Producción de estreptavidina*1 monomérica soluble con capacidad de unión reversible

de biotina*2.

Estreptavidina monomérica con capacidad de unión reversible de biotina tiene

muchas potenciales aplicaciones. Debido a que un sitio de unión completo de biotina en

cada subunidad de estreptavidina requiere la contribución de triptófano 120 de una

subunidad aledaña, la monomerización de la estreptavidina tetramérica natural puede

generar estreptavidina con una reducida afinidad de unión con biotina. Tres residuos,

valina 55, treonina 76 y valina 125, se cambiaron por cualquier arginina o treonina para

crear repulsión electroestática e impedimento estérico en las interfases. La mutación

doble (T76R, V125R) fue altamente efectiva para monomerizar la estreptavidina. Debido a

que los residuos hidrofóbicos interfaciales están expuestos al solvente una vez que la

estreptavidina es convertida a un estado monomérico, una muteína*3 cuádruple (T76R,

V125R, V55T, L109T), fue desarrollada. Las primeras dos mutaciones son

para monomerización, mientras que las últimas dos mutaciones tienen como propósito

mejorar la hidrofilicidad en la interfase para minimizar la agregación. La monomerización

fue confirmada por 4 métodos diferentes, incluyendo filtración en gel*4, dispersión

dinámica de la luz*5, sensibilidad a la proteasa k*6, y reticulación química*7. La muteína

cuádruple permaneció en estado tetramérica a concentraciones mayores que 2 mg/ml.

Sus parámetros cinéticos con la interacción de biotina sugieren una excelente capacidad

de unión con la biotina, lo que permite que la muteína sea fácilmente purificada en una

matriz biotina-agarosa. Otra muteína (D61A, W120K) fue desarrollada basada en dos

mutaciones que se han visto efectivas en la monomerización de avidina*8. Esta muteína

de la estreptavidina fue oligomerica en la naturaleza. Esto ilustra la importancia en

seleccionar los residuos y el enfoque apropiado para una efectiva monomerización de

estreptavidina.

Strept-avidina con capacidad de unión de biotina reversible puede extender las

aplicaciones de la tecnología de biotin-(strept) avidina. Estas moléculas pueden ser

aplicadas para purificación por afinidad de biomoléculas biotiniladas, detección de

ligandos ultratight (ultra “apretados”) a biomoléculas biotiniladas mostradas en el sistema

de visualización de fago, desarrollo de chips como biosensores reutilizables, micro arrays

de proteína/anticuerpo y biorreactores enzimáticos.

*1

Estreptavidina: proteína tetramérica que se caracteriza por su elevada afinidad por la biotina. El complejo biotina-estreptavidina la muestra como una de

las interacciones no-covalentes más fuertes que se conoce. Esta capacidad de unión se mantiene en condiciones extremas de pH, temperatura, disolventes

orgánicos, desnaturalizantes, detergentes y peptidasas.

*2

Biotina: Vitamina estable al calor, soluble en agua y alcohol, y susceptible a la oxidación que interviene en el metabolismo de los hidratos de

carbono, grasas, aminoácidos y purinas. Es esencial para la síntesis y degradación de grasas y la degradación de ciertos aminoácidos.

*3

Muteína: Molécula proteica que resulta de una mutación.

*4 Filtración en gel: Cromatografía de exclusión molecular.

*5

Dispersión dinámica de la luz : Sirve para medir el tamaño (y la forma) de una molécula.

*6

Proteasa K: Enzima capaz de digerir proteínas.

*7 Reticulación Química: formación de una red tridimensional formada por la unión de las diferentes cadenas poliméricas.

*8

Avidina: Glicoproteína tetramérica de unión a biotina producida en el oviducto de aves, reptiles y anfibios y depositada en la clara de sus huevos

La estrept-avidina es una molécula homotetramerica con un sitio de unión a

biotina en cada sub-unidad. La estructura tridimensional de la estrept-avidina sugiere que

cada sitio de unión de biotina completo requiere la contribución de un residuo de

triptófano por una subunidad adyacente. Estudios dirigidos a mutagénesis también han

demostrado la importancia de estos residuos para la estrecha unión de la biotina y la

comunicación de subunidades. Por lo tanto, el desarrollo de monómeros de estrep-

tavidina puede ser un atractivo enfoque para la ingeniera de estreptavidina con capacidad

de unión reversible de biotina.

