการยบยงการผลตไนตรกออกไซดใกลเคยงกบ AG โดยมเปอรเซนตการ
ยบยงเทากบ 70.66 ± 2.90 และ 67.28 ± 6.55 ตามล าดบ และเมอเปรยบเทยบความสามารถในการยบยง
การผลตพรอสตาแกลนดน E2 ของสาร JJST5 กบ indomethacin (IMC) ซงเปนสารควบคมแบบบวก ทความ
เขมขน 1 µM พบวาสาร JJST5 มประสทธภาพต ากวาสาร IMC โดยสาร JJST5 ทความเขมขน 12.5 µM ม
เปอรเซนตการยบยงเทากบ 38.14 ± 14.81 ในขณะทสาร IMC ทความเขมขน 1 µM มการยบยงเทากบ
98.80 ± 0.91 เปอรเซนต
44
ในการสงเคราะหไนตรกออกไซดในเซลลแมคโครฟาจในขณะทมการอกเสบนน จะถกเรงปฎกรยาดวย
เอนไซม iNOS การควบคมการแสดง ออกของ iNOS ถกควบคมหลกทระดบการถอดรหส (transcriptional
level) (Turko and Murad, 2002) สวนในการสงเคราะหพรอสตราแกลนดน E2 จะถกเรงปฎกรยาดวย
เอนไซม COX-2 ถกควบคมทงในระดบการถอดรหสและหลงถอดรหส (post-transcriptional levels) (Kaul
et al., 2006) การศกษานจงไดท าการตรวจสอบกลไกการลดการผลตไนตรกออกไซดและพรอสตาแกลนดน
E2 ของสาร JJST5 ในระดบmRNA และโปรตนของเอนไซม iNOS และ COX-2 พบวาสาร JJST5 สามารถลด
ปรมาณทงในระดบmRNA และโปรตนของเอนไซม iNOS ของเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS ได ในลกษณะท
ขนกบความเขมขน (ภาพท 3-6 และ 3-8A) แสดงวาการลดการผลตไนตรกออกไซดของสาร JJST5 อาจเปน
ผลมาจากการลดปรมาณ mRNA และโปรตนของเอนไซม iNOS ในการศกษานยงพบวาสาร JJST5 ไมสามารถ
ลดปรมาณ mRNA และโปรตนของเอนไซม COX-2 อยางมนยส าคญทางสถต แตสาร JJST5 สามารถลดการ
ผลตพรอสตาแกลนดน E2 โดยอาจจะเปนผลจากสาร JJST5 ยบยงตอแอกตวตของเอนไซม COX-2 ซงตองม
การศกษาเพมเตมตอไป
การสงเคราะหสารสอกลางการอกเสบตางๆ เชน ไนตรกออกไซด และพรอสตาแกลนดน E2 ในเซลล
แมคโครฟาจเมอถกเหนยวน าดวย LPS โดยม TLR4 เปนตวรบสญญาณ จะเกดขนผานการท างานของวถ
สญญาณทเกยวของกบการอกเสบ ไดแก วถสญญาณ NF-κB และ MAPKs (Tham et al., 2011) โดย NF-
κB เปนทรานสครปชนแฟกเตอร ทมบทบาทส าคญในการแสดงออกของยน iNOS, COX-2 และ ไซโตไคน
ตางๆ เชน TNF-α, IL-1β และ IL-6 เปนตน (Shao et al., 2013) จงไดท าการตรวจสอบวถสญญาณท
เกยวของกบการอกเสบโดยเรมศกษาจากวถสญญาณ NF-κB ในสภาวะปกตทไมมการเหนยวน าดวย LPS NF-
κB จะจบกบโปรตน IκB อยในไซโตพลาสซม ท าให NF-κB ไมสามารถเคลอนทเขาสนวเคลยสได ซง NF-κB
ทพบมากประกอบดวย 2 หนวยยอย ไดแก p65 และ p50 แตในสภาวะทถกเหนยวน าดวย LPS จะท าใหเกด
กระบวนการฟอสโฟรเลชนไปท IκB โดยเอนไซม IKK การเตมฟอสเฟตไปท IκB ซงจบอยกบ NF-κB จะท าให
IκB นนถกน าไปสลายโดย proteasome จงท าให NF-κB หลดออกเปนอสระและสามารถเคลอนทเขาส