La producción de estrep-tavidina a su forma monomérica es técnicamente

desafiante. En el caso de la avidina la primera generación de monómeros de avidina

producidos, pueden existir en estado monomérico solo en ausencia de biotina. Este

problema ha sido resuelto por el reciente desarrollo de la segunda generación de

monómeros de avidina, los que poseen dos mutaciones (N54A, W110K). El alineamiento

estructural de avidina y estreptavidina indican que esos dos residuos corresponden a Asp-

61 y Trp-120 en estreptavidina. Sin embargo, una muteína de la estreptavidina designada

AK, que posee las dos correspondientes mutaciones (N54A, W110K), no se convierte en

monómeros como demuestra el presenta estudio. Esto ilustra la necesidad de identificar

un nuevo grupo crítico de residuos, en combinación con enfoques efectivos para generar

monómeros de estreptavidina con el mínimo de cambios mutacionales. El desarrollo de

monómeros de estreptavidina ha sido reportado previamente a través de mutaciones de

tres residuos de alanina. Sin embargo, la baja afinidad de esta muteína hacia la biotina (Kd

= 1.7 x 10-6 m) hace que sea menos que ideal para muchas aplicaciones.

Para el desarrollo de mejores versiones de monómeros de estreptavidina, tres

residuos (Val-55, Thr-76 y Val-125), fueron seleccionados para una mutagénesis dirigida al

sitio. En combinación con la mutación L109T, una serie de simples, dobles, y cuádruples

muteínas de estreptavidinas fueron creadas y producidas por el Bacillus subtilis por

secreción.

A medida que se va produciendo en su forma soluble sin el requerimiento de re

plegamiento, su estado oligomerico puede ser rápidamente analizado por SDS-PAGE*9

usando sobrenadantes de la producción de cultivos de muteínas de estreptavidina. Las

muteínas fueron purificadas y además, caracterizadas por diferentes enfoques para

confirmar su estado monomérico. Los parámetros cinéticos para la unión de biotina

fueron determinados por biosensores de resonancia de plasmones superficiales*10

*1 SDS-PAGE :

acrónimo en inglés de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel Electrophoresis (Electroforesis en gel de poliacrilamida condodecilsulfato sódico)

*2

Biosensores de resonancia de plasmones superficiales: fenómeno que ocurre cuando la luz se refleja de las finas películas metálicas.

Una fracción de la energía de luz incidente en un ángulo definido puede interactuar con los electrones de la película metálica (plasmon) dicha interacción

reduce la intensidad de luz reflejada.

Tabla 1. Cebadores mutagénicos para la construcción de mutantes de estreptavidina.

Codones mutados están en negrita y subrayado. Las enzimas de restricción entre paréntesis después de los mutantes se

refieren al conjunto de enzimas utilizadas para la clonación.

Procedimientos experimentales

Construcción de estreptavidinas mutantes- diferentes mutaciones puntuales

fueron introducidas en la secuencia codificante del gen sintético de estreptavidina en la

expresión del vector PSSAV-Tcry de B. subtilis por PCR basada en mutagénesis directa de

oligonucleótidos. Cinco mutantes (V125R, V125T, V55R, V55T y T76R), cada una con una

mutación simple que resulta en el cambio de un residuo de aminoácido como el nombre

sugiere, fueron construidas usando pSSAV-Tcry como la plantilla y el primer listado en la

Tabla 1. Los productos amplificados fueron digeridos por el par de enzimas listadas en la

Tabla 1, y clonados en pSSAV-Tcry. Cinco plasmidios (pV125R, pV125T, Pv55R, Pv55T y

Pt76R) resultaron.

Dos mutaciones dobles (M2 y AK), también fueron construidas, para M2 (T76R,

V125R), un fragmento digerido de ScaI/NheI de Pv125r fue usado para remplazar los

fragmentos correspondientes en pT76R. Para AK (D61A, W120K), el fragmento que lleva

las dos mutaciones fue amplificado por OCR usando los primers SAVD61AF y SAVW120KB

(Tabla 1) y la plantilla pSSAV-Trcy. El fragmento amplificado fue digerido por XbaI(ScaI y

usado para remplazar el fragmento correspondiente en pSSAV-Tcry.

La construcción de M4 (T76R, V125R, V55T, L109T) involucra dos etapas (ver figura

suplementaria 1. Primero, a 164-bp el fragmento que tiene las dos mutaciones (T76R,

L109T) fue amplificado usando SAVT76RF y SAVL109TB (Tabla 1), como primers y pSSAV-

Tcry como plantilla. El producto amplificado fue digerido por BamHI/ScaI y usado para

remplazar el fragmento correspondiente en pV55T-T76R-L109T. En la segunda etapa un

fragmento digerido de ScaI/NheI del pV125R fue usado para remplazar el fragmento

correspondiente en pV55T-T76R-L109T para generar pV55T-T76R-L109T-V125R.