นวเคลยสได เมอ NF-κB เขาสนวเคลยสแลวจะเขาไปจบกบสวนควบคมแสดงออกของยนท าใหเกดการ
ถอดรหสของยนเปาหมาย (Shao et al., 2013) จากการศกษาพบวาสาร JJST5 ไมสามารถลดปรมาณโปรตน
NF-κB p65 ในนวเคลยสเมอเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยว (ภาพท 3-9) เมอใหเซลล
สมผสกบสาร PDTC ซงเปนสารทสามารถยบยงการกระตน NF-κB (Lim et al., 2004) แตไมมผลตอ
activating protein-1 (AP-1) (Schreck et al., 1992; Liu et al. 1999) ท าใหลดการแสดงออกของเอนไซม
iNOS พบวามปรมาณการผลตไนตรกออกไซดทเหนยวน าโดย LPS นอยลง สาร JJST5 มผลเชนเดยวกบสาร
PDTC คอลดการผลตไนตรกออกไซด แตเมอใหเซลลสมผสทงสาร LPS, PDTC และ JJST5 พบวามการยบยง
45
การผลตไนตรกออกไซดมากขนกวาเซลลทสมผส LPS และ PDTC หรอเซลลทสมผสกบ LPS และ JJST5
ดงนนการยบยงการผลตไนตรกออกไซดของสาร JJST5 อาจเกดผานการยบยงการกระตนวถสญญาณของ
ทรานสครปชนแฟกเตอรตวอนนอกเหนอจาก NF-κB เชน AP-1 เปนตน (Liew et al., 2011) จงท าใหเซลล
สมผสทงสาร LPS, PDTC และ JJST5 ถกยบยงการกระตน NF-κB โดยสาร JJST5 และถกยบยงการกระตนท
รานสครปชนแฟกเตอรตวอนโดยสาร JJST5 จงท าใหมการยบยงการผลตไนตรก ออกไซดมากยงขน มรายงาน
วาสารสงเคราะหหลายชนดทยบยงการผลตไนตรกออกไซดโดยไมผานวถสญญาณ NF-κB p65 ดงเชนงานวจย
ของสาวนย สมาขนธ (2554) ทรายงานวาสารสงเคราะห JJSK14 สามารถลดการผลตไนตรกออกไซดและ
พรอสตาแกลนดน E2 ได ผานการลดปรมาณ mRNA ของเอนไซม iNOS โดยผานวถการสงสญญาณทไม
เกยวของกบการเคลอนทเขาสนวเคลยสของ NF-κB p65
ขนตอมาท าการศกษาวถสญญาณทมการรายงานวามบทบาทส าคญในการควบคมการแสดงออกของ
เอนไซม iNOS และ COX-2 ทเกดจากการกระตนดวย LPS คอ วถสญญาณ MAPKs (Shao et al., 2013) วถ
สญญาณ MAPKs จะประกอบไปดวยเอนไซม ERK, JNK และ p38 ในสภาวะทเซลลแมคโครฟาจถกกระตน
ดวย LPS จะเกดการฟอสโฟรเลชนบน MAPKs ใหอยในรปทถกเตมฟอสเฟต คอ p-ERK, p-JNK และ p-p38
ซงเปนรปทท างานได (active) แลวจงจะท าการเตมฟอสเฟตไปบนทรานสครปชนแฟก-เตอรเปาหมาย
(Kaminska, 2005) โดย p-ERK จะเตมฟอตเฟตไปท Elk1 เอนไซม p-JNK จะเตมฟอตเฟตไปท c-Jun และ
เอนไซม p38 จะเตมฟอตเฟตไปท ATF-2 (Liew et al., 2011) จากการศกษาพบวา สาร JJST5 ไมมผลตอ
ปรมาณโปรตนของ ERK, JNK และ p38 เมอเทยบกบเซลลควบคมทไมไดรบสารทดสอบใดและพบวาสาร JJST5
ไมมผลตอปรมาณโปรตนของ p-ERK และ p-p38 เมอเปรยบเทยบกบเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยาง
เดยว (ภาพท 3-12 และ 3-13) แตสามารถลดปรมาณโปรตนของ p-JNK (ภาพท 3-11) ซงใหผลคลายกบ
งานวจยของ Chen et al. (2014) ซงมการรายงานวาสาร curcumol สามารถลดการแสดงออกของเอนไซม
iNOS ทงในระดบโปรตน และ mRNA จงสงผลใหลดปรมาณการผลตไนตรกออกไซด โดยผานการลดการเตม
ฟอสเฟตไปท JNK แตไมลดการเตมฟอสเฟตไปท ERK และ p38 ดงนนการลดการผลตไนตรกออกไซดของสาร
JJST5 อาจเปนผลมาจากการลดการฟอสโฟรเลชนบนเอนไซม JNK สงผลใหมการลดการกระตนโปรตน c-Jun
ซงเปนสวนประกอบของทรานสครปชนแฟกเตอร AP-1 และลดการแสดงออกของ iNOS ในทสด อยางไรก
ตามควรท าการศกษาเพมเตมตอไป
เอนไซม COX ประกอบไปดวย 2 ไอโซฟอรม นอกจาก COX-2 ซงเปนไอโซฟอรมทแสดงออกใน
สภาวะทถกกระตนและมบทบาทในการอกเสบแลว ยงมไอโซฟอรม COX-1 ทแสดงออกในสภาวะปกต และ
ตอบสนองตอหนาททางสรระวทยา (พรทว เลศศรสถต และสชลา จนทรวทยานชต, ม.ป.ป.) การใชยาตาน
อกเสบกลม NSAIDs ในปจจบนนน มผลยบยงทงเอนไซม COX-2 และ COX-1 เชน indomethacin และ
46
aspirin ท าใหเกดผลขางเคยง โดยเฉพาะทระบบทางเดนอาหาร ไต และการท างานของเกลดเลอด (ธงชย
กอสนตรตน, 2553) ดงนนสารตานอกเสบทดควรมความจ าเพาะในการยบยงเอนไซม COX-2 แตไมควรมผล
ตอเอนไซม COX-1 การทดลองนจงไดท าการวเคราะหปรมาณ mRNA ของเอนไซม COX-1 จากผลการ
ทดลองพบวาเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS เพยงอยางเดยวมปรมาณ mRNA ของเอนไซม COX-1 ลดลง ซง
ใหผลคลายกบงานวจยของ ราณ ชนค า และ คนาภรณ พนสทา (2556); ภศรา ทองจไร และ ณฐานต กจ
ววฒน (2556) และ Utar et al. (2011) นอกจากนยงพบวาสาร JJST5 สามารถเพมปรมาณ mRNA ของ
เอนไซม COX-1 ของเซลลทถกเหนยวน าดวย LPS ในลกษณะทขนกบความเขมขน และมปรมาณทไมแตกตาง
จากเซลลควบคมทความเขมขน 50 และ 100 µM (ภาพท 3-8) ในขณะทสาร IMC ลดการแสดงออกของ
เอนไซม COX-1 (Utar et al., 2011) อนเปนสาเหตหนงทท าใหเกดผลขางเคยง แตจากผลการทดลองใน
การศกษานจะเหนวาสาร JJST5 ไมลดการแสดงออกของเอนไซม COX-1 ดงนนสาร JJST5 จงไมนาจะมผล
ตอการสรางพรอสตาแกลนดนทท าหนาททางสรรวทยา แมวาประสทธภาพในการลดการผลตพรอสตาแกลน
ดน E2 จะต ากวายา IMC แตผลการศกษาน ท าใหไดหลกฐานทางวทยาศาสตรทจะน าไปใชในการพฒนาสาร
สงเคราะหชนดใหม ทมฤทธในการตานการอกเสบทดกวาเดม และมความจ าเพาะตอเอนไซม COX-2
4.2 สรปผลกำรทดลอง
1. สาร JJST5 สามารถยบยงการผลตไนตรกออกไซด และพรอสตาแกลนดน E2 ได ในเซลลแมคโคร
ฟาจ RAW 264.7 ทถกกระตนดวย LPS 2. สาร JJST5 มฤทธในการยบยงการผลตไนตรกออกไซด และพรอสตาแกลนดน E2 โดยสามารถลด
การแสดงออกของเอนไซม iNOS ในลกษณะทขนกบความเขมขน แตไมลดระดบ mRNA ของเอนไซม COX-1
ซงการยบยงไมไดเกดผานการเคลอนทของ NF-κB แตเกดผานการยบยงวถสญญาณ JNK
4.3 ขอเสนอแนะ
1. ควรมการศกษาฤทธของสาร JJST5 ตอแอกตวตของเอนไซม iNOS และ COX-2..................