Producción y purificación de estreptavidina. La estreptavidina tipo salvaje fue

producida por B. subtilis WB800 (pSSAV-Tcry) cultivadas en un medio definido. La proteína

secretada fue purificada hasta homogeneidad usando intercambio catiónico seguido por

cromatografía de afinidad a iminobiotina. Producción y purificación de muteína de

estreptavidina sigue un esquema similar pero con dos grandes modificaciones: un medio

súper nutritivo fue usado en ves de un medio definido, y agarosa-biotina (Sigma) fue

utilizada en ves de agarosa-iminobiotina como matriz de afinidad. Muestras dializadas que

contienes muteínas parcialmente purificadas fueron cargadas a una columna de 1-ml de

agarosa-biotina. Muteínas de estreptavidina fueron eludidas de la columna usando 20 mM

D-biotina en tampón fosfato salino (PBS; 50 mM fosfato de sodio, 100 mM NaCl, pH 7.2).

La concentración de estreptavidina purificada fue determinada espectrofotométricamente

usando el coeficiente de extinción molar ya conocido a 280 nm para cada muteína.

Determinación del tamaño molecular de la estreptavidina- la masa molecular de la

estreptavidina purificada y sus muteínas fueron ambas estimadas por filtración en gel y

estudios de dispersión dinámica de la luz. La filtración en gel fue realizada en la estación

de trabajo Bio-Rad equipada con una columna Bio-PrepSE 100/17 que ha sido calibrada

con masas moleculares de marcadores proteicos (Bio-Rad). La masa molecular también

fue estimada a partir del radio hidrodinámico de la muteína, siendo obtenido con un

dispersor dinámico de luz DynaPro MS (Soluciones proteicas), que ha sido calibrado con

lisozimas. Las muestras de proteínas (2 – 3 mg/ml en PBS) fueron pasadas a través de un

filtro a 0,02 µm (Whatman Anodisc 13) inmediatamente antes de la medición. El perfil de

la distribución del tamaño fue analizado usando el software Dynamics V6.

Proteinasa K, digestión de estreptavidina y sus muteínas – estreptavidinas y

muteínas purificadas (monómeros de 30 µm), fueron tratadas con Proteinasa K

(invitrogen, 5 µm) por 15 min a 30°C en 50 mM Tris-HCl conteniendo 5 mM CaCl2 a pH 8.0.

La reacción fue detenida por precipitación con ácido tricloroacetico. Muestras hervidas de

proteínas precipitadas fueron resultas mediante la reducción SDS-PAGE. El mismo análisis

fue realizado con muestras de estreptavidina tratadas con biotina (1 mM de

concentración final) anterior a la digestión por Proteinasa K.

Reacciones de reticulación química – reticulación química de estreptavidina y sus

muteínas se llevaron a cabo usando bi-etilenglicol (succinato de succinamida)(Sulfo-

EGS)(Pierce) como el agente de reticulación. Una mezcla típica de reacción (20 µl)

contiene la muteína purificada (0.25 mg/ml) fue incluida en el estudio para ayudar a

establecer las condiciones optimas de reacción.

Análisis cinético de muteínas de estreptavidina – Los parámetros cinéticos (con y

sin interacción con biotina) de muteínas de estreptavidina fueron determinados en

tiempo real usando biosensores BIAcoreX de resonancia de plasmones superficiales.

Biotina conjugada de suero de albumina de bovino inmovilizada en un chip sensorial CM5

fue usado para estudiar la reversibilidad de la unión de la biotina.

Programas computaciones para el análisis de estreptavidina –Swiss-pdb fue

usado para visualizar la estreptavidina (banco de códigos con información de proteínas,

1SWE), analiza los residuos interfaciales, mide la distancia entre residuos y alinea la

estructura de estreptavidina y avidina. Las áreas de contacto interfacial fueron calculadas

usando servidores de interacción proteína - proteína y el modulo de formiga de Sting

Millennium suite. Los diagramas de área superficial accesible de residuos individuales en

estreptavidina en tanto los estados monoméricos y tetraméricos fueron generados

usando el modulo de Dossier Protein en el Sting Millennium Suite.

Resultados

Selección de los principales residuos de estreptavidina por mutagénesis de sitio

directo – Estreptavidinas tetraméricas dispuestas como un dímero de dímeros (fig. 1A). La

interfase entre la subunidad A y B (y entre la C y la D) tiene la interacción de subunidades

mas extensa. El área de contacto interfacial entre A y B es ~ 1557 Å2 con 17 interacciones

puente hidrógenos (H-bonding), dos salt bridges (conjunto de interacciones electrostáticas

e interacciones hidrogeno), y numerosas interacciones van der Waals. La interfase de

contacto entre A y D también es extensiva con un área de contacto de 525 Å2 y dos

interacciones interfaciales de puentes de hidrogeno. La interfase de interacción mas débil

e entre la subunidad A y C con una superficie de contacto de 171 Å2. Para la producción

monomérica de estreptavidina con un limitado numero de residuos mutados. Un enfoque