2. ควรมการศกษาฤทธของสาร JJST5 เพมเตมไปททรานสครปชนแฟกเตอรตวอนนอกเหนอจาก NF-
κB เชน AP-1 เปนตน
47
บรรณำนกรม กลาวขวญ ศรสข. (2555a). หลกการและเทคนคพนฐานการเพาะเลยงเซลลสตว. พมพครงท 1. โอ. เอส. พรน
ตง. เฮาส: กรงเทพมหานคร.
กลาวขวญ ศรสข. (2555b). เอกสารประกอบการสอนวชา 316322 Biochemical Techniques1 (Part:
Electrophoresis and Immunochemistry). ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา.
จเร จรสจรญพงศ, ประภาพรรณ เตชะเสาวภาคย และกลาวขวญ ศรสข. (2556). รายงานการวจยฉบบสมบรณ “การสงเคราะหและฤทธตานการอกเสบของสารไตรเอรลมเทนแบบสมมาตร”. คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา.
พรทว เลศศรสถต และ สชลา จนทรวทยานชต. (ม.ป.ป.). ยาตานอกเสบชนดไมใชสเตยรอยด. [Online].
แหลงเขาถง med.mahidol.ac.th/med/sites/default/files/public/pdf/.../NSAIDS.pdf [สบคน
วนท 01/04/2557]
ภศรา ทองจไร และ ณฐานต กจววฒน. 2556. ฤทธยบยงการอกเสบของ trans-4-methoxycinnamalde-
hyde จากเหงาของเรวหอมในเซลลแมคโครฟาจ RAW 264.7 ทถกเหนยวน า โดย LPS. ปรญญา
นพนธ. ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา.
ราน ชนค า และ คนาภรณ พนสทา. 2556. ฤทธของสารประกอบทแยกไดจากเหงาเรวหอมตอการแสดง ออก
ของยน Cyclooxygenase-1 (COX-1). ปรญญานพนธ . ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร
มหาวทยาลยบรพา.
สาวนย สมาขนธ. 2554. กลไกการตานอกเสบของสาร tert-butyl (2,4,6-trimethoxyphenyl)
(cyclopentyl) methylcarbamate. ปรญญานพนธ. ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลย
บรพา.
เอกรฐ ศรสข และ กลาวขวญ ศรสข. (2554). รายงานการวจยฉบบสมบรณ “การศกษาสารออกฤทธทาง
ชวภาพจากตนเรวหอมและวานสาวหลง”. ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา.
Anzini M, Di Capua A, Valenti S, Brogi S, Rovini M, Giuliani G, Cappelli A, Vomero S, Chiasserini
L, Sega A, Poce G, Giorgi G, Calderone V, Martelli A, Testai L, Sautebin L, Rossi A, Pace
S, Ghelardini C, Di Cesare Mannelli L, Benetti V, Giordani A, Anzellotti P, Dovizio M,
Patrignani P, Biava M. (2013). Novel analgesic/anti-inflammatory agents: 1,5-
diarylpyrrole nitrooxyalkyl ethers and related compounds as cyclooxygenase-2
inhibiting nitric oxide donors. Journal of Medicinal Chemistry. 56 : 3191−3206.
48
Ballester, M., Riera, J., Castaner, J., Rovira, C. and Armed, O. (1986). An easy, high-yield
synthesis of highly chlorinated mono-, di- and triarylmethanes. Synthesis 64-66.
Biava M, Porretta GC, Poce G, Logu AD, Meleddu R, Rossi ED, Manetti F, Botta M. (2009). 1,5-
Diaryl-2-ethyl pyrrole derivatives as antimycobacterial agents: Design, synthesis, and
microbiological evaluation. European Journal of Medicinal Chemistry. 44 : 4734–4738.