atractivo es introducir ambas repulsiones de carga e impedimentos estéricos a estas

interfases. Como la proteína tiene una elasticidad estructural, es vital seleccionar residuos

interfaciales locales en una superficie rígida para maximizar el efecto de repulsión de

cargas e impedimento estérico. Debido a que la subunidad de estreptavidina forma 8

hebras antiparalelas con estructura lámina β, los residuos seleccionados deberían

localizarse más en las hebras β que en las regiones en lazo. Además, el residuo

seleccionado en una subunidad debería localizarse muy cercano al residuo equivalente o

a un residuo cargado en otra subunidad en la interfase. La examinación de residuos

interfaciales, muestran que Thr-76, Val-125 y Val-55 cumplen los criterios. Por lo tanto

fueron seleccionados para mutagénesis.

Fig. 1. Estructura de tetrámeros de estreptavidina y residuos de interfase críticos seleccionados

para mutagénesis. A. interfases de tetrámeros de estreptavidina. La subunidad A forma tres

interfases de contacto de subunidades con otras subunidades. Estas interfases incluyen A/B, A/C, y

A/D. subunidades A, B, C y D están destacadas en rojo, naranjo, amarillo y verde, respectivamente.

B. el entorno local del Thr-76 en la subunidad A muestra la interacción interfacial entre las

subunidades A y B. Thr-76 y Arg.59 en la subunidad A están destacadas en rojo y rosado,

respectivamente.Thr-76 y Arg-59 en la subunidad B están en negro y amarillo brillante,

respectivamente. Thr-76 en la subunidad A esta a 4 Å de Thr-76 y a 3,75 Å de Arg-59 en la

subunidad B. el remplazo de Thr-76 por una arginina crearía tanto la repulsión electrostática (Arg-

76 (subunidad A)-Arg-76 (subunidad B), Arg-76 (subunidad A)-Arg-59 (subunidad B), y Arg-76

(subunidad B)-Arg-69 (subunidad A)) e impedimento estérico en la interfase para las subunidades

A y B. Un efecto equivalente también se genera en la interfase entre las subunidades C, y D. C. el

entorno local de Val-125 en la subunidad A muestra la interacción interfacial entre las

subunidades A y D. Val-125 (rojo), en la subunidad A esta a 3,97 Å de Va-125 (verde) de la

subunidad D. Se encaja en una cavidad formada por Val-125 (verde) y Thr-123 (verde) de la

subunidad D. Un cambio de Val-125 por arginina creara tanto la repulsión electrostática y el

impedimento estérico en la interfase de la subunidad A/D. Lo mismo es aplicable para la

interacción de interfase de B/C. D. Entorno local de Val-55 en la subunidad A. Val 55 (Rojo)en la

subunidad A esta a 3,97 Å de Arg-59 (amarillo) en la subunidad B.

Efecto de mutaciones simples en la monomerización de estreptavidina- Muteínas de

estreptavidina que llevan un cambio de aminoácido en el sitio seleccionado fueron

producidas en su forma soluble por B. subtilis por secreción. El Análisis del sobrenadante

de los cultivos no hervidos por SDS-PAGE ofrece una rápida visión para el efecto de la

mutación. Las interacciones de las subunidades más débiles resultaran en un mayor

porcentaje de la muestra en estado monomérico en el gel de poliacrilamida SDS. Debido a

que la biotina puede fortalecer la interacción de las subunidades, las muestras fueron

analizadas en presencia y ausencia de biotina. El impacto de las mutaciones en las

interacciones de las subunidades débiles siguen el siguiente orden: T76R > V125R >

V125T V55R > V55T (fig.2 y tabla 2). La muteína T76R (designada M1), permaneció

100% en estado monomérico en el gel de poliacrilamida SDS, incluso en la presencia de

biotina. En contraste, la mutación V55T tuvo el menor impacto con la mayoría de las

moléculas en estado tetramérico, incluso en la ausencia de biotina. La presencia de

biotina desplaza a la mayoría de las muteínas restantes (V125R, V125T, y V55R), a su

estado tetramérico. Como es esperado cambiando valina por arginina ejerce un mayor

impacto que cambiando por treonina. Esto es valido tanto para Val-125 y Val-55.

Efectos de múltiples mutaciones en la monomerización de estreptavidina – para

desarrollar monómero de muteínas de estreptavidina ideales que tiendan a permanecer

en estado monómero a altas concentraciones de estreptavidina, y que tengan una

excelente capacidad de unión de biotina reversible, dos muteínas mas fueron creadas. M2

es la mutación doble que lleva tanto las mutaciones T76R y V125R. M4 es una mutación

cuádruple que lleva las mutaciones T76R, V125R, V55T, L109T. En estas combinaciones,

los tres residuos interfaciales hidrofóbicos Val-125, Val-55 y Leu-109 fueron cambiadas a

por unos hidrofílicos. La última construida es la AK, una mutación doble (D61A, W120K)

que lleva dos mutaciones (equivalentes a aquellas realizadas en avidina), que han

demostrado convertir tetrámeros de avidina a su estado monomérico. Como se muestra

en la Fig 3. Y tabla 2, al igual que M1, todas estas muteínas existen en estado monomérico

en el gel de poliacrilamida SDS aun en presencia de biotina.

Fig 2. Analisis Western Blot de sobrenadante de un cultivo de

cepas de B. subtilis produciendo muteínas de estreptavidina

llevando una sola mutación. 15 µl de muestras no hervidas de

sobrenadante del cultivo fue cargado en cada banda. Las

muestras en el conjunto del lado izquierdo fueron recolectadas

de un cultivo de cepas de B. subtilis en un medio súper nutritivo

sin la adición de biotina. El conjunto de muestras del lado

derecho son de un cultivo crecido con la presencia de biotina (20

µM). La mancha fue probada con anticuerpos policlonales contra

estreptavidina; -ve control, sobrenadante del cultivo de WB800

(pWB705HM) no produjeron ninguna estreptavidina

Purificación de muteínas de estreptavidinas – Purificación de M4 fue usada como

un ejemplo para ilustrar el proceso (Fig. 4). Proteínas parcialmente purificadas por

cromatografía de intercambio iónico (banda 2) se aplicaron a una columna de agarosa-

biotina. M4 puede ser rápidamente eluida afuera de la columna usando un tampón de

biotina como eluyente (bandas 5 -7). Muteína de estreptavidina pura obtenida por este

simple procedimiento, después de la eliminación de la biotina por diálisis, puede ser usado

para caracterizaciones bioquímicas. Para demostrar que la diálisis puede remover

efectivamente cualquier biotina unida a la muteína M4, la muestra dializada se vuelve a

cargar a la matriz de agarosa-biotina. Más del 95% de la muestra puede ser retenida en la

columna y eludida afuera de la columna usando biotina (Información no mostrada). De

todas las muteínas, M1 tiende a tener una cola muy larga de tiempo durante la elución.

Esto indica que M1 puede no tener la propiedad deseada de unión con biotina reversible.

Por lo tanto, no se caracterizó más.

Determinación del aparente peso molecular de muteínas de estreptavidina por

filtración en gel (cromatografía de exclusión molecular) – La observación de muteínas de

estreptavidina 100% monomerizada usando muestras no hervidas de SDS-PAGE no

siempre reflejan fidedignamente la existencia en estado monomérico en la solución

debido a que SDS puede promover la disociación de las subunidades. La aparente masa

molecular de la estreptavidina salvaje y la tres muteínas (M2, M4, y AK), fueron estimadas

por filtración en gel (Fig. suplementaria 2A y tabla 3). La masa molecular esperada de

monómeros de estreptavidina es de 16.5 kDa. M2 y M4 en la ausencia de biotina

muestran un aparente masa molecular de 19.95 y 21.87 kDa, respectivamente. Estas

masas incrementan ligeramente con la presencia de biotina. Esta información sugiere que

las muteínas son monómeros en la naturaleza por que sus masas son más pequeñas que

los dímeros de estreptavidina (33 kDa). En contraste, la muteína AK muestra una aparente

masa molecular de 56,66 kDa aun en la ausencia de biotina. Esto indica la naturaleza

oligomerica de esta muteína. Fig. 2B suplementaria muestra el perfil de elución de la M4

purificada (en ausencia de biotina) desde la columna de filtración en gel. La muestra

(cargada a 2 mg/ml) fue eludida como un solo pico. No hay evidencias de la presencia de

tetrámeros de estreptavidina, que se eluyó a 30.5 min.

Determinación de la masa molecular aparente de muteínas de estreptavidina por

dispersión de luz dinámica. – Debido a que la aparente masa molecular de la

estreptavidina tipo salvaje en ausencia de biotina es 10 kDa menos que lo esperado (56

en ves de 66 kDa) fue determinada por filtración en gel, la dispersión dinámica de la luz

fue usada como un segundo método para estimar la masa molecular aparente. La masa

molecular aparente de la estreptavidina tipo salvaje obtenida mediante esta forma (69

kDa) fue mas cercana a la esperada (66 kDa) (tabla 3). La masa molecular aparente para

ambos M2 y M4 en la ausencia de biotina indico que estaban en su estado monomérico.

La adición de biotina solo causo un ligero incremento de su masa molecular aparente. La

muteína AK fue se encontró que era nuevamente oligomerica, independiente de la

presencia o ausencia de biotina.