Cannella, R., Clerici, A., Pastori, N., Regolini, E. and Porta, O. (2005). One-pot four-component
reaction: Aqueous TiCl3/PhN2+-mediated alkyl radical addition to imines generated in
situ. Organic Letters 7, 645-648.
Chen X, Zong C, Gao Y, Cai R, Fang L, Lu J, Liu F, Qi Y. (2014). Curcumol exhibits anti-
inflammatory properties by interfering with the JNK-mediated AP-1 pathway in
lipopolysaccharide-activated RAW264.7 cells. European Journal of Pharmacology. 723 :
339–345.
Dhikav, V., Singh, S., Anand, K.S., (2002). Newer non-steroidal anti-inflammatory drugs—a review of their therapeutic potential and adverse drug reactions. Journal of Indian Academic Chemistry and Medicine 3, 332–338.
Giulietti A, Overbergh L, Valckx D, Decallonne B, Bouillon R, Mathieu C. (2001). An overview
of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression.
Methods. 25 : 386–401.
Kaminska B. (2005). MAPK signalling pathways as molecular targets for anti-inflammatory
therapy-from molecular mechanisms to therapeutic benefits. Biochimica et Biophysica
Acta. 1754 : 253-262.
Kaul R, Verma SC, Murakami M, Lan K, Choudhuri T, Robertson ES. (2006). Epstein-barr virus
protein can upregulate cyclo-oxygenase-2 expression through association with the
suppressor of metastasis Nm23-H1. Journal of Virology. 80(3) : 1321-31.
Kim JY, Shin JS, Ryu JH, Kim SY, Cho YW, Choi JH, Lee KT. (2009). Anti-inflammatory effect of
anemarsaponin B isolated from the rhizomes of Anemarrhena asphodeloides in LPS-
induced RAW 264.7 macrophages is mediated by negative regulation of the nuclear
factor-jB and p38 pathways. Food and Chemical Toxicology 47 : 1610–1617
49
Katzung, B.G. Basic & Clinical Pharmacology. (2001), International Edition. Lange Medical Books/McGraw-Hill, New York.
Lim S, Kang KW, Park SY, Kim SI, Choi YS, Kim ND, Lee KU, Lee HK, Pak YK. (2004). Inhibition
of lipopolysaccharide-induced inducible nitric oxide synthase expression by a novel
compound, mercaptopyrazine, through suppression of nuclear factor-kappaB binding
to DNA. Biochemical Pharmacology. 68 :719-728.
Lewis MR, Goland PP. (1952). Tumor-inhibitory activity of diaryl-and triarylmethane dyes.
Cancer research. 12 : 130-136.
Liew CY, Lam KW, Kim MK, Harith HH, Tham CL, Cheah YK, Sulaiman MR, Lajis NH, Israf DA.
(2011). Effects of 3-(2-Hydroxyphenyl)-1-(5-methyl-furan-2-y-l) propenone (HMP) upon
signalling pathways of lipopolysaccharide-induced iNOS synthesis in RAW 264.7 cells.
International Immunopharmacology. 11(1) : 85-95.
Liu SF., Ye X., Malik AB. (1999). Inhibition of NF-kB activation by pyrrolidine dithiocarbamate
prevents In vivo expression of proinflammatory genes. Circulation. 100; 1330-1337.
Mibu N, Yokomizo K, Uyeda M, Sumoto K. (2003). Synthesis and antiviral activities of some
4,4’-dihydroxytriphenylmethanes. Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 51 : 1325-
1327.
Nair, V., Abhilash, K. G. and Vidya, N. (2006). Efficient condensation reactions of electron-rich
arenes with aldehydes and enals promoted by gold(III) chloride: Practical synthesis of
triaryl- and triheteroarylmethanes and related compounds. Synthesis 21, 3647-3653.
Nair, V., Thomas, S., Mathew, S. C. and Abhilash, K. G. (2006). Recent advances in the
chemistry of triaryl- and triheteroarylmethanes. Tetrahedron 62: 6731-6747.
Parai MK, Panda G, Chaturvedi V, Manju YK, Sinha S. (2008). Thiophene containing triaryl-
methanes as antitubercular agents. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 : 289–
292.