Sensibilidad de la muteína de estreptavidina a la Proteinasa K - Se espera que la

estreptavidina monomérica sea más susceptible a la digestión de Proteinasa K. Por lo

tanto, estreptavidina tipo salvaje y sus muteínas fueron tratadas con Proteinasa K (Fig.

5A). La estreptavidina tipo salvaje fue convertida a su forma natural independiente de la

presencia o ausencia de biotina. Bajo las condiciones usadas, la estreptavidina natural fue

además, resistente a la degradación por Proteinasa K. En contraste, las tres muteínas

incluyendo AK, M2 y M4 fueron mucho más susceptibles a la digestión por Proteinasa K.

La sensibilidad a la proteasa K es mas aparente para M2 y M4, que fueron completamente

digeridas independiente de la ausencia o presencia de biotina. Esta propiedad es

consistente con la naturaleza monomérica de estas muteínas. La muteína AK se comporto

de manera diferente. Aunque la mayoría de estas fue digerida por la Proteinasa K en la

ausencia de biotina, llegaron a ser mucho mas resistentes a la proteasa K cuando la

biotina estuvo presente.

La reticulación de la estreptavidina y sus muteínas – Para fortalecer la idea que

tanto la M2 y M4 son monoméricas mientras AK es oligomerica en la naturaleza. La

reticulación proteica fue llevada a cabo usando sulfo-EGS como agente reticulador. Sulfo-

EGS reacciona con tanto el grupo α-amino accesible en los extremos N y los grupos ε

amino expuestos en la superficie de las cadenas laterales de lisina en la proteína. La

estreptavidina salvaje secretada tiene 8 residuos de lisina en casa subunidad. El modelo

estructural tridimensional de la estreptavidina sugiere que la lisina 121 en la subunidad A

esta a 14.1 Å de la lisina 121 en la subunidad D. Como el radio espaciador en la sulfo-EGS

es de 16.1 Å, subunidades A y D (las mismas que para las unidades B y C), debieran ser

fácilmente reticuladas por la sulfo-EGS. También es posible tener reticulación entre las

subunidades A y B como la región terminal N desde la subunidad A, la que contiene 2

residuos de lisina, es probable que se posicione cerca de la lisina 80 en la subunidad B. Lo

mismo es valido para las subunidades C y D. Por lo tanto, uno debiera ser capaz de

diferenciar la estreptavidina tetramérica de la forma monomérica con la observación de la

reticulación de la estreptavidina tetramérica usando sulfo-EGS. Lisozima, bien conocida de

ser monomérica en solución, sirvió como control negativo. La Fig. 5B muestra que la

cantidad de lisozima dimérica se incremento ligeramente con la presencia del agente

reticulantes. Esto ayudo a establecer el límite superior de la concentración de sulfo-EGS

para ser usado bajo condiciones experimentales. La subunidad de estreptavidina tipo

salvaje tuvo una aparente masa molecular de 19 kDa sobre el gel SDS. Después con el

tratamiento de sulfo-EGS se mostro que muchas de estas subunidades fueron reticuladas

a dímeros y oligomeros superiores con pequeñas cantidades remanentes en estado

monomérico. Las muteínas M2 y M4 se comportaron muy similarmente (los datos para

M2 no son mostrados). La mayoría de las muteínas M2 y M4 después del tratamiento de

reticulación migraron como monómeros con pequeñas cantidades en la forma dimérica.

Estos dímeros pueden representar las subunidades monoméricas reticuladas que fueron

artificialmente generadas de la misma forma que con lisozima. AK mostro un perfil de

reticulación muy similar a aquella de la estreptavidina tipo salvaje. Estos datos sostienen

fuertemente la idea que las muteínas M2 y M4 son monoméricas, mientras que la

muteína AK es oligomerica en solución.

Tabla 2. Resumen de los efectos mutagénicos sobre el debilitamiento de las interacciones

de las subunidades en las muteínas de estreptavidina como reflejo del grado

de monomerización de muteínas estreptavidina después de SDS-PAGE. La Estimación del

porcentaje de la estreptavidina en estados monoméricos y tetraméricos esta basada en las

manchas que muestras los patrones de migración de las muestras no hervidas en las

figuras 2 y 3.

Fig.3 Análisis de sobrenadantes de cultivos de cepas de B. subtilis produciendo muteínas de estreptavidina que llevan diferentes combinaciones de mutaciones. Todas estas cepas fueron cultivadas en un medio súper nutritivo suplementado con biotina (20 µM). 15 µl de sobrenadantes de un cultivo de muestras no hervidas

fue cargado. A, Coomassie Blue-stained SDS-polyacrylamide gel. Las bandas correspondientes a estreptavidina monomérica y tetramérica fueron marcadas con un asterisco y una cabeza de flecha, respectivamente. B, el Western blot probo los anticuerpos policlonales contra la estreptavidina.M, marcadores de la masa molecular ;wt, estreptavidina tipo salvaje; C, control negativo

Interacción reversible entre las muteínas de estreptavidina y la biotina – Las

variaciones de las interacciones entre las muteínas de estreptavidina y la biotina fueron

determinadas por biosensores BIacore de resonancia de plasmones superficiales. Como

se muestra en la tabla 4 (diagramas gráficos para M4 son mostrados en la figura

suplementaria s3), M2, M4, y AK tuvieron sus constantes de disociación (Kd), en el rango

de 10-7M. Los rangos menores (kd) para estas muteínas, fueron casi los mismos, mientras

que el rango superior (ka) para la muteína AK fue ligeramente mas baja que la del resto.

Uno de los factores que afectan el rango superior es el coeficiente de difusión (o masa

molecular), de la molécula de estreptavidina. Debido a que AK es oligomerica en la

naturaleza, esto puede influir en el menor rango para esta interacción de muteína-biotina.

Fig.4 Purificación de muteínas de estreptavidina M4

usando agarosa-biotina. La muteína M4

parcialmente purificada Por cromatografía en

columna Macro S (PPF), fue cargada sobre una

columna de biotina-agarosa. M, marcadores de masa

molecular; FT, columna de flujo;W, agrupación de

fracciones de lavado; EF1-EF3, fracciones eludidas.

Tabla 3. Determinación de la masa molecular de la estreptavidina tipo salvaje (wt) y sus

muteínas por filtración en gel y dispersión dinámica de la luz.

En la dispersión dinámica de la luz, la masa molecular estimada (M) fue calculada a través

del radio hidrodinámico medido (RH), usando la curva de calibración de una proteína. El

pico tiene una polidispersidad menor a 15%. Teóricamente la masa molecular esta

estimada a partir de la composición aminoacidica de una proteína madura.

DISCUSIÓN

Aunque la estreptavidina y la avidina tienen similares estructuras tridimensionales y

propiedades de unión a biotina, el desarrollo de estreptavidina monomérica es mucho

más difícil por dos razones. Primero, la estreptavidina tiene interacciones interfaciales de

subunidades más fuertes que la avidina. Son requeridas mutaciones más fuertes para

debilitar estas fuertes interacciones interfaciales. Segundo, la monomerización de

estreptavidina puede resultar en la exposición de residuos hidrofóbicos en la superficie

que normalmente serian sepultados en la interfase de la estreptavidina tetramérica. Esto

puede afectar potencialmente la solubilidad de la estreptavidina monomérica y llevar a la

reasociación de los monómeros. El problema podría ser menos dramático para la avidina,

la cual es una proteína glicosilada con una cadena carbohidratada en cada una de las

subunidades de la avidina.

A pesar de la dificultad, nuestro estudio ilustra que, seleccionando residuos críticos

localizados en la superficie rígida para un estudio mutagénicos y la introducción de

repulsión de cargas y el impedimento estérico en la interfase, una mutación simple (T76R)

podría ser muy efectiva en el desarrollo de estreptavidina monomérica. A pesar de lo

sugerido desde el análisis SDS-PAGE, estudios de filtraciones en gel de la muteína M1

también indico que la mayoría de M1 fue eludida a una posición correspondiente a la

forma monomérica (datos no mostrados).El principal inconveniente para esta muteína es

su comportamiento elusivo en la columna de agarosa-biotina. El perfil de elusión tuvo

típicos residuos a largo tiempo. Además, más M1 podría ser recuperada empapando la

columna durante la noche con un buffer que contenga biotina. Esto sugiere que partes de

la población de M1 tengan alta afinidad a la matriz.

Para incrementar la eficiencia de la monomerización de estreptavidina, las

muteínas M2 fueron desarrolladas combinando 2 potentes mutaciones (T65R, V125R). la

información desde el gel de filtración, dispersión dinámica de la luz, sensibilidad a la

Proteinasa K, y reticulación química confirmo el estado monomérico de M2. El perfil de

elusión de esta muteína desde la matriz de agarosa-biotina tuvo una mejora considerable

sobre la de M1. Cuando un periodo de 30 min de incubación en columna fue permitido

para el eluyente entre la acumulación de fragmentos, cerca del 90% de M2 puede ser

recuperado dentro de tres volúmenes de eluyente en la columna.