Reese, C. B. and Yan, H. (2001). Reactions between pyrrole and orthoesters:
preparation of tri-(pyrrol-2-yl)alkanes. Tetrahedron Letters 42: 5545-5547.
50
Roy S, Podder S, Choudhury J, Roy UK. (2007). Dual-reagent catalysis within Ir-Sn domain :
highly selective alkylation of arenes and heteroarenes with aromatic aldehyde. Journal
of Organic Chemistry. 72 : 3100-3103.
Rudzevich, Y., Rudzevich, V., Schollmeyer, D., Thondord, I. and Bohmer, V. (2005). Hydrogen
bonded dimers of triurea derivatives of triphenylmethanes. Organic Letters 7, 613-616.
Shao J, Li Y, Wang Z, Xiao M, Yin P, Lu Y, Qian X, Xu Y, Liu J. (2013). A novel naphthalimide
derivative, exhibited anti-inflammatory effects via targeted-inhibiting TAK1 following
down-regulation of ERK1/2- and p38 MAPK-mediated activation of NF-κB in LPS-
stimulated RAW264.7 macrophages. International Immunopharmacology. 17(2) : 216-
228.
Shin JS, Noh YS, Yoo MS, Lee JY, Cho YW, Lee KT. (2012). Anti-inflammatory and anti-arthritic
effects of new synthetic 3-(4-hydroxyphenyl)-4-(4-thiomethoxyphenyl)-1H-pyrrole-2,5-
dione. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 22 : 2221-2225.
Dithiocarbamates as Potent Inhibitors of Nuclear
Schreck R., Meier B., Mannel DN., Droge W., Baeuerle PA. (1992). Dithiocarbamates as potent
inhibitors of nuclear factor KB activation in intact cells. Journal of Experimental
Medicine. 175; 1181-1194.
Tham CL, Lam KW, Rajajendram R, Cheah YK, Sulaiman MR, Lajis NH, Kim MK, Israf DA. (2011).
The effects of a synthetic curcuminoid analogue, 2,6-bis-(4-hydroxyl-3-
methoxybenzylidine)cyclohexanone on proinflammatory signaling pathways and CLP-
induced lethal sepsis in mice. European Journal of Pharmacology. 652 : 136-144.
Tunctan, B., Altug, S., Uludag, O., Demirkay, B., Abacioglu, N., (2003). Effects of
cyclooxygenase inhibitors on nitric oxide production and survival in a mice model of
sepsis. Pharmacological Research 48, 37-48.
Turko IV, Murad F. (2002). Protein nitration in cardiovascular diseases. Pharmacological
Reviews. 54 : 619–634.
51
Utar Z, Majid MI, Adenan MI, Jamil MF, Lan TM. (2011). Mitragynine inhibits the COX-2 mRNA
expression and prostaglandin E2 production induced by lipopolysaccharide in RAW
264.7 macrophage cells. Journal of Ethnopharmacology. 136(1) : 75-82.
52
ผลผลตของโครงกำรวจย (Outputs):
1. Klaokwan Srisook, Petcharat Sawai, Kanjana Duangkate, JarayJaratjaroonphong.The molecular mechanism of anti-inflammatory effect of 1,1-bis-[2-(5-methylfuryl)]-4-nitrophenyl methane in LPS-induced macrophages.. (Manuscript in preparation). 2. ผลตนกวจยรนใหม ระดบปรญญาตร สาขาชวเคม จ านวน 2 คน คอ นางสาวเพชรรตน ไสว และนางสาวกาญจนา ดวงเกต
53
รายงานการวจยฉบบสมบรณ
การสงเคราะหและฤทธตานการอกเสบของสารไตรเอรลมเทน
แบบสมมาตร
Synthesis and anti-inflammatory activity of symmetrical
triarylmethanes
โดย
ผศ.ดร. จเร จรสจรญพงศ
อ. ดร. ประภาพรรณ เตชะเสาวภาคย
ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา
ผศ.ดร. กลาวขวญ ศรสข
ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา
ไดรบเงนอดหนนทนการวจยงบประมาณเงนรายได (เงนอดหนนจากรฐบาล)
งบประมาณป 2557