Para asegurar que la muteína de estreptavidina permanezca estable en su estado

monomérico, más mutaciones fueron introducidas a M2. La interfase expuesta de AB (o

CD) presentara tres residuos hidrofóbicos: Val-55, Leu-109 y Val-125. En la muteína M2,

Val-125 fue cambiada por arginina. Elegimos además convertir Val-55 y Leu-109 A

Treonina. Es preferible la conversión a treonina en ves de arginina debido a que proteínas

con alto pI son conocidas por tener interacciones no-específicas por interacciones

electrostáticas. El pI calculado para M2 es 8.1. Si tanto, Val-55 y Leu-109 son convertidas a

arginina, la muteína resultante tendrá un pI de 9.2. Esto podría incrementar probabilidad

de interacciones no-especificas relacionadas con carga. La conversión de estos residuos a

residuos con carga negativa no fueron considerados porque tanto Val-55 y Leu-109 están

localizadas en las cadenas β, y los residuos con carga negativa son relativamente pobres

en formación de cadenas β.

Las muteínas M4 comparten con las muteínas M2 muchas características deseables

de un monómero de estreptavidina ideal. Ambos existen en estado monomérico a una

alta razonable concentración de proteína (2 mg/ml o más si es para estudios de dispersión

dinámica de la luz). Ambos tienen excelente capacidad de unión reversible de biotina,

como se reflejo en las variaciones de la interacción con biotina. Ambas tienen un pI

moderado valuado en 8.1 por lo que sus interacciones no-especificas relacionadas con

carga serian mínimas. Sumando a esto, M4 tiene dos características que lo hacen aun más

atractivo en la práctica. Moléculas de muteína de M2 tienden a agregarse en solución. La

filtración de M2 a través de un filtro de 0,02 µm fue esencial para obtener una buena

señal de la muteína por estudios de la dispersión dinámica de la luz debido a la pobre

señal de detección causada por la presencia de pequeñas cantidades de grandes

agregados en una muestra no filtrada. Por otra parte, una señal decente podría ser al

menos obtenida con una muestra no filtrada con preparaciones similares a M4. Así, la

conversión de los dos residuos hidrofóbicos (Val-55 y Leu-109) al residuo mas hidrofílico

de treonina ayudo a minimizar la agregación de la muteína. Otra característica atractiva es

que M4 tiene un perfil de elución notablemente agudo con su purificación usando biotina-

agarosa. Sobre del 95% de la muteína puede ser rápidamente eludida fuera de la columna

usando solo dos volúmenes de eluyente en la columna, dejando una alta tasa de proteína

recuperada.

En el estudio de mutagénesis de sitio directo, no es difícil entender el impacto de

las mutaciones en el siguiente orden: T76R > V125R > V55R. El análisis de la accesibilidad

del solvente de residuos aminoacidicos individuales con estreptavidina tetramérica indica

que área accesible al solvente de Thr-76 en la subunidad A es 0. Su distancia cercana a

ambos Thr-76 y Arg-59 en la subunidad B y localizadas en una superficie rígida de una

estructura larga de lamina β construye un residuo ideal para ser cambiado por arginina

para lograr el efecto de máxima repulsión electrostática e impedimento estérico en la

interfase de la subunidad (Fig. 1B). El área de la superficie accesible de Val-125 en la

subunidad A es de 1,78%. Tiene una extensiva interacción con Leu-109, Trp-120, Thr-123 y

Val-125 en la subunidad D (Fig. 1C); Leu-109 en la subunidad B; y Gln-107 en la subunidad

C. La conversión a arginina resulta en una repulsión de cargas en la subunidad D y un

potencial impedimento estérico para las subunidades B, C y D. Tanto para Val-55 en la

subunidad A, su área de superficie accesible es de 29,7%; y solo se acerca a Arg-59 en la

subunidad B en la interfase (Fig. 1D). Así, V55R tienen el menor impacto en la

monomerización.

Aunque la muteína AK muestra propiedades de unión reversible de biotina y

comportamiento monomérico sobre el gel de poliacrilamida SDS, ciertamente existe en

solución en estado oligomerico como fue sugerido por estudios de filtración en gel,

dispersión dinámica de la luz, y patrones de reticulación. Estos estudios ilustran la

importancia de seleccionar residuos críticos y enfoques efectivos para alcanzar el efecto

máximo de monomerización sobre la estreptavidina tetramérica.

Fig. 5. Determinación de estados monoméricos u oligomericos de estreptavidina tipo salvaje y sus muteínas. La imagen muestra el CoomassieBlue-stained SDS-polyacrylamide gel. A, digestión de la Proteinasa K. B, estudios de reticulación usando sulfo-EEGS como agente reticulante. Todas las muestras fueron hervidas antes de ser cargadas. M, marcadores de peso molecular; wt, estreptavidina tipo salvaje ;L, lisozima. Los números representan moléculas de estreptavidina en estados: monomérico (1), dimerico (2), y oligomerico (3-5), respectivamente.

Tabla 4. Parámetros cinéticos para las interacciones entre muteínas de estreptavidina y biotina